ES2306677T3 - Procedimiento para la produccion de anticuerpos anticancerosos citotoxicos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la producción de anticuerpos anticancerosos usando una muestra de tejido canceroso aislada de un individuo particular que comprende: preparar anticuerpos usando la muestra de tejido como un inmunógeno para producir hibridomas; sin ensayar antes la unión a células cancerosas, someter un sobrenadante de dichos hibridomas a un ensayo que mide la citotoxicidad de los anticuerpos preparados respecto a células normales y a células cancerosas; y seleccionar así un subconjunto de anticuerpos que expresan una mejora del grado de citotoxicidad dirigidos hacia células cancerosas y son relativamente benignos respecto de células normales.
Description
Procedimiento para la producción de anticuerpos
anticancerosos citotóxicos.
Esta invención se refiere a la producción de
anticuerpos anticancerosos personalizados para el paciente
individual que pueden usarse para fines terapéuticos y
diagnósticos. La invención se refiere además al procedimiento por
el que se preparan los anticuerpos y a sus procedimientos de
uso.
Cada individuo que se enfrenta al cáncer es
único y tiene un cáncer que es tan diferente del resto de los
cánceres como la identidad de esa persona. A pesar de esto, la
terapia actual trata a todos los pacientes con el mismo tipo de
cáncer, en la misma fase, del mismo modo. Al menos el 30% de estos
pacientes fracasarán en la terapia de primera línea, conduciendo
así a más sesiones de tratamiento y al aumento de la probabilidad
de fallo del tratamiento, metástasis y, por último, a la muerte.
Una solución mejor para el tratamiento sería la personalización de
la terapia para el individuo particular. La única terapia actual
que se presta a la personalización es la cirugía. La quimioterapia
y el tratamiento con radiación no pueden adaptarse al paciente, y
la cirugía es por sí misma inadecuada en la mayoría de los casos
para producir curaciones.
Con la llegada de los anticuerpos monoclonales,
la posibilidad de desarrollar procedimientos para terapia
personalizada se hizo más realista ya que cada anticuerpo puede
dirigirse a un único epítopo. Además, es posible producir una
combinación de anticuerpos que se dirigen a la constelación de
epítopos que define de manera única el tumor de un individuo
particular.
Habiendo reconocido que una diferencia
significativa entre células cancerosas y normales es que las células
cancerosas contienen antígenos que son específicos para células
transformadas, la comunidad científica ha mantenido durante mucho
tiempo que pueden diseñarse anticuerpos monoclonales para elegir
específicamente como diana células transformadas mediante la unión
específica a estos antígenos del cáncer, dando lugar así a la
creencia de que los anticuerpos monoclonales pueden servir de
"balas mágicas" para eliminar células cancerosas.
Sin embargo, en este momento, el paciente con
cáncer tiene normalmente pocas opciones de tratamiento. La
solución reglamentaria para la terapia del cáncer ha producido
mejoras en las tasas de supervivencia y morbilidad globales. Sin
embargo, para el individuo particular, estas estadísticas mejoradas
no guardan necesariamente relación con una mejora en su situación
personal.
Por tanto, si se mostrara una metodología que
permitiera al médico tratar cada tumor independientemente de otros
pacientes en el mismo cohorte, esto permitiría la solución única de
adaptar la terapia a justamente esa persona. Dicha evolución de la
terapia aumentaría idealmente la tasa de curaciones y produciría
mejores resultados, satisfaciéndose así una necesidad que se
sentía desde hace tiempo.
Históricamente, el uso de anticuerpos
policlonales se ha usado con éxito limitado en el tratamiento de
cánceres humanos. Los linfomas y leucemias se han tratado con
plasma humano, pero había poca remisión o respuestas prolongadas.
Además, había una falta de reproducibilidad y no había beneficio
adicional en comparación con la quimioterapia. Los tumores sólidos
tales como cánceres de mama, melanomas y carcinomas de células
renales también se han tratado con sangre humana, suero de
chimpancé, plasma humano y suero de caballo con resultados
correspondientemente impredecibles e ineficaces.
Hay muchos ensayos clínicos de anticuerpos
monoclonales para tumores sólidos. En los años 80 hubo al menos
cuatro ensayos clínicos paró cáncer de mama humano que sólo
produjeron un paciente que respondió al tratamiento de los al menos
47 pacientes que usaron anticuerpos contra antígenos específicos o
basados en la selectividad de tejidos. No fue hasta 1998 que hubo
un ensayo clínico satisfactorio usando un anticuerpo humanizado
anti-her 2 en combinación con cisplatino. En este
ensayo, 37 pacientes tuvieron acceso a respuestas, de los cuales
aproximadamente un cuarto tuvieron una tasa de respuesta parcial y
la otra mitad tuvo menor progresión de la enfermedad o progresión
estable de la enfermedad.
