PT91295B - Processo para a preparacao de uma il/indice 2 humana recombinante nao glicosilada sob a forma reduzida - Google Patents

Processo para a preparacao de uma il/indice 2 humana recombinante nao glicosilada sob a forma reduzida Download PDF

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Philippe Riberon
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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 91 295
REQUERENTE: ROUSSEL-UCLAF,sociedade anónima francesa,in dustrial e comercial,com sede em 35,Bd des Invalides,75007 Paris, França.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA IL2 HUMA
NA RECOMBINANTE NÃO GLICOSILADA SOB A FORMA REDUZIDA
INVENTORES: Danielle LANDO,Philippe RIBERON e Pierre Yves ABECASSIS.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
França em 28 de Julho de 1988 sob o . .
88-10184.
INPI. MOD. 113 RF 16732
Descrição referente à patente de invenção de R0USSEL-UC1AP, sociedade anónima francesa, industrial e comercial, com sede em 35, Bd des Invalides, 75007 Paris, Prança, (invento res: Danielle LANDO, Philippe RIBERON e Pierre Yves ABECASSIS, residentes em Prança), para PROCESSO PARA A PREPARAgÃO DE UMA IB3 HUMANA RECOMBINANTE NÃO GLICOSILADA SOB A PORMA REDUZIDA.
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a um pro cesso para a preparação de uma Interleucina 2 humana recombinante, não glicosilada (designada por r-hILg), sob a forma reduzida, Biologicamente activa.
A IL2 humana natural qué é uma linfoci na que estimula a proliferação de células T activadas, possui 3 Cisteínas localizadas nas posições 58, 105 e 125 da sequência de amino ácidos da proteína. As cisteínas em 58 e 105 estão unidas por uma ponte de dissulfureto, enquanto que a cisteína em 125 tem um agrupamento sulfidrilo livre (Robb, Rj e col. Proc. Natl. Acad. Sei. Usa (1984) 81 6486-6490).
Descrevem-se processos para a prepara• ção da IL2 humana, de alelos ou de derivados, pela tecnologia . do ADN recombinante. Por exemplo, Taniguchi, T e col. Nature
PA
(1983) 302 305-310 e Devos, R e col. Nucleic Acids Research (1983) 11 4307-4323, descreveram a clonagem do gene da II2 mana e a sua empressão nos microorganismos, e Ju, C e col. J. Biol. Chem (1987) 262 5723-5731. obtiveram a expressão de deri vados recombinantes da IL2· Por outro lado sabe-se que, quando a IL2 se acumula no microorganismo no estado de grânulos insolúveis, encontra-se numa forma reduzida contendo 3 grupos tióis e é desprovida de actividade (pedido de patente japonesa J6 1257931). Admite-se assim que para dispor de uma IL2 activa era necessário proceder à oxidação da proteína reduzida acumulada nos grânulos. Para esse efeito, após dissolução da proteína num meio desnaturante, a formação da ponte de dissulfureto ^onveniente 58-105 que precisa de uma renaturação, era efectuada num meio oxidante controlado. Descrevem-se vários processos tais como a oxidação pelo oxigénio isolado (autooxidação ao ar) ou e em presença de iões cúpricos, ou de um oxidante fraco tal como um tiol ou ainda por uma mistura de tioldissulfureto (Tsuji, T e col. Biochemistry (1987) 26 3129-3134).
Após renaturação oxidante, é necessária uma purificação por cromatografia para eliminar os produtos de oxidação correspondentes à formação das pontes intramoleculares isómeras 58-125 e 105-125 assim como as pontes intermoleculares que se mostrou serem inactivas e poderem ser separadas por cromatografia em fase inversa segundo Wang, A e col. Science (1984) 224 1431-1433 ou Browing, JL e col. Anal Biochem (1986) 155 123-128).
A obtenção da IL2 recombinante oxidada homogénea com actividade biológica conveniente partindo da proteína acumulada sob a forma de grânulos, põe assim problemas técnicos, seja qual for o procedimento seguido, porque necessita de várias fases de purificação que conduzem a um abaixamento do rendimento no produto desejado.
processo de acordo com a invenção não necessita de fase de reoxidação para se obter um produto que apresenta a actividade biológica da ID2.
Um aspecto da invenção compreende um processo de preparaçao, a Interleucina 2 humana recombinante não glicosilada possuindo por um lado a sequência de aminoácidos seguintes:
X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu
His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser
Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn
Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Oys
Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg
Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
assim como os alelos ou derivados desta sequência na qual X .representa uma metionina ou um átomo de hidrogénio e em que as três cisteínas nas posições 58, 105 e 125 estão sob a forma re duzida, manifestando por outro lado uma actividade biológica comparável à da IL2 oxidada possuindo a mesma sequência e contendo uma ponte de dissulfureto na posição 58-105.
