NO161274B - Fremgangsmaate for fremstilling av immuninterferon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av intakt rekombinant, MW = 18000 Da, humanimmuninterferon i det vesentlige fri for proteolytiske fragmenter derav fra transformerte E. coli inneholdende dette protein, hvilken fremgangsmåte omfatter de trekk som er gitt i krav l's karakteriserende del.

Kort figurbeskrivelse

Figur 1 illustrerer natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) av renset rekombinant humanimmuninterferon under reduserende betingelser (A:0,7 M p-mer-

kaptoetanol) og i.kke-reduserende betingelser (B).

Figur 2 illustrerer sammenligningen mellom den forventede aminosyresekvens for rekombinant humanimmuninterferon og den faktiske DNA-sekvens for 15K og 18K rIFN~y typene. Figur 3 illustrerer HPLC-separasjonen av C-terminale peptider av 15K og 18K rIFN-y etter CNBr-behandling.

Figur 4 viser et tryptisk peptidkart av 18K rlFN-y.

Det er tidligere beskrevet forskjellige metoder for ekstraksjon og rensing av gruppen antivirusproteiner, kjent som interferon. Til dags dato er det kjent tre hovedklasser av interferon: IFN-* (leukocytt), IFN-/3 (fibroblast) og IFN-y (immun). Selv om de forskjellige interferonklasser kan oppdeles etter antivirus, anti-formeringsaktivitet eller struktur, har man tidligere ikke vært i stand til å finne en ensartet metode for ekstraksjon og rensing av alle disse klasser. Faktisk ville mange av fremgangsmåtene som er anvendelige for ekstraksjon og rensing av leukocytt-interferon fra en råblanding av andre proteiner og celleav-fall, ikke virke ved ekstraksjon og rensing av fibroblast-eller immuninterferon fra samme type preparat. ;Ekstraksjonstrinnet i renseprosessene som er tidligere kjente, inneholdt gjerne mekanisk ultralyd eller kjemisk lysing av mikroorganismer som hadde produs-ert, ofte ved rekombinantteknikker, det ønskede "fremmede" protein. Under denne mekaniske eller kjemiske lysingsmet-oden frigjøres imidlertid også forskjellige cellulære proteaser i blandingen. Disse proteaser er da fri og kan virke enzymatisk på og nedbryte det fremmede proteinet i blandingen . Disse proteaser kan derfor forhindre eller inhibere rensingen frem til homogenitet av den fullstendige eller modne og biologisk aktive form av det "fremmede" protein. ;Det er derfor et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte som overvinner begrensningene A.S.M. A/S. 15.000 6.84 ved de tidligere kjente ekstraksjons- og renseteknikker, hvorunder den intakte sekvensform av immuninterferon erholdes, og hvorunder fragmenter fra proteolyttisk nedbryt- ;ning fjernes fra det rensede immuninterferonpreparat. ;Det er videre et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille en homogen og intakt form av immuninterferon. ;Beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer ;Man har nå funnet at ved immuninterferon vil ekstraksjon og rensing med alle de vanlige tidligere beskrevne teknikker ikke gi et helt homogent preparat av immuninterferon med en intakt eller fullstendig aminosyresekvens. Først nylig har rekombinant teknologi kommet frem til det punkt hvor det er mulig å fremstille tilstrekkelige mengder av rlFN-^til å karakterisere det og bestemme dets aminosyresekvens. Når vanlige tidligere kjente teknikker ble anvendt for å ekstrahere rIFN-y-preparater, og aminosyresekvensen for renset materiale ble bestemt, fant man at det rensede preparat faktisk omfattet en rekke beslektede proteinarter med forskjellig molekylvekt. Man har nå, ved aminosyresekvens-ering, funnet at disse proteintyper faktisk er den intakte sekvensform for immuninterferon i kombinasjon med en hoved-del fragmenter av det intakte sekvensprotein. Selv om det nå er oppdaget at den tidligere kjente blanding inneholdt både intaktimmuninterferonprotein og fragmenter derav, er det overraskende funnet at en bestanddel av denne bland- ;ingen åpenbart også har bibeholdt biologisk aktivitet. ;Ekstraksjonen av