Los ensayos clínicos que investigan cáncer
colorrectal implican anticuerpos contra dianas tanto de
glicoproteínas como de glicolípidos. Los anticuerpos tales como
17-1A, que tienen alguna especificidad para
adenocarcinomas, se habían sometido a ensayos clínicos de fase 2 en
más de 60 pacientes, teniendo sólo un paciente una respuesta
parcial. En otros ensayos, el uso de 17-1A sólo
produjo una respuesta completa y dos respuestas menores entre los
52 pacientes en protocolos usando ciclofosfamida adicional. Otros
ensayos en los que participó 17-1A dieron
resultados similares. El uso de un anticuerpo monoclonal murino
humanizado autorizado inicialmente para la obtención de imágenes
tampoco produjo regresión tumoral. Hasta la fecha no ha habido un
anticuerpo que haya sido eficaz para cáncer colorrectal. Asimismo,
igualmente ha habido escasos resultados para cáncer de pulmón,
cánceres cerebrales, cánceres de ovario, cáncer pancreático, cáncer
de próstata y cáncer de estómago. Ha habido algún éxito limitado en
el uso de anticuerpo monoclonal anti-GD3 para
melanoma. Por tanto, puede verse que, a pesar de los estudios
satisfactorios en animales pequeños, que son un requisito esencial
para ensayos clínicos en humanos, los anticuerpos que se han
probado han sido en general ineficaces.
La patente de EE.UU. n° 5.750.102 describe un
procedimiento en el que las células de un tumor del paciente se
transfectan con genes de MHC que pueden clonarse de células o
tejido del paciente. A continuación, estas células transfectadas se
usan para vacunar al paciente.
La patente de EE.UU. n° 4.861.581 describe un
procedimiento que comprende las etapas de obtener anticuerpos
monoclonales que son específicos para un componente celular interno
de células neoplásicas y normales del mamífero, pero no para
componentes externos, marcar el anticuerpo monoclonal, poner en
contacto el anticuerpo marcado con tejido de un mamífero que ha
recibido terapia para destruir células neoplásicas y determinar la
eficacia de la terapia midiendo la unión del anticuerpo marcado al
componente celular interno de las células neoplásicas
degenerativas. En la preparación de los anticuerpos dirigidos hacia
antígenos intracelulares humanos, el titular de la patente reconoce
que las células malignas representan una fuente conveniente de
tales antígenos.
La patente de EE.UU. n° 5.171.665 proporciona un
anticuerpo novedoso y procedimiento para su producción.
Específicamente, la patente enseña la formación de un anticuerpo
monoclonal que tiene la propiedad de unirse fuertemente a un
antígeno de proteína asociado con tumores humanos, por ejemplo,
aquellos del colon y pulmón, mientras que se une a células normales
en mucho menor grado.
La patente de EE.UU. n° 5.484.596 proporciona un
procedimiento de terapia del cáncer que comprende extirpar
quirúrgicamente tejido tumoral de un paciente humano con cáncer,
tratar el tejido tumoral para obtener células tumorales, irradiar
las células tumorales para que sean viables, pero no tumorígenas, y
usar estas células para preparar una vacuna para el paciente que
puede inhibir la reaparición del tumor primario, mientras que
inhibe simultáneamente la metástasis. La patente enseña el
desarrollo de anticuerpos monoclonales que son reactivos con
antígenos de superficie de células tumorales. Como se expone en la
col. 4, líneas 45 y sig., los titulares de la patente utilizan
células tumorales autóctonas en el desarrollo de anticuerpos
monoclonales que expresan inmunoterapia específica activa en
neoplasia humana.
La patente de EE.UU. n° 5.693.763 enseña un
antígeno de glicoproteína característico de carcinomas humanos y
que no depende del tejido epitelial de origen.
La patente de EE.UU. n° 5.783.186 se refiere a
anticuerpos anti-Her2 que inducen apóptosis en las
células que expresan Her2, líneas celulares de hibridoma que
producen los anticuerpos, procedimientos para tratar cáncer usando
los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que incluyen dichos
anticuerpos.
La patente de EE.UU. n° 5.849.876 describe
nuevas líneas celulares de hibridoma para la producción de
anticuerpos monoclonales para antígenos de mucina purificados de
fuentes de tejido tumoral y no tumoral.
La patente de EE.UU. n° 5.869.268 se refiere a
un procedimiento para producir un linfocito humano que produce un
anticuerpo específico para un antígeno deseado, un procedimiento
para producir un anticuerpo monoclonal, además de anticuerpos
monoclonales producidos mediante el procedimiento. La patente se
refiere particularmente a la producción de un anticuerpo monoclonal
humano anti-HD útil para el diagnóstico y el
tratamiento de cánceres.
La patente de EE.UU. n° 5.869.045 se refiere a
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, conjugados de anticuerpos e
inmunotoxinas de una única cadena reactivos con células de
carcinoma humano. El mecanismo por el que estos anticuerpos
funcionan es doble, porque las moléculas son reactivas con
antígenos de la membrana celular presentes en la superficie de
carcinomas humanos, y además porque los anticuerpos tienen la
capacidad de internalizarse dentro de las células de carcinoma,
después de la unión, haciéndolas especialmente útiles para formar
conjugados anticuerpo-fármaco y
anticuerpo-toxina. En su forma sin modificar, los
anticuerpos también manifiestan propiedades citotóxicas a
concentraciones específicas.
La patente de EE.UU. n° 5.780.033 describe el
uso de autoanticuerpos para terapia tumoral y profilaxis. Sin
embargo, este anticuerpo es un autoanticuerpo antinuclear
procedente de un mamífero anciano. En este caso se dice que el
autoanticuerpo es un tipo de anticuerpo natural encontrado en el
sistema inmunitario. Debido a que el autoanticuerpo procede de
"un mamífero anciano", no hay necesidad de que el
autoanticuerpo proceda en realidad del paciente que va a tratarse.
