JPS62289600A - インタ−フエロン−γ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） ・本麹゛朋は、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（昼
下、ＣＨＯ細胞という）を宿主として組換えＤＮＡ法で
生産された糖鎖結合型ヒト・インターフェロン−γを純
粋な形で取得し、制癌剤等の医薬として供しようとする
ものである。

（従来の技術） インターフェロン−γはヒト白血球から最初に精製され
ＣＹ−Ｋ、　Ｙｉｐら：プロシーディングスオブ　ザ　
ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　Ｕ　Ｓ　Ａ
　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　。

ＵＳＡ）　　７８．１６０１　　（１９８１）、Ｙ、Ｋ
。

Ｙｉｐら：　プローシーディンゲス　オブ　ザ　ナショ
ナル　アカデミ−オブ　サイエンスＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ）　　７９
　。

１８２０　（１９８２）：ｌ、その構造も明らかにされ
た（　Ｅ、　Ｒｉｎｄａｒ　ｋｎｅｃｈｔら：ザ　ジャ
ーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）２５９．６７９０　（１９８４）〕。一方
、組換えＤ　Ｎ　Ａ法による生産もｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのク
ロニーングＣＰ　、Ｗ、　Ｇｒａｙら：ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２９５．５０３　（１９ｇ２））以後、大
腸菌を宿主とする製品が数多く生産され、臨床試験に供
されている。大腸菌による生産物は糖鎖を有さないこと
及びＮ末端にメチオニンが付加する等、天然型と異なる
構造を有するため、より天然型に近い製品の開発を目的
として、動物培養細胞を宿主とする生産も試みられてい
る［　Ｊ　、　ＨａｙｎｅｓおよびＣ，Ｗｅｉｓｓｍａ
ｎ　：ヌクレイツク　アシツズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　　１１　、６８７（１
９８８）　、　Ｓ、Ｊ、５ｃａｈｉｌｌら：プロシーデ
ィンゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンス　Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

ＳＣｉ、　ＵＳＡ）　８０　、４　（３５４（１９８Ｂ
）　、飢Ｆｕｋｕｎａｇａら：プロシーデインゲス　オ
ブ　ザナショナル　アカデミ−オブ　サイエンスＵ　Ｓ
　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ−５ＣＩ−
ＵＳ　Ａ）　８１　ｔ５０８６（１９８４）：ｌ。水発
明者らも、ｃＤＮＡではなく染色体Ｄ　Ｎ　Ａを使用し
てＣＨＯ細胞等の動物培養細胞に導入して発現する方法
を確立し、既に特許出願した（特開昭６０−２６２５９
’４）。　　　　　゛（発明が解決しようとする問題点
） 動物培養細胞を宿主として生産された組換えヒト・イン
ターフェロン−γは末梢血由来の天然をインターフェロ
ン−γに類似の構造を有すると推定されるが、まだその
点は明らかにされていない。

本発明はヒト・インターフェロン−γ遺伝子ヲ導入され
たＣａＯ細胞によって生産されたヒト・インターフェロ
ン−γを単離し、その構造を明らかにすることによって
構造の明確な糖鎖結合型ヒト・インターコニロン−γを
供給しようとするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、ＣＨＯ細胞によって生産されたヒト・イ
ンターフェロン−γを単ａｈ製し、精製物を電気泳動、
ＦＡＢ質量分析〔ファースト　アトム　ボンバードメン
ト　マス　スペクトロメトリー（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　
Ｂｏｍｏａｒｄｍｅｎｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃ−ｔｒｏ
ｍｅｔｒｙ）　）および気相プロティン　シーク工ンサ
ーによって分析することにより、その構造を明らかにし
、本発明を完成した。なおＦＡＢ質量分析による蛋白の
一次構造解析については、いくつかの論文〔例えば、Ｓ
、　Ａｉｒｒｘｏｔｏら：ヨーロピアン　ジャーナル　
オブ　バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ）　１２９　、２５７　（１９８２）。

Ｔ　、　Ｔａｋａｏら：フエブス　レター（ＦＥＢＳＬ
ＥＴＴ）　１５２　、１　（１９８３）　、Ｃ，Ｖ、Ｂ
ｒａｄｌｅｙら：　バイオケミカル　アンド　バイオフ
ィジカル　リサーチ　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎｕｎ、）　１０
４　、１２２８（１９８２）］によって示されているの
で、上記論文引用により本明細書中に包含されるものと
する。

