DK171419B1

DK171419B1 - Mikrobielt fremstillet humant Interleukin-1, fremgangsmåder til fremstilling deraf samt farmaceutiske preparater indeholdende dette, og dets anvendelse i behandling og profylakse

Info

Publication number: DK171419B1
Application number: DK077387A
Authority: DK
Inventors: Alvin Seth Stern
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1986-02-18
Filing date: 1987-02-16
Publication date: 1996-10-21
Also published as: NL8700397A; US5831022A; JP2590085B2; GB2186580A; IT1202565B; DE3704868C2; BE1000636A5; GB2186580B; DE3704868A1; FR2595714A1; FR2595714B1; IT8719420A0; DK77387D0; CH676008A5; GB8703663D0; JPS62209097A; DK77387A

Description

DK 171419 B1

Den foreliggende opfindelse angår mikrobielt fremstillet humant Interleukin-1, fremgangsmåder til fremstilling deraf samt farmaceutiske preparater indeholdende dette, og dets anvendelse i behandling og profylakse.

5 To gener, der koder for a- og β- formen af humant interleukin- l, er beskrevet i litteraturen, fx af March et al.,

Nature 315, 641-647 (1985). I EP 200986, offentliggjort den 12. november 1986, opfindere Gubier et al., beskrives kloning og ekspression af rekombinant humant interleukin-1, dvs. et 10 humant interleukin-1, der er fremstillet mikrobielt. Ved den deri beskrevne oprensningsfremgangsmåde er der et problem på grund af dette proteins uopløselighed i de bakterielle værtsceller. Det antages, at dette problem kan tilskrives produktionen af store mængder protein i et miljø, der tilsyneladen-15 de ikke er egnet til proteinets rigtige foldning. Problemerne ved proteinets foldning manifesterer sig ved dannelse af indeslutninger inde i bakterierne. Disse indeslutningslegemer ("inclusion bodies") kan kun opløses i stærkt denaturerende midler såsom urinstof og guanidin-hydrochlorid.

20 De oprensningsfremgangsmåder, ved hvilke disse stærkt denaturerende midler anvendes, giver oprenset rekombinant humant interleukin-l. Af grunde, der ikke fuldt ud kendes, men muligvis hænger sammen med proteinets foldning i dette ikke-biologiske miljø, er oprensede molekylers observerede 25 specifikke aktivitetsniveau ikke større end 6 x 106 en- heder/mg. Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at udvikle en oprensningsfremgangsmåde til rekombinant humant interleukin-1, især til rekombinant humant interleukin- la, hvilken fremgangsmåde tillader oprensning og 30 solubilisering af det ønskede protein i et biologisk kompatibelt puffersystem og giver et produkt med forhøjet specifik aktivitet.

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant humant interleukin-l, især 35 humant interleukin-la, specielt humant interleukin-la med en 2 DK 171419 B1 aminosyresekvens som vist i fig. 1, som et i det væsentlige homogent protein og i det væsentlige endotoxinfrit med forhøjet specifik aktivitet, især en specifik aktivitet på mindst ca. 5 x 107 enheder/mg. Desuden angår opfindelsen 5 rekombinant humant interleukin-1, der fremstilles ved nævnte fremgangsmåde, nemlig et humant interleukin-1, der fremstilles mikrobielt, i det væsentlige endotoxinfrit som et i det væsentlige homogent protein med en specifik aktivitet på mindst ca. 5 x 107 enheder/mg. Dette humane interleukin-1 kan 10 anvendes som farmaceutisk middel til behandling og profylakse af sygdomme. Endvidere angår opfindelsen farmaceutiske præparater, der indeholder dette humane interleukin-1. Det er klart for fagfolk, at det humane interleukin-1 ifølge opfindelsen kan have en yderligere methioninrest ved N-termina-15 len.

