JPS6169800A - 免疫インタフエロンおよびその精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、次に示すアミノ酸配列を有し、Ｃｙｓ　Ｔｙ
ｚ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＴｙＴ：Ｖａｌ
　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｌｓｕ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅ：　λ５ｐｖａＩＡｌａ　Ａｓｐ　Ａ
ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｚ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　　Ｉｌｅ　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｚｐ　ｌ、、
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　！５ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｚｇ　Ｌ
ｙｓ　　ＩＩｓ　ＭｅｔＧｉｎ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｅｌ
ｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ：　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ：　Ｐｈｓ　［
、ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｅ’ｈｅＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｌｙｓ　５ｅｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｚ　Ｉｌｅ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓ　ＰｈｅＰｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｇ
　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　
ＧｌｕＬｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｘ　ＡｉｎＴｙｒ　Ｓｅｔ
、Ｖａｌ　Ｔｈｚ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＶａｌＧ
ｉｎ　ｋｘｑ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｌａｕ　　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌ
ａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ：Ｆ’ｚｏ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｚ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡｚｇＬｙｓ　
ｋｘｑ　Ｓｅｘ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　ｌ＋＋ｅｕ　Ｐｈｅ
Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡｌａＳｅｔ　　Ｇ
ｉｎ その配列はアミン末端にさらに任意にメチオニン残基を
含み、本質的にそのたん自分解析片を有しないヒト免疫
インタフエロンに関するものであり、またそのようなヒ
ト免疫インタフエロンを含有する医薬組成物に関するも
のである。本発明はまた本質的にそのたん自分解析片を
含まない完全なヒト免疫インタフエロンの製造法に関す
るものであり、該製造法は完全な組み換えヒト免疫イン
タフエロンをそれを含む形質転換微生物よりプロテアー
ゼまたは酵素活性は阻害するが免疫インタフエロンの生
物活性には影響しないような抗たん自分解試薬、例えば
グアニジン塩酸、で抽出し、得られる抽出インタフエロ
ンを免疫インタフエロンに対する新規なモノクローナル
抗イ木を用いて［１することより成る。

先行技術の発明でインタフエロンとして知られる抗ウイ
ルス性たん白質群の抽出および精製を行なういろいろな
方法が考案されている。現在、インタフエロンには三種
の主要グループが知られている：ＩＦＮ−α（白白球イ
ンタフェロン）、ｒＦＮ−β（線雑芽細胞インタフエロ
ン）およびＩＦＮ−γ（免疫インタフエロン）である。

これらのインタフエロン群は、抗ウイルス性、増殖阻害
活性あるいは構造配列の点から類似しているが、これら
全ての群のインタフエロンを抽出、精製する統一的な方
法は確立されていない。実際に白血球インタフエロンを
他のたん白質や細胞残漬の粗混合物より抽出し、精製す
るのに有効な方法の多くは、同様な粗混合物より線維芽
細胞インタフエロンまたは免疫インタフエロンを抽出、
精製することは出来ない。

従来用られる精製での抽出は、多くの場合組換え技術を
用いて目的の“異種たん白″を生産した微生物を、物理
的（例えば音波破砕）或いは化学的溶菌により破壊する
のが典型であった。しかし、この物理的または化学的な
溶菌工程中に細胞の種種のプロテアーゼも混合液中にＭ
Ｍする。これらのプロテアーゼは液中の異種たん白質に
自由に酵素的に作用し、分解できる。従ってこれらのプ
ロテアーゼは“異種゛′たん白を完全なまたは仕上った
生物的活性型の単一物質として精製するのを妨げ、或い
は阻害する。

従って、先行技術の抽出および精製法の限界を克服する
方法を提供し、それにより免疫インタフエロンの完全配
列の型を冑、精製免疫インタフエロン標品からたん自分
解による断片を除去することが本発明の目的である。

さらに、均質で完全な型の免疫インタフエロンを１ｑる
ことが本発明の目的である。

免疫インタフエロンの場合、先行別技に記載される従来
のいかなる抽出および精製技術を用いてもそのま）の、
または完全なアミノ酸配列を有する完全に均質な免疫イ
ンタフエロン標品を得ることが出来ない。最近になりは
じめて組換え技術の進歩により十分量のｒｌＦＮ−γを
１ｑて性質を明かにし、そのアミノ酸配列を決定するこ
とが可能になった。従来の先行技術を用いて　ｒｌＦＮ
−γの抽出を行ない、精製標品のアミノ酸配列を決定す
ると、精製標品が、事実、異なる分子量の各種関連たん
白樺より成ることがわかった。アミノ酸配列決定により
さらにこれらのたん白樺は完全なたん白の断片の多くを
組み合せた免疫インタフエロンそのま）の配列であるこ
とがわかった。、ｆｆｉくことに、先行技術の標品は完
全な免疫インタフエロンとその断片を含んでいることが
わかったが、このような混合物成分も生物活性を維持し
ていることがわかった。

ｒｌＦＮ、−ｒの抽出は音波処理または化学的溶菌を用
いて行なう。しかし　ｒＩＦＮ−γ（それから得られる
ＤＮＡ塩基塩基配列上３アミノ酸配列は参考文献１に記
載される）は音波処理または化学溶菌の工程で分解され
る。しかし凍結細胞の音波処理では主として１５Ｋｒｌ
ＦＮ−γ、即ち、第１３２、ｆｆｉ目から１４６番目の
Ｃ大端アミノ酸残基を除去した　ｒｌＦ：Ｎ−γ、が（
ｑられる。このような分解は抽出の際塩酸グアニジンの
ようなｒｌＦＮ−γの生物活性やアミノ酸配列に抽出条
件下では影響しない試薬を用いることにより防止できる
。さらに驚くことに、免疫インタフエロンは精製標品に
グアニジン塩酸を加えると生物活性が失なわれるにも拘
ず、塩酸グアニジン抽出しても生物活性が保持されるこ
とが明かとなった。

従って、本発明はそのよ）の完全な配列を有する組換え
ヒト免疫インタフエロンより成る。本たん白質はそれを
含む形質転換微生物より、抽出過程でプロテアーゼや酵
素活性を阻害するが抽出条件下で目的たん白の活性には
影響しないと思われる試薬（またはその混合物）、例え
ばたん白変性剤であるグアニジン塩酸塩を用いて該微生
物を処理することにより）ｑられる。精製ｒｌＦＮ−γ
は抽出上澄液を、出来れば適当に希釈した後、直１ｇ粘
製１好ましくはモノクローナル抗体カラムにのせること
により得られる。抽出および精製工程は大量製産の場合
自動化できる。従って、本発明によりはにめて多聞の均
質ｒ［ＦＮ−γが供給可能となり、その結果人々的な臨
床試験、生物試験、Ｘ−線結晶回折および購造活性研究
が出来るようになる。

本発明で用いる抗たん自分解削はグアニジン塩のいずれ
でもよい。グアニジン塩としては例えば酢酸のような有
様酸塩、或いは例えばハロゲン化水素、即ち、臭化水素
、塩化水素、弗化水素および沃化水素のような鉱酸との
塩などがある。好ましいグアニジン塩は塩酸グアニジン
である。微生物を処理する時のグアニジン塩の濃度は決
定的ではなく、効果のある濃度なら使用できる。しかし
微生物処理には３−７Ｍのグアニジン塩溶液を使用し、
菌体１グラム当り３−９１８容最の塩溶液を用いるのが
好ましい。４ｇ溶液は水または水性緩衝液、例えば酢酸
アンモニウム、ピリジン／酢耐等、を溶媒として作製す
る。また本発明の実施においては、例えば尿素や硫シア
ン酸塩などのような他のプロテアーゼ阻害剤も使用でき
る。