Además, la patente describe un autoanticuerpo antinuclear natural y
monoclonal procedente de un mamífero anciano, y una línea celular
de hibridoma que produce un autoanticuerpo antinuclear
monoclonal.
Esta solicitud enseña un procedimiento para
producir anticuerpos anticancerosos específicos para el paciente
usando un paradigma novedoso de cribado. Estos anticuerpos pueden
prepararse específicamente para un tumor y, por tanto, posibilitan
la personalización de la terapia del cáncer. Dentro del contexto de
esta solicitud, los anticuerpos anticancerosos que tienen
propiedades destructoras de células (citotóxicas) o inhibidoras del
crecimiento celular (citostáticas) se denominarán en lo sucesivo
citotóxicos. Estos anticuerpos pueden usarse en beneficio de la
determinación del estado y diagnóstico de un cáncer, y pueden
usarse para tratar metástasis tumorales.
Las perspectivas de tratamiento anticanceroso
individualizado provocarán un cambio en el modo en que se trata un
paciente. Un escenario clínico probable es que se obtenga una
muestra de tumor en el momento de la presentación y se guarde en un
banco. A partir de esta muestra, el tumor puede clasificarse según
un panel de anticuerpos anticancerosos preexistentes. Se
determinará convencionalmente la fase del paciente, pero los
anticuerpos disponibles pueden ser útiles en una determinación
posterior de la fase del paciente. El paciente puede tratarse
inmediatamente con los anticuerpos existentes y puede producirse un
panel de anticuerpos específicos para el tumor bien usando los
procedimientos explicados resumidamente en este documento o
mediante el uso de bibliotecas de expresión en fagos conjuntamente
con los procedimientos de cribado descritos en este documento.
Todos los anticuerpos generados se añadirán a la biblioteca de
anticuerpos anticancerosos, ya que existe la posibilidad de que
otros tumores puedan compartir algunos de los mismos epítopos que
el que va a tratarse.
Además de anticuerpos anticancerosos, el
paciente puede optar por recibir las terapias actualmente
recomendadas como parte de una pauta posológica multimodal de
tratamiento. El hecho de que los anticuerpos aislados mediante la
presente metodología sean relativamente no tóxicos para células no
cancerosas permite que se usen combinaciones de anticuerpos a altas
dosis, bien solos o conjuntamente con terapia convencional. El alto
índice terapéutico también permitirá volver a tratar en un corto
periodo de tiempo, lo que debería disminuir la probabilidad de
aparición de células resistentes al tratamiento.
Si el paciente no responde al tratamiento
inicial de la terapia o desarrolla metástasis, puede repetirse el
procedimiento de generación de anticuerpos específicos para el
tumor para repetir el tratamiento. Además, los anticuerpos
anticancerosos pueden conjugarse con glóbulos rojos obtenidos de
ese paciente y volver a infundirlos para el tratamiento de la
metástasis. Ha habido pocos tratamientos eficaces para cáncer
metastático y las metástasis normalmente auguran un escaso éxito,
dando como resultado la muerte. Sin embargo, los cánceres
metastáticos están normalmente bien vascularizados y la
administración de anticuerpos anticancerosos mediante glóbulos
rojos puede tener el efecto de concentrar los anticuerpos en el
sitio del tumor. Incluso antes de la metástasis, la mayoría de las
células cancerosas dependen del aporte de sangre del huésped para
su supervivencia, y los glóbulos rojos conjugados con anticuerpos
anticancerosos también pueden ser eficaces contra tumores in
situ. Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse con
otras células hematógenas, por ejemplo linfocitos, macrófagos,
monocitos, células asesinas naturales, etc.
Hay cinco clases de anticuerpos y cada una está
asociada con una función que se confiere por su cadena pesada.
Generalmente se piensa que la destrucción de células cancerosas
mediante anticuerpos desnudos está mediada por la citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente
del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos murinos contra IgM e
IgG2a pueden activar el complemento humano uniendo el componente
C-1 del sistema del complemento, activando así la
ruta clásica de la activación de complementos que puede llevar a la
lisis tumoral. Para anticuerpos humanos, los anticuerpos
activadores del complemento más eficaces son generalmente IgM e
IgG1. Los anticuerpos murinos del isotipo IgG2a e IgG3 son eficaces
en el reclutamiento de células citotóxicas que tienen receptores Fc
que llevarán a la destrucción de células por monocitos, macrófagos,
granulocitos y ciertos linfocitos. Los anticuerpos humanos tanto
del isotipo IgG1 como del IgG3 participan en la ADCC.
Otro mecanismo posible de destrucción del cáncer
mediado por anticuerpos puede ser mediante el uso de anticuerpos
que actúan para catalizar la hidrólisis de diversos enlaces
químicos en la membrana celular y sus glicoproteínas o glicolípidos
asociados, los denominados anticuerpos catalíticos.
Hay dos mecanismos adicionales de destrucción de
células cancerosas mediados por anticuerpos que están más
ampliamente aceptados. El primero es el uso de anticuerpos como una
vacuna para inducir que el cuerpo produzca una respuesta
inmunitaria contra el antígeno del cáncer putativo que reside en la
célula tumoral. El segundo es el uso de anticuerpos para elegir
como diana receptores del crecimiento y afectar a su función o para
regular por disminución ese receptor de manera que se pierda
eficazmente su función.
Por consiguiente, un objetivo de la invención es
enseñar un procedimiento para producir anticuerpos anticancerosos
a partir de células derivadas de un individuo particular que son
citotóxicas con respecto a las células cancerosas, aunque
simultáneamente son relativamente no tóxicas para células no
cancerosas.