以下、実施例において本発明を具体的に説明する。

実施例１ ヒトインターフェロン−γ産生ＣＨＯ細胞の取得 ヒト・インターフェロン−γ遺伝子の上流にシミアンΦ
ウィルス（８１ｍ１ａｎ　ｖｉｒｕｐ）　４０　（Ｄｅ
ａｒｌｙプロモーターを連結し、マーカー遺伝子として
Ｅｃｏｇｐｔを有する発現ベクターｐ８Ｖｅ８ｍａ工γ
をＷｉｇｌｅｒらの方法［ＩＢＬＷｉｇｌｅｒらセル（
Ｃｅｌｌ）１１．２２８（１９７７））に準じてＣＨＯ
・Ｋ１細胞（大日本製薬より購入）にトランスフェクト
した。なおｐｓＶｅｓｍａ　Ｉ　　の作成方法について
は特開昭６０−２６２５９４に記述した。

プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め５％牛脂
、児血清（ＧＩＢＣＯ製）を含むイーグルＭＥＭ培地（
日本製）で生育させたｃｕｏ、ｍ胞（３×１０５細胞／
　３．６　ｍｌ！／直径６ｃｍ培養皿）に加え、同じ培
地で１回の培地交換の後、５％牛脂児血清、２５　ｔｔ
ｊｌ／ｍｌ！ミ＝＋７１７−　ル酸、２５０ｐＪｉ／ｍ
ｒキサンチン、０．１　ｐｉ／ｍｌ　７　ミ／プテリン
、５μｍ１／ｍｌチミジンおよび２５　＃ｌ／ｍｌ　７
デニンを含むＭＥＭ培地で更新し、ミコフェノール酸耐
性株を分離した。得られたミコフェノール酸耐性株から
インターフェロン−γ　１〜８ＪＵ／ｍ／　ヲ生産する
ＣＨＯ−２０株を選択した。

実施例２ インターフェロン−γ産生ＣＨＯ細胞の培養３１容の撹
拌培養槽に、１！！の５％牛脂児血清を含むＭＥＭ培地
を入れ、実施例１で得られたＣＩＩＩＩＯ−２０株を３
×１０　細胞／ｍｌになるように接種した。温度３７℃
、ｐＨ７，０，撹拌数１０゜ｒｐｍ、Ｎ２　ｓ　０．２
混合ガス通気によりＤＯ３ｐｐｍに保持して培養を行っ
た。培養開始後、４８時時間上り無菌的に新鮮培地を添
加し、また添加と同量の培養液をフィルターを通して抜
き出した。培養は１０日間実施し、約２万Ｔｌ／ｍｌの
ヒト・インターフェロン−γを産生じている培養液１０
Ｉ！を得た。

実施例３ インターフェロン−γの精製 培養槽からフィルターを通して抜き出した培養上清１０
Ｊ当りに洗浄したＣＰＧ４０（エレクトロ　ヌクレオニ
クス社製）１００ｍｌ！を添加し、ローラーボトル中で
５時間回転した。この処理で培養上清中のインターフェ
ロン−γは完全ニＣＰＧ−１０に吸着した。インターフ
ェロン−γヲ汲着したＣＰＧ−１０を回収し、内径２．
５儒長さ２０ｃｍのガラス製カラムに充填した。このカ
ラムを１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｎＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ７，２、５００ｍ！！で洗浄した後、３
０％（Ｖ／Ｙ）エチレングリコールを含む同緩衝液でイ
ンターフェロン−γを溶出した。

活性画分ａｓｏｍｌ！を集め、１Ｍ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，２で２倍に
希釈した後、これを同緩衝液で平衡化した０ｏｎＡセフ
アロース（ファルマシア社製）カラム（２，５ｃｍＸ　
１２．２譚）に負荷した。カラムを同緩衝液ａ　ｏ　ｏ
　ｍＩ！で洗浄した後、０．３Ｍα−メチル−Ｄ−マン
ノシドを含む同緩衝液ａｏｏｍｚで溶出した。Ｃｏｎ　
Ａセファロースカラムクロマトのインターフェロン−γ
の回収率は約８０％でアラた。また、ＣｏｎＡセファロ
ースへの結合により、回収されたインターフェロン−γ
は糖鎖結合型であることが判明した。