さらに好ましい具体例を以下の明細および実施例で示す
。

Ｅ、ｃｏｌｉ中に生産された組換えヒト免疫インタフエ
ロンは凍結細胞より７Ｍ−塩酸グアニジンで抽出し、好
ましくは新規のモノクローナル抗体アフィニティーカラ
ムを用いた精製方法で精製する。

グアニジンにより５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける見かけの分
子量ｉｓ、ｏｏｏダルトン（１８Ｋ）の精製インタフエ
ロンが得られ、グアニジン非存在下の音波処理抽出では
より低分子の種（主要種はおよそ１５．０００ダルトン
、１５Ｋ）が単離される。１８におよび１５にの両たん
白兵アミノ末端配列はこのヒト免疫インタフエロンたん
白をコードするＤＮＡから予想される配列と一致した。

本発明を通して記載される１８に免疫インタフエロンの
ＤＮＡ配列は下の式の通りである：ＡＧＧＡＧＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧ　τＧＴ　ＴＡＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＣ
Ａ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣＡＧＡＡ　
ＡＡＣＣＴＴ　ＡＡＧ　んυ、ＴλτＴττＡＡＴ　Ｇ
ＣＡ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ’　ＧＴＡ　Ｇ
ＣＧＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣ−、ＣＴＴ　ＴτＣ
ＴＴＡ　ＧＧＣＡＴＴ　ＴｒＧ　　ＡＡＧ　ＡＡＴ　Ｔ
ＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧＧＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＣＡＣ
Ａ　ＡＡＡ　　ＡＴＡ　　ＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＧＣ
ＣＡＡ　　ＡＴＴ　　ＧＴＣＴＣＣＴＴＴ　　ＴＡＣＴ
ＴＣＬ購ＣＴτＴ−思出ＣＴＴＴ　Ａｊ五ＧＡＴ　ＧＡ
ＣＧＡＧ　ＡＧＣＡＴＣＣＡＡ　ＡＡＧＡＧＴ　ＧＴＣ
ＧＡＣＡｃｅ　ＡＴＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣＡＴＧ　
ｋＡＴ　ＧＴＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＣＡＡＴＡＧＣＡ
ＡＣＡＡＡ　ＡＡＧ　ｍ　ＣＧＡ　ＧＡＴ　ＧＡＣＴＴ
ＣＧＡＡ　ＡＡＧ　、ＣＴＧ　ＡＣＴＡＡＴ　ＴＡＴτ
ＣＧ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴＣ
ＣＡＡ　ＣＧＣＡＡＡ　Ｇ（Ａ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡ
Ａ　ＣＴＣＡＴＣＣＡＡ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　Ｇ
ＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＡＡ
Ａ　ＡＣＡ　ＧｃＧ　ＡＡｃＣＧＡ　ＡＡＡＡＧＧＡＧ
ＴＣＡＧ　ＡＴ（２ＣＴＧ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　
ＣＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＴＣＣＣＡＧ立Δ但し、１１
　Ｘ　１１の下の塩基はりボゾーム結合部位および翻訳
開始シグナルをコードし、“Ｙ゛の上の塩基は翻訳停止
シグナルをコードする。

１８Ｋ　　ｒｌＦＮ−ｒから遊離するＣ−末端ペプチド
を精製後分析および配列決定して決定したＣ末端配列は
ｒｌＦＮ−γの予想されるアミノ配列と一致し、これは
１８に種が完全な分子であることを示す。本川ｉｓに記
載する１８に免疫インタフエロンのアミノ酸配列は次の
式で示される：Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓ
ｐ　Ｐｅｏ　Ｔｙｃ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ａｌａ
　ＧｌｕＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｔ　Ｐ
ｈ＠Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　ａｅｒ　Ａｓｐ
Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ＬｅｕＬｙｓ
　Ａｓｎ　Ｔｚｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒｒ
：　Ａｓｐ　ｋｘｑ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＭｅｔＧｉｎ　
Ｓａｒ：Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　ＶａＬ　Ｓｅｘ　Ｐｈｅ　Ｔ
／ｒ：　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　　Ｌａｕ　：’ｈａＬｙｓ　
Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓ
ａｒ　Ｅｌｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓ＠ｘＶａＬ　Ｇｌｕ
　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　
Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＥ’ｈｅ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｘ　Ａｓｉ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　１．、ｙｓ　Ａｒｇ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＧＬｕＬｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈ
ｚ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｗ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ
　Ｌａｕλｓｎ　ＶａｌＧｉｎ　ＡＪ：ｇ　Ｌｙｓ　Ａ
ｌａ　Ｚｌｅ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌ
ｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　
　Ｐ＋：ｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　ＬＹＳ　ｋＥｑＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　
ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　ＡＪ：ｑＧＩＹ　Ａｚｇ　Ａ
ｒｇ　ＡｌａＳｓ＋ｃ　　Ｇｉｎ 免疫インタフエロンたん白の７ミノ末端にさらにメチオ
ニン（Ｍｅｔ）残基を含むものも本発明の考察範囲に含
まれる。従って１８ＫｒｌＦＮ−ｒはアミノ末端がメチ
オニン或いはシスティンで始まるポリペプチドおよびそ
れらの混合物より成る。

本発明の好ましい具体例では、醗酵工程で受容菌として
用いられ、他に記載がない限りは、使用する（紋生物は
英国特許Ｎ０．２０５５３８２△に記載されるＥ　ｓｃ
ｔ＋ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　Ｋ　−１２２９４
株であり、水筒は１９７８年１０月２８日付けでＡｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐｅ　Ｑｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎにＮｏ。

３１４４６の番号で寄託されている。さらに全ての紺換
えＤＮＡ実験はＮａｔｉｏｎａｌ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅｓ　ｏｆｌ（ｅａｌｔｈの適用ガイドラインに沿っ
て行なわれた。

しかし、本発明は上述のＥ、ｃｏｉｌ　　Ｋ−１２２９
４株のみを含蓄するものでなく、他のＥ、ｃｏｉｌ　　
株、例えばＥ、ｃｏｌｉ　　ＭＡ２１０あるいはＥ、ｃ
ｏｌｉ　　ＲＲｌ（ＡＴＣＣ−３１３４３）、または多
くが公的に入手可能か、Ａ　ｌ１ｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　（ＡＴ
ＣＣカタログ参照）などの認められた微生物寄託機関に
寄託され、入手可能であるような池の微生物舎も含蓄す
る。

本発明に従えば上述の新規免疫インタフエロンは他の既
知のインタフエロンと同じ目的、叩ら、ウィルス性また
は腫瘍性疾患の予防や治療、或いは免疫抑制状態の治療
の目的に使用できる。インタフエロンは医薬的に容認さ
れる経口用、注射用または局所用組成および方式で投与
される。投与■および投与回数は既知インタフエロンの
臨床応用に現在用いられているものと対応し、典型的に
はおよそ毎日１−２００Ｘ１Ｃ１単位である。本発明に
よる医薬組成物は共存し得る医薬的に容認される担体物
質と合わせてインタフエロンを含有する。従来のいかな
る担体物質も利用できる。担体物質は内服、経皮または
非経口段用に適した有償、無機の不活性担体である。適
当な担体としては水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、
でん粉、ステアリ酸マグネシウム、タルク、植物油、ポ
リアルキレングリコール、黄色ワセリンなどが含まれる
。さらに医薬調合剤は他の活性剤も含むことがある。香
味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液などのような添
加剤も医薬品製剤の容認されるＭｌｌに従って添加され
ることができる。

