PT85538B

PT85538B - Processo para a preparacao de fragmentos de interferon imunogenicos recombinantes homogeneos

Info

Publication number: PT85538B
Application number: PT85538A
Authority: PT
Inventors: Reiner Gentz; Heinz Dobeli; Erich Hochuli
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-13
Publication date: 1990-06-29
Also published as: NO873389D0; DE3773295D1; JPS6349098A; FI873512A0; IE60670B1; IL83474A0; FI873512A; EP0256424A1; ZA875819B; HU202920B; IE872160L; GB8619725D0; NO873389L; KR880002996A; AR244808A1; HUT47148A; AU7668687A; PH27432A; NO174631C; GR3003417T3

Description

A presente invenção refere-se a fragmentos de interferão imune humanos recombinantes homogéneos que possuem entre 6 a 11 aminoácidos anulados no terminal carboxi como comparado com inter ferão imune humano recombinante maduro de comprimento completo (indica-se a sequência de aminoácidos na Fig, 1), A presente invenção também se refere a veículos de expressão microbiana replicáveis que incluem uma sequência nucleotídica que codifica um fra£ mento de interferão imune recombinante definido anteriormente, a microorganismos transformados com estes veículos de expressão e a processos para a preparação dos referidos fragmentos de interferão e dos referidos microorganismos, A presente invenção ainda se re fere a composições farmacêuticas que contêm um ou mais destes fra. gmentos de interferão imune recombinante e ã utilização destes fragmentos de interferão imune recombinante e das composições far macêuticas para o tratamento de varias condições de doença, interferão imune humano natural (IFN-^) e produzido por estimulação mitogenica dos línfÕcitos, Aquele exibe actividade anti-viral e anti-proliferativa. Esta actividade e lãbil a um pH de 2, A forma funcional do interferão imune pode ser um multímero, mais provavelmente um dímero, um trímero ou um tetramero (Pestka et al., J. Biol, Chem. 258» 9706-9709 1983 ),

Verificou-se que o interferão imune ê codificado no genoV 2 Τ

ma humano por um gene único que codifica para um precurssor poM péptidico com 166 resíduos de aminoacidos, (Derynck et al, Nucleic Acj_ ds Res.[_o_s 3605-361 5,/1982/). Acredita-se que o processamento põs-tradução resulta num polipêptido que compreende 146 aminoãcidos que têm uma sequência N-terminal Cys-Tyr-Cys-Gln-,,.

Utilizando-se métodos de tecnologia recombinante de DNA (ver por exemplo Maniatis et al , Molecular Cloning - A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) foram construídos vectores de expressão que codificam este interferão imune recombinaji te os quais compreendem 146 aminoacidos. Apos introdução destes vectores de expressão num hospedeiro microbiano, os polipéptidos do interferão imune recombinante, constituídos por 147 aminoacidos, nomeadamente os 146 aminoacidos referidos anteriormente e uma metionina N-terminal adicional são sintetizados. A metionina adicional e proveniente do sinal AVG de iniciação da tradução do mRNA que codifica para o aminoácido metionina, No gene humano original este sinal de iniciação da tradução está -situado em frente do peptido sinal. Este peptido sinal ê cindido apos o processo de pós tradução, conjuntamente com a metionina provenieri te do sinal de iniciação da tradução que conduz ao interferão imu ne maduro isento de metionina constituído por 146 aminoacidos , Hospedeiros procarioticos são capazes de cindir o peptido sinal em frente do polipeptido precursor do interferão imune humano, na posição correcta, Portanto, a sequência codificadora para o peptj_ do sinal no gene do interferão imune tem que ser removida por meio í

de engenharia genética com o fim de exprimir o interferão imune na forma madura,

codão ATG directamente em frente da sequência codificadora para o polipéptido maduro resulta na metionina do N-terminal presente no interferão imune humano recombinante, Apesar da metionina do N-terminal adicional e apesar do facto de não ser glícosilado, o interferão imunesrecombinante exibe actividade anti-viral e anti-proliferativa ligada com a labilidade a pH2 comparável com o interferão imune isolado a partir de linfócitos humanos (Gray et al,, Nature 295 , 503-508 /Ϊ982/), Pósteriormente em Riji derknecht et al., (J. Biol. Chem, 2-59, 6790-6797 /1 984/), mostrou que interferão imunes purificado de linfocítos de sangue periférico humano induzido consiste num polipéptido que possui 143 resíduos de aminoãcidos sem a sequência Cys-Tyr-Cys- e possui um re siduo de piroglutamato no seu N-terminal , Observou^se no terminal carboxilico alguma heterogeneidade.

Utilizando-se novamente técnicas de engenharia genética o gene do interferão imune recombinante original conduziu a vectores de expressão que codificam para interferão imune recombinante mad£ ro que compreende estes 143 aminoãcidos e que possui, como se. referiu anteriormente, uma metionina adicional no N-terminal, A comparação das actividades biológicas dos interferões imunes humanos recombinantes com ou sem a sequência Cys-Tyr-Cys- mostraram que a anulação de Cys-Tyr-Cys- conduz a uma actividade anti-viral duas vezes maior (pedido de patente de invenção europeu N9 146,354, p_u blicado em 26.6,85). Além disso mostrou-se no pedido de patente de invenção europeu N9 146,354 que os fragmentos de interferão imu ne gerados por digestão triptica limitada do interferão tmune humano recombinante maduro, diminuíram a actividade anti>viral compa_ rada com a preparação de interferão recombinante que consistia nu-4-

ma mistura de polipeptidos de interferão (= a -material de referência) com 139 ou 143 aminoácidos (proporção 98:2), Por exemplo um fragmento constituído por 131 aminoácidos, s-em 12 amtnoícidos C-terminal mostrou 40-50% da actividade específica, comparado com o material de referencia mencionado anteriormente.. Os fragmentos com 3 ou 6 aminoácidos adicionais removidos do C-terminal possuiam 6 a 9 ou 1% respectivamente de actividade específica do material de referência.

Portanto com a finalidade de se reduzir a actividade exibida pelos fragmentos de interferão imune exemplificados no pedido de patente de invenção europeu referido anteriormente põde-se concluir que todos os fragmentos a que faltam aminoácidos terminais terão uma actividade anti-viral mais baixa do que o material de r_e ferencia mencionado antes, ou do que o interferão imune humano recombinante maduro, com 143 aminoácidos a que falta a sequência Cy_s -Tyr-Cys- no terminal N. Por outro lado estes fragmentos de interferão imune foram gerados somente por digestão tríptica limitada. A triprina catalisa a hidrólise das ligações peptidicas, cuja função carbonilo e dotada de um aminoãcido básico, usualmente arginj[ na ou lisina. Existem 20 resíduos de lisina e 8 resíduos de arginj[ na na sequência de aminoácidos do interferão imune, A quantidade de fragmentos individuais gerados pela triprina depende na acessibilidade da ligação peptídica que tem que ser cindida para proporcionar fragmentos,

No entanto a digestão proteolítica limitada conduz a um largo espectro de fragmentos e a purificação de um fragmento espe cífico ate ã obtenção da homogeneidade a partir de uma tal mistura é altamente problemática, em particular, se tem que se separar τ5-

polipeptidos que possuem essencialmente a mesma sequência de aminoãcidos e que diferem na dimensão por poucos aminoãcidos, Sob as condições prévias o fraccionamento por HpLC descrito no pedido de patente de invenção europeu 146.354 não ? considerado como adequa do para purificação dos fragmentos de interfirão imune exemplificados aqui atê ã obtenção de homogeneidade o que significa que eles são obtidos essencialmente isentos de outros fragmentos de interferão imune diferentes no tamanho, Alem disso devido ã especificidade da Triprina os fragmentos de interferão imune da presente invenção que possuem aminoãcidos do terminal-C nao básicos como a serina, metionina, glutamina ouleucinaou fenilalanina não podem ser obtidos por digestão triptíca, Esta pode ser a razão pela qual apenas fragmentos de interferão imune com 125, 129, 131 e 139 aminoãcidos possuindo arginina ou alisina como o aminoácido do C-ter minai são exemplificados no pedido de patente de invenção europeu N9 146,354. Alem disso e geralmente descrito um método para a pre paração de fragmentos de interferão imune por tecnologia de recombinação de DNA no anteriormente referido pedido de patente de invenção europeu, fragmentos de interferão imune humanos recombinantes que compreendem 132 a 137 aminoãcidos contados a partir do primeiro resíduo de glutamina na sequência de aminoãcidos representada na Fig. 1 e que foi preparada pela primeira vez sob uma forma homogénea pelos métodos da presente invenção,

Muito surpreendentemente descobriu-se que estes fragmentos imunes recombinantes homogéneos têm uma actividade anti-viral esp£ cífica aumentada quando comparados com o interferão imune recombinante maduro de comprimento completo. Semelhantemente também se observou que outras activfdades biológicas exibidas pelo interferão imune (revisto por Trrnchferi et al,, Immunology Today 6_, 131-