Em alelos e derivados, incluem-se as sequências modificadas por substituição, anulação ou adição de um ou vários aminoácidos diferentes das cisteínas 58, 105 125 desde que esses produtos conservem a actividade biológica característica da II2 reduzida. Conhece-se bem a obtenção dessas modificações no processo do ADN recombinante, por exemplo pelas técnicas de mutagénese dirigida que foram revistas por Lather, EP e Lecoq., JP em Genetic Engineering Academic Press (1983) 31-50 ou Smith, M e Gillam, S Genetic Emgineering Principies and Methods, Plenum Press (1981) 3 1-32. Por forma redu zida, entende-se que os resíduos de cisteína que contêm a IL2 contêm um agrupamento sulfidrilo livre em que se faz a determi nação, por exemplo, por espectrofotometria com a ditiodipiridi na como reagente dos tióis. A actividade biológica da forma re duzida obtida de acordo com a invenção é detrminada, comparati vamente à da forma oxidada correspondente contendo a ponte de disulfureto 58-105, medindo a proliferação das linhagens celulares leucémicas de ratos dependentes da IL2 CTLL-2, com um en saio colorimétrico com sal de tetrazólio (Mossmann, T J. Immunol Meth. (1983) 65 55-63).
A invenção compreende também um pro cesso para a preparação de uma IL2 humana recombinante não gli colisada possuindo por um lado a sequência de aminoácidos seguintes :
X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu
His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asr.
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Vai Ile Vai
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asj
Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
asiim como os alelos ou derivados desta sequência em que X representa uma metionina ou um átomo de hidrogénio e em que as três cistinas nas posições 58, 105 e 125 estão na forma reduzida, manifestando por outro lado uma actividade biológica de pelo menos 0,5 x 10 U/mg. Define-se a unidade de actividade da IL2 como a quantidade que produz 50$ da resposta máxima no ensaio. Utiliza-se como padrão um provete Biological Response Modifier program (BRMP) referência reagente humano IL2 (JurkatJ1 fornecido pelo National Institute of Câncer (NCI). A invenção compreende mais preeisamente um processo para a preparação da Interleucina 2 humana recombinante não glicosilada possuindo a sequência de aminoácidos seguintes:
X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu
His Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Vai
Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu
Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp
Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
na qual X representa uma metionina ou um átomo de hidrogéni
em que as três cisteínas na posição 58, 105 e 125 estão na forma reduzida e manifestam uma actividade biológica comparável à • da IL2 humana nativa. Por actividade comparável, entende-se a — mesma actividade específica que a da IL2 natural isolada das
- 4 07 Λ células leucémicas Jurkat isto é 1,5 x 10 U/mg (referência BRMP), ou una actividaee diferente no máximo de 25% desta actividade especifica. A sequência da IL2 reduzida obtida de acordo com a invenção tem eventualmente uma metionina N-terminal suplementar de acordo com 0 microrganismo transformado, tal como E. coli, na qual se exprime. Num modo de execução preferido do processo da invenção, prefere-se a sequência contendo uma metionina, mas pode-se igualmente utilizar uma mistura de produto contendo uma metionina com produto não contendo metionina ou 0 produto desprovido de metionina.
processo de acordo com a invenção para a preparação da ILg humana recombinante não glicolisada reduzida compreende em primeiro lugar a extracção da ILO acumu ~ ά — lada sob a forma de grânulos num microrganismo transformado pela solubilização num meio redutor com 0 auxilio de um agente caotropo, em seguida a purificação por precipitação seguida de uma cromatografia líquida de alto rendimento de fase inversa com um eluente ácido, caracterizado por:
a) submeter-se a fracção principal eluida da referida cromatografia a uma fase de arrefecimento a uma temperatura da ordem de -20°C, seguida de uma separação da fase aquosa que
b) se diluir num meio ácido, em seguida cromatografa-se sobre uma outra coluna de cromatografia líquida de alto rendimento em fase inversa num meio ácido e isola-se a referida II^·
A H12 recombinante produzida na forma de grânulos, graças a uma taxa de expressão elevada, por um microorganismo transformado tal como E. coli, pode ser, por processos bem conhecidos, solubilizada com a ajuda de uma solução concentrada de um agente caotropo tal como uma solução de sal * de guanidina 6 a 8 M, purificada em seguida por cromatografia líquida de alto rendimento em fase inversa (desgnada em seguida por RP-HPLC) com suportes disponíveis comercialmente, de preferência sílicas enxertadas tais como C5, C4, C8 ou C18, com nm eluente ácido com pH de 1 a 4. A IL2 pode ser eluida na coluna com 0 auxilio de um sistema de gradiente compreendendo nm ácido orgânico tal como o ácido acético ou 0 ácido trifluoroacético (designado em seguida por TEA) e um solvente orgânico tal como o acetonitrilo. A fracção principal em que se detecta a 280 nm \\ por espectrofotometria a eluição é a matéria prima para a fase de arrefecimento eventual que faz parte do processo da presente invenção. Entende-se por arrefecimento o facto de a referida fracção principal recolhido à temperatura ambiente ser colo cada num ambiente de temperatura da ordem dos -20°C que permite a formação progressiva de fases aquosa e sólida em que se pode eliminar a fracção sobrenadante por decantação. A fase aquosa assim eventualmente separada serve, apóe diluição, como matéria prima para a RP-HPLC num meio ácido descrito a seguir que faz parte do processo da invenção. A diluição da fase aquo sa é realizada em meio ácido com pH de 1 a 4, de preferência de 2 a 3. Cromatografa-se a fase aquosa diluida numa coluna de *£ase inversa utilizando os suportes disponíveis comercialmente tais como sílicas enxertadas C3, 04, C8 ou C18 possuindo poros de tamanho conveniente para a utilização com proteínas, por exemplo com um diâmetro de pelo menos 150 A. A eluição da Ιΐ£ compreende a utilização de um gradiente de concentração crescente de um álcool inferior miscível com a água e contendo um ácido orgânico.