Uno de los beneficios potenciales de los
anticuerpos monoclonales con respecto al tratamiento del cáncer es
su capacidad para reconocer específicamente antígenos
individuales. Se pensó que, en algunos casos, las células
cancerosas poseían antígenos que eran específicos para ese tipo de
célula transformada. Ahora se cree más frecuentemente que las
células cancerosas tienen pocos antígenos únicos, sino que más bien
tienden a sobreexpresar un antígeno normal o a expresar antígenos
fetales. Sin embargo, el uso de anticuerpos monoclonales
proporcionó un procedimiento para administrar dosis reproducibles
de anticuerpos al paciente con la esperanza de mejores tasas de
respuesta que con los anticuerpos policlonales.
Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales
se han preparado según principios fundamentales establecidos por
Kohler y Milstein. Los ratones se inmunizan con antígenos, con o
sin adyuvantes. Los esplenocitos se recogen del bazo para
fusionarse con componentes de hibridoma inmortalizado. Éstos se
siembran en placas de microvaloración, en las que pueden segregar
anticuerpos en el sobrenadante que se usa para el cultivo celular.
Para seleccionar de entre los hibridomas que se han sembrado en
placa aquellos que producen los anticuerpos de interés, los
sobrenadantes de hibridoma se prueban normalmente para la unión de
anticuerpos a antígenos en un ensayo ELISA (ensayo inmunosorbente
ligado a enzimas). La idea es que los pocillos que contienen el
hibridoma de interés contendrán anticuerpos que se unirán más
ávidamente al antígeno de prueba, normalmente el antígeno
inmunizante. A continuación, estos pocillos se subclonan en un modo
de dilución limitante para producir hibridomas monoclonales. La
selección de los clones de interés se repite usando un ensayo ELISA
para probar la unión del anticuerpo. Por tanto, el principio que se
ha transmitido es que, en la producción de anticuerpos
monoclonales, los hibridomas que producen los anticuerpos que se
unen más ávidamente son aquellos que se seleccionan de entre todos
los hibridomas que se produjeron inicialmente. Es decir, el
anticuerpo preferido es aquel con la mayor afinidad por el antígeno
de interés.
Se han realizado muchas modificaciones de este
procedimiento tales como usar células completas para la
inmunización. En este procedimiento, en lugar de usar antígenos
purificados, se usan células enteras para la inmunización. Otra
modificación es el uso de ELISA celular para el cribado. En este
procedimiento, en lugar de usar en el ELISA antígenos purificados
como diana, se usan células fijadas. Además de pruebas de ELISA, en
el procedimiento de cribado también se han usado ensayos de
citotoxicidad mediada por el complemento. Sin embargo, los ensayos
de unión del anticuerpo se usaron conjuntamente con pruebas de
citotoxicidad. Por tanto, a pesar de muchas modificaciones, el
procedimiento para producir anticuerpos monoclonales se basa en la
unión del anticuerpo al antígeno de prueba como criterio de
valoración.
La mayoría de los anticuerpos dirigidos contra
células cancerosas se han producido usando los procedimientos
tradicionales explicados resumidamente anteriormente. Estos
anticuerpos se han usado tanto terapéutica como diagnósticamente.
En general, para estas dos aplicaciones, el anticuerpo se ha usado
como agente director que administra una carga útil al sitio del
cáncer. Estos conjugados de anticuerpos pueden ser radiactivos,
tóxicos, o servir de intermedios para administrar más fármaco al
cuerpo, tal como una enzima o biotina. Además, hasta recientemente
se consideró generalmente que los anticuerpos desnudos tenían poco
efecto in vivo. Tanto HERCEPTIN como RITUXIMAB son
anticuerpos monoclonales murinos humanizados que han sido
recientemente autorizados por la FDA para uso humano. Sin embargo,
estos dos anticuerpos se prepararon inicialmente ensayando la unión
de anticuerpos y su citotoxicidad directa no fue el objetivo
primario durante la producción de hibridomas. Por tanto, cualquier
tendencia de estos anticuerpos a producir la destrucción de células
tumorales es por casualidad, no por diseño.
Aunque la producción de anticuerpos monoclonales
se ha llevado a cabo usando la inmunización de células completas
para diversas aplicaciones, el cribado de estos hibridomas se ha
basado en antígenos diana putativos o identificados o en la
selectividad de estos hibridomas para tejidos específicos. Es
axiomático que los mejores anticuerpos son aquellos con las mayores
constantes de unión. Este concepto se originó del principio
bioquímico básico de que las enzimas con las mayores constantes de
unión eran aquellas que eran las más eficaces para catalizar una
reacción. Este concepto puede aplicarse a la unión de ligandos a
receptores en la que la molécula de fármaco que se une al receptor
con la mayor afinidad tiene normalmente la mayor probabilidad de
iniciar o inhibir una señal. Sin embargo, esto no puede ser siempre
el caso ya que es posible que en ciertas situaciones haya casos en
los que la iniciación o inhibición de una señal pueda estar mediada
por la unión a no receptores. La información transmitida por un
cambio conformacional inducido por la unión de ligandos puede tener
muchas consecuencias tales como una transducción de señales,
endocitosis, entre otros. La capacidad para producir un cambio
conformacional en una molécula de receptor puede no ser
necesariamente debida a la ocupación de un sitio del
ligando-receptor, pero puede producirse mediante la
unión de otro dominio celular adicional o debido a la agrupación de
receptores inducida por un ligando multivalente.