-136 ΖΪ98§7). também estão aumentadas para os fragmentos de inter ferão imune recombinantes· da presente invenção em comparação com o interferão imune recombinante maduro, As composições farmacêuticas que contem um ou mais dos fragmentos de interferão imune recombinante da presente invenção podem ser utilizadas para o tratamento de vários estados de doença, São exemplos destes estados de doença as infecções virais, doenças neo-plísicas e a artrite reumatoide,

A presente invenção, portanto, proporciona fragmentos de interferão imune recombinantes homogéneos que possuem uma elimina_ ção de 6 a 11 aminoácidos no C-terminal, quando comparado com o in terferão imune humano recombinante maduro com o comprimento complje to, Mais especificamente a presente invenção proporciona fragmentos de interferão imune recombinantes homogéneos de fóVmula geral

X-Y-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-AsnA1a-Gly-Hi s-Ser-Asp-Vai-Ala-Asp-As n-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-IleLeu-Lys-Asn-Trp-Lys-Ulu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Met-Gln-Ser-GlnI1e-Va1-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-GlnSer-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-LysPhe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-ThrAsn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-GluLeu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-LysArg-Lys-Arg-Z na qual ou X representa um resíduo de metionina

Y representa um resíduo de glutamina

ou <-7/ í

X representa um átomo de hidrogénio e

Y representa um resíduo de glutamina ou um resíduo de piroglutamato e

Z representa

Ser,

Ser-Gln,

Ser-Gln-Met,

Ser-Gln-Met-Leu,

Ser-Gln-Met-Leu-Phe ou

Ser-Gln-Met-Leu-PherArg,

Estes· fragmentos de interferão imune recombinante homogéneos têm uma actividade bíologica significativa elevada quando com parada com o interferão imune humano recombinante maduro o que significa que um interferão imune recombinante de comprimento complj? to com 143 aminoácidos que possui um resíduo de glutamina ou um re síduo de piroglutamato na posição 1 na sua sequencia de aminoãcidos, Quando o resíduo de aminoácidos na posição 1 e a glutamina o interferão imune recombinante de comprimento total pode conter eventualmente um resíduo de metionina adicional como o aminoãcido 144 no seu N-terminal, 0 resíduo metionina adicional deriva do sinal AUG de iniciação de tradução do mRNA que codifica para o amino ãcido metionina como se referiu anteriormente, Nos sistemas de expressão como o E, coli esta metionina não e sempre processada, Ve“8 — rificou-se que esta mettonina adicional do N-terminal não prejudj_ *

ca actividade biológica da maior parte dos polipeptidos recombinaji tes (Winnacker, in Gene und Klone, p, 255, VCH, Weinheim, Germany /1985/).

Apos eliminação da metionina do N-terminal no interferão imune recombinante ou nos seus fragmentos o resíduo de glutamina do N-terminal agora produzido pode ciclizar para a forma de piroglutamato, acreditando-se ainda que sem qualquer prejuízo para a actividade biológica. Os fragmentos de interferão imune recombinaji tes da presente invenção podem tomar múltiplas formas, mas de preferência eles devem estar presentes na forma de dímeros, trimeros e tetrãmeros.

Os fragmentos de interferão imune recombinantes da presente invenção podem ser utilizados para se prepararem composições farmacêuticas que consistem numa quantidade significativamente reduzida dos referidos fragmentos de interferão imune recombinante maduro, necessário para obter essencialmente a mesma actividade ajn ti-viral e um veículo fisiolõgicamente compatível, Tais composições farmacêuticas sao úteis para o tratamento de varias doenças,

Entende-se que as substituições de aminoácidos, particular mente as substituições de um único aminoãcido nos fragmentos de iji terferão imune recombinante, aqui descritos, dão origem a variantes de fragmentos de interferão imune recombinante que actividade, especifica elevada comparativamente ã que é oossuem >

possível obter com o interferão imune humano recombinante maduro, Faz parte da técnica introduzir este tipo de substituições num polipéptido recombinante. Mais geralmente a presente invenção inclui todos os fragmentos de interferão imune recombinante com uma anulação entre r9r a 11 aminoácidos no C-terminal quando comparado com um tnterferão imune humano recombinante maduro com o comprimento completo ou as suas modificações ou variações alelicas, cujos fragmentos exibem maior actividade biolõgica do que a do interferão imune humano recombinante maduro e de comprimento total, A presente invenção também proporciona veículos da expressão microbiana réplicaveis que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica um fragmeji to de interferão imune recombinante ligado de um modo operacional a uma sequência de controlo da expressão e microorganismos transformados com um tâl veiculo da expressão,

Alem disso a presente invenção proporciona composições far maceuticas que incorporam um ou mais fragmentos de interferão imune recombinante e um veículo fisiológicamente compatível, A preseji te invenção ainda se refere a processos para a preparação de fragmentos de interferão imune recombinante mediante tecnologia de recombinação de DNA, a processos para a preparação de um microrgani^s mo transformado com o mencionado veículo de expressão microbiana replicãvel e a métodos para a preparação de composições farmacêuticas que contem tais fragmentos de interferão imune recombinante,

Além disso a presente invenção refere-se ã utilização destes fragmentos de interferão e as correspondentes composições farmacêuticas para o tratamento de varias doenças,

A presente invenção pode ser melhor compreendida fazendo-se referência ã descrição detalhada seguinte desta invenção, quaji do considerada em conecção com os desenhos que a acompanham em que as abreviaturas e os símbolos utilizados são os seguintes:

Β. E, H. S, Sa, Sc, X, Xb, indica sítios para as endonuν] 0cleases de restrição BamHI, EcoRl, HindIII, Sphl, Sall, Scal, Xhol, e Xhal, respectivamente,

Nas figuras 2, 4 e de 6 até 9 representa promotores dos genes bla, lacl e neo; representa sítios de ligação ribo£ sómica dos genes bla, cat, neo, e lacl; nfflW representa os terminantes t e TI; I representa o promotor regulãvel/elemento opje rador ^25^/0⁵ Ι~ίλ^:Ι representa o sítio de ligação ribossomal RBSII, Sphl; representa as regiões de codificação sob controlo deste sítio de ligação ribossomica; representa as regiões necessárias para a rêplicação do DNA (repl,);|^ representa as regiões de codificação para di-hidrofolato redutase (dhfr), cloranfenicol aceti1transferase (cat), B-lactamase (bla), e o repressor lac (lacl), a neomicina fosfotransferase (neo), e interferão -Y (IFN-Y),

Figura 1

Sequência de aminoácidos de interferão imune humano recombinante maduro (rIFN-Y) desprovido da sequência Cys-Tyr-Cys- no N-terminal e a sequência nucleotidica que a codifica. 0 sítio Hinfl utilizado para a construção dos fragmentos de interferão imune recombinante está sublinhado. A metionina do N-terminal proveniente do sinal de iniciação da tradução procariÕtica está colocada entre parêntesis.

Figura 2

Desenho esquemático do plasmídeo pDS8/RBSII, Sphl,

Figura 3

Sequência nucleotídica do fragmento Xhol/Xbal do plasmídeo pDS8/RBSII, Sphl, que contêm o prometor regulavel/ou elemento ope-

rl 1 r rador Ρ^δ^/ο» ^{0 s}^^t10 ligação ribossomica RBSII, Sphl, o gene dhfr, o terminante t_Q, o gene cat e o terminante TI, Os sítios de endonuclease de restrição indicados na Fig, 2 estão sublinhados e a região sob controlo de RBSII, Sphl, que codifica um polipéptido de di-hidrofolato redutase esta sublinhada, Alem disso a entidade pBR322 do pDS8/RBSII, Sphl estã representada esquematicamente em que os numeros se referem ã sequência nucleotídica de pBR322 (J, G. Sutcliffe, Cold Spring Harbor, Symp, Quant, Biol, 43, pp, 77-90 _} 1979 ),

I

Figura 4

Desenho esquemático do plasmídeo pDMI.l,

Figura 5

Sequência de DNA do plasmídeo pDMI,l, Os sítios de endonuclease de restrição indicados na Fig. 4 estão sublinhados e as regiões codificadoras para a neomicina fosfotransferase (neo) e o re pressor lac (lacl) estão sublinhados,

Figura 6

Representação esquemática da construção e isolamento do fragmento 1 que contém o gene para o interferão imune humano recombinante maduro (rIFN-y) que se inicia no plasmídeo pRC23/IFI-900 que contêm o gene que codifica para um interferão humano recombinante constituído por 146 aminoácidos que possui a sequência Cys-Tyr-Cys- como N-terminal,

Figura 7

Integração do fragmento 1 no pDS8/RBSII, Sphl, que resulta no pGLS. (Sc) no desenho esquemático do pGLS indica a posição onde ^12r /

s o fragmento 1 se liga com o sítio de cisão de Scal de pDS8/RBSII, Sphl.