processo da invenção é nomeadamente caracterizado por a fase de arrefecimento eventual se efectuar numa solução aquosa de acetonitrilo contendo pelo menos 0,1% de ácido trifluoroacético, em que a diluição se efectua com o auxílio de uma solução aquosa de um ácido orgânico tal como o ácido cítrico e por a referida II^ ser eluída na segunda cromatografia, com o auxilio de uma solução contendo isopropanol, água e um ácido orgânico tal como o ácido cítrico. A solução aquosa de acetonitrilo contendo cerca de 0,1% de TEA, que é a mistura preferida submetida à fase eventual de arrefecimento de acordo com a invenção, corresponde à fracção princi pal eluida da primeira cromatografia. Muito preferivelmente, efectua-se imediatamente a diluição da fase aquosa, seja depois da separação eventual, seja depois da primeira cromatografia. Faz-se esta diluição por adição, de preferência w de pelo menos 2 volumes de agua contendo de 0,5 a 2% de um ácido orgânico tal como o ácido formico, acético, propiónico, trifluoroacético ou cítrico, mais preferivelmente pela adição de cerca de 2 volumes
de água contendo 0,5$ de ácido cítrico. A segunda cromatografia, que faz parte do processo reivindicado da invenção, consiste em submeter a fase aquosa eventuaimente separada após a fase de arrefecimento seguida de eluição, a uma RP-HPLC utilizando suportes comercialmente disponíveis tais como sílicas en xertadas C5, C4, C8 ou G18 com diâmetro de poros de pelo menos o ,
150 A· 0 suporte preferido e uma silica enxertada C4 VYDAC 300
X que é um gel de sílica que tem grupos butilo enxertados de Λ o forma covalente, em que os poros tem um diâmetro de 500 A e em que as partículas têm um tamanho médio de 15 a 20 micrómetros. A eluição da II^ de acordo com o processo da invenção realiza-se com o auxílio de um sistema de gradiente compreendendo um álcool tal como o propanol ou o isopropanol e um ácido orgânico tal como 0 ácido fórmico, acido acético, ácido propiónico, ácido trifluoroacético ou ácido cítrico. A mistura preferida compreende isopropanol, água e ácido cítrico de preferência de 0,5 a 2$, muito preferivelmente 0,5$ e permite, com o auxilio de um sistema de gradiente de concentração crescente de isopro panol, a eluição de uma fracção menor de pelo menos 48$ de iso propanol seguido de uma fracção maior de pelo menos 59$ de iso propanol, compreendendo esta última a II^ humana recombinante não glicosilada activa numa forma reduzida.
A invenção tem iguaimente por objectivo a IL2 humano recombinante não glicosilada numa forma redu zida susceptível de se obter pelo processo descrito abaixo.
Rode-se conservar a referida fracção obtida entre 0°C e -20°C. Ela é estável nestas condições. Pode -se iguaimente eliminar 0 isopropanol por destilação azeotrópi ca sob vazio. Pode-se conservar a solução obtida a + 4°C ou isolar-se directamente a IL£ da presente invenção por liofilização.
A invenção compreende iguaimente uma variante do processo no qual não se submete a fracção principal à fase de arrefecimento e de separação da fase aquosa.
A fracção principal diluída, obtida de acordo com a variante reivindicada do processo da invenção pode-se conservar eventuaimente a +4°C. Ela é estável e consti tui a matéria prima para a segunda cromatografia que faz par- 7 -
te do processo reivindicado da invenção.