医薬品調合剤はいかなる慣習的な型にも作り上げること
ができる。例えば；ａ）錠剤、カブビル、火剤、粉末、
粒剤なとのような軽口投与用の固体：ｂ）溶液、シロッ
プ、けん溶液、エリキシルなどのような経口投与用の液
体：Ｃ）滅菌した溶液、けん濁液または乳化液のような
注射用調合剤；およびｄ）溶液、けん濁液、軟こう、ク
リーム、ゲル、微小粉末、エアゾールなどのような局部
投与用調合である。医薬調合剤は滅菌し、かつ／または
保存剤、安定剤、浸潤剤、乳化剤、浸透圧変化用の塩お
よび／または緩衝液のようなアジュバントを含有する。

非経口投与用形態は静脈内または筋肉的注入できる注入
液または注射液である。これらの調合剤もまた他の医薬
的活性物質を含有できる。保存剤、安定剤、乳化剤、緩
衝液のような添加物が医薬品製剤の容認される慣習に従
って添加される。

〈実施例　１〉 抗原と１ノて用いた担体たん白−ポリペプチド複合体の
合成 ポリペプチドＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｏ−８
ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ　−Ａ　　ｒＯ−Ａ　　ｒ（］　−Ａ　　Ｉａ　−Ｓ
　　ｅｒ　−Ｇ　　Ｉｎ　−０ト１　を　Ｇ　ｏｏｄｆ
ｒｉｅｎｄ　　ら、３　ｃｉｅｎｅｅ　　１４４巻、１
３３４頁（１９６４年）の方法に従ってヂログロプリン
（以ＩＴＧと略す）とカップルさせた。

ペプチド自身は従来から知られるペプチド合成の方法で
作製した。多くの場合液相合成法の方が有利であったが
、固相、液相の画法とも使用できる。そのようペプチド
合成法は例えば“Ｔｈｅｐ　ｅｐｔｉｄｅｓ”、第１巻
、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　
、ＵＳＡ、１９６６年中で５ＣｈｒＯｄｅｒおよびＬ　
ｕｂｋｅ　　により、”　Ｐ　ｅｐｔｉｄｅ　　Ｓ　ｙ
ｕｔｈｅｓｅｓ”、丸首、東京、１９７５年中で泉谷ら
により、或いは“Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　３
　ｉｏｃｈａｍｉＢｒｙ　”　（生化学実験講座）、第
１巻、２０７−４００頁、東京化学同人、１９７７年中
で矢島冶明により記載されており、アジド法、塩化法、
無水酸法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法
、Ｗｏｏｄｖａｉｄ試薬Ｋを使用する。方法、カルボジ
イミダゾール法、酸化−還元法およびＤＣＣ／添加物（
例えばＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ　、ＨＯ８ＬＩ　）　法’、
）とがある。

ＩＦＮ−γの１３１−１３６断片の調製の詳細な記載は
欧州特許出願Ｎｏ、１０３８９８参照のこ乙 ２．５ｍｏの該ポリペプチドを３．７５ｍｇのＴＧと混
ぜ、５０ｍＭりん酸緩衝液を２ｍｌ添加した後、混合物
を水冷浴中でよく撹拌した。これに２００ｍ１の蒸溜水
に３０．４ｍｑの塩酸カルボジイミドを溶解した溶液を
一滴ずつ徐々に添加した。その後、混合物を水冷浴中で
３時間撹拌した。反応終了後蒸溜水に対して十分透析を
行ない、凍結乾燥して４．７１１１（＋のたん白根合体
を得た。

〈実施例　２〉 ＥＩＡのための酵素結合抗原ハＪ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７９巻、２３３＠（１９７
６年）の北側らの方法により調製した。

（１）　ポリペプチドへのマレイミド基の導入実施例１
で１７られたポリペプチド （３５０ｎｍｏｌｅ　）を１１００１Ｉりん酸緩衝液（
Ｄ１１６．８）１ｍｌに溶解し、この溶液を５８５μｇ
（１，７５μｍｏｌｅ）のＮ−（４−力）Ｌｔ；ｔ、＊
ジシクロヘキシルメチル）マレイミド　Ｎ−ヒドロキシ
−コハク酸イミドエステルを７０μｍのＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド１．：溶解した溶液に添加し
た。氾合液を３０℃で３０分間撹拌した。反応終了後、
セファデックスＧ−２５のカラムで分画を行ない、マレ
イミド基が導入されたポリペプチド画分１８５　ｎ１ｏ
ｌｅを得た。

（２）　マレイミド基含有ポリペプチドとβ−１〕−ガ
ラクトシダーピとのカプリング マレイミド基含有ポリペプチド （１６，５ｎｌｌ１０＋８　）を３．３ｎｍｏｌｅのβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼと混合した。４℃で１８時間反
応後、反応を停止するため４１２．５ｎｍｏｌｅのβ−
−メルカプトエタノールを添加した。β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ結合ポリペプチドをセファロース６Ｂのカラム
で分画し、以後の実験に使用した。

・、実施例　３〉 免疫化 ７〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス６匹に実施例１で（
ｑられたたん白抜合体の４０μ９　（たん白吊として）
を７０インド完全アジユバントとの親和性混和物として
抗原として皮下注射した（−次免疫）。−次免疫２週間
後に再び上記と同じ徂の抗原をフロインド不完全アジュ
バン１−との親和性混和物としてマウスに皮下注射した
（二次免疫）。

さらに２週間後に二次免疫と同じようにして三回目の免
疫を行なった。三次免疫の６日後にマウスより血液を一
部採取し、下に述べるＥＩＡ法により血清抗体の力画を
測定した（　ｒ　１ｍｕｎｏ　−ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ
ｇｙ　１巻、３頁［１９７８年］参照）。

γ−２と命名したマウスが最も高い抗体力価を示したの
で最終免疫を０．５１の塩化ナトリウム溶液に溶解した
１２０μｑの抗原で静脈注射により行なった。各マウス
の抗体力価の値を第１表に示す。

箸１人 免疫したマウスの抗ペプチド抗体力価 Ｂ／Ｔ　（％） ２〉　血清希釈率：　１／６３００ ３）　血清希釈率：　１／７８００ ４）　　−：検出できず ５）Ｎ、Ｄ、：測定せず Ｂ／Ｔ：（結合醇累活性／添加した全酵素活性）Ｘ１０
０ＥＲＡ法 実施例２で得られるたん白抜合体で免疫したマウスの血
清中、或いはハイブリドーマ上澄液中の抗体活性の検出
はＥＩＡ法［１ｍｌｌｌｕａＯ−ｐｈｏｒｍａｃｏｌｏ
ｕ　１巻、３頁（１９７８年）〕により行なった。即ち
、血清またはハイブリドーマ上澄液を緩衝液Ａ（２０１
１１〜Ｉ　　ＮａｚＨＰＯ４，１００１１１Ｍ　　Ｎａ
　Ｃ１，０，１％ＮａＮ３．１ｍＭＭＧｃＩｚ、ｐＨ７
，０）で希釈し、希釈液１００μｍを１００μｍの酵素
結合ポリペプチド誘導体〈実施例２）と混ぜて反応を２
４℃２４時間進行さＵだ。次にウサギの抗マウスＩｇＧ
とカップルさせた３％セルロースを１００　ｌｔ　ｌ添
加し、反応を２４℃４時間進行させた。反応終了後、０
．５％のＴ　ｗｅｅｎ２０を含む緩衝液Ａでセルロース
をより洗い、２０μｇ　／ｍｌの４−メチルウンベリフ
ェリル−β−Ｄ−ガラクトシド５００μｍを添加して３
７℃２時間反応後、反応を停止するため３ｍｌの１００
ｍＭ炭酸緩衝液＜ｐＨ１０，５）を加えた。螢光強度を
螢光計で測定した（励起：３６５　ｎｉｌ　：発光；４
５０ｎｍ）。

