CN1036532C - 还原型非糖基化重组人体白细胞介素-2的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备还原型非糖基化重组人体IL2的方法，该方法包括提取转化微生物体内以颗粒形式存在的IL2，然后用反相HpLc纯化。
Description
本发明涉及有生物活性的还原型非糖基化重组人体白细胞介素(Interleukine)2(r-hIL2)的制备方法。
天然的人IL2是刺激活性T细胞增生的淋巴因子，在其蛋白质的氨基酸顺序中有3个半胱氨酸，位于第58、105和125位。位于58和105位的半胱氨酸由一个双硫键桥连接，而125位的半胱氨酸有游离的巯基(Robb，RJ et al·Proc.Natl·Acad·Sci·USA(1984)81 6486-6490).
通过重组DNA技术，用等位基因或衍生物制备人体IL2的方法已有文献报道。例如，Taniguchi，T.等人〔Nature(1983)302 305-310〕和Devos，R.等人〔NucleicAcids Research(1983)11 4307-4323〕已描述了人体IL2基因的无性繁殖及其在微生物中的表达，Ju，C等人(J·Biol·chem(1987)262，5723-5731)已获得了IL2重组衍生物的表达。此外，已经发现：当IL2以不溶的颗粒状累积于微生物中时，它是含有3个硫醇基还原型，并且没有活性(Japanese Patent ApplicationJP 1257931)。因此认为：要得到具有活性的IL2，该颗粒状累积的还原型蛋白必须经过一个氧化过程。为此，将该蛋白溶于变性介质中后，在控制的氧化介质中使之形成一个需要复性的适宜的二硫键桥58-105.还有其它的氧化方法，例如仅用氧气氧化(空气自动氧化)或有铜离子存在的氧气氧化或弱氧化剂存在下的氧气氧化，或用硫醇和二硫化物混合物的氧化(Tsuji，Tetal.Biochemistry(1987)26 3129-3134)。
经氧化复性后，必须经色层析纯化以除去生成的氧化产物异构体，它们包括分子内58-105和105-125键连的异构体及其它分子内键连的异构体，这些异构体无活性，而且可按Wang，A等人〔Science(1984)224，1431-1433〕或Browing，JL等人〔Anal Biochem(1986)155，123-128〕的方法用反相色谱将它们分离。
因此从颗粒状累积蛋白中制备具有适宜生物活性的同质氧化重组IL2存在某些技术问题，因为不论采用什么方法都必须有纯化的几个步骤，而这几个纯化步骤使所要产物的产率降低。
本发明方法不需要再氧化便可得到具有IL2生物活性的产物。
首先，本发明涉及制备非糖基化重组人体IL2及其等位基因或衍生物的方法，所述IL2一方面具有下述氨基酸顺序：X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu LeuLys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu TyrAla Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe CysGln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr其中X代表蛋氨酸或氢原子，位于58,105和125位的三个半胱氨酸均为还原型；另一方面，所述IL2的生物活性类似于具有相同氨基酸顺序并在58-105位含有一个二硫键桥的氧化型IL2。