Figura 8

Representação esquemática da construção dos· fragmentos

EcoRI-HindIII, F(.-6), F(-8) e F(-ll) que codificam para o C-terminal de três diferentes fragmentos de interferão imune recombinante utilizando um fragmento Hinfl de pgLS e os adaptadores HinfI-HindlII, A(-6), A(-8) e A(-ll). Os fragmentos EcoRI-HindI 11, F(-7), F(-9)

F e F(-10) foram construídos de modo idêntico ao utilizado para os adaptadores Hinfl-HindlII,

AC-7} AGTCAGATGCTGTTTTAA

GTCTACGACAAAÁTTTCGA

A(-9) AGTCAGATGTAA

GTCTACÁTTTCGA

A(-10) AGTCAGTAA

GTCÁTTTCGA

Nas sequências fornecidas os codões relevantes para a terminação da tradução estão sublinhados,

Figura 9

Descrição sumãtica da integração dos fragmentos F(-6),

F(-8) e F(-ll) nos sítios de clivagem EcoRI e HindIII de pDS8/RBSII, Sphl que resulta nos plasmídeos pIFN-y(-6], pIFN-y(-8) e pIFN-y(-ll}, Os fragmentos F(-7), F(-9) e F(-10)l foram integrados de modo fdenttco resultando nos plasmídeos pIFN-y(-71, pIFN-y(-9) e pIFN-y(-101,

Figura 10

Sequências de aminoácidos dos produtos genéticos rIFN-y, f 1 3r

IFN-y(-6), IFN-y(-7), IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-lO) e

IFN-y(-ll), que foram obtidas após a expressão de pGLS, pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-lO) e pIFN-y(-ll) , res pectivamente.(130 aa) significa os 130 aminoacidos da posição 1 atê ã posição 130 (ver Fig. 1).

Figura 11

Analise de interferão imune humano maduro e de fragmentos de interferão humano por electroforese de gel de poliacri1amida-SDS .

Nas bandas a., b, c e d	(Fig. 11a, parte A) e nas bandas de 1 a 9
(Fig, 11b) representam-	se os	lisados de	células E. coli Ml 5 que
incorporam o pDMI, 1 e	ainda	o vector de	expressão indicado a se-
guir:
Vector de exoressão	Figura lia Figura 11b
		banda	banda
pGLS		a	1,9
pIFN-y(-4)		-	2
pIFN-y(-5)		-	3
pIFN-y(-6)		b	4
pIFN-y(-8)		c	5
pIFN-y(-9)		-	6
pIFN-y(-lO)		-	7

pIFN-y(-ll) d

Estão representadas as bandas a, b, c e d (Fig. 11a, a par te B) e as bandas 10 a 17 e a banda 20 da (Fig.11b) polipeptidos de interferão purificados, isolados dos lisados a, b, c e d, (Fig,

11a, parte A) e as bandas de 1 a 9, (Fig, 11b), respectivamente, /

Os fragmentos de interferão imune humano IFN-y(-14) e IFN-y(-18) estão preparados por proteõlise limitada estão repre sentados nas bandas 18 e 19 respectivamente.

MW (Fig, 11a) e M (Fig, 11b) representam um marcador de ta_ manho proteico (dos laboratórios BIO-RAD) que consiste em proteínas com um peso molecular de 14,4 Kd, 21,5 Kd, 31 Kd, 45 KD ,

66,2 Kd e 92,5 Kd (1 Kd = 1000 daltons),

Figura 12

Actividade anti-viral em relação com a sequência carboxiterminal de IFN-y, A sequência carboxiterminal é representada pelo codigo de uma letra descrita por Dayhoff et al,, (Atlas de Protein Sequence e Structure M.O. Dayhoff, ed_T, Vol , 5_ p, 17, Natl. Biomed, Res, Found,, Silver Spring, Maryland, U.S.A., 1979 ) na aBcissa.

A actividade anti-viral exibida pelos fragmentos de interferão im_u ne recombinante está identificada na abcissa pelo numero de amino£ eidos anulados no carboxiterminal em comparação com o interferão inw ne humano recombinante maduro completo, identificado por o símbolo 0, que esta colocado na ordenada. Cada ponto representa a media geométrica do título de pelo menos de seis determinações independeri tes. As barras indicam os correspondentes limites de confiança de 95%.

Figura 13

Comparação da actividade anti-viral, a acttvação de macro fago e o receptor ligado ã capacidade em relação com a sequência carboxiterminal de IFN-y (para detalhes ver a legenda da Fig, 12 e o texto), Os valores para a actividade anti-viral, actrvação macro fagica e capacidade do receptor de ligação dos fragmentos- de fnter

-15/ ferão imune em relação com os valores que correspondem ao interfe^ rão imune recombinante maduro que foram arbitrariamente consider^ dos como 1, mostram-se em escala logarítmica. 0 valor absoluto para a derivação macrofágica do interferão imune recombinante madu ro foi de 5x10 U/mg.

No aspecto preferido da presente invenção fragmentos de in terferão imune recombinante podem ser preparados por selecção de um plasmídeo apropriado que contem uma cópia completa do gene de interferão imune humano ou suas variantes alélicas. Os codões de paragem da tradução podem em seguida ser introduzidos na região do gene que codifica para o C-terminal do interferão imune quer no sj) tio que dirige a mutagene como descrito por Smith et al. (in Gen£ tic Engineering 3, 1-32, 1981, J. K. Setlow, A. Hollander eds., Plenum Press, New York) ou quer por remoção de um fragmento de res_ trição apropriado desta região e por substituição deste fragmento de restrição com um fragmento de DNA sintético que codifica para o C-terminal desejado do fragmento de interferão imune recombinain te. No ultimo método, de preferência, as duas endonucleases de restrição são utilizadas para cortar o plasmídeo inicial, gerando duas extremidades diferentes coesivas. 0 DNA sintético que contem as extremidades coesiyas complementares pode em seguida ser integrado directamente na orientação correcta. Na fase seguinte a sequência de DNA que codifica para o fragmento de interferão imune recombinante pode ser inserido num vector de expressão microbia^ no replicavel que compreende uma origem de replicação, um promotor ou promotor-operador e uma sequência que codifica um sítio de ligação ribossõmica (RBS). Vectores de expressão replicáveis apropriados podem ser encontrados em Maniatis et al., (supra), ou nos exemplos da presente invenção.

16*

Vectores de expressão replicãvel apropriados que compreendem uma sequência nucleotldica que codifica um fragmento de interferão imune recombinante, ligado de um modo operacional com uma se quencia de controlo de expressão são os pIFN-y(-6), pIFN-y(-7), pI FN-yX -8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-lO) e pIFN-y(-ll), em que a sequêji cia codificadora dos fragmentos de interferão imune recombinante ê integrada no vector de expressão pDS8/RBSII, Sphl (Fig, 2). 0 vector de expressão pDS8/RBSII, Sphl foi introduzido na E, coli Ml5 (pDMI.l) uma estirpe de E. coli (E, Coli DZ291) transformada com o plasmideo pDMI,l (Fig, 4) que codifica o repressor lac,

A estirpe de E. coli Ml 5 resultante (pDS8/RBSII, Sphl, pDMI,l) foi depositada em 6 de Agosto de 1986 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) com o numero de deposito DSM 3809. Os m£ todos para a construção dos veículos que codificam para os fragmeji tos de interferão imune recombinante IFN-y(-6), pIFN-y(-7),

IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN^y(-lO), e IFN-y(-ll) são descritos em de talhe nos exemplos. Fundamentado nestes exemplos e possível a um técnico nesta matéria, construir vectores de expressão capazes de exprimirem fragmentos de interferão imune recombinante, são em seguida transformados num organismo hospedeiro apropriado por meio do processo especifico descrito nos exemplos ou como descrito por Maniatis et al,, (supra),

Os fragmentos de interferão imune recombinantes podem estar sob a forma glicosilada ou não glicosilada, dependendo da célula hospedeira utilizada, Organismos hospedeiros preferidos incluem o Escherichia coli, (por exemplo a estirpe Ml5 ou a estirpe W3110, ATCC N<? 27325 ), Bacíllus- subtiltis e outros, 0 organismo mais pre ferido para esta invenção e a estirpe M15 de E, coli referida ante riormente.

-17ί

Λ 5?

Logo que os organismos susceptíveis de realizarem a expres^ são dos polipéptidos da presente invenção foram preparados, o processo desta invenção pode ser realizado por uma variedade de vias dependente na natureza da construção dos vectores de expressão e das caracterlsticas do desenvolvimento hospedeiro, Tipicamente o organismo hospedeiro desenvolver-se-ã sob condições que são favoráveis para a produção de grandes quantidades de células. Quando um grande número de células está acumulado, indutores apropriados ou agentes não repressores no meio de desenvolvimento ou uma temperatura variável origina a sequência de controlo fornecida com uma tal sequência de DNA para ficar activa permitindo a transcrição e tradução da sequência codificadora.

Na presente invenção, a expressão do gene codificador para os fragmentos de interferão imune recombinantes é inibida pelo repressor lac. Quando um grande número de células se acumularam o ge ne do interferão ê transformado num agente não repressor pela adição de isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG), A proteína prodi£ zída pela célula recombinante pode ser ligada por meio de lise ã célula por processos convencionais conhecidos na técnica. Meios es_ pecíais de lise dependerão da célula hospedeira utilizada. Na presente invenção prefere-se a lise das células, com cloridrato de gua. n i d i o.