Quando se doseiam os grupos tióis, a
IL2 obtida de acordo com a invenção apresenta 5 agrupamentos sulfidrilo livres e manifesta uma actividade especifica de 0,7 a 1,5 χ 107 U/mg no ensaio de proliferação das linhagens CTLL-2, isto é comparável à da IL2 nativa. Esta actividade jus tifica a utilização da IL2 humana recombinante não glicolisada numa forma reduzida tal como acima descrita a título de medica mento da mesma maneira que a IL2 nativa, numa variedade de indicações que utilizam a sua actividade imunomoduladora assim como a sua actividade anti-tumoral que foram descritas por exemplo por Plechter, M e col. Lymphokine Research 6 (1987)
47-57 e que compreende por exemplo, a proliferação dos linfóci — tes T, a indução da citotoxicidade das células NK (mortíferas naturais natural killer) e das células LAK (mortíferas activadas pela linfocina lymphokine activated killer), a restauração da imunidade celular, um efeito protector contra a infec ção nos casos de deficiência imunitária ou um efeito adjuvante em vacinas. A administração pode ser directa ou pode ser antes uma administração associada ao método da imunoterapia adoptiva que foi descrito por Rosemberg, SA e col. na Engl. J. Med. (1985) 515 1485-1492.
Tal como a IL2 nativa, a IL2 obtida de acordo com a invenção pode ser utilizada sozinha ou em asso ciação com outros agentes imunomoduladores tais como o interfe rão alfa, interferão gama, e ou outros agentes terapêuticos.
A II2 humana recombinante não glicolisada na forma reduzida pode ser utilizada para preparar composições farmacêuticas que a contêm a título de principio acti vo.
A composição pode ser sólida ou líqui da. A Il2 da presente invenção pode ser formulada de acordo com processos conhecidos para preparar uma composição famacêutica útil na qual a IL2 se combina com um veículo de suporte farmaceuticamente aceitável. Esta composição contem uma quanti dade eficaz de IL2 com uma quantidade apropriada do veículo conveniente à ddministração doméstica. Pode-se obter a formula ção a partir de uma solução aquosa ácida de IÍJ2 da invenção
após eliminação do isopropanol por destilação azeotrópica em vazio ao qual se adiciona um agente de carga solúvel na água e liofiliza-se. Por agente de carga, entende-se uma substância solúvel na água que não modifique o pH inicial assim que a mis, tura se reconstitua. Exemplos de agentes de cargas que se podem adicionar são os açúcares tais como glicose, ribose, sacarose, maltose, tréhalose”, ou os açucares reduzidos tal como o manitol. Prefere-se o manitol. Adiciona-se o manitol na concentração de 10 a 50 mg/ml, de preferência na ordem de 50 mg/ml, quando a concentração da IL2 8a presente invenção está compreendida entre 0,05 θ 1 mg/ml, de acordo com a dose a admi nistrar. Reparte-se em frascos de dose a solução que se filtrou esterilmente na ausência do oxigénio e liofiliza-se. Pode-se reconstituir a mistura liofilizada por injecção, no frasco, de água destilada conveniente para injecção parentérica.
A composição de acordo com a invenção pode ser administrada por via intravenosa em bólus ou em perfusao contínua, por via intramuscular, intraperitoneal, intrapleral ou sub-cutânea. A dose eficaz de IL2 8e acordo com a invenção, que depende da via de administração e da doença a tratar, está compreendida geralmente entre 1 x 10 U/M /24 h
2 6 e 40 x 10° U/M /24 h, de preferência da ordem de 2o x 10°
U/M /24 h que para adultos quer para crianças. A dose diária depende também da duração da administração e não se pode limitar às doses descritas acima.
Para uma administração em perfusão, a composição farmacêutica contem particularmente II^ humana re combinante não glicolisada na forma reduzida, água e um ácido orgânico tal como o ácido cítrico. Pode-se obter essa composição a partir da composição farmacêutica liofilizada da invenção que se dissolve na presença de um veículo apropriado que contribui para a estabilidade do principio activo durante a perfusão, por exemplo glicose. As .condições preferidas consistem em diluir a mistura liofilizada reconstituída por injecção de água destilada, introduzindo num vaso de perfusão contendo um volume de glicose, na concentração de 50 mg/ml, de terminada como conveniente para a dose a administrar.
Todas as publicações citadas são in- 9 -
corporadas, por referência, no texto do presente pedido.
As figuras em anexo ilustram alguns aspectos da invenção:
A figura la. é um cromatograma de RP-HPLC analítico do extracto bruto de guanidina 8M do exemplo
1.
A figura ib. é um cromatograma de RP-HPLC analítico das IL2 padrão reduzida e oxidada.
A figura 2 é um cromatograma de RP-HPLC analítica da ressolubilização” do exemplo 1.
A figura 3. é um cromatograma de RP-HP1C da fracção principal” após a fase de arrefecimento do ^xemplo 1.