所谓等位基因和衍生物，通过取代，去除或增加修饰除58,105和125位的半胱氨酸外的氨基酸顺序中的一个或多个氨基酸，其修饰程度以这些产物能保持还原型IL2特有的生物活性为限。用重组ADN方法可得上述的修饰物是共知的，例如可用导向诱变技术，该技术已有综述〔Lather RF and Lecoq JP inGenetic Engineering Academic Press(1983)31-50 or Smith Mand Gillam S，GeneticEngineering principals and methods PlenumPress(1981)31-32〕。所谓还原型指的是含有IL2的半胱氨酸残基有游离的巯基，该巯基可用分光光度计以二硫双吡啶作为硫醇试剂进行测定。通过用四氮唑鎓盐的比色试验〔Moss-mann，TJ.Immunol.Meth.(1983)65 55-63〕测量依赖IL2 CTIL-。的小鼠白血病细胞系的增生测定了按本发明方法获得的还原型IL2的生物活性，结果与相应的在58-105位含有二硫键桥的氧化型IL2的生物活性相同。
本发明还涉及制备非糖基化重组人体IL2及其同位基因或衍生物的方法，所述IL2一方面具有下述氨基酸顺序：X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu LeuLys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu TyrAla Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe CysGln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr其中X代表蛋氨酸或氢原子，位于58,105和125位的三个半胱氨酸均为还原型；另一方面，所述IL2的生物活性至少为0.5×107U/mg·IL2活性的单位定义为：试验中产生50％最大反应的量。所用标准是由国家癌症研究所(NCT)提供的样品〔Biological Response ModiferProgram(BRMP)reference human reagentIL2(Jurkat)〕。
更具体地讲，本发明涉及制备非糖基化重组人体IL2的方法，所述IL2具有下述氨基酸顺序：X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu LeuLys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu TyrAla Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe CysGln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr其中X代表蛋氨酸或氢原子，位于58,105和125位的三个半胱氨酸均为还原型，所述IL2的生物活性与天然的人IL2相似。所谓相似活性指的是与从白血病Jurkat细胞中分离得到的天然IL2的特殊活性相同，即1.3×107u/mg(参照BRMP)，或与该特殊活性的差别最多不大于25％。按本发明方法得到的还原型IL2的氨基酸顺序，根据要表达的转化微生物(如E.Coli)可任意增加一个N-端蛋氨酸。在本发明方法的优选实例中含有蛋氨酸的氨基酸顺序是优选的，但也可用含有蛋氨酸和不含蛋氨酸产品的混合物。
按本发明，制备非糖基化重组人体IL2的方法包括：先用离液序列高的试剂将转化微生物体内以颗粒状累积的IL2溶于还原介质中进行提取，然后沉淀纯化，继之用反相高效液相色谱仪纯化，用酸洗脱。该方法的特征在于：a)如果必要，将上述色层中洗脱的主要馏分(含产品部分)于-20℃范围内冷冻，然后分离水相；b)分离的水相在酸性介质中稀释，然后在酸性介质中于另一反相高效液相色谱柱上层析，分离得到所述的IL2。