La producción de anticuerpos para producir la
destrucción de células no necesita basarse en el cribado de los
hibridomas para los anticuerpos de mejor unión. Más bien, aunque no
es recomendado por aquellos que producen anticuerpos monoclonales,
el cribado de los sobrenadantes de hibridoma para la destrucción de
células o alternativamente para el cese del crecimiento de las
células cancerosas puede seleccionarse como un criterio de
valoración deseable para la producción de anticuerpos citotóxicos o
citostáticos. Se entiende bien que los anticuerpos in vivo
logran su función a través de las porciones Fc y que la utilidad
del anticuerpo terapéutico está determinada por la funcionalidad de
la región constante o restos unidos. En este caso, la porción FAb
del anticuerpo, la porción que se combina con el antígeno,
conferirá al anticuerpo su especificidad y la porción Fc su
funcionalidad. El sitio del anticuerpo que se combina con el
antígeno puede considerarse como que es el producto de una
biblioteca combinatoria natural. El resultado de la reorganización
de la región variable del anticuerpo puede considerarse una
biblioteca combinatoria molecular en la que la salida es un
péptido. Por tanto, el muestreo de esta biblioteca combinatoria
puede basarse en cualquier parámetro. Al igual que el muestreo de
una biblioteca de compuestos naturales para antibióticos, es
posible muestrear una biblioteca de anticuerpos para compuestos
citotóxicos o citostáticos.
Los diversos criterios de valoración en un
cribado deben diferenciarse entre sí. Por ejemplo, la diferencia
entre la unión del anticuerpo a la célula es distinta de la
destrucción de la célula. La destrucción de células (citotoxicidad)
es distinta de los mecanismos de muerte celular tales como oncosis
o apóptosis. Puede haber muchos procedimientos por los que se
consiga la muerte celular y algunos de estos pueden conducir a
oncosis o a apóptosis. Se especula que hay otros mecanismos de
muerte celular distintos de la oncosis o apóptosis, pero
independientemente de cómo muere la célula, hay algunas
características comunes de muerte celular. Una de éstas es la
ausencia de metabolismo y otra es la desnaturalización de enzimas.
En cualquier caso, las tinciones vitales fracasarán al teñir estas
células. Estos criterios de valoración de muerte celular se han
entendido desde hace tiempo y son anteriores al entendimiento
actual de los mecanismos de muerte celular. Además, existe la
distinción entre efectos citotóxicos, en los que las células se
destruyen, y efectos citostáticos, en los que se inhibe la
proliferación de células.
En una realización preferida de la presente
invención, el ensayo se realiza centrándose en la actividad
citotóxica hacia células cancerosas como criterio de valoración. En
una realización preferida se utiliza un kit de ensayo de células
vivas/muertas, por ejemplo el kit de ensayo de
viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD® (L-3224) de
Molecular Probes. El kit de Molecular Probes proporciona un ensayo
de viabilidad celular de fluorescencia de dos colores que se basa
en la determinación simultánea de células vivas y muertas con dos
sondas que miden dos parámetros reconocidos de viabilidad
celular-actividad de la esterasa intracelular e
integridad de la membrana plasmática. Los principios del ensayo son
generales y pueden aplicarse a la mayoría de los tipos de células
eucariotas, incluyendo células adherentes y ciertos tejidos, pero
no a bacterias o levadura. Este procedimiento basado en la
fluorescencia para evaluar la viabilidad celular se prefiere en
lugar de tales ensayos como exclusión con azul de tripano,
liberación de Cr y procedimientos similares para determinar la
viabilidad y citotoxicidad celulares.
En la realización del ensayo, las células vivas
se distinguen por la presencia de actividad ubicua de la esterasa
intracelular, determinada por la conversión enzimática de la
calceína AM penetrante a células prácticamente no fluorescente
respecto a la calceína intensamente fluorescente. El colorante
polianiónico calceína se retiene bien dentro de las células vivas,
produciendo una fluorescencia verde uniforme intensa en células
vivas (ex/em \sim495 nm/\sim515 nm). EthD-1
entra en células con membranas dañadas y experimenta una mejora de
la fluorescencia de 40 veces con la unión a ácidos nucleicos,
produciéndose así uña fluorescencia roja brillante en células
muertas (ex/em \sim495 nm/\sim635 nm). EthD-1
es excluido por las membranas plasmáticas intactas de células
vivas. La determinación de la viabilidad celular depende de estas
propiedades físicas y bioquímicas de las células. Los
acontecimientos citotóxicos que no afectan estas propiedades
celulares no pueden evaluarse con exactitud usando este
procedimiento. Los niveles de fluorescencia de fondo son
inherentemente bajos con esta técnica de ensayo porque los
colorantes son prácticamente no fluorescentes antes de
interaccionar con las células.
Además de los diversos criterios de valoración
para el cribado, hay otras dos características muy importantes del
procedimiento de cribado. La biblioteca de productos génicos de
anticuerpos no es una biblioteca aleatoria, pero es el producto de
un procedimiento de sesgado. En los ejemplos siguientes, el sesgado
se produce inmunizando ratones con células fijadas. Esto aumenta la
proporción de anticuerpos que tienen el potencial de unirse al
antígeno diana. Aunque la inmunización se entiende como una forma
para producir anticuerpos de mayor afinidad (maduración de la
afinidad), no es en este caso. Más bien puede considerarse como una
forma para desplazar el conjunto de sitios que se combinan con el
antígeno hacia las dianas. Esto también es distinto del concepto de
cambio de isotipo, en el que la funcionalidad, como se impone por
la porción constante de la cadena pesada, cambia del isotipo de
IgM inicial a otro isotipo tal como IgG.