rIFN-y kan utføres ved bruk av ultralyd ;eller kjemisk lysing. Imidlertid blir rIFN-y (DNA-basesek-vensen og aminosyresekvensen dedusert fra denne, er som beskrevet i henvisning 1) nedbrutt under ultralydbehandling eller kjemiske lysingsekstraksjonstrinn. Ultralydbehandling av frosne celler ga imidlertid primært 15K rlFN-y, dvs. ;rIFN-y under fjerning av C-terminale aminosyrerester nr. 132-146. Denne nedbrytning kan forhindres ved bruk av en reagens for ekstraksjon, såsom guanidin-HCl, som ikke på- ;A.S.M.A/S 15.000.6.84 virker den biologiske aktivitet eller aminosyresekven av rIFN-y under ekstraksjonsbetin<g>elsene. Dertil har man overraskende funnet at immuninterferon beholder sin biologiske aktivitet etter et guanidin-HCl-ekstraksjonstrinn, selv om guanidin-HCl ødelegger den biologiske aktiviteten når det tilsettes et renset preparat av immuninterferon. ;Denne oppfinnelse omfatter derfor rensing av en intakt og fullstendig sekvensform av rekombinant humanimmuninterferon. Dette protein erholdes fra et preparat av transformerte E. coli ved behandling av de transformerte mikroorganismer med et guanidinsalt eller urea, proteindenaturerin-germidler, som antas å inhibere protease eller enzymak-tivitet under ekstraksjon, men som ikke påvirker aktiviteten til det ønskede protein under ekstraksjonsbetingelsene. Renset rIFN-Jf oppnås til slutt ved å sette ekstraksjonssu-pernatanten, fortrinnvis etter passende fortyn- ;ning direkte på en monoklonal antistoff- ;kolonne. Disse ekstraksjons- og renseprosesser kan automat-iseres for produksjon i stor skala. Således gjør oppfinnelsen det mulig for første gang å oppnå store mengder homogent rIFN-y, og vil således muliggjøre utstrakte kliniske forsøk, biologiske studier, røntgenkrystallografi og struktur-funksjonsstudier. ;Det antiproteolytiske middel i foreliggende oppfinnelse ;kan være alle guanidinsalter. Blant slike guanidinsalter nevnes salter med organiske syrer, såsom f.eks. eddiksyre eller mineralsyrer, såsom f.eks. hydrohalogenider, dvs. hydrobromid, hydroklorid, hydrofluorid og hydrojodid. Det foretrukne guanidinsalt er guanidinhydroklorid. Konsentrasjonen av guanidinsalt i behandlingen av mikroorganismene er ikke kritisk, idet enhver effektiv mengde kan brukes. ;Det foretrekkes imidlertid å bruke en 3-7M løsning av guanidinsaltet for behanding av mikroorganismene, og at ca. 3-9 volumdeler av saltløsningen brukes pr. gram transformerte mikroorganismer. Konsentrasjonen av saltet kan oppnås ved å løse saltet opp i et løsningsmiddel, såsom vann eller vandige buffere, såsom ammoniumacetat, pyridin/eddiksyre, og lignende. Ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse kan andre proteaseinhibitorreagenser anvendes, såsom urea. ;Ytterligere foretrukne utførelsesformer vil illustreres i den følgende beskrivelse og eksempler. ;Rekombinant humanimmuninterferon fremstilt i E. coli eks-traheres fortrinnsvis fra frossen cellepasta med 7M guanidin.HCl og renses ved renseanordninger, fortrinnsvis med en ny monoklonal antistoffaffinitetskolonne. Det rensede interferon med en omtrentlig molekylvekt på 18000 daltons (18K) ved SDS-PAGE, er fremstilt med guanidin, mens lavere molekylvektstyper (hovedtyper ca. 15000 daltons, 15K) ble isolert ved ultralydbehandling uten guanidinekstraksjon. ;De aminoterminale sekvenser av både 18K og 15K proteinene var i overensstemmelse med den forventede frekvens utfra DNA-kodingan for dette humanimmuninterferonprotein . ;DNA-sekvensen for 18K immuninterferon som brukes i foreliggende beskrivelse har følgende formel: ; hvor nukleotidene under "X" koder for ;ribosombindingspunktet og translasjonsstartsignalet, nukleotidene over "Y" koder for translasjonsstoopsignalet. ;Den C-terminale sekvens som ble bestemt ved analyse og sekvensering av renset C-terminalt peptid frigjort fra 18K rIFN-y, stemte overens med den forventede aminosyresekvens for rIFN-y, hvilket viser at 18K typene er det intakte molekyl. Aminosyresekvensen