由于转化微生物(如E.coli)的高效率表达而产生的粒状重组IL2可用已知的方法溶于离液序列高的浓溶液(如6-8M的胍盐溶液)中，然后用反相高效液相色谱仪(下文简称RP-HPLC)纯化。所述RP-HPLC用商售得到的载体，最好是移植的硅胶如C3，C4，C8或C18，并用酸性洗脱剂(PH在1-4间)洗脱。柱上的IL2也可用梯度洗脱系统洗脱，该系统包括有机酸如乙酸或三氟乙酸(下文称TFA)及有机溶剂如乙腈。用分光光度计于280nm处检测洗脱液，含产品的主要馏分作为任意冷冻步骤的原料，该冷冻步骤是本发明方法的一部分。所谓冷冻是指将在环境温度下收集的所述主要馏份置于-20℃逐级降温的环境中，使之逐步形成含水固体相，通过倾倒可除去固体水相的上清液部分。以该方法分离得到的水相经稀释后，在下述酸性介质中用作RP-HPLC的原料，此乃本发明方法的一部分。所述水相的稀释是在酸性介质中进行的，该酸性介质的PH为1-4，最好为2-3。稀释后的水相于反相柱上层析，该反相柱用商售载体如移植硅胶C3，C4，C8或C18，这些载体具有适用于蛋白的适合的孔径，例如直径至少为150_，IL2的洗脱包括使用含与水混溶的低级醇和有机酸的浓度逐渐增加的梯度洗脱液。
本发明方法显而易见的特征在于任意冷冻步骤在含有约0.1％三氟乙酸的乙腈水溶液中进行；用有机酸如柠檬酸的水溶液进行稀释；和所述IL2在第二次色谱层析中是用含异丙醇，水和有机酸(如柠檬酸)的溶液洗脱的。所述含有约0.1％TFA的乙腈水溶液与第一次层析中洗脱的主要馏分是一致的，它是适合于本发明所述任意冷却步骤的优选混合物。最好水相的稀释在任意分离之后或在第一次层析之后立刻进行。稀释时，最好加入2倍体积的水，其中含有0.5-2％的有机酸如甲酸，乙酸，丙酸，三氟乙酸或柠檬酸，更优选的是加入2倍体积的含有0.5％柠檬酸的水。第二次色谱层析是本发明要求专利保护的方法的一部分，它包括将冷冻步骤之后分离得到的并经稀释的水相用于RP-HPLC层析，层析中使用商售载体如移植硅胶C3，C4，C8或C18，这些载体的孔径至少为150_。最好的载体是C4VYDAC300A移植硅胶，它有以共价链方式移植的丁基，孔径为300_，平均粒径为15-20微米。按本发明方法，用梯度系统进行洗脱，该系统含有醇如丙醇或异丙醇，有机酸如甲酸，乙酸，丙酸，三氟乙酸或柠檬酸。优选的混合物包括异丙醇，水和0.5-2％的柠檬酸，更优选的含0.5％的柠檬酸，并且用异丙醇浓度逐渐增加的梯度系统时，低馏分洗脱液中异丙醇含量为约48％，而高馏分洗液中异丙醇的含量为约59％，后一洗脱液中含有还原型非糖基化活性重组人体IL2。
本发明课题也涉及通过上述方法获得的还原型非糖基化重组人体IL2。
将得到的上述馏分静置于0°至-20℃，它在该温度范围内是稳定的。可通过减压共沸蒸馏除去异丙醇，将得到的溶液置于+4℃，或立即冻干分离出本发明的IL2。
本发明还涉及主要馏分不经过冷冻步骤和水相分离步骤的改进制备方法。
按本发明所要求保护的改进方法得到稀释的主要馏分，可将其置于+4℃，它是稳定的，并是第二次色谱层析的原料，所述第二次色谱层析是本发明要求保护的方法的一部分。
当有硫醇基存在时，按本发明得到的IL2有3个游离的巯基，对CTL1-2系的增生试验的特定活性为0.7-1.3×107U/mg，即相当于天然IL2的活性。这一活性是以与天然IL2的相同方式药用上述还原型非糖基化重组人体IL2的依据，利用它的免疫调节活性及抗肿瘤活性可以治疗许多疾病。所述免疫调节活性和抗肿瘤活性已有人描述过〔例如，参见Fletcher，M.et al.lymphokine Research 6(1987)47-57〕，它们包括：T淋巴细胞的增生，NK(天然杀手)细胞和LAK(激活的淋巴因子杀手)细胞的细胞毒性的诱导，细胞免疫性的恢复，在免疫缺陷中抗感染的保护作用或免疫的调节作用。可直接给药，或结合采用Rosenberg，SA等人描述的免疫治疗方法〔N.Engl·J·Med·(1985)313，1485-1492〕给药。
同使用天然IL2相同，按本发明得到的IL2可单独使用，或与其它免疫调节剂如干扰素α，干扰素γ和/或其它治疗剂合用。