く　実　ｈ色　例　　　　４　〉 ｌｌ１ｌ胞融合 実施例３に記載した最終免疫の３日後に、γ−２マウス
より牌臓を摘出し、ステンレス製メシュで加圧ＩＩ過後
後イーグル最少必須培地ＭＥＭ）にけん濁して牌臓細胞
けん濁液を得た。細胞融合にはＢＡＬＢ／Ｃマウス由来
のＰ３−Ｘ６３．Ａｇ８、Ｕｌ　（Ｐ３Ｕ１）骨髄腫細
胞を用いた［Ｃｕｒｒｅｌｌｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ
　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄｌ　ｉ＋ｉｕｎ
ｏｌｏｇｙ　、８１巻、１頁（１９７８年）］。

ＩＩ胞融合はＫＯ旧ｅ「およびＭ　１ｌｓｔｅｉｎ　、
　Ｎ　ａｔｕｒｃ２５６巻、４９５−４９７頁（１９７
５年）の最初の方法により行なった。即ち、牌臓細胞と
Ｐ３ｕ１細胞を別々に血清無添加ＭＥＭで３回洗滌し、
５：１の割合（細胞数として）で混合した。混合物を８
００　ｒａｍで１５分間遠心分離して細胞を沈でんさせ
た。上澄液を完全に除去してから沈でんを軽くほぐし、
０．３１の４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　
６０００　（Ｋｏｃｈ　−Ｌｉ（ｌｈｔ）を加えてから
３７℃の温浴中で７分間静置して細胞融合を行なった。

その後ＭＥＭを毎分２１の割合で添加し、合計１２１の
ＭＥＭを添加後得られた混液を６００ｒｐｍ１５分間遠
心分離し、続いて上澄液を除去した。細胞法でん物を１
０％胎児仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ
ＰＭＩＩ６４０−１０ＦＣ８）に２Ｘ１０５Ｐ３１Ｊ１
細胞／１の濃度となるようにけん濁し、２４穴−マルチ
ディツシュ（ｌ　１ｎｂｒｏ　）の１４４ウエルのそれ
ぞれにこのけん濁液を１１ずつ接種した。接種後細胞を
３７℃にて５％炭酸ガスインキュベーター中でインキュ
ベートした。２４時間後にｆ−ＩＡＴ（１ｘｌＯ″″４
Ｍヒボキサンチン、４Ｘ１０−７Ｍアミノプテリン、 １．６Ｘ１０−５Ｍチミジン）添加ＲＰＭ１１６４０−
１０ＦＣ８培地をウェル当り１ｍｌずつ加えてＨＡＴ選
択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は培養開始後３．５
および７日目に古い培地を１ｍｌの）−ＩＡＴ培地と交
換して続けた。ハイブリドーマの生育は細胞融合後、１
０〜１４日目に認められた。培養液が黄色に変化したら
（およそｌＸｌｏＳ個／１）上澄液を集めてＥＩＡ法に
より抗体の存在を確認した。このようにしてハイブリド
ーマの生育が認められた１４１個のウェルの上澄液を試
験した。２個のウェル（γ２−１１およびγ２−１００
）が強い抗体活性を示し、他の２１（γ２−６２および
γ２−７０）が弱い抗体活性を示した。

く実１１　５＞ クローニング 抗体活性が陽性であった３１１のウェル（γ２−１１、
γ２−６２およびγ２−１００）からのハイブリドーマ
を制限希釈法でクローン化した。即ら、ハイブリドーマ
細胞をＲＰＭ１１６４０−２０ＦＣ３に少なくとも１１
当り２１１！Ｉとなるようけん濁し、その０．１ｉｔＩ
ずつを９６−穴のマイクロプレートのウェルに分注した
。各ウェルに５×１０５個のＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細
胞をフィーダー細にとして添加した。その結果、およそ
２週間のうちに細胞増殖が観察された。上澄液を集めて
実施例３に記載のＥｉＡ法で抗１本の存在を調べた。γ
２−１１からの１９個のクローン中８藺、γ２−６２か
らの５４クローンの中３クローン、γ２−１００からの
４７クローン中５クローンに抗体活性が認められたく第
２表）。

〈実施例　６〉 モノクローナル抗体の［ＦＮ−７への結合能モノクロー
ナル抗体のＩＦＮ−γへの結合能を次の方法で測定した
。ウサギの抗マウスＩｇＧ抗体とカップルさせたセルロ
ースの３％溶液３００μｌにγ２−１１、γ２−６２お
よびγ２−１００のウェルの夫々よりの各２〜３クロー
ン細胞の上澄液３００μｍを添加し、室温で１２−２０
時間反応させた。次にセルロースを生理的食塩水で十分
洗滌し、それに下に示す方法で１４たＪＦＮ−７の５５
０Ｕ／ｍｌを加えた。反応３〜４時間少に上澄液を集め
、そのＩＦＮ−γ活性をマイクロプレートを用いる細胞
ｍ性効果（ＣＰＥ）判定法［Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｃ＋ｙ　１６Ｗ、１７０６頁（１９６８
年）］により測定した。

、　　　第２表 クローン化ハイブリドーマの抗ペプチド抗体活性即ち、
９６−穴のマイクロプレー１−の各ウェルに５０μｌの
ＭＥＭを入れ、最初のウェルには５０μｍのＩＦＮ標品
を加えてから順次２倍希釈を行なった。このようにして
準備したウェルにＷＩＳＨ細胞の２０％ＦＣ３含有ＭＥ
Ｍ４プん濁液（４Ｘ１０５個／ＩＩ＋）５０μｍを添加
し、炭酸ガスインキュベーター中３７℃で２４時間イン
キュベートした。その後２０００ＴＣＩ　Ｄｓ　。

（ＴＣＩＤｓｏ：平均組織培！感染ＩＢｒ　）に調整し
た水痘性口内炎ウィルス（Ｎ　ｅｗ　　Ｊ　ｅｒｓｅｙ
株）５０μｍを各ウェルに加え、炭酸ガスインキュベー
ター中３７℃でインキュベーションを行なった。

約３５時間の後、ＩＦＮ標品無添加ウェつ中の細胞が１
００％ＣＰＥを示したら、各ウェルを顕鏡してＣＰＥを
判定し、５０％ＣＰＥを示すウェルの［ＦＮ標品の希釈
係数の逆数をＩＦＮの力価とした。

使用したＩＦＮ−γの標品はヒト末梢リンパ球細胞を４
０μＱ　／Ｒ１１コンカナバリンＡおよび１５ｎ（＋／
１の１２−〇−テトラーデカノイルホルボール−１３−
７けテートで刺激して７２時間（１こ１宋取した上澄液
である。この１８養上澄液Ｉよ１ｍｌ当り４４００単位
のヒトＩＦＮ−γ（熱ａ３よび酸不安定）を含有してい
た。クローン化細胞培養瀘／ｉｔこＩＦＮ−γとの結合
能を有する抗体が存在寸れ（Ｊ、添加した［ＦＮ−７は
セルロース上の抗体に結合し、上澄液のＩ　ＦＮ−７活
性は低下する筈である。

での結果、クローン７２−１１に比較０り上吊（１１１
：Ｎ−γとの結合能が認められ、添加したＩＦＮ−７＜
５５０甲位／１）の５０７５’３６／Ｊ’抗体と結合し
たく第３表）。