A figura 4. é um cromatograma de RP-HPIC analítica da fracção ”59” do exemplo 1.
A figura 5· é o protocolo da purifi-?
cação do exemplo 1.
A figra 6 é o gel de electroforese
SDS-PAGE do exemplo 2.
As figuras 7a e 7b são as cartas pep tídicas do exemplo 2.
As figura 8a e 8b são as curvas de
DC do exemplo 2.
A figura 9 θ a curva de efeito mitogénico sobre os linfócitos humanos do exemplo 3A figura 10 é a curva de toxicidade obtida das linhagens 30 K 562 e DAUDI.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem contudo a limitarem.
Exemplo 1: purificação da r-hIL2 reduzida biologicamente activa a partir de grânulos.
Os grânulos são obtidos por centrifu gação de culturas de uma estirpe de E. coli transformada com a ajuda de um plasmídio compreendendo a sequência codificando pa ra a IL2 nativa e susceptivel de acumular a IL2 nesta forma no interior das células, tal como descrito por exemplo por Sato,
T e col. J. Biochem (1987) 101 525-534. As células assim obti- 10 —
I ί
das de um fermentador de 10 litros são submetidas a uma desintegração num homogeneizador de Manton Gaulin. A partir dos resíduos celulares isolados e lavados (90-170 g em peso húmido) a IL2 é solubilizada em 2,5 volumes de um tampão Tris, HCl 20 mM pH 8 contendo cloridrato de guanidina (Gu,HCl) 8M e Ditiotreitol (DTT) 100 mM. A quantidade de IL2 solubilizada (1,5 a
2,5 g) é estimada por RP-HPLC analítica numa coluna 04 VYDAC o .
(0,46 x 15 cm) 500 A, 5 micrometros, num caudal de 2 ml/mn, com um gradiente linear de acetonitrilo (50 a 70% em 10 minutos) contendo 0,1% de TPA, uma detecção espectrofotométrica a 280 nm ou 210 nm, na qual se avalia a superfície do pico a 280 nm após calibração com um padrão de IL2 (fig· la e fig. lb). A ,JL2 é em seguida precipitada por abaixamento a 2M da concentra ção em Gu, HCl, na presença de DTT. Após lavar o precipitado com o auxílio de uma solução aquosa de TPA a 0,1% até se obter um pH do sobrenadante inferior a 5,0. A IL2 é solubilizada numa solução aquosa a 20% de actonitrilo e 0,1% de TPA. A ressolubilização obtida, que contem, segundo a RP-HPLC analítica (fig. 2), um teor em IL2 reduzida superior a 85%, 1em uma actividade biológica inferior a 0,01 x 10' U/mg da IL2 reduzida e um teor em agrupamentos sulfidrilo de 2,85 SH/mole de IL2 redu zida. Uma fracção da solução obtida, correspondente a cerca de 200 mg da IL2 estimada por RP-HPLC analítica, é diluída de maneira a ajustar a concentração de acetonitrilo inferior a 10% no TPA a 0,1%, seguido da aplicação a uma coluna C4 VYDAC (5,7 x 50 cm). Elui-se a IL2 num caudal de 100 ml/mn, com o auxilio de um gradiente linear de acetonitrilo (50 a 80% em 40 minutos contendo 0,1% de TPA, a uma concentração de cerca de 60% de acetonitrilo num pico maior detectado por espectrofometria de 280 nm e analisado por RP-HPLC. A fracção principal recolhida que contem a IL2 reduzida é em seguida submetida a um fase de arrefecimento lento, entre a temperatura ambiente e -20°C + 1°C, que permite eliminar por decantação uma fase orgânica superior rica em acetonitrilo. A fase inferior, rica em água e contendo a IL2, pode ser conservada no estado de congelação. Após descongelação, a solução obtida é, após diluição com 2 vo lumes da solução aquosa do ácido cítrico a 0,5%, aplicada a
uma coluna 04 VYDAC (5,7 x 30 cm) que se revela com um gradien te linear de isopropanol (20 a 70% em 40 minutos) contendo 0,5% de ácido cítrico, num caudal de 50 ml/mn 0 efluente, seguido de espectrofotometria a 280 nm, mostra a eluição sucessiva de um pico menor a concentração de cerca de 48% de isopropanol (fracção ”48’') e de um pico maior na concentração de cerca de 59% de isopropanol (fracção ”59) (fig· 3). Recolhe-se a fracção 59”. Ela é estável à conservação à temperatura de 0°C durante pelo menos 24 h, ao abrigo do ar.