本发明的非糖基化重组人IL2可用于制备以其作为主要活性成分的药用组合物。该组合物可以是液体或固体。本发明得到的IL2可接已知方法组方制备适用的药用组合物，在组合物中，IL2可与药学上可接受的载体结合。该组合物含有有效量的IL2和适量的适宜于人服用的载体。减压共沸蒸馏除去异丙醇后得到本发明的IL2酸性水溶液，将水溶性填充剂加入其中，并冰冻干燥可以得到组方物。填充剂指的是一种水溶性物质，该物质在混合物重新溶于水时不改变原来的PH值。可用的填充剂的例子是糖，如葡萄糖，核糖，蔗糖，麦芽糖，海藻糖或还原糖如甘露糖醇甘露糖醇是最好的。加入甘露糖醇的浓度取决于给药量，当本发明的IL2浓度为0.05-1mg/ml时，其加入浓度为10-50mg/ml，最好为50mg/ml。将该溶液在无菌和无氧条件下过滤，再分装入剂量瓶或冰冻干燥。冻干的混合物装于小瓶中，注射时用适合于非肠道给药的蒸馏水再配制。
本发明的组合物可以静脉注射或滴注给药，也可以经肌肉，腹膜，胸膜或皮下给药。本发明得到的组合物的有效剂量取决于给药的途径和要治疗的疾病，对成人和儿童而言，一般为1×106U/M2/24h至40×106U/M2/24h，最好在20×106U/M2/24h范围内。每天的剂量也取决于给药的持续时间，它不应受上述剂量的限制。
就灌注给药而言，药物组合物特别含有还原型非糖基化重组人IL2，水和有机酸如柠檬酸。这样的组合物可通过下法制得：在适宜的载体如葡萄糖的存在下，将本发明冻干的药用组合物溶解，所述载体的作用是使活性成份在灌注期间保持稳定。优选的条件在于先将蒸馏水注入冻干的混合物中配成溶液，然后将该溶液注入含葡萄糖液的灌注袋中，得到的稀释浓度为50mg/ml，该浓度适合于给药的剂量。
本申请的说明书中的参考文献包括了引用的全部出版物。
下述附图就本发明的某些方面作出解释。
图1a是实例1中于8M胍溶液中的粗提物的RP-HPLC色谱分析图；
图1b是还原型和氧化型IL2标准的RP-HPLC色谱分析图；
图2是重溶解的实例1样品的RP-HPLC色谱分析图；
图3是实例1中冷冻步骤后主要馏分的RP-HPLC色谱图；
图4是实例1中馏分“59”的RP-HPLC色谱分析图；
图5是实例2样品明胶电泳的SDS-PAGE图；
图6a和6b是实例2样品的多肽曲线图；
图7a和7b是实例2样品的DC曲线图；
图8是实例3样品对人淋巴细胞的促有丝分裂影响曲线；
图9是获得的关于K562和DAUDI细胞系的毒性曲线。
下述实例解释本发明而不是限制本发明。实施例1
该实施例的纯化原始记录详见本说明书第19页。
还原型生物活性r-hIl2粒状物的纯化
通过离心由质粒转化的E.coli菌株的培养物得到了粒状物，所述质粒含有天然IL2的密码并能够在细胞内按该密码累积IL2，例如参见Sato，T等人的描述〔J.Biochem(1987).101，525-534〕。于是将从10升发酵液中得到的细胞于Manton Gaulin匀浆器中打碎。从分离的和水洗的细胞残渣(湿重90-170g)中得到IL2，将其溶于2.5倍体积的Tris缓冲液(Hcl 20mM，PH8)中，该缓冲液含有8M胍盐酸盐(Gu，Hcl)和100mM二硫苏糖醇(DTT)。通过RP-HPLC分析估计IL2溶解量(1.5-2.5g)，所述RP-HPLC分析用C4VYDAC柱(0.46×15cm)300_，5微米，流速2ml/mn，用含0.1％TFA的乙腈线性梯度洗脱液(10分钟30-70％)，用分光光度计于280nm或210nm处检测，用标准IL2标定后计算280nm处的峰面积(图1a和1b)。然后在DTT存在下降低Gu.HCl的浓度至2M，使该IL2沉淀出来，用0.1％的TFA水溶液洗沉淀，直至上清液的PH＜5.0，然后将IL2沉淀溶于含20％乙腈和0.1％TFA的水溶液中。根据RP-HPLC分析(图2)，得到的重溶解物中还原型IL2的含量大于85％，其生物活性比还原型IL2纯品低0.01×107U/mg，其巯基含量为2.85SH/每分子还原型IL2。