第３表 ＩＦＮ・−γ活性のモノクローナル抗体への吸着〈実施
例　７〉 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる腹水の生
成 腹水の生成は鉱油で前処理したＢ△ｌｌｉ／ｃマウスに
ＩＦＮ−γとの結合活性を有す゛る抗体産生能を持つγ
２−１１．１クローン化細胞をｌＸｌｏＳ個腹腔内投与
して起した。ハイブリドーマを腹腔的投与して１０日後
に腹水を取って抗休店性を１０７倍希釈まで調べた。対
応するクローン細胞培養濾液の抗体活性は１０４倍希釈
まで検出されたが、腹水生成（腹水化）により抗体活性
はＪりよそ１０００倍増加した。

〈実施例　８〉 七ツク［］−ナル抗体の￥１製 実施例７で得られた腹水４１を出発原料どしてモノクロ
ーナル抗体の植装を３　ｔａｃｌｌｃ　ｌ　ｉ　ｎらの
ｙノ法（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ　１ｏｌｏａｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｉｉｓｔｒｙ２５６５５、≦）７５０貞［
１９８１１）により？−Ｔ　＜ｃッ／コ。ｌＢｌら、腹
水をまず１０．００Ｏｒｌ）Ｉｌｌ　１５分間遠心分酩
してフィブリン様物質を除去し、りん酸緩衝液−食塩水
（Ｐｕｓ　：　８．１　　ｍＭ　　Ｎａ　ｌ−１２ＰＯ
４，１、５ｍＭ　　　　ＫＨ２ＰＯ４、２，７ｍＭ　　
　　ＫＣＩ　　　、１３７　　ｍＭ　　ＮａＣｌ　　：
　　ＤＨ７，２）で希釈して潤度が２８０ｎｍの吸収（
Ａ２８０）が１２から１４の範囲になるようにした。そ
の後、飽和硫酸アンモニア溶液を硫Ｍｍ度が４７％とな
るように添加した。混合物を４℃で６０分間攪拌して塩
析を行ない、遠心分１（１０，ＯＯＯｒｐｍ　、１５分
）で沈でんを１ｑた。沈でｌυを５０ｍＭＮａＣｌ含イ
ｊの２０ｍ１ｙｌ　　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，９）に
溶解し、２リツトルの同じ緩衝液に対して透析を行なっ
た。２時間後に透析液をυましい同じ溶液と交換し、さ
らに透析を１５時時間側Ｊた。次に沈でｌυを１０．　
ＯＯＯｒｐｍ　１５分遠心分離して除去し、上澄液をＡ
２８０の１ｌｆｌが２０−３０となるような湯度に調整
した。このサンプルを５０ｍＭＮａＣ１含右Ｔｒｉｓｌ
ｆｆ衝液（ｐｉ−１７，９）で十分平衡化したＤＥＡＥ
−セルロースカラム（８ｍ１、Ｗｈａｔｍａｎ　　Ｄ　
Ｅ　５２　）にかりて分画し、５０ｍＭＮａＣ１含有の
Ｔｒｉｓ緩衝液で１．５ｍ／分の速度で溶出を行なった
。この条件下で抗体活性は主に溶出液区分に検出された
。精製標品が抗体であるという確認はｌ　ａｅｌＲｌｌ
ｌ　ｉら、Ｎ　ａｔｕｒｅ　２２７巻、６８０頁（１９
７０年）により２戟される５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により行
なった。即ち、硫酸、アンモニウム塩析ｊ′３よびＤＥ
ＡＥ−セルロース分画で１７られたいくつかの区分につ
き２−メルカプトエタノールで還元し、続いて１７％Ｓ
ＯＳゲル電気詠勤を３０ボルトで２４時間かけた。抗体
活性のピークと一致して二つのバンドがおよそ５５キロ
ダルトン（）１−鎖）および、１１３よそ２８二１」１
グル１−ン（Ｌ−鎖）の分子聞に相当する位置に認めら
れた。このようにして精製した抗体の画分１７に′〕い
てＩ　ＦＮ”７　（２２００ＬＪ／ｍｌ＞を添加してＩ
ＦＮ−γ結合活性を調べた。その結果、約５０％のＩＦ
Ｎ−γが抗体と結合づることがゎがった（第４表）。

第４表 〈実施例　９〉 七ツクローナル抗本が　づる１ナブクラス精製した抗体
の画分１７（実施例８）を１０償希釈して寒天上の免疫
沈降反応（オークテルロニー・テスト：　１ｍｍｎｕｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｑｅｌ−Ｑ　１
Ｎｕｓｉｏ’ｎ　　７’　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　１
３１ａｃｋｗｅｌｌ。

Ｏｘｒｏｒｄ、　１９６４年）を山羊の抗マウスＩｇＧ
１、Ｇ２ａ　、Ｇ２ｂ　、＃よびＧ３抗体（Ｍｉｌｃｓ
）を用いて行ない、？”２−１１．１モノクロ一ナル抗
体が屈するサブクラスの同定をした。七ツクローナル抗
体と山羊の抗マ・クスＩ（］　Ｇ２ｂ抗体とはっきりし
た一本のバンドが見られ、モノクローナル抗体と他の抗
体との間にはバンドの形成が認められなかった。従って
該モノクローナル抗体は１ｇＧ２ｂに居することが判明
した（第５表）。

第５表 モノクローナル抗体サブクラス 〈実施例　１０＞ 実施８の方法で精製した溶出区分からの七ツク［１−ナ
ル抗体２５ｍ１（６５，３ｍ（＋＞を０．１ＭＮａ　１
ｌｃＯ３（ｐｌ−１ｓ、３）に対して一晩透析を（１な
った。別に２５ｍ１のＡ「Ｆｌ−ＧＩＥＬ　　’１０（
１３ｉｏ　−１１ａｄ）をガラスフィルターを用いて水
で十分洗滌し、０．　１Ｍ　　Ｎａ　ＨＣＯ３（ｐｌ−
１８，３）にけん濁してから上述の抗体と混合した。

６合物を４℃で４「１間静かに澄ＩＴＬで反応を進行さ
け、４℃で一晩静置した。八Ｆ　Ｆ　１−　Ｇ　Ｅ　ｌ
−１０をガラスフィルターを用いて０．１ＭＮａ　ＨＣ
Ｏ３（ＤＨ８，３）　でよく洗った。コノゲルにｏ、ｉ
Ｍエタノールアミンと０．１５ＭＮａ　Ｃ１を含む溶液
を２５ｍ１加えた。混合物を４℃で１時間振とうして未
反応の活性基を阻害した。

次にゲルを１）　Ｂ　Ｓで十分洗ｉ）χし、０．１％Ｎ
ａＮ３含有ＰＢＳ２５ｍｌにけん濁した。けん濁液を４
℃で保存した。添加した抗体量と回収した上澄液の抗体
ｍとより、抗体はゲルに２．３５ｍｇ／ｌの割合で結合
したこ乏がわかった。このようにして得られた反応生成
物をカラムに充填して抗体カラムどして使用した。