Os fragmentos de interferão imune recombinantes homogéneos da presente invenção podem ser purificados por qualquer método coji venctonal, tal como por precipitação com sulfato de amónio, dialise para eliminar os sais sob condições normais de pressão ou sob vácuo, filtração de gel, cromatografia, focagem isoeléctrica de base plana preparativa, electroforese de gel, cromatografia Ifquida

-18de alta resolução, cromatografia de permuta tónica, filtração por gel e cromatografia de fase inversa, cromatografia de afinidade e outros por meio de utilização de anticorpos monoclonais ou policio, nais. Os fragmentos de inteferão imune recombinantes homogéneos obtidos são essencialmente isentos doutras proteínas e podem ser analisados por meio de electroforese de gel de poliacri1amida-SDS ou por HPLC.

Os fragmentos de interferão imune recombinantes podem fo£ mar dímeros, trímeros ou tetrãmeros o que significa que os fragmeji tos de interferão imune recombinantes podem estar presentes sob a forma duma combinação de dois, três ou quatro desses fragmentos. A natureza do mecanismo de combinação e pouco clara.

As actividades anti-virais dos fragmentos de interferão inw ne recombinantes IFN-y(-6), IFN-y(-7), IFN-y(-8) , IFN-y(-9),

IFN-y(-lO), e IFN-y(-ll), foram determinados por um bioensaio fuji damentado na redução do efeito citopãtico como descrito por Rubi_n stein et al., (d. Virol, 17, 755-758, 1 981 ). Foram utilizadas cê lulas amniõticas humanas, (celulas-FL) e vírus Sindbis como vírus de inoculação. As amostras foram prê-diluídas para cerca de 1000 unidades por ml e tituladas numa placa microtituladora em duplica do. Como padrão de trabalho foi utilizada uma preparação (lote N$ 85, 20 SX-Pool) de interferão imune recombinante maduro comple to, (sequência da Fig. 1). Esta foi calibrada para o padrão de gama interferão imune humano de referência NIH Νθ Gg 23-901-530 . 0 padrão NIH possuía um titulo de 3,68+0,34 log^Q unidades por am pola (n = 39).

Os resultados estão resumidos no quadro 1 seguinte. Cada valor representa a média de pelo menos 13 determinações individuais, Os títulos da media geométrica foram estatisticamente avaliados com

-19um teste-t, As diferenças entre o interferão imune recombinante ma^ duro e os fragmentos de interferão Imune recombinante são significativamente elevadas (P = 99%). A diferença entre os títulos de IFN-y(-6) e IFN-y(-ll) são também altamente significativas, Os valores de IFN-/(-6) e de IFN-y(-8) diferem significativamente (P-95%), As potências de IFN-y(-8) e IFN-y(-ll), contudo, não são significativamente diferentes.

Quadro I

Actividade específica antiviral

Interferão imune de recombinante maduro

Fragmento de recombi nante

Fragmento de recombinante

Fragmento de recombi nante (rIFN-y) interferão imune

IFN-y(-6) interferão imune

IFN-y(-8} interferão imune

IFN-y(-ll).

9.5Ί0⁶ U/mg

4.1-10⁷ U/mg

5,9‘10⁷ U/mg

7,0 «Ί0⁷ U/mg

A fim de se est-udar o aumento da actividade anti-viral com maior detalhe, foram construídos fragmentos de interferão imune re combinante quer como se descreveu anteriormente, por exemplo IFN-y(-4) e IFN-yC-51 ou por proteolise limitada de interferão inw ne recombinante maduro completo, por exemplo IFN-y(-14J que foi preparado utilizando-se protease Arg C, de glândula submaxtlar de murganho que corta as proteínas especificamente no carboxilo la^ teral da arginina (Schenkein et al,, Arch, Biochem, Biophys, 182_?

-2064-70, 1977) enquanto que ο INF-y(-18) foi preparado utilizando-se a enzima plasmina fabrinolTtica.

A actividade anti-viral especifica destes polipeptidos foi determinada como se descreveu anteriormente. No Quadro 2 e Fig. 12 mostra-se os fragmentos de interferão imune recombinanté IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-lO) e IFN-y(-ll), que exibem uma actividade antj[ virai especifica notavelmente mais elevada do que o interferão imju ne recombinante maduro ou os fragmentos de interferão imune IFN-y(-lÔ) preparados por proteolise limitada.

Quadro 2

Actividade anti-viral especifica (U/mg) (limites de confiança de 95%)

rIFN-y	1,91	X	10⁷	(1,36	X	10⁷	2,67	X	10⁷	)
IFN-y(-4)	2,88	X	10⁷	(2.19	X	10⁷ -	3,80	X	10⁷	)
IFN-y(-5)	4,79	X	10⁷	(3.54	X	10⁷	- 6,47	X	10⁷	)
IFN-y(-6)	3,39	X	10⁷	(2,46	X	10⁷	- 4.66	X	10⁷	)
IFN-y(-8)	7.08	X	10⁷	(5,06	X	10⁷	- 9.91	X	10⁷	)
IFN-y(-9)	9,33	X	10⁷	(6.60	X	10⁷	- 1,32	X	10⁸	)
IFN-y(-10)	8,32	X	10⁷	(6.72	X	10⁷ -	1.03	X	10⁸	)
IFN-y(-ll)	6.32	X	10⁷	(4.99	X	10⁷ .	7.97	X	10⁷)

De um modo semelhante os fragmentos de interferão imune

IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-lO) e IFN-y(-ll) exibiam uma actividade anti-proliferativa mais elevada e actividades imunorreguladoras aumentadas.

A actividade anti-prol i ferati va pode ser determinada mediji do-se a acção inibidora de interferões imunes diferentes na inco£ / *21* poração de timidina marcada radioactivamente no DNA celular, Três linhas de células malignas (U 937, BS 14, LLC 1) e uma linha de f£ broblastos normais (AG 1523, passagem Νθ 6-10) foram utilizadas, A linha de células U 937 é uma linha de células de leucemia mielomonocítica, a BS 14 foi derivada de um doente com melanoma maligno e a LLC 1 era proveniente de um doente com cancro do pulmão, As cê lulas foram plaqueadas em placas microtituladoras de 96 cavidades em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de vitela fetal, 1% de L-glutamina (200 mM), (100 yj/ml), 1% peni cil i na-(1 00 /ig/ml) de estreptomicina, 1% de MEM aminoácidos não essenciais (100 x) e 1% de piruvato de sódio (100 mM) com diferentes densidades de acordo com as curvas de crescimento individuais respectivas; 20,000 celu las/ml para U 937 e AG 1523, 1000 células/ml para BS 14 e LLC 1, As células foram deixadas a aderir durante 24 horas, 0 interferão imune recombinante maduro (rIFN-y) e o fragmento de interferão im£ ne IFN-y(-lO) respectivamente foram em seguida adicionados nas cavidades. As placas de controlo negativo foram tratadas apenas com um meio enquanto que os controlos positivos consistiam em adriamicina numa concentração compreendida entre 10 e 10 M. Decorridos 2 dias adicionou-se H-timidina com uma concentração final de 1 yu C i cavidade. Apos mais 18 horas de incubação as células foram colhidas e a incorporação da timidina foi determinada como descrito por Carr et al,, (Cell, Immunol. 5, 21-29> 1972 ), Descobriu-se que são necessárias 14 vezes menos a quantidade do fragmento de interferão imune IFN-y(-lO) para se obter a mesma actividade anti-prolj_ ferativa das células AG 1 523 do que de interferão imune recombinan_ te maduro (rIFN-y). De um modo idêntico descobriu-se ser necessária uma quantidade de 5, 3 e 6 vezes mais pequena de IFN-y(-lO) pa_ ra se obter a mesma actividade anti-proliferativa do que a quantipor

-22τ dade de rIFN-y em U 937, BS 14 e células LLC 1 respectivamente,

Sabe-se que o interferão imune medeia diversas funções inw norreguladoras, Ele parece ser um dos factores da activação macrofagica (MAF). A activação de macrofagos foi medida por duas diferentes vias, Macrofagos humanos normais obtidos de acordo com Talmadge et al, (Eur, J, Immunol , 16, 1471 -1477 , 1986 ), foram activa^ dos por diferentes formas de interferão imune descrito no presente pedido de patente de invenção. A ruptura oxidativa foi medida em termos do reforço da libertação de peróxido como descrito por Pick et al. (J, Immunol, Methods 46, 211-226 , 1981 ), enquanto que a indução da actividade bactêricida dos macrofagos foi medida como descrito por Peck et al , (J, Immunol, Methods 82, 131-140; 1985 ), Subsequentemente o interferão imune exerce a sua função imunorreg_u ladora via ligação com receptores de membrana, as actividades imunorreguladoras estão dependentes da ligação do interferão imune aos seus receptores, A ligação competitiva de interferão imune recombinante maduro marcado radioactivamente e de fragmentos de interferão imune recombinante (Kung et al,, Metfi, in Enzymology 119, 296-301j 1986 ) para o receptor do interferão foram medidas como descrito por Rashidbaigi et al ,, (d, Biol , Chem, 260, 8514-8519) 1085 ), Os resultados das experiências referidas anteriormente mostram-se na Fig. 13 sob uma forma resumida, Além disso a actividade anti-viral notavelmente mais elevada dos fragmentos de interferão tmune IFN-y(-8), IFN-y(-9), IFN-y(-lO) e TFN-y(-ll), mostraram também uma capacidade de activação notavelmente aumentada para os macrofagos e capacidade de ligação aos receptores,

A exposição dos novos fragmentos de interferão imune recom binante a temperatura ambiente durante vários dias não produziu tw *23 τ /

$ /

vos picos por analise HPLC tal como se observou com o interferão imune recombinante maduro completo e portanto adicionalmente a sua maior actividade, estes fragmentos também são mais estáveis.