将重溶解得到的溶液的一部分(经RP-HPLC分析约含相当于200mg的IL2)稀释至乙腈浓度小于10％，TFA浓度为0.1％，然后将该稀释液用于C4VYDAC柱(5.7×30cm)上层析，用含0.1％TFA的乙腈线性梯度洗脱液(40分钟内从30％至80％)洗脱IL2，流速为100ml/mn，用分光光度计于280nm处检测，当乙腈浓度约为60％时有最大吸收峰，洗脱的IL2用RP-HPLC分析。将收集的含还原型IL2的“主要馏分”用于冷冻步骤，从室温冷至-20℃±1℃，使富含水和IL2的下层处于冻结状态。解冻后得到溶液，用2倍体积的0.5％柠檬酸水溶液稀释后将其用于C4VYDAC柱(5.7×30cm)上层析，用含0.5％柠檬酸的异丙醇线性梯度液(40分钟内从20％至70％洗脱，流速50ml/mn，用分光光度计于280nm处检测流出液，发现当异丙醇浓度为约48％时(馏分“48”)有最小吸收峰，而异丙醇浓度为约59％时(馏分“59”)有最大吸收峰(图3)。收集馏分“59”，在0℃隔绝空气保存至少24小时是稳定的。
通过减压共沸蒸馏除去异丙醇后，用RP-HPLC分析馏分“59”，得一单峰(图4)，它随约60％的乙腈流出，而参照物氧化型IL2随约57％的乙腈流出(图1b)。除去异丙醇后的馏分“59”，其中IL2的浓度大于1mg/ml，PH3±0.5，可隔绝空气于4℃保存至少一周，可直接冻干或配成药用组合物。按CTLL-2细胞繁殖的体外试验，给予冻干的馏分“59”，其生物活性为(1.3±0.5)×107U/mg，与天然IL2相同。
用二硫双吡啶的比色计方法测定，冻干的馏分“59”的巯基含量是2.94SH/mol，而氧化型参照物IL2为0.76SH/mol。
从10升发酵液得到的馏分“59”中，可制得还原型的r-hIL2，通过RP-HPLC分析其量为150-300mg，含3SH基团，具有生物活性，RP-HPLC图谱为单峰(按19页格式记录)。实例2
有生物活性的还原型r-IL2的纯化
除了主要馏分不经过冷冻步骤的倾倒分离，而直接用2体积0.5％柠檬酸水溶液稀释外，其余程序用实例1，按实例1收集和处理馏分“59”。实例3
有生物活性的还原型r-hIL2的理化特征
将按本发明在实例1馏分“59”中得到的还原型r-hIL2测定下列性质：
1)均一性
在含有10％SDS的两相(分别具有5％和15％丙烯酰胺的浓缩明胶和移动明胶)明胶上进行SDS PAGE电泳。先将样品于含有1％SDS和5％巯基乙醇的缓冲液中在100℃加热2分钟，然后与1％SDS缓冲液一起移动，用银着色，表明为单带，2ug沉淀物(图5)，纯度大于99％。
2)电泳测定分子量
在还原介质中测得的表观分子量(MW)约为15kd，与计算分子量一致(图5)。
3)氨基酸组成
将25ug本发明的还原型r-hIL2溶于0.5ml水中，并放于玻璃水解管中，加入5ml含有31.7％TFA和4.8％巯基乙酸的浓盐酸，真空下将该管密封，于155℃水解40分钟，将水解物减压蒸发至干，将残留物溶于0.7ml柠檬酸盐缓冲液(PH＝3)中，于Interaction AA 511柱(0.46×15cm)上进行氨基酸分析，该柱的PH梯度为3至5，含有Nacl的柠檬酸缓冲液(浓度0-70g/l)，柱温60℃，流速0.5ml/mn，在柱出口处样品变成邻苯二醛的衍生物后用荧光检测器检测，结果见表1，为两次水解的和2次层析的平均值，其氨基酸组成除N-端多-蛋氨酸外，与天然IL2的组成一致。
表 1
I N T E R L E U K I N 2氨基酸 理论值 测定值GIN+GLU 18 17.56ASN+ASP 12 12.61THR 13 12.09SER 8 7.05PRO 5 ND*GLY 2 2.59ALA 5 5.50VAL 4 4.34MET 5 5.59ILE 9 9.15LEU 22 19.96TYR 3 2.60PHE 6 5.90TRP 1 NC**LYS 11 10.19HIS 3 3.48ARG 4 5.29CYS 3 NC***ND＝未测定**NC＝未计算
4)N-端氨基酸顺序