〈実施例　１１〉 Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲ１（ＤＲＫ２４８ｃ　Ｉｔｓ。

ｐＲｃ２３１／ＩＦＩ−９００＞（木組換え微生物の＋
ｉ？＋築はヨーロッパ特許出願Ｎｏ、９９０８４に詳細
に記載されている）をｒｌＦＮ−γの生産に使用した。

プラスミド１）ＲＫ２４８ｃ　ＩｔｓおよびｐＲｃ２３
１／ＩＦＩ−９００はそれぞｎ温度感受性ラムダレプレ
ッサーおよびＩＦＮ−γ遺伝子を含／υでいる。ｒｌＦ
Ｎ−γ遺伝子の光１，１．ｊ　ＧよＰＬプロモーターの
調節下にある。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ｐＲｌ　（ρＲＫ２４８ＣＩｔｓ、　
　ｐＲＣ２（３１／　ｌ　ｒ　Ｉ−９００）の−晩ｊ８
古物を［［３培地中３０℃で増殖さけた。、１リツトル
のＩＡ　ｈ　ｉ′ＩＩ）をカリ”ミノ酸含有最少Ｍ−９
培地で１０倍に希釈した。対数増殖期に培養を３０℃か
ら４２°Ｃにシフト１ノ、４２゛Ｃで２〜３「５）間増
殖を続りた。遠心分ぎ１により集菌し、菌体ペレットは
１吏用するまで−２０’Ｃで保存した。全てのｉ’ｌ！
！酵および操（す（まＮ　　ａｊｉｏｎａｌ　　　［ｎ
５ｔｉｔｕｊｃｓ　　Ｏｆ　　　ト１ｅａｌｔｈ　　の
帽　換　えＤＮＡ実験ガイドラインに従−）で行４ｒっ
た。

ｒ）ＦＮ−７”の１３１１４６のＣ末端合成ペプチドに
対するモノクロ−ノール抗体を上述の如くＩＴＦ　’Ｉ
ｆｊ　Ｌだ。精製にはモノクローナル抗体Ｍ。

γ２・−１１，１を使用した。モノクローナル抗体カラ
ムは実施例１０に記載した通り調堅しｌこ。

１４Ｇ−ヨード酢酸による　ｒｌＦＮ−γのカルボギシ
メチル化は参考文献（３）に記載される。Ｊ、うに６　
Ｍ　ｊ３醇グアニジンの存在下で行／ｊっだ。過剰の試
薬はＣ８−逆相カラムのトＩＰＬｃにて除去した。カル
ボキシベブチダーぜ消化は０．２ＭＨＮ　４ＬＩ　Ｇ　
Ｏ３中で参考文献（４）に記載される通り行なつｌこ。

ｒＩＦＮ−γを参考文献く５）に記載される通り、７０
％ギ酸中でＣＮＢｒ　　（メチオニンに対して１００　
イＥ’、モル早）で処理した。ＣＮＢｒペブヂペプチド
１８逆相カラムを用いたｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃで分離した
。ペプチドの溶出は０．１％１〜リフルオロ酢酸中Ｏか
ら７０％のＣＨ３ＣＮブレジエン１−で（１４【　つ　
ｌこ　。

たん白またはペプチド標品は月仏したＮ　２−２．１人
吸引管中、４％チオグリコール酸合有の沸とう用酸中で
２０−２４１′１．ｌｊ間加水分解を行なった。アミノ
酸分析は参考文献（６）に記載されるフルオレスカミン
−アミノ酸分析几］を用いて行なった。

カルボキシメヂル化たん白の配列分析に【よ、参考文献
（７）に記載されているΔＢ＋（ΔｐｐｌｉｃｄＢ　ｉ
ｏｓｙｓｔｃｍ、　　Ｉ　ｎｃ、　）の気相シークエン
サー４７０Ａを用いＩζ。ＰＴＨ−アミノ酸の量ナンプ
ルは参考文献（８）に記載されている超粒子ＯＤ　Ｓカ
ラムの逆相ＨＰＬＣで同定した。

全ての精製工程は４℃で行なった。凍結細胞（２５（］
）を３３倍ｆｆ１７５１１）の７ＭＪｇ酸グアニジン（
ｐＨ７）にけん澗した。けん濁液を１時間撹拌後、３０
，０ＯＯＸ（Ｉで１時間遠心分離した。

上澄液をＰＢＳまたは０．１５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，５）で１０倍に希釈し、３０．０ＯＯＸ（
］で３０分間遠心分離した。もう一つの方法としては、
凍結細胞＜２５（１）を１．５倍ｆｆ１（３７，５ｍ１
）の０．１５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）
にけん濁し、１時間攪拌した。混合物を３０秒ずつ５回
音波処理し、３０、ＯＯＯＸｇで１時間遠心分離した。

塩酸グアニジン抽出または音波処理の上澄液をＰＢＳで
１）ｊ１洗滌したシリカ２５ｍ１と回転振どう機上で１
時間混合した。混合物をカラムに注ぎ、カシム容吊の２
０−３０倍のＩＭ　　Ｎａ　Ｃｌ　ｒカラムを洗った。

次にカラムを０．０１Ｍホウ酸ナトルウム緩衝液（ｐＨ
８，０）中の０．５Ｍ塩化テトラメチルアンモニウムで
溶出した。インタフエロン活性（よＪ３よそ２Ｏｏｍｌ
中に溶出し、４つの区分に分前８れた。各区分をＰＢＳ
て平衡化したＤツクロー犬ル抗体（γ２−１１．１）ア
フイニテイノＪラム（容ｎｔ４ｍｌ）にかけた。カラム
１０倍量のＰＢＳＣ洗註後、１Ｍ塩酸グアニジンまたは
１ＭＮａ（：ｌおよび２０ｍＭりん酸ナトリウム緩仲１
液（ｐＨ７，０）含イｉの５０％丁チレングリ］−ルで
溶出した。インタフエロン活性は最初の２０ｍ１に溶出
した。

Ｓ　Ｉ）　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅは１−　ａｅｍｗｌ　
ｉ　（ｇ　６文献９）により記載される通りに行なった
。たん白７ｊは結晶ウシ血清アルブミンを対照標準とし
てフルオレスカミン分析で測定した。インタフエロン活
性は参化文献１０に報告されている通り、水亀性ロ内炎
つ−ｒルスＪ３よびヒｌ−Ｗ　［Ｓ　＋−１細胞を用い
た細胞重性効果阻害アッセイにより測定した。インタフ
エロンカ圃は部分精製したヒト免疫インタフエロンの対
象標ｉ％に対して基準化した相対単位／ｍｌで表示した
。

抽出および精製工程の要約を第６表に示す、、金体の回
収率は２５−３２％で粕製度は約１００〜７６９倍であ
り、平均比活性は１×１０）１１１０７ｍ１であった。

ｒｒＦＮ−γの全収量はグアニジン抽出の方が３〜４倍
高かった。精製最終段階の５ＤＳ−ＰＡＧＥを第１図に
示す。グアニジン抽出からの精製標品はおよそ１８，０
００ダル［ヘン（１８Ｋ　　ｒｌＦＮ−γ）に単一バン
ドを示したが、音波処理からの物は主要バンドを約１５
．０００ダルトン（１５Ｋ　Ｎ　ＦＮ−７）に、３した
ｉｉ９イバンドを約１７，０００ダルトンに示した（第
１八図）。非ｉＷ元性ゲルではｒｌｌ”Ｎ−γの二Ｌ１
１１木やオリゴマーが形成した（第１Ｂ図）。

第６表 ｒＩ　ＦＮ−ｒの精製 １１１ｇ１Ｉｎｉｔｓ　　　　Ｕｎｉｔ／′ｍＱ　　−
４ｏ１ｄ　　％丁、グアニジン曲出 １ｒＵｎ’ｉ　　　　　　　　２．８０６　　　２．５
Ｘ１０８　９Ｘ１０”　　　　　　−＋００シリカ　　
９８　　１．０Ｘ１０８１Ｘｉ０６１１　４０Ｅツク１
コ一プール抗体　８　　　　０．８Ｘ１０”　　　ｌＸ
ｌ０７１１０　　　３２■音波処１１１ 土ｚｒ７液　　０．１３６　８．０ＸＩ０７１．３ＸＩ
Ｏ’　　−１００シリカ　　８７　　１１．５Ｘ１０１
５．２Ｘ１０６４００　５６モノクロ一ナル抗体　２　
　　　２．０Ｘ１０’　　　１．０Ｘ１０７７６９　　
　２５１８Ｋｒ［ＦＮ−γは均質でそのアミノ酸組成は
Ｄ　Ｎ　Ａ配列から予想されるものと一致した。