活性画分２００ｍ１！を集め、抗インターフェロンーγ
抗体カラム（ガンマセファロース：セルテツク社製）（
’２．５傭Ｘ２ｃｍ）に負荷した。カラムを１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．１Δ１トリス−塩酸ａ荷液ｐＥ［８
，５、ｌｊＯｍＩ！で洗浄した後、１３１塩化カリウム
を含むＣＡＰＳ（３−（シクロへキシルアミノ）−１−
プロパンスルホン酸）　−ＮａＯＨ緩街液ｐＨ１０，７
，１００ｍ１！で溶出した。溶出液は直ちに１／２体積
の２Ｍ）！Ｊスー塩酸緩衝液ｐＥＩ７．５によって中和
した。次にこのインターフェロン−γ溶液をＰＢ８緩衝
液に充分透析した。

精製インターフェロン−γの比活性は、ＦＬ細胞とラッ
ドビス・・ウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）を
用いた細胞変性効果阻止−色素取込み法［Ｊ、Ａ。

Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、メンツズ　イン　エンザイモロ
ジ＝（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１６ｇｙ　
）　、　７８　。

５ｅｃｔｉｏｎ　４　、１９８１　、］によって検定し
た結果、２−５　Ｘ　１０　１　ＴＪ／ｍｌ・蛋白の値
を示した。

この際、標準インターフェロン−γとしては、Ｎ工■よ
り入手した国際標應インターフェロン−γ（Ｇ、Ｆ　２
Ｂ−９０１−５８０）を用いた。又、蛋白定量はクーマ
シーブリリアントブルーＧ−２５０を用いる蛋白定量キ
ット（バイオラッド社製）を用い、標ｉ蛋白としては同
キットに含まれる牛血清アルブミンを用いた。全精製収
率は培養上清中のインターフェロン−γ総活性に対して
４０％であった。

実施例４ インターフェロン−γの分子量 精製インターフェロン−γ　１０μ、７をＳＤＳポリア
クリルアミドゲル（厚さ１１１１Ｉ１１のスラブゲル）
電気泳動にかけ銀染色したところ分子量約２６，０００
を中心とする位置に複数のバンドが接近して見られ、分
子量約２１．０（）Ｏの位置にもバンドが見られた。ま
た分子量約５０，０００の位置にも僅かにバンドが見ら
れた。

精製インターフェロン−γ１５μ、９を０．１％ＳＤＳ
溶液中で室温１時間処理した後、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけゲルを１ａｌｌ１幅にスライス
して蛋白を抽出し、インターフェロン−γ活性を測定し
た。その結果、染色で観察されたすべてのバンドに活性
が認められた（第１図参照）。染色したゲルをデンシト
メーター（島津Ｏ８−９１０デュアル　ウェイブレンゲ
ス　ティーエルジ−スキャナー）でスキャンし純度測定
を行った結果、９５％以上の純度を示した（第２図参照
）。

実施例５ 密度勾配等電点電気泳動 精製インターフェロン＝γ　１．３．ｍ、ｐ　ヲｐＨ＠
ＦＭ３．５〜１０のファルマライト（ファルマシア社製
）を用いたショ糖密度勾配等電点電気泳動（カラム：　
ＬＫＢアンフオライン　カラム　１１０ｍＪ）に負荷し
た。インターフェロン−γは等電点６．４７〜９，９０
の範囲に６本の活性ピークを示した（第３図参照）。

精製インターフェロン−γ　１．８ｍｌをノイラミニダ
ーゼ（ワージントン社製）５００！Ｔｌユニツトトトモ
にクエン酸−リン酸２ナトリヮム８％液ｐＨ５，０中で
３６．５℃、２４時間インキュベートした後、ショ糖密
度勾配等１点電気泳動にかけた。