El tercer rasgo clave que es crucial en el
procedimiento de cribado es el uso de cribado de múltiples dianas.
La especificidad está relacionada hasta un cierto grado con la
afinidad. Un ejemplo de esto es la situación en la que un antígeno
tiene una distribución de tejido muy limitada y la afinidad del
anticuerpo es un determinante clave de la especificidad del
anticuerpo - cuanto mayor sea la afinidad, más tejido específico
para el anticuerpo, y asimismo un anticuerpo con baja afinidad
puede unirse a tejidos distintos de aquel de interés. Por tanto,
para dirigir la cuestión de la especificidad, los anticuerpos se
criban simultáneamente contra una variedad de células. En los
ejemplos siguientes, los sobrenadantes de hibridoma (que
representan las fases más tempranas del desarrollo de anticuerpos
monoclonales) se prueban contra varias líneas celulares para
establecer la especificidad, además de la actividad.
Los anticuerpos se diseñan para el tratamiento
terapéutico del cáncer en pacientes. Idealmente, los anticuerpos
pueden ser anticuerpos desnudos. También pueden estar conjugados
con toxinas. Pueden usarse para elegir como diana otras moléculas
para el cáncer, por ejemplo enzimas conjugadas con biotina. Para la
conjugación también pueden usarse compuestos radiactivos.
Se prevé que estos anticuerpos puedan usarse
para el diagnóstico, pronóstico y control del cáncer. Por ejemplo,
pueden haberse extraído muestras de sangre de los pacientes para
liberarse de antígenos tumorales que pueden detectarse mediante
estos anticuerpos en diferentes formatos tales como ensayos ELISA,
formatos de paneles de pruebas rápidas, etc. Los anticuerpos pueden
usarse para teñir biopsias de tumores con los fines de diagnóstico.
Además, puede usarse un panel de anticuerpos terapéuticos para
probar muestras de pacientes para determinar si hay algún
anticuerpo adecuado para uso terapéutico.
Ejemplo
uno
Con el fin de producir anticuerpos monoclonales
específicos para una muestra de tumor, el procedimiento de
selección de los pocillos de hibridoma apropiados se complica por la
probabilidad de seleccionar pocillos que producirán señales
positivas falsas. Es decir, existe la probabilidad de producir
anticuerpos que pueden reaccionar contra células normales, además
de células cancerosas. Para obviar esta posibilidad, una estrategia
es ocultar los anticuerpos anti-antígenos normales
del procedimiento de selección. Esto puede llevarse a cabo
eliminando los anticuerpos anti-normales en la
primera fase de cribado, revelándose así la presencia de los
anticuerpos deseados. Un clonado posterior por dilución limitante
puede definir los clones que no producirán la destrucción de
células de control, pero producirán la destrucción de células
cancerosas diana.
Las piezas de biopsia de tumores de mama,
melanoma y pulmón se obtuvieron y se guardaron a -70°C hasta que se
usaron. Se prepararon suspensiones individuales de células y se
fijaron con -30°C, etanol al 70%, se lavaron con PBS y se
reconstituyeron hasta un volumen apropiado para inyección. Se
inmunizaron ratones Balb/c con
2,5x10^{5}-1x10^{6} células y se reforzaron
cada tercera semana hasta que se realizó un refuerzo final previo a
la fusión tres días antes de la esplenectomía. Los hibridomas se
prepararon mediante fusión de los esplenocitos aislados con los
constituyentes del mieloma Sp2/0 y NS1. Los sobrenadantes de las
fusiones se probaron para subclonar los hibridomas. Las células
(incluyendo células del melanoma A2058, fibroblastos de
CCD-12CoN, células de mama MCF-12A,
entre otras) se obtuvieron de ATCC y se cultivaron según las
instrucciones adjuntas. La línea celular HEY fue un obsequio de la
Dr. Inka Brockhausen. Las células no cancerosas, por ejemplo
fibroblastos de CCD-12CoN y células de mama
MCF-12A, se sembraron en placa en placas de
microvaloración de 96 pocillos (NUNC) 1 a 2 semanas antes del
cribado. Las células cancerosas, por ejemplo HEY, A2058, BT 483 y
HS294t, se sembraron en placa dos o tres días antes del cribado.
Las células normales sembradas en placa se
fijaron antes de uso. Las placas se lavaron con 100 microlitros de
PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se secaron
por aspiración. A cada pocillo se añadieron 75 microlitros de
glutaraldehído al 0,01 por ciento diluido en PBS durante cinco
minutos y luego se aspiraron. Las placas se lavaron tres veces con
100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Los pocillos se
vaciaron y a cada pocillo se añadió durante una hora a temperatura
ambiente 100 microlitros de albúmina de suero humano al uno por
ciento en PBS. A continuación, las placas se guardaron a cuatro
grados Celsius.