１５におよび１８にのｒｌ　ＦＮ−γのアミノ酸組成を
第７表に示ず。数百ピコピルのｊＷ元カルボキシメ升ル
化１５ＫＪ５よび１８にたん白を自動気相たん白／ベブ
ヂドシークエンリーー中で−［ド７ン分解を行’Ｊつた
。１５Ｋによび１８にたん白のアミノ酸末端のそれぞれ
最初の３２および２６残阜の配列はＤＮＡ配列から予想
されるものと一致しｌこ（第２図）。１４０−力ルボキ
シメチル化システィンは配列分析の一番目と三番目のサ
イクルに検出された。Ｎ−末端のメチオニンは検出され
なかった。１８におよび１５にのｒｌＦＮ−７のＮ末端
配列分析の結果、両たん白のこの領域の配列はＤＮＡ配
列から予想されるものと同一であることがわかった。Ｃ
末端ペプチドも分析してこの領域に変化−１ｂ欠落が起
っているか調べた。カルボキシベブヂダーゼＡ（ＣＰＡ
）分解物のアノミｌ’ｌ！２分析の結果、１８ＫｒｌＦ
Ｎ−γからはセリンおよび／またはグルタミン（Ｃ末端
アミノ酸）がｉｒｉ離し、１５ＫｒｌＦＮ−γは同じ条
件下でＣＰＡにより分解されないことがわかった。３ｅ
ｖ−ＱｌｎはｒｌＦＮ−γのＣ末端配列であるので、１
８に種はそのま）のＣ末端を有し、他方１５に種はＣＰ
Ａで分解されない伯のＣ末喘残り（Ｌｙｓ）をイｉする
ことが明らかとなった。

ＯＮＡ配列から予想したＣ末端残基はさらにＣＮ１３ｒ
　９１１埋後のＣ末端ペプチドの配列分析により確認し
た。Ｃ末端ペプチドはＣ−１８の逆相カラムによるＬｌ
　＋’）　ｌ　Ｃで分離した（第３図）。ブレジエンｉ
・の最初の部分で溶出される鋭いペプチドピーク（ピー
ク■）は１５ＫｒｌＦＮ−７からはｊｒｆられたが、１
８Ｋ　　ｒｌ　ＦＮ−７のＣＮ　１３　ｒ分解混合物か
らは認められなかった。このペプチドのアミノ酸分析の
結果、本ペプチドはホモセリンよｌこはホモセリンラク
トンを１１しないことがわかり、従って１５にたん白の
Ｃ末１ｃＮ３ｒペプチドであろうと思われる。アミノ酸
分析（第８表）に阜づいて、本ペプチドはＩＦＮ−γの
１２１−１３１のアミノ酸残基に対応した（アルギニン
は検出されなかった）。１１１［！ｉｔのアミノ酸の配
列はシーフェンシング分析により確認されたく第２図）
１８ＫｒｌＦＮ−γの場合には、溶出の初期に比較的ブ
ロードなピークが得られた。このピークはゆるやかなグ
レジエントによりさらに２個のピークに分団１した。ア
ミノ酸分析により最初のピークが１８にたん白のＣＮＢ
ｒ化Ｃ末喘ペブヂドであつく第８表）、アミノ酸組成は
第１３８−１４６のアミノ酸残基に対応した。９個のア
ミノ酸の配り１１をシーフェンシングにより決めたく第
２図〉。

１５にたん白のＣ末端アミノＭはリジンであると決定さ
れた。

これらの結果は１８　Ｋ種はｒｌＦＮ−γのそのままの
分子であり、１５に種はそのたん自分前産物であること
を示す。１５に種では１３１番目と１３２番のアミノ酸
残基（Ｌ　ＶＳ−Ａ　ｒ（］）の間のペプチド結合が切
断したしのである。

〈実施例　１２〉 １８ＫｒｌＦＮ−γのトリプシン分解ペプチド結合 １８ＫｒｌＦＮ−γのトリプシン分解ペプチド地図作成
を行なった。１８ＫｒｌＦＮ−γ（４３μｇ）をＩＰＧ
Ｋ−トリプシン（１，１１１Ｑ　、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ　　；米国）を用い、１４７μｍの２５ｍＭ酢酸アン
モニウム−Ｎ　ａ　ＯＩ−１（ｎＬＩ８、○）中３７℃
で１８時間分解を行なった。２−メルカプトエタノール
（０，６μｍ）を分解液に添加してインキュベーション
を２時間続（プた。

反応を停止するために５３μｍの１％トリフルオ［］酢
酸（ＴＦＡ＞を添加した。分解物金体を、０．０２％Ｔ
ＦＡ−５％アピトニトリルで平衡化した超粒子オクチル
カラムでクロマＩ−グラフィーを行なった。溶出は３０
’Ｃ１５−７０％のアはト二トリルの直線グレジエント
にて１　、０ｍｌ／ｍｉｎの速度で行なった。溶出液は
フルオレスカミンを用いた螢光光度計によりモニターし
た。１ｑられた地図を第４図に示す。

〈実施例　１３〉 １８ＫｒｌＦＮ−γのＣ末端アミノ酸の決定１８Ｋｒｌ
ＦＮ−γのＣ末端アミノ酸を成田らの方法（Ｊ　、　１
３　ｉｏｃｈｅｍ、［東京１５９巻、１７０ｊＴ　［１
９６６年１）の方法に従い、ヒドラジン分解により決定
した。、１８Ｋ　　ｒｌＦＮ−ｒ　（１８５μ０）を無
水ヒドラジンと１００℃で６時間加熱した。ヒドラジン
分解物の凍結乾燥物を水に溶かし、ベンズアルデヒドを
添加した。混合物を室温で１１Ｆ１間激しく振とうし、
遠心分離した。−Ｌ　ｉｒＦ　ａを凍結乾燥し、アミノ
酸分析にかけた。しかし、その結末アミノ酸は何も検出
されなかった。この結末は１８に種のＣ末端アミノ酸が
グルタミンζ′ある事実と一致する。

第７表 １５におよび１８ＫｒｌＦＮ−γのアミノ酸組成（残基
数） Ｔｈｒ　　　　　　５．１　（５）　　　　　　　　　
４．９　（５）Ｓｃｒ　　　　　　９．８（１１）　　
　　　　　　６．７（９）Ｇｌｕ　　　　　１８．５　
（１８＞　　　　　　　１５．１　（１６）Ｐｒｏ　　
　　　　　＊　　（２）　　　　　　　　　　＊　　（
２）Ｇｌｙ　　　　　　５．９　（５）　　　　　　　
　　５．６　（４）Ａｌａ　　　　　　８．２（８）　
　　　　　　　　７．３（７）Ｃｙｓ　　　　　　　＊
　　（２）　　　　　　　　　＊　　（２）Ｖａｌ　　
　　　　９．１　（８）　　　　　　　　　９．１　（
８）Ｍｅｔ　　　　　　４．７　（４）　　　　　　　
　　３．８　（，３）Ｉｌｅ　　　　　　７．２　（７
）　　　　　　　　　６．６　（７）Ｌｅｕ　　　　　
１０．５　（１０）　　　　　　　　９．６　（９）Ｔ
ｙｒ　　　　　　５．５　（５）　　　　　　　　　４
．８　（５）ｐｈｅ　　　　　１０．３　（１０）　　
　　　　　　８．２　（９）Ｈｉｓ　　　　　　１．８
　（２）　　　　　　　　　２．５　（２）Ｌｙｓ　　
　　　１９．９　（２０）、　　　　　　１６．．９（
１９）Ａｒｇ８．６　（８）　　　　　　　　　５．６
　（３）Ｔｒｐ　　　　　　　　＊　　（１）　　　　
　　　　　　　＊　　（１）カッコ内の数字はＤＮＡ配
列から予想される残基数を示す。