Após eliminação do isopropanol por destilação azeotrópica em vazio, a fracção ”59” é analisada em RP-HP1C analítica e produz um pico homogéneo (fig. 4) eluido a cerca de 60% de acetonitrilo enquanto a IL9 oxidade de re ferência se elui a cerca de 57% de acetonitrilo (fig. ih). A fracção ”59” que, após a eliminação do isopropanol, tem uma con centração em IL2 superior a 1 mg/mL e um pH de 3 + 0,5, pode-se conservar à temperatura de +4°C, ao abrigo do ar, durante pelo menos uma semana ou pode ser imediatamente liofilizada ou formulada para a obtenção de uma composição farmacêutica. A fracção ”59” liofilizada é doseada em actividade biológica, se gundo o ensaio in vitro da proliferação de células CTLL-2, e tem uma actividade específica de 1,3 + 0,5 x 10 U/mg comparável à da Il2 nativa.
teor em agrupamentos sulfidrilo li vres da fracção ”59” liofilizada, determinada pelo processo c£ lorimétrico à ditiodipiridina, é de 2,94 SH/mole comparativamente a 0,76 SH/mole para a Il2 oxidada de referência.
150 a 300 mg titulados por RP-HPLC analítica de r-hIL reduzida, contendo 3 agrupamentos SH, biolt) gicamente activos, homogéneos em RP-HELC, são obtidos na fracção 59 a partir de um fermentador de 10 litros (de acordo com o esquema do protocolo da fig. 5).
Exemplo 2; purificação da r-IL2 reduzida biologicamente activa.
Opera-se como no exemplo 1, com a ex cepção de não se submeter a fracção principal à fase de arre fecimento depois da separação por decantação, mas dilui-se ime diatamente em 2 volumes de solução aquosa de ácido cítrico a
- 12 0,5%. Recolhe-se a fracção ”59 e trata-se como no exemplo 1. Exemplo 3: caracterização fisicoquímica da r-IL2 reduzida biologicamente activa.
A r-IL2 reduzida obtida de acordo com a invenção na fracção 59” do exemplo 1 é examinada para determinar as seguintes propriedades:
1) Homogeneidade
A electroforese SDS PAGE é efectuada sobre um gel de duas fases (gel de concentração e gel de migra ção respectivamente a 5% θ 15% de acrilamida) contendo 10% de SDS. A amostra é aquecida previamente durante 2 mn à temperatu ^a de 100°0 num tampão de 3% de SDS e 5% de mercaptoetanol.
A migração com um tampão a 1% de SDS é seguida de uma coloração prateada que revela uma única banda correspondente a uma pureza superior a 99% para um depósito de 2 ug (fig. 6).
2) Peso molecular por electroforese
Num .meio redutor, determina-se um PM aparente de cerca de 15 kd, de acordo com o PM calculado de 15420 (fig. 6).
3) Composição em aminoácidos
Uma amostra, contendo 25 ug da r-hlLreduzida da invenção em 0,5 ml de água, é colocada num tubo pa ra a hidrólise em vidro ao qual se adicionam 0,5 mL de ácido clorídrico concentrado a 31,7% de TPA e 4,8% de ácido tioglic£ lico. 0 tubo é selado em vazio, e depois a hidrólise é efectua da a 155°G durante 40 min. 0 hidrolisado é em seguida evaporado à secura sob pressão reduzida. Dissolve-se o resíduo em 0,7 mL de tampão de citrato pH=3, e depois submete-se à análise em aminoácidos numa coluna Interaction AA 511 (0,46 x 15 cm) com o auxilio de um gradiente de pH (3 a 5) e de cloreto de sódio (o a 70 g/1) no tampão de citrato, à temperatura de 60°C, a um caudal de 0,5 ml/mn e uma detecção por fluorescência, após a derivação de ortoftaldeído à saída da coluna. Os resultados são indicados na Tabela 1. Os valores são a média obtida por 2 hidrólises repetidas e 2 cromatografias respectivamente repetidas. A composição está de acordo com a da IL2 nativa com uma metionina N terminal suplementar.
TABELA 1
INTERLEUCINA2
Aminoácidos Numero teórico Numero determinado
GLN + GLU 18 17,56
ASN + ASP 12 12,61
THR 13 12,09
SER 8 7,05
PRO 5 ND*
GLY 2 2,59
ALA 5 5,50
VAL 4 4,34
MET 5 5,59
ILE 9 9,15
LEU 22 19,96
TYR 3 2,60
PHE 6 5,90
TRP 1 NC**
LYS 11 10,19
HIS 3 3,48
ARG 4 5,29
CYS 3 NC**
ND = não detectado
NC = nao calculada
4) Sequência em aminoácido N terminal
A sequência N terminal é identificada por microsequencia utilizando o processo automático de degra dação de Edman : a análise de 15 /xg de r-hIL2 reduzida, biologi camente activa de acordo com a invenção, num microsequecnciador de fase de gás de Applied Biosystems 470A em conjunto com a HPLC 120A, permite a identificação dos PHT aminoácidos seguin14
tes:
Pases PTH .AA Pases PTH AA
1 Met Ala 11 Thr
2 Ala Pro 12 Gin
3 Pro Thr 13 Leu
4 e» Thr Ser 14 Gin
5 Ser 15 Leu
6 Ser 16 Glu
7 Ser 17 His
8 Thr 18 Leu
9 Dys 19 Leu
10 Lys 20 Leu
A sequência dos 20 resíduos terminais-N esta de acordo com a ordem de cadeia teórica da IL2 nativa. Observam-se cerca de 10% da IL2 sem metionina.