Antes de transferir el sobrenadante de las
placas de hibridoma, las células normales fijadas se lavaron tres
veces con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Después de
la aspiración, los microlitros de los sobrenadantes primarios del
cultivo de hibridoma se transfirieron a las placas de células
fijadas y se incubaron durante dos horas a 37 grados Celsius en un
incubador con 8 por ciento de CO_{2}. Los sobrenadantes de
hibridoma derivados del melanoma se incubaron con células
CCD-12 CoN y aquellos derivados del cáncer de mama
se incubaron con células MCF-12a. Después de la
incubación, el sobrenadante absorbido se dividió en dos porciones
de 75 microlitros y se transfirieron a placas de células
cancerosas diana. Antes de la transferencia, las placas de células
cancerosas se lavaron tres veces con 100 microlitros de PBS. El
sobrenadante de las células CCD-12 CoN se
transfirió a las células A2058 y HS294t, mientras que el
sobrenadante de las células MCF-12A se transfirió a
las células HEY y BT 483. Las células cancerosas se incubaron con
los sobrenadantes de hibridoma durante 18 horas a 37 grados Celsius
en un incubador con 8 por ciento de CO_{2}.
El ensayo de citotoxicidad con Live/Dead se
obtuvo de Molecular Probes (Eu, OR). Los ensayos se realizaron
según las instrucciones del fabricante con los cambios explicados
resumidamente más adelante. Las placas con las células se lavaron
una vez con 100 microlitros de PBS a 37°C. Se transfirieron de 75 a
100 microlitros de sobrenadante de las placas de microvaloración de
hibridoma a las placas de células y se incubaron en un incubador
con 8% de CO_{2} durante 18-24 horas. A
continuación, los pocillos que sirvieron como control de todas las
células muertas se aspiraron hasta vaciarlos y se añadieron 50
microlitros de etanol al 70%. A continuación, la placa se vació
invirtiéndola y se secó con material absorbente. Se dispensó PBS a
temperatura ambiente a cada pocillo de un frasco lavador
multicanal, se golpeó tres veces, se vació mediante inversión y
luego se secó con material absorbente. A cada pocillo se añadieron
50 microlitros del colorante Live/Dead fluorescente diluido en PBS
y se incubaron a 37°C en un incubador con 5% de CO_{2} durante
una hora. Las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de
placas Perkin-Elmer HTS7000 y los datos se
analizaron en Microsoft Excel.
Se realizaron cuatro sesiones de cribado para
producir cultivos individuales de hibridoma clonado. Durante dos
sesiones de cribado, los sobrenadantes de hibridoma se probaron
sólo contra las células cancerosas. En la última sesión de cribado,
el sobrenadante se probó contra varias células no cancerosas,
además de las células diana indicadas en la tabla 1. Los
anticuerpos se clasificaron en isotipos usando un kit comercial de
clasificación de isotipos.
Se produjeron varios anticuerpos monoclonales
según el procedimiento de la presente invención. Estos
anticuerpos, cuyas características se resumen en la tabla 1, se
identifican como 3BD-3, 3BD-6,
3BD-8, 3BD-9,
3BD-15, 3BD-25,
3BD-26 y 3BD-27. Estos anticuerpos
se consideran monoclonales después de cuatro sesiones de clonado
por dilución limitante. Los anticuerpos
anti-melanoma no produjeron destrucción
significativa de células cancerosas. El panel de anticuerpos
anti-cáncer de mama destruyó el
32-87% de las células diana y <
1-3% de las células de control. El isotipo
predominante fue IgG1, aún cuando se esperaba que la mayoría de los
anticuerpos anti-tumorales se dirigirían contra
antígenos de carbohidratos, y por tanto, serían del tipo IgM.
Existe un alto índice terapéutico ya que la mayoría de los
anticuerpos perdonan a las células de control de la muerte
celular.
Ejemplo
2
En este ejemplo, anticuerpos anticancerosos
personalizados se producen obteniendo primero muestras del tumor
del paciente. Normalmente, ésta es de una pieza de biopsia de un
tumor sólido o una muestra de sangre de tumores hematógenos. Las
muestras se preparan en suspensiones celulares individuales y se
fijan para inyección en ratones. Después de completarse el programa
de inmunización, los hibridomas se producen a partir de los
esplenocitos. Los hibridomas se criban contra una variedad de
líneas celulares cancerosas y células normales en ensayos de
citotoxicidad habituales. Aquellos hibridomas que son reactivos
contra líneas celulares cancerosas, pero no son reactivas contra
células normales no transformadas, se seleccionan para posterior
propagación. Los clones que se consideraron positivos fueros
aquellos que destruyeron selectivamente las células cancerosas, pero
no destruyeron las células no transformadas. Los anticuerpos se
caracterizan por un gran número de parámetros bioquímicos y luego
se humanizan para uso terapéutico. Las células tumorales de
melanoma se aislaron y las líneas celulares se cultivaron como se
describe en el ejemplo 1. Se inmunizaron ratones Balb/c según el
siguiente programa: 200.000 células s.c. e i.p. en el día 0, luego
se inyectaron i.p. 200.000 células en el día 21, luego se
inyectaron 1.000.000 de células en el día 49, luego se inyectaron
i.p. 1.250.000 células en adyuvante completo de Freund en el día
107, y luego se inyectaron 200.000 células i.p. en el día 120 y
luego los ratones se sacrificaron en el día 123. Los bazos se
recogieron y los esplenocitos se dividieron en dos alícuotas para
fusionarse con constituyentes del mieloma Sp2/0 (1LN) o
NS-1 (2LN) usando los procedimientos explicados
resumidamente en el ejemplo 1.