用Edman自动降解法通过微程序分析3N-端氨基酸顺序：将本发明具有生物活性的还原型r-hIL2(15ug)用连接有HPLC120A的用于生物系统470A的气相微顺序分析仪分析，识别下列PTH氨基酸：
Stages PTH AA Stages PTH AA
1 Met 11 Thr
Ala
2 Ala 12 Gln
Pro
3 Pro 13 Leu
Thr
4 Thr 14 Gln
Ser
5 Ser 15 Leu
6 Ser 16 Glu
7 Ser 17 His
8 Thr 18 Leu
9 Lys 19 Leu
10 Lys 20 Leu
20个N-端残基的顺序与天然IL2的理论连接顺序一致。观察到约10％的IL2没有蛋氨酸。
5)具有溴化氰的肽图
将700ug本发明还原型IL2残留物(约53nmoles)溶于4ml甲酸(浓度70％)液中，并加入5.6mg溴化氰，室温搅拌过夜，用水稀释，冻干，用RP-HPLC分析，该分析用UBondapack C18柱(0.46×20cm)，用含0.1％TFA的乙腈梯度洗脱液(浓度变化为0-70％)洗脱，流速1ml/mn，温度为室温，用分光光度计于220nm处检测。还原型r-hIL2的肽图(图6a)表明：与作对照的氧化型IL2的肽图(图6b)比较具有不同的碎片。
6)圆二色性
在室温下用Jobin YVon MarkV光谱图测定圆二色性光谱(CD)。按实例1方法，样品经RP-HPLC层析之后用线性梯度异丙醇液(其中含0.5％的柠檬酸用0.1％的甲酸代替)洗脱，然后蒸去异丙醇，冻干得还原型r-hIL2样品，将该样品溶于乙酸中，浓度为1mg/ml。就肽吸收区(185-250nm)和芳香族吸收区(260-320nm)而言，使用的容器分别具有0.01cm和0.5cm厚。每个样品的溶剂吸收光谱从IL2的吸收光谱中扣除。结果以椭圆率0的形式给出(每个IL2残留物的平均重量＝116)。
图7a为远紫外区CD光谱：本发明具有生物活性的还原型r-hIL2的光谱表明有第二种结构顺序存在，α螺旋线率(％)的测定表明：与氧化型IL2对照相比几乎无明显差别(％α螺旋率#50％)。
图7b表明近紫外区的CD光谱：氧化型IL2(对照)的DC光谱表明对芳香残基的光谱而言具有明显的不对称性，而本发明的还原型r-hIL2不明显，但有差别。实例4
生物活性
用体外或体内实验评价本发明的还原型r-hIL2的生物活性。
1)对人细胞的活性
a.成淋巴细胞转化试验
除了对小鼠细胞系(如可进行IL2的生物测定的CTLL-2)有促增生活性外，通过对掺入ADN中氚标记的胸苷的测定(图8)表明：本发明的还原型r-hIL2对正常循环的人淋巴细胞具有促有丝分裂的作用，作用的大小取决于剂量，该作用与氧化型IL2(对照)的作用相同。
b)单核细胞的细胞毒性诱导
本实验按下述方法进行：将人循环单核细胞在IL2存在下保温，然后在4小时内通过测量Cr51的盐析来测定对癌变靶细胞的细胞毒性影响，所述癌变靶细胞是分别由B淋巴瘤(抗NK细胞)衍生的红白血病细胞系K562(对NK细胞敏感)和DAUDI细胞系。结果(用每106个细胞的溶解单位，即，UL/106表示)表明：对癌变靶细胞而言，本发明的还原型γ-hIL2能够增加NK的活性或诱导T淋巴细胞的细胞毒性，作用大小取决于剂量，该作用与天然IL2已知的作用相同(图9)。
2)对小鼠的体内活性(腹膜巨噬细胞的刺激作用)
对正常Balb/c和MRL-+/+小鼠连续腹膜内注射次最佳剂量(100-300U)的大鼠重组干扰素r，24小时后注射本发明的还原型r-hIL2，产生吞噬细胞的氧化机制，该机制通过下述方法评价：本发明的IL2注射24小时后杀死小鼠，从腹腔移出吞噬细胞，在佛波酯(phorbal ester，即PMA)的存在下测定化学荧光。其作用大小取决于剂量，该作用与用氧化型IL2(对照)时所观察到的相同。