for 18K immuninterferon som brukes i foreliggende beskrivelse har følgende formel: ; Det ligger også innenfor oppfinnelsestanken at aminoenden til immuninterferonproteinet erkarakterisert veden ytterligere metionin (Met) -rest. Således omfatter intakt 18K rIFN-y polypeptider som starter enten med metionin eller cystein på aminoenden og blandinger derav. ;I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen ;anvendes E.coli som resipient i fermenteringsmetoder og, med mindre annet er angitt, er mikroorganismen Escherichia coli K-12 stamme 294, som beskrevet i britisk patent nr. 2044382A, som er deponert hos American Type Culture Collec-tion under ATCC tilgjengelighetsnummer 31446 av 28. oktober 1978. Videre ble alt rekombinant DNA-arbeide her utført i overensstemmelse med anvendelige forskrifter fra National Institutes of Health. ;Oppfinnelsen omfatter imidlertid ikke bare bruk av E. coli K-12 stamme 294, som er omtalt ovenfor, men også andre kjente E. coli-stammer såsom E. coli MA210 eller E. coli RR1 (ATCC nr. 31343). ;Det forannevnte nye immuninterferon fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan brukes for de samme formål som andre kjente interferoner, f.eks. i profylakse eller behandling av virus eller neoplastiske forstyrrelser, eller ved behandling av immunosupressive tilstander. Det kan også gis i farmasøyt-isk akseptable orale, injiserbare eller topiske blandinger og former. Doser og doseringshastigheter kan være paral-lelle med slike som vanligvis brukes i kliniske anvendelser av de kjente interferoner, gjerne ca. 1-200 x 10^ enheter daglig. Disse farmasøytiske blandinger ;inneholder immuninterferonet i forbindelse med et kompati-belt farmasøytisk akseptabelt bæremateriale. Alle vanlige bærematerialer kan anvendes. Bærematerialet kan være et organisk eller uorganisk inert bæremateriale som er egnet for enteral, perkutan eller parenteral administrering. Egnede bærere er vann, gelatin, gummi arabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, vegetabilske oljer, polyalkylenglykoler, petroleumgelé og lignende. Videre kan de farmasøytiske preparater inneholde andre farmasøytisk aktive midler. Ytterligere additiver, såsom smaksstoffer, preserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgerings-midler, buffere og lignende, kan tilsettes ifølge akseptert praksis for farmasøytisk formulering. ;De farmasøytiske preparater kan foreligge i alle vanlige former innbefattet: a) en fast form for oral administrering, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og lignende; b) en flytende form for oral administrering, såsom løs-ninger sirups, suspensjoner, eliksirer og lignende; c) preparater for parenteral administrering, såsom sterile løs-ninger, suspensjoner eller emulsjoner; og d) preparater for topiske administreringer, såsom løsninger, suspensjoner, salver, kremer, geler, mikroniserte pulvere, aerosoler og lignende. De farmasøytiske preparater kan■være sterilisert og/eller kan inneholde hjelpestoffer, såsom preserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fuktemidler, emulgerings-midler, salter for variasjon av det osmotiske trykk og/eller buffere. ;Parenterale doseringsformer kan være infusjoner eller injiserbare løsninger som kan injiseres intravenøst eller intramuskulært. lisse preparater kan også inneholde andre medisinsk aktive substanser. Ytterligere additiver, såsom preserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgerings-midler, buffere og lignende kan tilsettes i overensstemmelse med vanlig praksis for farmasøytisk formulering. ;Eksempel 1 ;Syntese av bærerprotein- polypeptidkompleks som antigen ;Polypeptidet H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH ble koblet med tyroglobulin (her-etter TG) ifølge metoden til Goodfriend et al., Science 144, 1334 (1964). ;Selve peptidet kan fremstilles ved vanlige metoder for pep-tidsyntese. Enten kan fastfase- eller flytende-fasemetoden benyttes, selv om den