＊値を測定せず 第８表 １５におよび１８にのＣＮ８γＣ末端ペプチド１５Ｋ　
　　　　　　　　　　　１８ＫＴｈｒ　　　　　　　　
　　　　０．９　（１）Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　
　１．１　（１）　　　　　　　　　０．８４　（１）
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　１．１　（１）　　　
　　　　　　１．１　（１）Ｐｒｏ　　　　　　　　　
　　　＊　　　（１）Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　
１．５　（１）　　　　　　　　　１．３　（１）Ａｌ
ａ　　　　　　　　　　　　２．４　（３）　　　　　
　　　　１．１　（１）Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　
　１．Ｏ（１）　　　　　　　　　１．１　（１）Ｐｈ
ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．０（１）Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　１．
９　（２）　　　　　　　　　２．８　（３）配列中の
位置　　　　　　　１２１−１３１　　　　　　　１３
８−１４６カツコ内の数字はＤＮＡ配列から予想される
残基数二１；測定せず 参　　考　　文　　献 １、　　グレイ他（Ｇｒａｙ、Ｐ、　Ｗ、、ｅｔ　ａｌ
、）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）２９５，５０３
−２、　スタヘリン他（Ｓｔａｈｅｌｉｎ、Ｔ、、ｅｊ
　ａｌ、）　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６．９７５０−３
、　アレン（Ａｌｌｅｎ、　Ｇ、　）　、　タンハ’ｙ
ＨヨＵペプチドの配列決定（３ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏ
ｆＰｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　）　
、　ｐｐ、　３０−３１　（１９８１）、ノースオラン
ダ社、。

アムステルダム、ニューヨーク ４、　アンバー（Ａｍｂｅｒ、　Ｒ，Ｐ、　）　、面積
学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　）ユニＩ　　、４３６−４４５　　（１９
６７）５、　ウオルフエ（Ｗｏｌｆｅ、　Ｒ，Ａ、　）
およびスタイン（３ｔｅｉｎ、　ｓ、　）　、薬理学に
おける最近の方法（Ｍｏｄｅｒｎ　１ｙｌｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏ（ＪＶ　）　、　Ｄｐ、　
５５−７７（１９８２）、Ａｌａｎ　　Ｒ，Ｌ　ｉｓｓ
、　　　Ｉｎｃ、。

ニューヨーク、ＮＹ。

６、　スタイン（Ｓ　ｔＱｉｎ、　Ｓ　、　）およびブ
リンク（３ｒｉｎｋ、　Ｌ、　）　、酵素学における方
法＜ＭｅｔｌｌＯｄＳ　ｉｎ　Ｅ　ｎＺＶｍｏｌｏｇｙ
’）　、　７９　。

７、　ヘライック（Ｈｅｗｉｃｋ、　　Ｒ，Ｍ、　）　
　、ハンカヒ７−　（１−１ｕｎｋａｐｉｌｌａｒ、　
　Ｍ、　Ｗ、　）　。

ホット（ｌ−１ｏｄｄ、　　Ｌ、　Ｅ、　）およびドレ
イヤ−（［）ｒｅｙｅｒ、Ｗ、　Ｉ　、　）　、　Ｊ　
、　Ｂ　ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５６．７９９０−７９９７＜１９８１） ８、　ホーク（ｌ−１１−１ａ、　Ｄ　、　）　、ヤン
（Ｙ　ｕａｎ。

Ｐ−Ｍ、）、およびシブレー（Ｓ　ｈｉｖｅｌｙ。

、Ｊ　、　Ｅ　、　）　、　Ａ　ｎａｌ、　　Ｂ　ｉｏ
ｃｈｅｍ、　ＬＬ止。

９、　　Ｉ、ｔムｌ）　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＬＪ、に
、　）　、ネイチャー　＜Ｎａｔｕｒｅ　＞２２７．６
８０−６８５１０、　　ルピンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓ
ｔｅｉｎ、　　Ｓ　、　）　。

ファミレツテイー（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ、Ｐ、　Ｃ，
）およびベスカ（Ｐｅｓｔｋａ、　　Ｓ、、Ｊ、　）Ｖ
ｉｒｏｌ、３７．７５５−７５８　（１９８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は粒子構造を示す写真であって、還元条件下＜Ａ
：０．７Ｍ　　β−メルカプトエタノール）および非還
元条件下（Ｂ）における精製組換えヒト免疫インタフエ
ロンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。 第２図は組換えヒト免疫インタフエロンの予想アミノ酸
配列とｒｌＦＮ−７の１５におよび１８に種の実際のＤ
ＮＡ配列の比較を示す。 第３図はＣＮＢγ処理俊の１５におよび１８ＫｒｌＦＮ
−γのＣ末端ペプチドのＨＰＬＣでの分離を示す。 第４図は１８ＫｒｌＦＮ−γのトリプシン分解ペプチド
地図を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）次に示すアミノ酸配列を有し、本質的にそのたん
   白分解断片を含有しないヒト免疫インタフエロン。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）アミノ酸配列のＮ−末端にさらにメチオニン残基
   を有する第（１）項記載のヒト免疫インタフエロン。
3. （３）単一ペプチドとしての第（１）項および第（２）
   項のいずれか一つに記載のヒト免疫インタフエロン。
4. （４）治療剤として使用する上記第（１）項〜第（３）
   項のいずれか一つに記載のヒト免疫インタフエロン。
5. （５）以下に示すアミノ酸配列を有し、さらに任意にそ
   のアミノ末端にメチオニンを有し、本質的にそのたん白
   分解断片を含まない完全な組換えヒト免疫インタフエロ
   ンを、本たん白を含む形質転換微生物より調製する方法
   であつて、完全な組換えヒト免疫インタフエロンを形質
   転換微生物よりプロテアーゼ阻害剤で抽出し、得られる
   抽出インタフエロンをモノクローナル抗体を用いて精製
   することよりなる調製方法。 【アミノ酸配列があります】
6. （６）プロテアーゼ阻害剤がグアニジニウム塩である第
   （５）項記載の方法。
7. （７）プロテアーゼ阻害剤がグアニジン塩酸である第（
   ５）項記載の方法。
8. （８）グアニジウム塩を溶液とした第（６）項または第
   （７）項のいずれか一つに記載の方法。
9. （９）形質転換微生物をグアニジン塩酸溶液にけん濁す
   る第（５）項記載の方法。
10. （１０）溶液中のグアニジン塩酸濃度が少なくとも約４
    Ｍである第（９）項記載の方法。
11. （１１）形質転換微生物１グラム当り少なくとも約３倍
    容のグアニジニウム塩溶液を用いる第（９）項または第
    （１０）項のいずれか一つに記載の方法。
12. （１２）活性成分として第（１）項〜第（３）項のいず
    れか一つに記載のヒト免疫インタフエロンおよび医薬と
    して使用可能な不活性担体を含有する医薬組成物。
13. （１３）治療剤としての第（１）項〜第（３）項のいず
    れか一つに記載のヒト免疫インタフエロンの使用。
14. （１４）第（５）項〜第（１１）項のいずれか一つの方
    法またはそれと自明の均等方法で製造したヒト免疫イン
    タフエロン。