结果如下：注射剂量 注射IL2后的化学荧光(CPM×10)(ng/每只小鼠) 还原型 氧化型0 5+2 4+31 7+3 5+13 90+5 71+510 130+10 140+7030 350+50 400+70100 710+20 695+25300 375+25 350+20实例5
注射药用组合物
将相当于本发明的馏分“59”减压共沸蒸馏除去异丙醇，得到 还原型r-hIL2的水溶液，立即用甘露醇水溶液稀释，比率为每毫升含100ug还原型IL2和每毫升含50mg甘露糖醇，所述甘露糖醇水溶液中的空气被氮气排出并用氮气将该溶液饱和。将上述稀释液用0.22u膜过滤，无菌下分装于小瓶中(每瓶1ml)，冻干，在氮气环境中封瓶，放于+4℃备用。实例6
连续灌注的药用组合物
将相当于本发明的馏分“59”减压共沸蒸馏，除去异丙醇，得到还原型r-hIL2的水溶液，立即用甘露糖醇水溶液稀释，比率为每毫升含500ug还原型IL2和每毫升含50mg甘露糖醇，所述甘露糖醇水溶液中的空气被氮气排出并用氮气饱和该溶液。将上述稀释液用0.22u膜过滤，无菌下分装于小瓶中(每瓶1ml)，冻干，在氮气环境下封瓶，放于+4℃备用。使用时向每瓶注入1ml无菌蒸馏水将其溶解，将相当于7瓶剂量的溶液(约35.166单位)注入含有500ml TravenolR葡萄糖溶液(5％灌注液)的ViaflaxR容器中。
记 录发酵
细菌残留物提取
用Manton Gaulin匀浆器打碎含产物的细胞
水洗
洗液溶于含胍的缓冲液中
提取
稀释含胍液使产物沉淀
用水/TFA洗涤
用乙腈/TFA重溶解层析
RP-HPLC C4乙腈/TFA梯度洗脱液
冷冻至-20℃
RP-HPLC C4异丙醇/柠檬酸梯度洗脱液
减压蒸馏除去异丙醇冻干
Claims (3)
1.制备非糖基化重组人体白细胞介素2(IL2)的方法，所述人体IL2，一方面具有下述氨基酸排列顺序，即X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His LeuLeu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu LeuLys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu AsnLeu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu TyrAla Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe CysGln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr其中X代表蛋氨酸或氢原子，位于58，105和125位的三个半胱氨酸均为还原型；另一方面在体外的CTLL-2细胞的增生试验中具有与同一氨基酸顺序的氧化型IL2相似的生物活性，氧化型IL2在58-105位有一双硫键桥；该制备方法包括，先将转化的大肠杆菌(E.coli)体内以颗粒状累积的IL2溶于含有二硫苏糖醇和胍盐的还原介质中进行提取，然后通过沉淀纯化，继之用反相高效液相色谱仪纯化，用含有三氟乙酸的酸性洗脱液洗脱；该制备方法的特征在于
a)将从上述色谱仪中洗脱出的主要液分不经过冷却或经过冷却至-20℃，而分离出水相，
b)用含有柠檬酸的酸性介质稀释该主要液分或所得的该水相，然后于另一反相高效液相色谱柱上层析，用含有柠檬酸的酸性介质洗脱，再分离出上述的IL2。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于稀释步骤在柠檬酸中进行；在第二次层析中，用异丙醇，水和柠檬酸的溶液将上述IL2洗脱下来。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于冷却步骤在含有0.1％三氟乙酸的乙腈水溶液中进行。
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