インターフェロン−γ活性は等電点１０．４５に単一の
活性ピークを示し、インターフェロン−γの糖鎖がシア
ル酸を含むことが確認された（第４図参照）。

実施例６ ＦＡＢ質量分析によるアミノ酸配列の解析精製インター
フェロン−γ　１００μｍをＶｓ　プロテアーゼ（スタ
フィロコッカス由来、ワージントン社製）２μｙととも
にｐＨ７，８で３６．５℃、２４時間消化した。得られ
たペプチドの混合物をＦＡＢ質量分析計（日本電子ＪＥ
ＯＬ−ＨＸＩ００ダブル　フォーカシング　マス　スペ
クトロメーター）で質量分析し、各ペプチドの質量を測
定した。ＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列と■８
プロテアーゼの、１１特異性を基に生成するペプチドを
推定し質量の理論値を算出した。この値と前記の質量分
析結果を照合し、各ペプチドの同定を行った。ざらに■
８プロテアーゼでインターフェロン−γを消化して得ら
れたペプチド混合物を１回エドマン分解し、すべてのペ
プチドのＮ末端アミノ酸を除去した後、再びＦ　Ａ　Ｂ
質量分析針で質量分析を行い、エドマン分解前後のペプ
チドの質量の差から前記の同定したペプチドのＮ末端ア
ミノ酸を確認した。また更にｖ８プロテアーゼによる消
化と同様の実験をトリプシン（ワージントン社製）を用
いて行った。これらの結果からインターフェロン−γの
アミノ酸配列がほぼ判明した。

しかし、以上の実験ではＣ末端アミノ酸配列を一確認す
ることはできなかったため、精製インターフェロン−ｒ
ｌ、７６ｍ！ｉを前記と同様ｖ８プロテアーゼ３６μＩ
とともにｐＨ７，８で３６．５℃、２４時間インキュベ
ートしペプチド断片とした。

このペプチド混合物全量をＯＤＳカラムを用いた高速液
体クロマトグラフィーにかけてペプチドを分離した。溶
出は０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中、アセトニトリ
ル濃度０〜６０％（ｖ／ｒ）の濃度勾配を用いた。溶出
した各ピークを分取し、濃縮した後、ＦＡＢ質量分析計
を用いて質量を測定゛　した。一方ＤＮ’Ａ配列から予
想されたインターフェロン−γのアミノ酸配列とｖ８プ
ロテアーゼの基質特異性を基に生成する可能性のあるＣ
末端ペプチドを推定し、その理論的質量を算出した。Ｆ
ＡＢ質量分析の質量測定結果と前記の算出した理論値を
照合してＣ末端ペプチドを同定した。