syntetiske flytende-fasemetode er fordelaktig i mange tilfeller. Slike metoder for peptidsyn-teser er f.eks. beskrevet av Schroder og Lubke i "The Peptides", bind 1, Academic Press, New York, U.S.A., 1966, av Izumiya et al. i "Peptide Syntheses", Maruzen, Tokyo, Japan, 1975, eller av Haruaki Yajima i "Experiments in Biochemistry", bind 1, sidene 207-400, Tokyo Kagaku Dojin, 1977, og innbefatter bl.a. azidmetoden, kloridmetoden, syreanhydridmetoden, blandet syreanhydridmetode, DCC-metoden, aktiv estermetoden, metode ved bruk av Woodwards reagens K, karbodiimidazolmetoden, oksydasjons-reduksjonsmet-oden og DCC/additiv (f.eks. HONB, HOBt, HOSu) -metoden. ;For detaljert beskrivelse av fremstillingen av 131-146 fragmentet av IFN-y, se europeisk patentsøknad nr. 103 898. ;2,5 mg av polypeptidet ble blandet med 3,75 mg TG og, etter tilsetning av 2 ml 50 mM fosfatbuffer, ble blandingen rørt godt i isvann. Dertil satte man gradvis dråpe for dråpe en løsning av 30,4 mg karbodiimidhydroklorid i 200 ml destil-lert vann. Deretter ble blandingen rørt i isvann i 3 timer. Etter at reaksjonen var ferdig dialyserte man mot destil-lert vann i tilstrekkelig grad, etterfulgt av frysetørking, hvilket ga 4,7 mg av et proteinkompleks. ;Eksempel 2 ;Fremstilling av enzymbundet antigen for enzymimmunologisk måling ( EIA) for antistoffpåvisning ;Det enzymbundede antigen for EIA ble fremstilt ifølge Kita-gawa et al., Journal of Biochemistry _7_9, 233 (1976). (i) Innføring av en maleimidogruppe i polypeptidet Polypeptidet ((350 nmol) fremstilt i Eksempel 1 ble oppløst i 1 ml 100 mM fosfatbuffer (ph 6,8), og løsningen ble satt til en løsning av 585 ug (1,75 umol) N-(4-karboksycyklohek-sylmetyl)maleimid-N-hydroksysuccinimidester i 70 pl N,N-di-metylf ormamid.. Blandingen ble rørt ved 30°C i 30 minutter. Etter at reaksjonen var ferdig, fraksjonerte man på en "Sephadex" G-2'5 kolonne, hvilket ga 185 nmol av en polypep-tidfraksjon hvori maleimidogruppen var innført. ;(ii) Kobling av det maleimidogruppe-holdige polypeptid med ;/i-D-galac.tosidase ;Det maleimido-holdige polypeptid (16,5 nmol) ble blandet med 3,3 nmol /i-D-galactosidase. Etter 18 timers reaksjon ved 4°C ble 412,5 nmol /i-merkaptoetanol tilsatt for å stoppe reaksjonen. Det Æ-D-galactosidasekoblede polypeptid ble fraksjonert på en "Sepharose" 6B kolonne og brukt for de etterfølgende eksperimenter. ;Eksempel 3 ;Immunisering ;Hver av 6 BALB'/C hunnmus, 7-8 uker gamle, ble inokkulert subkutant med 40^jg (på basis av proteinet) av proteinkomplekset fremstilt i Eksempel 1 som antigen i grundig blanding medFreund's fullstendiqe medium (primær immunisering). To uker etter den primære immunisering ble musene igjen inokkulert subkutant med antigen i samme dose som ovenfor i grundig blanding medFreund's ufullstendiae medium (sekundær immunisering). Ytterligere to uker senere ble en tredje immunisering foretatt på samme måte som den sekundære immunisering. Seks dager etter tredje immunisering ble parti-elle blodprøver tatt fra musene og serumantistoffkonsentra-sjonene ble bestemt ved EIA metoden beskrevet nedenunder (sammenlign Immunopharmacology _1, 3 (1978 )). Musen med nr. y-2 ga den høyeste antistoffkonsentrasjon og ble sluttimmu-nisert ved intravenøs inokkulering med 120 jjg av antigenet oppløst i 0,5 ml vandig natriumklorid. Antistoffkonsentra-sjonsdata for hver mus er vist i tabell 1. ; EIA metode ;Påvisningen av antistoffaktivitet i serumet til mus immuni-sert med proteinkomplekset fremstilt i Eksempel 2 eller i hybridomasupernatanten, ble utført ved EIA metoden (Immunology 1_, 3 (1978)). Således ble serumet eller hybridomasupernatanten fortynnet med buffer A (20 mM ^2^0^, ;100 mM NaCl, 0,1 % NaN^, 1 mM MgCl2, pH 7,0), en 100 pl porsjon av fortynningen ble blandet med 100 pl av det enzymbundede polypeptidderivat (Eksempel 2) og reaksjonen fikk forløpe ved 24°C i 24 timer. Deretter ble 100 pl 3 % cellulose koblet med kanin antimus IgG tilsatt, og reaksjonen fikk