Os fragmentos de interferão imune recombinante purificados da presente invenção ou as suas misturas podem ser utilizados para a preparação de composições farmacêuticas, Estas composições farma_ cêuticas contêm uma quantidade significativamente reduzida dos referidos fragmentos ou fragmentos de interferão quando comparada com a quantidade de interferão imune humano recombinante maduro n_e cessario para obter essencialmente a mesma actividade anti-viral e um veículo compatível do ponto de vista fisiológico, Esta quantida_ de reduzida é fundamentada na actividade anti-viral específica significativa mais elevada (em unidades/mg) exibida pelos fragmentos de interferão imune recombinante (Ver Quadro 11, Para os fragmentos de interferão imune recombinante preferidos* da presente invenção, calculou-se esta quantidade reduzida utilizando-se valores p£ ra a actividade anti-viral específica representada no Quadro 1, A quantidade reduzida é cerca de:

23% para o fragmento de interferão imune recombinante
	INF-y(-6}
16%	para o fragmento INF-y(-8)	de	i nterferão	imune	recombi nante
14%	para o fragmento INF-y(-ll)	de	interferão	imune	recombinante

comparadas com a quantidade de interferão humano recombinante madu ro necessário (tomado como 100%), para obter a mesma actividade ajn ti-viral específica, Resultados idênticos podem ser obtidos utilizando-se os dados do Quadro 2.

04r i

As composições farmacêuticas que podem ser preparadas por qualquer processo convencional incluem: a) uma forma solida para administração oral, tal como comprimidos, capsulas, pírulas, põs^ grânulos e equivalentes; b) uma forma liquida para administração oral, tal como, solução, xarope, suspensões, elixires e outras;, c) preparações para administração parenterica, tais como soluções estéreis, suspensões ou emulsões; e d) preparações para administração tõpica tais como, soluções, suspensões, pomadas, cremes, geles, pos micronizados, aeroso'is e equivalentes. As preparações farmacê^ ticas podem ser esterilizadas e/ou podem conter adjuvantes, tais como, agentes conservantes, estabi1izantes, agentes humectantes, emulsionantes sais para variar a pressão osmótica e/ou agentes tam pão.

As formas para dose parenterica podem ser perfusões ou soluções injectãveis que podem ser injectadas por via endovenosa ou intramuscular, Estas preparações também podem conter outras substâncias medicamentosas activas, Podem ser adicionados outros aditi_ vos tais como agentes conservantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes tampão e outros de acordo com a pratica corrente da formulação farmacêutica,

De acordo com esta invenção as composições farmacêuticas que contêm um fragmento de interferão imune recombinante podem ser utilizadas para o tratamento de infecçoes virais, doenças neoplasicas e/ou artrite reumatoide,

Estas podem ser administradas em composições ou formulas aceitãveis em farmácia, orais, injectãveis ou tópicas, A dosagem e a Taxa de dose pode ser paralela ã correntemente utilizada em aplicações clinicas de interferoes conhecidos, típicamente cerca de

-2510^ unidades diárias. Estas composições farmacêuticas da presente invenção contêm os referidos fragmentos de interferão imune recombinante em associação com material veicular aceitável e compatível do ponto de vista farmacêutico. Qualquer veículo convencional pode ser utilizado. 0 material veicular pode ser um veículo inerte orgânico ou inorgânico apropriado para administração entérica, percu tãnea ou parenterica. São veículos apropriados a agua, a gelatina, goma arábica, lactose, amidos, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais, poli-alquileno-glicois , geleia de parafina e equivalentes. Além disso as preparações farmacêuticas podem conter outros agentes farmacêuticos activos. Outros aditivos tais como agentes apaladantes, conservantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes tampão e outros, podem ser adicionados de acordo com a prática corrente de formulação farmacêutica.

Tendo sido descrita de um modo geral, esta invenção tornar-se-ã roais explícita por preferência dos exemplos específicos que estão aqui incluídos apenas como ilustração e, não são entendidos como limitantes a menos que especificado de outro modo.

Exemplo 1

A. Princípios

Escolheu-se pDS8/RBSII, Sphl para a expressão do interferão imune humano recombinante maduro e para os fragmentos de inter ferão imune recombinante da presente invenção, Para a expressão eficaz o vector referido anteriormente continha como sequência de controlo da expressão o promotor regulãvel/elemento operador Pn25^/0 í^^tu*^{ier a}^’» EMBOJ, 2» 3143-3148,1984 ) e o sitio de ligação ribossõmica RBSII, Sphl, Este sitio de ligação ribossomica foi derivado via síntese de DNA que combina o sítio de ligação ribossomica sob controlo do promotor Ρθ25 ^^a9° T5 E, coli (R, Gentz, Ph. D. thesis, University de Heidelberg, FRG ,7984 ), Devido ã elevada eficácia destes sinais de expressão o vector mencionado anteriormente pode ser mantido estavelmente apenas no E, coli se o promotor/elemento operador ê reprimido via ligação do repressor lac ã entidade operadora de ^^25^/0» θ repressor lac ê codificado pelo gene lacl, 0 P^s^yQ ? eficientemente reprimido somente se quantidades suficientes das moléculas do repressor estiverem presentes,

Portanto, foi utilizado 0 alelo lacl^ que contem um promotor mutante que resulta numa expressão aumentada do gene repressor, 0 alelo lacl^ está contido no plasmídeo pDMI.l (Fig. 4), Este pias, mídeo transporta também para 0 gene lac 0 neogene, que confere resistência ã canamicina como um marcador selectivo, 0 plasmídeo pDMI,l ê compatível com 0 vector de expressão pDS8/RBSII, Sphl,

As células E, coli para serem transformadas com vectores de expressão baseados no pDS8/RBSII, Sphl têm que incorporar 0

Γ-·* pDMI.l para assegurar a estabilidade do vector de expressão, A indução da expressão neste sistema e facilmente conseguida por adição de IPTG ao meio na densidade de células desejada,

B. Plasmídeo pDS8/RBSII,SphI

A parte do plasmídeo pDS8/RBSII ,SphI (Fig. 2) entre os sítios para as endonucleases de restrição Xhal e Xhol que continham a região requerida para a replicação do DNA e manutenção do plasmj) deo na célula e o gene completo para a beta-1actamase que confere resistência ã ampicilina ê derivada do plasmídeo pBR322 (Bolivar et al,, Gene .2, 95-113; 1977 ; Sutcliffe supra), A parte restante do plasmídeo transporta o promotor regulãvel/elemento operador ^PN25^X/0 (Stuber et al ., supra) seguido por o sítio de ligação ribossÕmica, RBSIIjSphl que faz parte de um fragmento EcoRI/BamRI, pela região codificadora para a di-hidrofolato reductase, da linha de células AT-3000 de murganho (Chang et al . , Nature '275 , 617-624.5 1978 ; Masters et al. , Gene 21 , 59-63 , 1983 ), pelo terminante do fago Lambda de Escherichia coli (Schwarz et Nature 272, 410-414j 1978 ), pelo promotor isento do gene para cloranfenicol acetiltransferase (Marcoli et al,, FEBS Letters 110, 11-14 _} 1980 ) e pelo terminante TI do operão de Escherichia coli rrnB (Brosius et al., J. Mol, Bfol,, 148, 107-127, 1981

C, Plasmídeo ρΡΜΙ,Ι plasmídeo pDMI ,1 (Fig. 4)_ transporta o gene para a neond cina fosfotransferase do transfosão Tn5 (Beck et al,, Gene 19, 327-336 3 1982 ) que confere resistência ã canamicina e o gene lacl (Farahaugh, Nature 274, 765-769, 1978 ) com a mutação do promotor I^q (Calos, Nature 274, 762-765 , 1978 ) que codifica o repressor lac. Além disso o pDMI,1 contem a região do plasmídeo pACYC184 r 28r (Chang et al., J. Bacteriol. 134, 1141-1156^1978 ) que transporta a informação necessária para a sua replicação e permanência es tãvel no E. coli.