Et vigtigt aspekt af den foreliggende opfindelse bygger på den overraskende erkendelse, at en betragtelig del af det i en bakterievært, fx i E. coli, udtrykte rekombinante humane interleukin-1, er indeholdt i den opløselige cytosolfraktion, 20 selv om den specifikke aktivitet i denne fraktion ligger langt under aktiviteten af indeslutningslegemer, der er ekstraheret med urinstof. Desuden er det således, at humant interleukin-1 ikke blot er indeholdt i cytosol, men det har overraskende vist sig, at det kan oprenses fra cytosol ved 25 simpel to- eller eventuelt tretrins søjlechromatografi.

I første trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås en opløselig cellefraktion ved sprængning af transformerede mikrobielle værtsceller, som er dyrket under betingelser, der bevirker ekspression af det indførte gen for humant inter-30 leukin-1 og fraskillelse af det uopløselige cellemateriale, herunder indeslutningslegemerne, i hvilke størstedelen af det udtrykte humane interleukin-1 (rHIL-1) ifølge den kendte teknik skal befinde sig.

Sprængningen af cellerne kan foretages ved almindeligt kendte 35 teknikker, fx ved enzymatisk nedbrydning, fx ved lysozym-be- 3 DK 171419 B1 handling, ved fysisk spaltning under anvendelse af en kugle-mølle eller en lignende indretning eller fortrinsvis ved ultralydbehandling. Fraspaltningen af det opløselige cytosol fra det uopløselige cellemateriale opnås lettest ved centri-5 fugering, fx ved 20.000 x g i ca. 30 minutter. Supernatanten med cytosolfraktionen, der indeholder opløseligt rHIL-1, underkastes derpå gelfiltrering, hvorved der til eluering anvendes en pufret saltopløsning. En til dette fremgangsmådetrin egnet søjle er en SephacrylA S-200-søjle (Pharmacia 10 Feinchemikalien AB, Uppsala, Sverige).

Gelchromatografi-fraktionerne i den pufrede saltopløsning, fortrinsvis i en med Tris/HCl, pH 8,0, pufret NaCl-opløsning, der kan indeholde en proteinstabilisator såsom ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA), undersøges. De kombinerede biologisk 15 aktive fraktioner fortyndes med yderligere pufret saltopløsning og anvendes i det andet trin af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Undersøgelsen af de chromatografiske fraktioner kan udføres ved almindeligt kendte metoder. En egnet analysemetode er 20 muse-thymocyt-proliferationsanalysen (LAF-analyse) som beskrevet af Mizel et al., J. Immunol. 120, 1497-1508 (1978).

Det andet fremgangsmådetrin omfatter ionbytningschroma-tografi, fortrinsvis på en DEAE-cellulosesøj le, under anvendelse af en gradient med stigende saltkoncentration i en 25 pufret opløsning. I en foretrukken udførelsesform er denne gradient en 0-800 mM NaCl-gradient i 25 mM Tris/HCl-puffer, pH 8,1.

Ved oprensning i stor målestok fjernes nukleinsyrerne i cytosolfraktionen, efter centrifugering til fjernelse af 30 cellerester, ved streptomycinsulfat-udfældning. En tiendedel volumen (af supernatanten) af en 10% w/v streptomycinsul-fat-opløsning tilsættes. pH-Værdien holdes på 6,2-6,4 med IN eddikesyre. Suspensionen centrifugeres ved 20.000 x g i 30 minutter. Proteinerne i den resulterende supernatantopløsning 4 DK 171419 B1 koncentreres ved tilsætning af ammoniumsulfat til 60% mætning. Suspensionen centrifugeres ved 20.000 x g i 30 minutter, og det resulterende sediment opløses i et minimalvolumen af 25 mM Tris/HCl, pH 8,0, 800 mM NaCl.

5 I nogle tilfælde, især ved udførelse af fremgangsmåden i større målestok, kan endotoxin-mængden i dette trin være større end det tilladelige. Følgelig kan der eventuelt tilføjes et tredje trin til fjernelse af endotoxinet. Der kan anvendes almindeligt kendte fremgangsmåder til dette formål, 10 skønt den foretrukne fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfindelse omfatter, at opløsningen (1:1 v/v fortyndet med 25 mM Tris/HCl, pH 8,1) fra DEAE-søjlen ledes gennem en Detoxi-GelA-søjle (Pierce Chemical Company, Rockford, 111., USA) i henhold til producentens anvisninger.