以上の結果からＣＨＯ細胞により生産されるインターフ
ェロン−γは、アミノ酸配列のＮ末端がピログルタミン
酸で始まり、Ｃ末端は１２７Ｇ１ｙ。

１２８Ｌｙｓ、１’２９Ａｒｇ、１８０Ｌｙｓ、１３１
Ａｒｇ、１８２Ｓｅｔ、１８８ＧＩｎ、１３４Ｍｅｔ。

の各々で終るインターフェロン−１分子の混合物よりな
ることが明らかになった。得られた全アミノ酸配列は下
記一般式に示す通りである。

ｐＧｌｕＡｓｐＰｒＱｒＶａＩＬｙｅＧｌｕＡｌａ　Ｇ
：ＬｕＡａｎＬｅｕＬｙｅＬｙｓＴｙｒＰｈｅ　Ａｓｎ
ＡｌａＧｌｙＨｉｓ　５ｅｒ２１　　　　　　　マ　　
　　　　　　　８０４０ＡｓｐＶ４１Ａｌａ　ＡｓｐＡ
ａｎＧ１ｙ％ｘＬｅｕＸ’ｈｅＩａｕＧｌｙ工１ｅｋｕ
Ｌｙｓ　ＡｓｎＴｒｐＩ、ｙａＧｌｕＧｌｕ８ｅｒＡｓ
ｐＡｒｇ１．ｙｓ　ｎｅ＆１ｔＧｌｎＳｅｒＧｌｎ　ｎ
ｅＶａｌＳｅｒＰｈｅ　ＴｙｒＦｈｅｌｔａＬｅｕＰｈ
ｅＩｙｓＡｓｎＰｈｅＬｙａＡｓｐＡａｐＧｌｎ８ｅｒ
ｎｅＧｌｎＬｙｅ８ｏｒＶａｌ　ＧｌｕＴｈｒ工１ｅＬ
ｙａＧ１ｕＡｓｐ＆ｔＡｓｎＶａｌＬ）ｒｓ８１９０　
　　　　　　　　マ　　　１００ＰｈａＦｈｅＡａｎ８
ｅｒＡａｎＬ）ｒｓＬｙｅ　ＬｙｅＡｙｇＡｓｐＡｓｐ
ＰｈｅＧｌｕＬｙｓＩａｕＴｈｒＡｓｎＴｙｒ　８ｅｒ
Ｖａ１’ＦｈｒＡｓｐｂｕＡｍＶａｌＧｌｎＡｒｇＬｙ
ｓＡｌａ　ｎｏＥｉｓＧｌｕＬｅｕ工１ｅＧ１ｎＶａ１
ＭｅｔＡ１ａＧ１ｕＩａｕｅａｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａ
ｌａＬ）ｒｓ　Ｔｈｅ　ＧｌｙＬｙｓ　ＡｒｇＬｙｓ　
Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｕｎ　ＭｅｔＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　ＡｌａＬｙｓ　Ｔｈｅ　ＧｌｙＬｙｓ　ＡｒｇＬｙ
ｓ　Ａｒｇ　Ｅｓｒ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　Ｐｒｏに巨Ａ１ａ
ＬｙｓＴｈｅ　ＧｌｙＬｙｓＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　５
ｅｒＳｅｒＰｒｏＡｌａＡｌａＬｙｓ　’ＩｈｅＧｌｙ
’ＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｒｇ３ｅｒＰｒｏ足ゐＱ山戸ｎ
℃Ｇ１７勾〜に名勾旧Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ
Ｌｙｓ　’Ｉ’ｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＥ３ｅｒ
　Ｐｒｏ　ｌｕａ　ＡｌａＬｙｓ　’ｆ’ｎ０ＧｌｙＬ
ｙｓＳｅｒＰｒｏ　Ａｌａ　ＡｌａＬｙｓ　’Ｉｈｅ　
Ｇｌｙ（式中、マは糖鎖結合部位を示す） 実施例７ 糖鎖結合位置の解析 糖鎖結合位置の決定をＥ、　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ
　らの方法〔ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカルケ
ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｎ、）　２５
９　、６７９０（１９８４）：ｌに準じて行った。すな
わち精製インターフェロン−γ７．Ｏｍ、９をトリプシ
ン１４０μｙとともにｐ　Ｈ７，８で３６．５℃、２４
時間インキュベートした後、得られたペプチドの混合物
を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５％重炭酸アンモ
ニウム緩逝液ｐＨ７，８で平衡化したＣｏｎＡセファロ
ースカラム（ｌｃ、ｚＸ８ｃ：！Ｌ）に負荷した。カラ
ムを同緩衝液１５ｍ１！で洗浄した後、０．２Ｍ　α−
メチル−Ｄ−マンノシドを含む０．５％重炭酸アンモニ
ウム緩衝液ｐ　Ｈ７，８の６ｍｒで糖鎖結合ペプチドを
溶出した。溶出液をＦＤＩＯセファデックス０２５カラ
ム（ファルマシア社製）を用いて０．５％重炭酸アンモ
ニウム緩衝液ｐＥ［７，８に緩衝液交換をした。緩衝液
交撲液約７ｍｌ！をＯＤ８高速液体クロマトカラムに負
荷した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液ｐＨ２中ア
七ト二トリル濃度θ〜６０％（Ｖ／Ｖ　）の直線濃度勾
配で溶出した。アセトニトリル濃度的２０％および約３
０％の位置に、各々２〜４本のピークが溶出されたので
、各溶出位置で最も大きなピークを各々分取し、濃縮し
た後、気相プロティン・シークエンサー（アプライドバ
イオシステムズ社製、モデル４７０Ａ）　　を用い、エ
ドマン法によりアミノ酸配列を解析した。

その結果、アセトニトリル濃度的２０％で溶出される糖
鎖結合ペプチドは９５ＬｅｕをＮ末端とし９７Ａｓｎを
含むペプチド断片であり、またアセトニトリル濃度的３
０％で溶出される糖鎖結合ぺプチドは１４　ＴｙｒをＮ
末端とし、２５Ａｓｎを含むペプチド断片であることが
判明した。

一般に、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖は、アミノ酸配列上の
Ａｓｎ　−（ｘ）　−８ｅｒまたはＡｓｎ−（ｘ）　−
Ｔｈｒの配列中のＡｓｎに結合していることは良く知ら
れていることである（Ｗｉｎｇｌｅｒ、Ｍら、ホルモ−
ナル　プロテインズ　アンド　ペプタイズ、アカデミツ
ク　プレス、ニューヨーク（ＨｏｒｍｏｎａｌＰｒｏｔ
ｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｌ’ｅｐｔｉｄｅｓ、　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　。