Exemplo 2

Construção do plasmídeo pGLS que codifica IFN-y

A. Princípios

Utilizando-se oligonucleotidos sintetizados quimicamente o gene IFN-y foi adaptado para o sitio de ligação ribossomica RBSII, Sphl (Fig. 6). 0 fragmento que codifica IFN-y foi isolado e integrado no pDS8/RBSII,Sphl resultando o plasmídeo pGLS (Fig, 7),

B. Síntese dos fragmentos oligonucleotídicos sintéticos que adaptam o gene IFN-y ao RBSII, Sphl

Na Fig. 6 representam-se os fragmentos oligonucleotídicos sintéticos, Estes fragmentos oligonucleotídicos foram preparados simultaneamente num muiti-stntetizador como descrito no pedido de patente de invenção europeu N9 Al 181 491 publicado em 21.5,86, utilizando-se vidro poroso controlado (CPG) como um suporte material (Kiefer et al., Immunol. Meth. 3, 69-83, 1985 ; Sproat et al,, Tetrahedr. Lett, 24, 5771-5774_á 1983 ; Adams et al,, 0, Am. Chem. Soc. 105, 661-663 j 1 983 ), Os o 1igonucleotidos liofilizados foram dissolvidos na agua durante 1 hora ã temperatura de 4°C para proporcionarem uma concentração de DNA, de 100 nmoles/ml,

150 pmoles de cada oligonucleotido foram fosforilados com /11 de P^-ATP (2 pmoles, 5000 ci/mmol), 1 U T4-pol i nucl eotido quinase (Glbco-BRL, Basileia) em 10 ^ul de HCl-tris 50 mM de pH 8,5,

- 2 9 Γ-

ΙΟ mM de MgCl^ durante 10 minutos 3 temperatura de 37°C, Todas as reacções prosseguiram pela adição de 1 /il de 5 mM de ATP, As reacções foram detidas por aquecimento das amostras durante 7 minutos ã temperatura de 65°C,

C. Construção e isolamento do fragmento 1 que codifica IFN-y

Foram digeridos 4 /ig do plasmídeo pRC23/1FI-900 (pedido de patente de invenção europeu N9 A2 99 084 publicado em 25,1.84) com uma concentração de DNA de 400 /ug/ml , com 10 U de Ndel em BRL-I tampão de núcleo (HCl-tris 50 mM, pH8, 10 mM de MgCl^» 50 mM de NaCl) fornecido pela Gibco-BRL em Basileia, durante 1 hora a temperatura de 37°C com o volume total de 20 /11 . Apôs digestão o DNA foi extraído uma vez com fenol, tratado uma vez com eter, precipitado com etanol e o aglomerado seco durante 2 minutos num concentrador Speed-vac.

aglomerado foi dissolvido em tampão de T4-ligase (50 mM tris/HCl pH 7, 8, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 500 /uM ATP). Foram adicionados 25 pmoles de oligonucleotidos fosforilados que compreendiam o adaptador 1, Sphl-Ndel (Fig.6) em 1 x tampão de ligase para um volume final de 25 /11. As ligações foram realizadas ã temperatura de 22°C durante 3 horas utilizando-se 1 /11 de DNA-ligase (1 Weiss-unit, Boehringer, Mannheim). A ligação foi detida por incubação da amostra durante 7 minutos ã temperatura de 60°C,

DNA foi precipitado com etanol, seco como descrito anteriormente e em seguida fez-se de novo a suspensão em 50 /11 de tampão de digestão Ncol (50 mM Tris-HCl, pH8, 10 mM MgC^» 50 mM NaCl, 50 mM KC1), adicionaram-se 10 U de Ncol (BRL-Gibco, Basileia) e a amostra foi incubada durante 1 hora ã temperatura de 37°C, A enzi

-30*

ma de restrição foi inactivada por aquecimento da amostra durante 7 minutos a temperatura de 65°C, ApÕs uma extracção com fenol o DNA foi precipitado e seco como se descreveu antes, 0 aglomerado foi dissolvido em 20 /H de tampão de Klenow (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10-mM MgSO^, 100 /iM DTT) e foram adicionados dATP, dGTP, dCTP, e dTTP para uma concentração final de 100 /iM (volume de reacção to_ tal: 30 μ 1). Adicionou-se enzima de Klenow (1 unidade, Boehringer Mannheim) e a amostra foi incubada durante 1 hora a temperatura de 22°C, A reacção foi detida por adição de 2 ^ul de EDTA 0,25 Μ, A mistura foi extraída uma vez com fenol e o DNA foi precipitado como se descreveu antes e em seguida fez-se de novo a suspensão em tampão de digestão Sphl (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl^, 50 mM NaCl, 6 mM 2-mercatoetanol), Apôs a adição de 10 U de Sphl (BRL-Gibco, Basileia), a amostra foi incubada durante 1 hora a temperatura de 37°C. A digestão foi detida por aquecimento da amostra durante 7 minutos ã temperatura de 65°C, seguida de uma extracção por fenol. 0 DNA foi então precipitado e seco como se descreveu aji teriormente, aglomerado de DNA foi dissolvido em 10 jul de tampão mergulhado em gel e os fragmentos de DNA foram separados por electroforese em gel de poliacri1amida a 6% que continha 0,5 x Tris-acetato-tampao (40 mM de HCI-Tris, 20 mM de acetato de sodio, 2 mM EDTA, pH 7,8). Apos coloração com brometo de etidio (0,5/il/ml) as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta a 300 nm . A banda de DNA que codifica o gene de IFN-y foi cortada e retirada do gel com um escalpelo, 0 DNA marcador era o fago 0X digerido com HaelII (Gtbco-BRL, Basle), Transferiu-se a porção do gel para uma cavidade de 4x4 mm num gel de agarose 0,7% que continha tampão TBE (90 mM Tr is-borato, 90 mM de acido borico, 3mM EDTA, pH 8,3), A cavida-

de foi selada com agarose líquida a 0,7% em IxTBE a ftm de proporcionar um cabo elétrico homogéneo. Em frente da amostra foi inserida uma porção de membrana NA45 (Schleicher and Schuell, Dassel, BRD) e o DNA foi submetido a electroforese na membrana durante 5 minutos a 300 U, A tira com o DNA foi em seguida lavada com agua destilada e transferida para um tubo de Eppendorf que continha 250 pl de acetato de lítio 1,5 M, 50 mM de HCl-Tris pH 8,0 e 10 mM EDTA. 0 DNA foi eluído durante 20 minutos ã temperatura de 65°C com mistura em vortex ocasional, A tira da membrana foi removida do tubo e a amostra foi extraída uma vez com 200 pl de fenol que estava saturado com Tris 1M de pH 8,0,

Após rotação das amostras durante 10 minutos a 12,000 rpm numa microcentrifugadora o sobrenadante que continha o DNA foi retirado. 0 DNA foi precipitado em gelo seco durante 10 minutos e dei pois adicionado coro 20 /11 de acetato de lítio 5M e 440 pl de isopropanol. 0 DNA foi reunido durante 10 minutos a 12,000 rpm numa microcentrifugadora. 0 aglomerado foi lavado coro etanol a 80% e seco sob vacuo. 0 granulo foi dissolvido em 10 pl de tampão-TE (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ETDA).

D. Preparação do plasmideo pDS8/RBSII,SphI pmoles do plasmideo pDS8/RBSII,SphI (400 pg/ml) foram dj. geridos com 10 U de Sphl num volume de 50 pl de tampão de núcleo a temperatura de 37°C durante 1 hora, adicionados com 1 U de Scal e digeridos durante mais 30 minutos, Apôs digestão a amostra foi extraída uma vez com fenol, tratada com eter, precipitada e seca como foi descrito anteriormente. 0 granulo foi dissolvido em 20 pl de tampão (50 mM de Trts-HCl, pH 8) que continha 1 unidade de fos^ fatase intestinal de vitela (CIP, Boehringer, Manheim) e incubado r32 durante 1 hora ã temperatura de 37°C, Apôs tnacttvação pelo calor do enzima e remoção da proteína (Ver anteriormente) o DNA foi precipitado com etanol. Apos ter-se feito de novo a suspensão do DNA, do fragmento Scal/Sphl do pDS8/RBSII, do Sphl que continha parte do gene cat, o terminante TI, da origem de repli.cação, do gene bla, do promotor ^^25^/0 ^e ligação ribossÕmica RBSII, isolou-se Sphl por meio de electroforese em gel de agarose a 1% e, transferiu-se também por electroforese para membrana NA45, Realizou-se a eluiçao a precipitação em etanol e de novo a suspensão em 100 jul de tampão TE como descrita anteriormente, Obteve-se cerca de 1 pmol do fragmento vector,

E. Agrupamento do plasmídeo pfiLS

Foram ligadas 2 /ul de fragmento do vector com 2 ^1 da inserção de DNA (fragmento 1) em tampão ligase (ver atras) que continha 1 yul de DNA-1igase (1 unidade Weiss, Boehringer, Mannheim) num volume total de 20 μΐ, As ligações foram realizadas ã temperatura de 22°C durante 3 horas, Em paralelo foi executada uma ligação de controlo sem qualquer inserção de DNA, As ligações foram d£ tidas por aquecimento das amostras durante 7 minutos ã temperatura de 65°C, Prepararam-se as células de E.coli Ml 5 competentes utilizadas para a transformação, utilizando-se o método de Morrison (Methods Enzymol. 68, 326-331 , 1979 ). As misturas de ligação foram adicionadas a 200 jul das células de E, coli Ml 5 descongeladas que incorporavam o plasmídeo pDMI,l. As amostras foram colocadas sobre gelo durante 30 minutos seguido de incubação de 2 minutos ã temperatura de 42°C, Apos adição de 0,5 ml de meio LB as amostras foram incubadas durante 90 minutos ã temperatura de 37°C em banho de agua. As células foram em seguida centrifugadas durante 30 se/ /

gundos com 12,000 rpm numa microcentrifugadora, Os sobrenadantes foram retirados e os grânulos foram retirados e os grânulos foram suspensos em 100 pl de meio LB eplaqueados em placas de agar-LB que continha 100 /ug/ml de ampicilina, mais 25 jig/ml de canamicina,

As placas foram incubadas durante a noite ã temperatura de 37°C. Da ligação de controlo não foram obtidos quaisquer transformantes apos transformação. A ligação com o fragmento 1 forneceu cerca de 200 transformantes, Recolheram-se colónias isoladas com uma palheta de para duntes e transferiram-se para um tubo que continha 10 ml de meio LB com 100 ^ug/ml de ampicilina e 25 pg/ml de canamicina e desenvolveram-se durante 12 horas ã temperatura de 37°C sob agitação vigorosa. As células foram centrifugadas durante 10 minutos a 8000 rpm, 0 DNA plasmidico foi extraído de acordo com o método de Birnhoim et al,, (Nucleic Acids Res, 7, 1513-1523, 1979 ).