5) Carta peptídica ao brometo de cianogénio
Dissolvem-se 700 ug de IL2 neduzida de acordo com a invenção (cerca de 53 nmoles) em 4 ml de ácido fórmico a 70% e adicionam-se a 5,6 mg de brometo de cianogéno. Agita-se a solução durante uma noite à temperatura ambiente, dilui-se em água e depois liofiliza-se. Analisa-se a mistura reaccional por RP-HPLC numa coluna uBondapack C18 RP (0,46 x 20 cm), com o auxilio de um gradiente de concentração de acetonitrilo variando de 0 a 70% contendo 0,1% de TPA, a um caudal de 1 ml/mn, à temperatura ambiente e com uma detecção espectrofotométrica a 220 nm. A carta peptídica da r-Kllp ne- 15 duzida (fig. 7a) mostra uma fragmentação diferente da IL2 oxidada de referência (fig. 7b).
6) Dicroismo circular
Os espectros de dicroismo circular (DC) são determinados à temperatura ambiente num espectrógrafo Jobin Yvon Mark V. A amostra de r-hIL2 reduzida, liofilizada após a realização RP-HPLC com um grdiente linear de isopropanol em que se substitui o ácido cítrico a 0,5$ de acordo com o exemplo 1, pelo ácido fórmico a 0,1$, seguido de destilação do isopropanol e liofilização, é levado de novo à concentração de 1 mg/ml em ácido acético. As cuvas utilizadas são de 0,01 cm e 0,5 cm respectivamente para a região peptídica (185-250 nm) e .a região aromática (260-520 nm). 0 espectro do solvente é subtraído do espectro da IL2 em cada amostra. Os resultados são dados por elipticidade 0 (peso médio por resíduo de IL2 = 116).
A figura 8a mostra o espectro DC nos UV longínquos j a r-hIL2 reduzida biologicamente activa de acordo com a invenção, tem um espectro que indica a presença de uma estrutura secundária ordenada. A determinação das $ de hélice alfa mostra pouca diferença significativa com a IB2 oxidada de referência ($ hélice alfa ff 50 $).
A figura 8b mostra o espectro DC num UV próximo: A IL2 oxidade de referência tem um DC significativo que indica um ambiente assimétrico para os resíduos aromáticos, enquanto a r-hIL2 reduzida da invenção tem um DC pouco significativo mas diferente.
Exemplo 4: actividade biológica
A eficácia biológica da r-hll2 reduzida da invenção é avaliada em experiências in vitro ou ex vitro 1) Actividade in vitro sobre células humanas
ã.» ensaio da transformação linfoblástica
Para além da actividade proliferadora sobre linhagens celulares de ratos tais como CTLD-2 que permite a dosagem biologica da Il2, a r-hll2 reduzida da invenção manifesta um efeito mitogenico, dependente da dose, comparável a demonstrada pela IL2 oxidada de referência sobre os linfócitos humanos circulantes normais, demonstrada pela medida da incorporação de timidina tritiada no ADN (fig. 9).
b. indução da citotoxidade das células mononucleadas estudo é realizado com células mononucleadas circulantes humanas incubadas na presença da IL2 θ em que se determina o efeito citotóxico de células alvo tumorais, respectivamente a linhagem eritroleucémica K 562 (sensível às células NK) e a linhagem DAUDI derivada de um linfoma B (resistente às células NK), medindo da libertação de Cr 51 em 4 horas. Os resultados, expressos em unidades líticas por 10 células (Ul/ΐΟθ), mostra que a Il2 reduzida da invenção manifesta uma capacidade, dependente da dose, respectivamente para aumentar a actividade NK ou para induzir a citotoxicidade dos linfócitos T dos alvos tumorais, de maneira comparável à conh£ cida para a IIO nativa.
2) Actividade ex vivo no rato (estimulação de macrófagos peritoneais
No rato normal Balb/c e MRL-+/+ a in jecção intraperitoneal sucessiva do interferão gama recombinan te de ratazana em doses subóptimas (100 a 3000 U), seguido de 24 horas mais tarde, de IL2 reduzida da invenção, actua os mecanismos oxidantes das células fagocitárias, avaliadas por medida da quimioluminescência, na presença do éster de forbol (PMA), das células retiradas da cavidade peritoneal de ratos sacrificados 24 h após a injecção de IL2· 0 efeito, dependente da dose, é comparável ao observado com a ΤΤ·2 oxidade de referência.