15 Det oprensede humane interleukin-1 ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes på kendt måde som farmaceutisk middel for at stimulere en patients immunsystem, idet det fx forbedrer immunresponset over for patogener, virker som vaccine -adj uvans og forstærker forsvaret mod neoplastiske syg-20 domme. Andre kliniske anvendelsesformål omfatter fremme af sårheling ved stimulation af fibroblast-væksten og forbedring af helbredelsen af kritisk syge, proteinunderernærede patienter.

Det humane interleukin-1 ifølge den foreliggende opfindelse 25 kan indgives til varmblodige pattedyr til de ovenfor nævnte kliniske anvendelsesformål. Indgiften kan ske ved en hvilken som helst konventionel metode såsom ved parenteral anvendelse enten intravenøst, subkutant eller intramuskulært. Det er klart, at den nødvendige dosis afhænger af de særlige om-30 stændigheder, sygdommens sværhedsgrad, behandlingens varighed og indgiftsmetoden. En egnet doseringsform til farmaceutisk anvendelse kan fås ved, at sterilfiltreret, lyofiliseret humant interleukin-1 før anvendelsen rekonstitueres på kendt måde. Tilsætning af puffere, stabilisatorer, bakteriostatika 35 og andre tilsætningsstoffer, som sædvanligvis anvendes i DK 171419 B1 5 farmaceutiske parenterale doseringsformer, kan foretages ifølge den almindelige viden inden for området.

Opfindelsen belyses ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1

5 E. coli-celler, der var transformeret med en ekspressionvektor, der koder for rekombinant humant interleukin-la (rHIL-la), lodes vokse under betingelser, der tillader ekspression af rHIL-la. Cellerne blev indsamlet og frosset ned. Til oprensning af rHIL-la blev de frosne E. coli-celler 10 optøet i 30 mM Tris/HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (i et forhold på 1:5 w/v). De resuspenderede celler blev sprængt med en Branson- celleknuser 350 (sonikator). De sprængte celler og "uopløseligt" rHIL-la i form af indeslutningslegemer blev fjernet ved centrifugering ved 20.000 x g. Supernatanten indeholdende 15 opløseligt rHIL-la blev anbragt på en SephacrylA S-200-søjle (fig. 2). Søjlen blev ækvilibreret med 30 mM Tris/HCl (pH

8,0), 800 mM NaCl, 5 mM EDTA. De biologisk aktive fraktioner blev forenet, fortyndet i et forhold på 1:3 (v/v) med 30 mM Tris/HCl (pH 8,0) og chromatograferet på DEAE-cellulose 20 (anionbytter DE 53, Whatman Ltd.) under anvendelse af en lineær gradient af 0-800 mM NaCl i 25 mM Tris/HCl (pH 8,1) (fig. 3). Over 50% af den biologiske aktivitet blev isoleret med en specifik aktivitet på 0,4-1,0 x 107 enheder/mg protein. Proteinets renhed blev bekræftet ved hjælp af SDS-poly-25 acrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) ifølge Laemmli et al., Nature 227, 680-685 (1970) (fig. 4) samt ved hjælp af omvendt -fase- HPLC. Efter chromatografi på SephacrylA S-200 var rHIL-la forurenet med 1000-2000 endotoxinenheder/ml, men DEAE-chromatografien bevirkede en 99% reduktion af endotoxi-30 net. Den biologiske aktivitet viste sig at være stabil i mindst 3 måneder, når proteinet blev opbevaret ved 4°C.