Os grânulos finais foram dissolvidos em 200 jul de tampão TE, Digeriram-se 4 ^il com Sphl e Xhal para libertar o fragmento que continha o gene de INF-y com o terminante TI, Todas as amostras de DNA analisadas libertaram o fragmento da dimensão esperada com cerca de 1 Kb. Estes plasmideos foram designados por pGLS,

F. Analise da sequência do gene de IFN-y, clonado no pGLS

Para confirmar que a sequência correcta de IFN-y estava i_n tegrada no pGLS, foi sequenciado o DNA plasmfdico circular de dupla cadeia utilizando-se um iniciador marcado na extremidade com (Υ-³²ρ)-ατρ.

Q iniciador continha os nucleÔtidos desde a posição 199 at? 218 do pDS8/RBSII,SphI e terminava portanto com 6 nucleotidos

em frente de ATG do sítio Sphl, Precipitaram-se Ί5 pl do DNA isolado (0,3 pmol) com etanol e lavados uma vez com étanol a 80%. Apôs secagem durante 2 minutos do agolmerado num concentrador Speed vac, o aglomerado foi dissolvido em 8 ml de tampão TE a 1/4, ApÕs /3 2 a adiçao de 2 pmol do iniciador marcado na extremidade com/ y- p -ATp/a amostra foi aquecida durante 5 minutos ã temperatura de 95°C e em seguida colocada durante 5 minutos num banho de agua a 42°C,

Para a sequenciação do fragmento utilizou-se o método de terminação de cadeia por didesoxi essencialmente como descrito por Sanger et al., (Proc, Natl, Acad, Sei, USA, 74, 5463-5467 _? 1977 ) com a modificação de que uma vez que o iniciador era marcado radio, activamente, utilizaram-se desoxi-ribonucleotidos trifosfatos não marcados para a enlongação da reacção.

Os dados da sequência demonstraram que o gene do interferão imune estava integrado dum modo adequado no plasmídeo pGLS,

- Exempl 0' 3

Construção dos plasmrdeos pIFN-yÇ-6), pIFN-yf-7), pIFN-y(-8) pIFN-y(-9), pIFN-y(-TO) e pIFN-y(-ll)

A. Princípios igonucleotídos sintetizados quimicamente que continham codões de paragem traduzidos nas posições desejadas foram ligados com o sitio de reconhecimento único Hinfl do gene IFN-y (Fig,8), resultando finalmente nos fragmentos FC-6), F(-7)’, F(-8], F(-9), F(-10) e F(-ll), Estes fragmentos foram ligados no plasmídeo pDS87RBSII,SphI do que resultaram os plasmídeos pIFN-y(-6), /

7’ ' pIFN-y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-y(-9), pIFN-y(-lO) e pIFN.y(-ll), (Fig. 9).

B, Preparação dos fragmentos F(-6), F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) θ £(.:211 pmoles do plasmídeo pGLS foram digeridos com 15 U de Hinfl (Fig. 8) em tampão de núcleo a temperatura de 37°C num vo lume de 50 pi durante 1 hora, ApÕs digestão o enzima de restrição foi inactivado durante 7 minutos a temperatura de 65°C, a amostra foi extraída com fenol, tratada com éter, precipitada e seca como anteriormente se descreveu, 0 aglomerado foi dissolvido em 50 yil tampão de ligase.

Os oligonucleotidos que incorporavam os adaptadores A(-6), A(-7), A(-8), A(-9), A(-10) e A(-ll) foram sintetizados de acordo com a descrição feita no exemplo 2B, 100 pmoles de adaptadores fo_s forilados foram adicionados em paralelo a 10 pl de plasmídeo pGLS digerido por Hinfl. Apôs a adição de tampão de ligase e 1 U de T4-DNA-1igase, as ligações foram realizadas num volume total de 25 jul ã temperatura de 22°C durante 12 horas, Pararam-se as reacções mediante aquecimento das amostras durante 7 minutos ã temperatura de 65°C. ApÕs precipitação dos grânulos de DNA com etanol estes foram suspensos de novo em tampão de núcleo e digeridos com 15 U de EcoRI e 20 U de HindIII durante 2 horas ã temperatura de 37°C num volume de 50 pl , Apôs a inactivação por aquecimento, extracção com fenol, tratamento com éter e precipitação com etanol, as amostras foram dissolvidas em 10 ml de tampão embebido em gel e submetidas a el ectroforese em gel de pol iacri 1 amida a 6%, As bari das de DNA foram visualizadas por radiação UV a 300 nm_{ As bandas que continham os genes IFN-y foram retiradas do gel e submetidas a

electroforese numa membrana NA45 como foi descrito anteriormente.

DNA marcador utilizado foi o DNA-0 X fagico, digerido com HacIII.

Os DNA's foram eluidos como se descreveu e designados por F(-),

F(-7),F(-8), F(-9), F(-10) e F(-ll) respectivamente.

C. Preparação do plasmídeo pDS8/RBSII, Sphl

Como esta representado na Fig. 9, 2 pmoles do plasmídeo pDS8/RBS11,SphI foram digeridos com 10 U de EcoRI e 10 U de HindIII durante 1 hora ã temperatura de 37°C num volume total de 50 ul.

Apos inactivação pelo calor a enzima e o granulo de DNA precipita do com etanol foram dissolvidos em 10 ul de tampão mergulhado em gel. Apos electroforese em gel de agarose a 1% o fragmento HindIII/EcoRI que continha o terminante Τθ, gene cat, terminante TI , a origem de replicação, o gene bla e o promotor ^25^/0 retirado do gel e eluido como se descreveu anteriormente. 0 gran£ lo de DNA final foi dissolvido em 50 ul de tampão de ligase.

D. Agrupamento dos plasmideos pIFN-Y(-6), pIFN-Y(-7), pIFN-y(-8), pIFN-Y(-9), pIFN-Y(-lO) e pIFN-Y(-ll) ul do fragmento vector e metade da quantidade de cada fragmento isolado F(-6)_s F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) e F(-ll) obtidos no Exemplo 3B foram ligados em paralelo num volume de 20 ul com uma unidade de ligase T4 ã temperatura de 22°C durante 3 horas. Paralelamente fez-se um controlo de ligação sem a presença de quaj_ quer inserção de DNA. A ligação foi detida por aquecimento das amostras durante 7 minutos ã temperatura de 65°C.

As transformações foram realizadas como descreveu Morrison (supra) utilizando-se células de E. coli Ml5 que incorporavam o plasmídeo pDMI,i. As células foram plaqueadas em placas de agar-LB

que continham 100 ul/ml de ampicilina e 25 ug/ml de canamicina co mo se descreveu anteriormente. As placas foram incubadas durante a noite ã temperatura de 37°C.

Como se esperava não foram obtidos transformantes nas ligações de controlo. As ligações que continham o DNA vector mais os fragmentos forneceram cerca de 500 a 1000 colónias. Recolheram-se colónias isoladas com uma palheta dental e desenvol veram-s.e em 10 ml de meio LB como descrito. 0 DNA plasmídico foi extraído de acor I do com o método de Birnhoim et al., (supra). Os grânulos finais foram dissolvidos em 200 ul de tampão TE. 4 ul dos DNA's isolados foram digeridos com 2 U de EcoRI e 2 U de HindIII. Todos os clones ensaiados libertaram fragmentos do tamanho esperado de cer ca de 450 p. b.

Os plasmídeos que continham o fragmento F(-6) foram designa^ dos por pIFN-Y(-6), enquanto que os plasmídeos que incorporavam F(-7), F(-8), F(-9), F(-10) e F(-ll) foram designados por pIFN-Y(-7), pIFN-Y(-8), pIFN-Y(-9), pIFN-Y(-lO) e pIFN-Y(-ll), ) respectivamente. Estes plasmídeos são vectores de expressão para os genes que codificam para os fragmentos de interferão imune recom binante IFN-Y(-6), IFN-Y(-7), IFN-Y(-8), IFN-Y(-9), IFN-Y(-IO) e IFN-Y(-ll) respectivamente (Fig. 10).