El cribado se llevó a cabo 11 días después de la
fusión contra células del melanoma A2058 y fibroblastos de
CCD-12CoN. Cada par de placas se lavó con 100
microlitros de PBS a temperatura ambiente y luego se aspiró hasta
casi sequedad. Luego se añadieron 50 microlitros de sobrenadante
de hibridoma a los mismos pocillos en cada una de las dos placas.
El sobrenadante de Sp2/0 gastado se añadió a los pocillos de
control al mismo volumen y las placas se incubaron durante
aproximadamente 18 horas a 37 grados Celsius en un incubador a 8%
de CO_{2}, 98% de humedad relativa. A continuación, se sacó cada
par de placas y los medios se sustituyeron en los pocillos de
control positivos por 50 microlitros de etanol al 70% durante 4
segundos. A continuación, las placas se invirtieron y se lavaron
una vez con PBS a temperatura ambiente y se secaron. Luego se
añadieron 50 ul del colorante Live/Dead fluorescente diluido en PBS
(kit Live/Dead de Molecular Probes) durante una hora y se incubaron
a 37 grados Celsius. A continuación, las placas se leyeron en un
lector de fluorescencia de placas de Perkin-Elmer y
los datos se analizaron usando Microsoft Excel. Los pocillos que
se consideraron positivos se subclonaron y el mismo procedimiento
de cribado se repitió 13 días después y luego 33 días después. Los
resultados del último cribado se explican resumidamente en la tabla
2 de a continuación. Se produjeron varios anticuerpos monoclonales
según el procedimiento de la presente invención. Estos anticuerpos,
cuyas características se resumen en la tabla 2, se identifican
como 1LN-1, 1LN-12,
1LN-14, 2LN-21,
2LN-28, 2LN-29,
2LN-31, 2LN-33,
2LN-34 y 2LN-35.
La tabla ilustra que los clones de tanto las
fusiones de Sp2/0 como de NS-1 pudieron producir
anticuerpos que tenían una tasa de destrucción superior al 50% para
células cancerosas y, al mismo tiempo, algunos de los clones
pudieron producir una destrucción inferior al uno por ciento de
fibroblastos normales de control.
Los anticuerpos anticancerosos de la invención
son útiles para tratar un paciente con una enfermedad cancerosa
cuando se administran en mezcla con un adyuvante farmacéuticamente
aceptable, por ejemplo solución salina normal, una emulsión de
lípidos, albúmina, solución salina tamponada con fosfato o
similares, y se administran en una cantidad eficaz para lograr el
tratamiento de dicha enfermedad cancerosa, por ejemplo con un
intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 1
g/ml.
El procedimiento para tratar un paciente que
padece una enfermedad cancerosa puede incluir además el uso de
anticuerpos anticancerosos conjugados y esto incluiría conjugar
anticuerpos anticancerosos específicos para el paciente con un
miembro seleccionado del grupo que está constituido por toxinas,
enzimas, compuestos radiactivos y células hematógenas; y
administrar estos anticuerpos conjugados al paciente; en el que
dichos anticuerpos anticancerosos se administran en mezcla con un
adyuvante farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salina
normal, una emulsión de lípidos, albúmina, solución salina
tamponada con fosfato o similares, y se administran en una cantidad
eficaz para lograr el tratamiento de dicha enfermedad cancerosa,
por ejemplo con un intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a
aproximadamente 1 g/l. En una realización particular, los
anticuerpos anticancerosos útiles en cualquiera de los
procedimientos anteriormente explicados resumidamente pueden ser un
anticuerpo humanizado.
Esta lista de referencias citada por el
solicitante sólo es para conveniencia del lector. No forma parte
del documento de patente europea. Aunque se ha puesto mucho
cuidado en recabar las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP niega cualquier responsabilidad en este
aspecto.
- \bullet US 5750102 A [0010]
- \bullet US 5783186 A [0015]
- \bullet US 4861581 A [0011]
- \bullet US 5849876 A [0016]
- \bullet US 5171665 A [0012]
- \bullet US 5869268 A [0017]
- \bullet US 5484596 A [0013]
- \bullet US 5869045 A [0018]
- \bullet US 5693763 A [0014]
- \bullet US 5780033 A [0019]
Claims (3)
1. Un procedimiento para la producción de
anticuerpos anticancerosos usando una muestra de tejido canceroso
aislada de un individuo particular que comprende:
preparar anticuerpos usando la muestra de tejido
como un inmunógeno para producir hibridomas;
sin ensayar antes la unión a células cancerosas,
someter un sobrenadante de dichos hibridomas a un ensayo que mide
la citotoxicidad de los anticuerpos preparados respecto a células
normales y a células cancerosas; y
seleccionar así un subconjunto de anticuerpos
que expresan una mejora del grado de citotoxicidad dirigidos hacia
células cancerosas y son relativamente benignos respecto de células
normales.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
que comprende además la etapa de eliminar anticuerpos
anti-antígenos normales de dichos anticuerpos
preparados antes de realizar dicho ensayo de citotoxicidad mediante
absorción previa del sobrenadante de hibridoma con células
normales.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o
reivindicación 2, que incluye además la etapa de humanizar dicho
subconjunto de anticuerpos que expresan una mejora del grado de
citotoxicidad dirigidos hacia células cancerosas y son
relativamente benignos respecto de células normales.
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