EKSEMPEL 2 6 DK 171419 B1

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde blev udført i forstørret målestok til fremstilling af 32 mg i det væsentlige rent rHIL-la. 100 g cellemasse blev åbnet med en Manton-Gaulin (Meth. Enzymology 22, 482-484 [1971]), og det resulterende 5 opløselige produkt blev behandlet med streptomycinsulfat og ammoniumsulfat til fjernelse af nukleinsyrer og koncentration af proteinerne. Det resulterende resolubiliserede protein blev chromatograferet i pufret saltopløsning på en 10 liters SephacrylA S-200-søjle. Det oprensede materiale blev derefter 10 chromatograferet på en DEAE-cellulosesøj le. Proteinet var mere end 95% rent, hvilket kunne fastslås ved SDS-PAGE. Den samlede aktivitet, der blev opnået, var på 1,6 x 109 enheder med en gennemsnitlig specifik aktivitet på 5 x 107 enhe-der/mg. I modsætning til det egentlige pilotforsøg var dette 15 materiale imidlertid en smule forurenet med endotoxin (op til 500 endotoxinenheder/ml). Denne endotoxinforurening kunne let fjernes ved, at proteinopløsningen blev ført hen over en med DetoxiGelA pakket søjle, idet producentens anvisninger blev fulgt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, 2 hvor 3 fig. 1 viser aminosyresekvensen af humant interleukin-la.

4

Fig. 2 viser et chromatogram over gelfiltreringen af E.

5

coli-cytosol med opløseligt rHIL-la på SephacrylA

6 S-200. Elueringsmidlet er 30 mM Tris/HCl (pH 8,0), 7 800 mM NaCl. I en delmængde af fraktionerne blev 8 interleukin-1-aktiviteten bestemt ved LAF- analyse.

9

Fig. 3 viser et chromatogram over DEAE-cellulose-chromato- 10 grafi af de forenede interleukin-1-aktive fraktioner 11 fra SephacrylA s- 200-søjlen. rHIL-la blev elueret med 12

en saltgradient af 0-800 mM NaCl i 25 mM Tris/HCl (pH

13 8,1). Prøver af hver frak tion blev testet for bio 14 logisk aktivitet ved LAF-analyse.

15

Fig. 4 viser oprensning af rHIL-la. Prøver fra forskellige 16 trin af oprensningen af rHIL-la blev analyseret ved SDS- PAGE.

Claims

1. Mikrobielt fremstillet i det væsentlige homogent humant interleukin-1, 20 kendetegnet ved, at det er i det væsentlige endo-toxinfrit, og at det er et protein med en specifik aktivitet på mindst ca. 5 x 107 enheder/mg.

2. Humant interleukin-1 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er humant interleukin-la.

3. Humant interleukin-1 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har den i fig. 1 viste aminosyresekvens.

4. Humant interleukin-1 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 til anvendelse som farmaceutisk middel. DK 171419 B1

5. Fremgangsmåde til fremstilling af humant interleukin-1 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at mikrobeceller, der er transformeret med en ekspressionsvektor, som indeholder genet for 5 rekombinant humant interleukin-1 og inducerer ekspression af dette gen, sprænges, uopløseligt cellemateriale skilles fra en cytosolfraktion, og interleukin-1 fra denne cytosolfrak-tion underkastes gelfiltrering under anvendelse af en pufret saltopløsning, de biologisk aktive fraktioner fra gelfiltre-10 ringen forenes, og de udsættes for ionbytningschromatografi under anvendelse af en gradient med stigende saltkoncentration i en pufret opløsning.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at mikrobecellerne sprænges ved 15 ultralydbehandling.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5-7, kendetegnet ved, at gelfiltreringen udføres på en Sephacryl® S-200-søjle, og at den pufrede saltopløsning er en Tris/HCl-pufret NaCl-opløsning.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5-8, kendetegnet ved, at ionbytningschromatografien udføres under anvendelse af en DEAE-cellulosesøj le, og at gradienten med stigende saltkoncentration i en pufret opløsning er en 0-800 mM NaCl-gradient i Tris/HCl-puffer. 1

9. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de indeholder humant inter-leukin-1 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3.