-38Exemplo 4

Expressão dos genes IFN-Y em E. coli

A. Pri ncípi o

A fim de demonstrar que os genes de IFN-Y modificados são expressos no E. coli em quantidades elevadas eles foram expressos em E. coli Ml 5 (pDMI ,1), transformada com pIFN-Y(-6), pIFN-Y(-7), pIFN-Y(-8), pIFN-Y(-9), pIFN-Y(-lO) ou pIFN-Y(-ll) e a proteína celular total foi analisada por electroforese de gel de poliacri1 ami da-SDS.

B. Produção de proteínas IFN-Y em E. coli

Células de E. coli M15 que continham o plasmídeo pDMI,1 fo ram transformadas com pIFN-Y(-6), pIFN-Y(-7), pIFN-Y(-8), pIFN-Y(-9), pIFN-Y(-lO) ou pIFN-Y(-ll) e em paralelo com pGLS como um.controlo. Os transformantes desenvolveram-se em meio LB que continha 100 ug/ml de ampicilina e 25 ug/ml de canamicina. Numa densidade Õptica a 600 mm e cerca de 0,7 as culturas foram induzidas com IPTG (conceji tração final 1 roM). Após mais 6 horas de incubação as células foram colhidas por centrifugação.

C. Visualização das proteínas produzidas em E. coli

Células provenientes do volume de 40 ul da cultura foram suspensas de novo no tampão de amostra que continha 3% de SDS, 3% de B-mercapto-etanol, 20% de glicerol e 125 mM de Tris-HCl e pH

6,8. As amostras foram submetidas a ebulição durante 5 minutos, ar refecidas em gelo, centrifugadas a 12,000 x g durante 30 segundos e submetidas a electroforese em gel de poliacri1amida-SDS (12,5% de acrilamida, na proporção de acri 1 amida/bisacri1amida de 30/0,8)

de acordo com o processo descrito por Laemmli (Nature- 227, 680-685, 1970 ). Apos cloração das proteínas com azul brilhante de Coomassie R-250 o corante em excesso foi removido do gel, 0 gel mostrou que os fragmentos de interferão imune recombinante IFN-y(-6), IFN-/(-7), IFN-y(-8), IFN-y(-91, IFN-y(-lO) e IFN-y(-ll) são produzidos no E. coli em quantidades mais elevadas do que o interferão imune maduro recombinante completo apesar do facto de todas as proteínas estarem sob o controlo da mesma sequência de controlo de expressão,

I

Exemplo 5

Purificação dos fragmentos de interferão imune recombinantes

Todos os fragmentos de interferão imune recombinante foram purificados até a homogeneidade pelo método seguinte: Células de

E. coli recombinantes que continham o vector de expressão para um fragmento interferão imune recombinante desenvolveram-se como se indicou anteriormente, Apôs indução com IPTG e 6 horas mais de incubação as células foram centrifugadas a 4000 x g durante 10 minutos a temperatura de 4°C, 0 sobrenadante foi eliminado, A desagregação das células (100 g) foi realizada com cloridrato de guanidina 7 M em tampão de borato de sodio 0,01 M de pH 8,0 (300 ml), A suspensão resultante foi agitada durante 1 hora ã temperatura de 4°C, 0 fragmento de interferão imune recombinante solubilizado foi separado das partículas por centrifugação a 10,000 x g durante 30 minutos ã temperatura de 4°C, 0 sobrenadante foi diluido com 10 v£ zes o volume de borato de sodio 0,15 M de pH 8,0 e as partículas que permaneceram sedimentaram por meio de centrifugação como anteriormente, Ao extracto em bruto foram adicionados 360 g de gel de sílica 100 (partículas de 0,063-0,200 mm), A suspensão foi agitada cuidadosamente para evitar a sedimentação, Apõs 1 hora a agita, ção foi parada, Depois da formação de um sedimento retirou-se o sobrenadante e o sedimento foi transferido para uma coluna com o diâmetro de 5 cm e o comprimento de 17,5 cm, 0 gel de silica da C£ luna foi lavado com cloreto de sodio 1M em borato de sodio a 0,01M de pH 8,0 com um débito de 6 ml/minuto, 0 fragmento de interferão imune recombinante foi eluído com cloreto de tetrameti1-amónio 0,5M e sulfato de amónio 0,7M em tampão de borato de sódio 0,01M de pH 8,0, com um débito de 6 ml/minuto. 0 elufdo foi imediatamente bombeado para uma coluna de feni1sefarose de débito rápido (0,5 cm, comprimento 21 cm, Farmácia, Prototipo gel KK33904) que tinha sido equilibrada com cloreto de tetrameti1-amónio 0,5M e sulfato de amónio 0,7M em tampão de borato de sodio 0,01H de pH 8,0 com um debito de 6 ml/minuto. 0 fragmento interferão imune recombinante foi encontrado no líquido circulante enquanto que as contaminações de proteases foram absorvidas pela matriz, A coluna foi regenerada por lavagem da matriz com tampão de borato de sodfo de pH 8,0, Numa fase seguinte o fragmento de interferão imune recombinante eluí do da coluna de fenil-sefarose foi absorvido numa coluna de fenil-sefarose CL-4B de diâmetro de 5 cm e comprimento 21 cm, Farmácia, equilibrada com sulfato de amónio 0,7Mem tampão de borato de sodio 0,01M de pH 8,0, A coluna foi lavada intensamente e o fragmento in, terferão imune recombinante foi eluído com um gradiente linear de 4 horas contra tampão de borato de sodio 0,01M de pH 8,0, 0 eluído foi diluído com 4 vezes o volume de ãgua e aplicado numa coluna de Fractogel TSK CM-650 (M) (0 2,6 cm, comprimento 18 cm; fierck) equi_ librada com tampão de fosfato de sodio 0,05M de pH 6,0 isento de pirogénio (débito 4 ml/minuto), 0 fragmento de interferão imune r£ *41 ί >

combinante foi diluído utilizando-se um gradiente linear de cloreto de sodio de 0-0,6M, Para a fase de purificação final a fracção do fragmento de interferão imune recombinante foi aplicada numa co luna de Sefadex G-50 super fino (0 5 cm, comprimento 85 cm, Farmácia), equilibrada com tampão de fosfato de sodio 0,05M de pH 7,5 isento de pirogénios.O debito foi ajustado para 2 ml/minuto,

Os fragmentos de interferão imune recombinante purificados por esta via verificaram-se serem homogéneos através de análises por HPLC de fase inversa -18 e electroforese de gel de poliacrilamida-SDS, Para a análise dos aminoácidos do C-terminal as proteínas purificadas foram digeridas com protease V8 de Staphylococcus aureus, Os pe^tídos do C-terminal foram isolados por HPLC RP-18, 1iofi1izados, hidrolisados com ácido clorídrico e submetidos 5 anã lise de aminoácidos, No hidrolisado encontraram-se os aminoácidos esperados,

ApÕs filtração estéril, o fragmento de interferão imune re combinante descobriu ser estável durante vários meses de conser vação a temperatura de 4°C,

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação de fragmentos de interferon imunogéniccs recombinantes homogéneos que exibem uma anulação de 6 a 11 aminoácidos no C-terminal comparado com interferon imunogêni co humano recombinante maduro com o comprimento total, caracterizado pelo facto de se cultivar um microrganismo, transformado com um veículo de expressão replicável capaz de exprimir os referidos fragmentos de interferon, de se desenvolver e exprimir os referidos fragmentos de interferon e de, em seguida, se recuperarem.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caraeterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicável capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo comportando a sequência de aminoácidos seguinte:

X-Y-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-PheAsn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-LeuGly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-MetGln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-PheLys-Asp-ABp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-GluAsp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-AspAsp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-ValGln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-LeuSer-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Z na qual

X representa um resto de metionina e

Y representa um resto de glutamina, ou

X representa um ãtomo de hidrogénio e Y representa um resto de glutamina ou um resto de piroglutamato, e

Z representa:

-43ff

Ser

Ser-Gln,

Ser-Gln-Met,

Ser-Gln-Met-Leu, Ser-Gln-Met-Leu-Phe ou Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg.
3, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, no qual Z representa Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg.
4, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, na qual Z representa Ser-Gln-Met-Leu-Phe.
5, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, no qual Z representa Ser-Gln-Met-Leu,
6, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, no qual Z representa Ser-Gln-Met,
7, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, no qual Z representa Ser-Gln.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma cultura de um microrganismo transfor mado com um veículo de expressão replicãvel capaz de exprimir um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo, como definido na reivindicação 2, no qual Z representa Ser.
9, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se recuperar o referido fragmento de interferon sob a forma de um dímero, trímero ou tetrâmero.
10, - Processo para a preparação de microrganismos capazes de exprimirem fragmentos de interferon imunogénicos recombinantes de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pe lo facto de se transformar um microrganismo com um veículo de expres são microbiano replicãvel e de se codificar a sequência nucleotídi ca do referido fragmento de interferon imunogênico ligado de um mo do operacional a uma sequência de controlo de expressão.
11, - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se combinar uma quantidade eficaz de um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8,como ingrediente activo, com um ou mais veículos aceitáveis em farmácia.
12, - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um fragmento de interferon imunogênico recombinante homogéneo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, como ingrediente activo, com um veículo aceitável em farmácia.