ＮｅｗＹｏｒｋ）　ｐ、１　（１９７３）ｌｏ　　上記
実験結果および実施例６のアミノ酸配列解析結果より、
ＣＨＯ細胞により産生されるヒト・・インターフェロン
−γの糖鎖は、２５　Ａｓｎおよび９７ＡＳｎに結合し
ていることが強く示唆された。この位置の存在は、末梢
血由来のヒト・インターフェロン−γの結果（：　Ｅ、
　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、ジャーナルオブバイオ
ロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｉｈｅｍ
、）２５９．６７９０（１９８４））に一致する。また
実施例６で示した２５Ａｓｎと９７　Ａｓｎを含む各ペ
プチドのアミノ酸配列は、糖鎖の結合していないペプチ
ドよりＦＡＢ質量分析計で解析した結果である。したが
って、実施例４，６および本実験結果から、ＣＨＯ細胞
により産生されるヒト・インターフェロン−γは、２５
Ａｓｎと９７　Ａｓｎ　　の両位置に糖鎖を有するもの
、２５Ａｓｎのみに糖鎖を有するもの及び９７　Ａｓｎ
のみに糖鎖を有するものの混合物よりなることが推察さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製インターフェロン−γを１２．５％アクリ
ルアミドを含む５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動した後、各ゲルスライス中より抽出シたインターフ
ェロン−γの活性を示す。 第２図は、精製インターフェロン−γを１２．５％アク
リルアミドの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳
動した後、銀染色したものをデンシトメーターで測定し
た結果を示す。 第３図は、精製インターフェロン−γのショ糖密度勾配
等電点電気泳動のクロマトグラフィーを示す。 第４図は、精製インターフェロン−γをノイラミニダー
ゼ処理した後のショ糖密度勾配等電点電気泳動のクロマ
トグラフィーを示す。 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士　浅　野　真　− 才　２　図 今→ｇ−（ｇｔｏす ＝＋　ζ゛−−１嶋　う ｒｒｗ−ｒ　　；ｔ　ｉＬ（ｔｔ７−ｔ）１ＦＮ４　　
；’ｋ　　すｔ　　（ｔｔｎｔ’ｔ１乙−）手続補正書
（方（ １、事件の表示 昭和６１年　７奇　１ヤ　願第３４０５９号３、補正す
る者 事件との関係　　　特許出皿人 住　所　　　大阪市北区中之島三丁目２番４号エ　、格
称）　（０？＋）鐘淵化学工業株式会社５、補正命令の
日付（督エリ　　ｖ４妙６Ｑｌｄ３０Ｈ８・補正の内容
　１カ伽、　７３１ニア１．１今１２１ｔ別代−１打り
シ。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト・インターフェロン−γ遺伝子を導入された
   ＣＨＯ細胞によつて産生される、一般式： 【アミノ酸配列があります】 （ただし、Ｘ、ＹはＨ又は糖鎖をＺはＧｌｙ、Ｇｌｙ　
   Ｌｙｓ、Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ、Ｇｌｙ　ＬｙＳＡｒ
   ｇ　Ｌｙｓ、Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ
   、Ｇｌｙ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ、Ｇ
   ｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｇｌｎ
   、またはＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＳｅ
   ｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔのいずれかを表す。またｐＧｌｕは
   ピログルタミン酸を表す。） で表わされるヒト・インターフェロン−γ又はこれらの
   混合物よりなるヒト・インターフェロン−γ。
2. （２）糖鎖の末端にシアル酸を有する特許請求の範囲第
   １項記載のヒト・インターフェロン−γ。
3. （３）等電点電気泳動において複数のピークを示す特許
   請求の範囲第１項または第２項記載のヒト・インターフ
   ェロン−γ。
4. （４）ヒト・インターフェロン−γ遺伝子を導入された
   ＣＨＯ細胞を培養し、培養液から次の一般式： 【アミノ酸配列があります】 （ただし、Ｘ、ＹはＨ又は糖鎖を、ＺはＧｌｙ、Ｇｌｙ
   　Ｌｙｓ、Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ、Ｇｌｙ　ＬｙｓＡ
   ｒｇ　Ｌｙｓ、Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒ
   ｇ、Ｇｌｙ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ、
   Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｇｌ
   ｎ、またはＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　
   Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔのいずれかを表す。またｐＧｌ
   ｕはピログルタミン酸を表す。） で表わされるヒト・インターフェロン−γ又はこれらの
   混合物からなるヒト・インターフェロン−γを採取する
   ことを特徴とするヒト・インターフェロン−γの製造方
   法。
5. （５）ＣＨＯ細胞の培養を浮遊撹拌培養により行う特許
   請求の範囲第４項記載のヒト・インターフェロン−γの
   製造方法。