Resultados:
Dose Injectada 1 (ng por rato) 1 1 Quimioluminescência (CPM x 10^) após injecção de r-hll2
Reduzida Oxidada
0 5+2 4 ± 3
1 1 7 ± 3 5+1
5 | 90 + 5 71 + 5
10 130 + 10 140 + 70
30 i 350 + 50 400 + 70
100 710 + 20 695 + 25
300 _ 375 + 25 350 + 2o
_ 17
Exemplo 5: composição farmacêutica para injecção
A solução aquosa de r-hIL2 reduzida correspondente à fracção 59’1 da invenção em que se eliminou o isopropanol por destilação azeotrópica em vazio é extemporânea mente diluida com o auxilio de uma solução aquosa de manitol desgasificado e saturado em azoto, à razão de 100 }ig de IL2 reduzida/ml e 50 mg/ml de manitol. Após filtração sobre uma membrana de 0,22 um, repartição estéril de 1 ml nos frascos e liofilisação, os frascos são fechados numa atmosfera de azoto e conservados a uma temperatura de +4°C antes de se utilizarem Exemplo 6; Composição farmacêutica para perfusão contínua
A solução aquosa de r-hIL2 reduzida correspondente à fracção 59 da invenção em que se eliminou 0 «S» , z isopropanol por destilação azeotropica em vazio e extemporânea mente diluída com o auxílio de uma solução aquosa de manitol desgasificado e saturada em azoto, à razão de 500 ug de IL2 re duzida/ml e 50 mg/ml de manitol. Após filtração numa membrana de 0,22 )im, repartição estéril de 1 ml nos frascos de liofilização, os frascos-dose são fechados numa atmosfera de azoto e conservados à temperatura de 4°C, antes de se utilizarem. 0 conteúdo de cada frasco é em seguida dissolvido por injecção com 1 ml de água destilada estéril. As soluções correspondentes a 7 frascos-dose (cerca de 35,16 unidades são introduzip das num recipiente Viaflex contendo 500 ml de solução para p
perfusão Travenol Glicose a 5$.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - lã Processo para a preparação da Interleucina 2 humana recombinante não glicosilada contendo por um lado a sequência seguinte de aminoácidos:
    X-Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu
    His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr bem como os alelos ou derivados desta sequência na 1 qual X re-
    presenta uma metionina ou um átomo de hidrogénio e em que as três cisteinas na posição 58, 105 e 125 se encontram sob a for ma reduzida, manifestando por outro lado uma actividade biológica comparável a da 11^ oxidada contendo a mesma sequencia e contendo uma ponte de dissulfureto na posição 58-105, compreen dendo em primeiro lugar a extracção da IL2 acumulada sob a for ma de grânulos num microrganismo transformado por solubilização em meio redutor com o auxílio de um agente caotropo, em se guida a purificação por precipitação seguida de cromatografia líquida de alto rendimento em fase inversa com um eluente ácido, caracterizado por:
    (a) submeter-se a fracção principal eluida da referida cromato. grafia a uma fase de arrefecimento a uma temperatura da ordem de -20°C, e depois a uma separação da fase aquosa que (b) se dilui em meio ácido, e em seguida se cromatografa numa outra coluna de cromatografia líquida de alto rendimento em fa se inversa em meio ácido e isolar-se a referida IL2·
    - 2s Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fase de arrefecimento ser efectuada numa solução aquosa de acetonitrilo contendo cerca de 0,1% de ácido trifluoroacético, e a diluição ser efectuada com o auxílio de uma solução aquosa de um ácido orgânico como por exemple o acido cítrico e por a referida IL2 ser iluida na segunda cromatografia, com o auxilio de uma solução contendo isopropanol, água e um ácido orgânico como por exemplo o ácido cítrico.
    - 3§ _
    Processo de acordo com as reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por não se submeter a fase principal à fase de arrefecimento e separação da fase aquosa.
    - 4ê _ ·*» Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se obter um produto ma nifestando uma actividade biológica de pelo menos 0,5 x 10 U/mg.
    - 5ê Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se obter um produto ma nifestando uma actividade biológica comparável à da Il2 humana nativa.
    - 6â Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto quando preparado de acordo com a reivindicação 1, sob uma forma adequada à sua utilização, em associação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitá- 7ê Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 3, sob uma forma adequada à sua utilização, em associação com um veículo ou diluente farma ceuticamente aceitáveis.
    - 8» ** Processo de acordo com as reivindica çoes 6 ou 7, caracterizado por se adicionarem também água e um ácido orgânico como por exemplo o ácido cítrico.
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