forløpe ved 24°C i 4 timer. Etter at reaksjonen var ferdig, ble cellulosen vasket godt med buffer A inneholdende 0,5 % Tween 20, så ble 500 pl 20 ug/ml 4-met-ylumbelliferyl-&-D-galactosid tilsatt, og etter 2 timers reaksjon ved 37°C ble 3 ml 100 mM karbonatbuffer (pH ;10,5) tilsatt for. å stoppe reaksjonen. Fluorescensintensi-teten ble målt med et fluorometer (eksitasjon: 365 nM; emisjon: 450 nm ) . ;Eksempel 4 ;Cellefusjon ;3 dager etter sluttimmuniseringen beskrevet i Eksempel 3, ble milten skåret ut fra y-2 mus, filtrert under trykk gjennom et rustfritt gitter, og oppslemmet i Eagle's mini-mum essential medium (MEM)', hvilket ga en miltcellesuspen-sjon. For cellefusjon ble BALB/C musderivert P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) myelomacelle brukt (Current Topics in Microbiology and Immunology, _8_1, 1 (1978)). Cellefusjon ble utført ved den opprinnelige metoden til Kohler og Milstein, Nature 256, 495-497 (1975). Således ble miltceller og P3Ul-celler vasket separat 3 ganger med serumfritt MEM og blandet i et forhold på 5:1 (i antall celler). Blandingen ble sentrifugert ved 800 opm i 15 minutter, hvorved cellene sediment-erte. Etter grundig fjerning av supernatanten, ble sedi-mentet løsnet forsiktig, 0,3 ml 45 % pylyetylenglykol (PEG 6000 (Koch-Light) ble tilsatt, og blandingen fikk stå i en varm vanntank holdt ved 37°C i 7 minutter for å oppnå cellefusjon. Deretter ble MEM satt til dette med en hastig-het på 2 ml/minutt. Etter tilsetning av 12 ml totalt MEM, ble den resulterende blanding sentrifugert ved 600 opm i 15 minutter, etterfulgt av fjerning av supernatanten. Celle-sedimentet ble oppslemmet i RPMI-1640 medium tilsatt 10 % fetalt kalveserum (RPMI1640-10FCS) i en konsentrasjon på 2 x IO<5>P3U1 celler/ml, og hver av 144 brønner på 24-brøn-ners multiskåler (Linbro) ble tilført 1 ml av suspensjonen. Etter tilførselen ble cellene inkubert ved 37°C i en 5 % karbondioksydgass-inkubator. Etter 24 timer ble HAT-selek-tiv kultur oppstartet ved å tilsette RPMI1640-10FCS medium ;-4 - 7 ;tilsatt HAT (1 x 10 M hypoxantin, 4 x 10 M amino-pterin, 1,6 x 10<5>M tymidin) -medium i en mengde på 1 ml/brønn. Den HAT-selektive kultur ble fortsatt, mens 1 ml av det gamle mediet ble erstattet med 1 ml HAT-medium 3, 5 og 7 dager etter start av kulturen. Veksten av hybridomer ble notert 10-14 dager etter cellefusjonen. Når dyrknings-væsken ble gul (ca. 1 x 10<6>celler/ml), ble supernatanten ;samlet og undersøkt med hensyn til nærvær av antistoff med EIA-metoden. På denne måte ble supernatanter for 141 brøn-ner, hvori hybridomavekst var funnet, undersøkt. To brønner (y 2-11 og y 2-100) viste sterk antistoffaktivitet, og to andre brønner (y 2-62 og y 2-70) viste svak antistoffaktivitet. ;Eksempel 5 ;Kloning ;Hybridomer fra 3 brønner (y 2-11, y 2-62 og y 2-100) som viste positiv antistoffaktivitet, ble klonet ved den begrensende fortynningsmetode. Således ble hybridomaceller oppslemmet i RPMI1640-20FCS i en konsentrasjon på minst 2 hybridomaceller/ml, og suspensjonen ble fordelt i 0,1 ml 1s porsjoner i brønner på en 96 brønners mikroplate. I denne fordeling ble 5 x IO<5>pr. brønn BALB/C mustymocytter tilsatt som feeder-celler. som et resultat derav ble celle- formering observert i ca. 2 uker. Supernatanten ble så samlet og undersøkt med hensyn til nærvær av antistoffer ved EIA-metoden som beskrevet i Eksempel 3. Antistoffaktivitet ble notert i 8 av 19 kloner fra y 2-11 brønnen, i 3 av 54 kloner fra y 2-62 brønnen, og i 5 av 47 kloner fra y 2-100 brønnen (Tabell 2). ; Eksempel 6 ;Bindingskapasitet av monoklonale antistoffer til IFN- y ;Bindingskapasiteten av monoklonale antistoffer til IFN-y ble målt ved den følgende metode. Til 300 pl av en 3 % løs-ning av cellulose koblet med kanin antimus IgG antistoff, ble 300 pl av kultursupernatanten fra hver av 2 eller 3 klonede cellelinjer fra hver av y 2-11, y 2-62 og y2-100 brønner satt, og reaksjonen fikk forløpe ved romtemperatur i 12-20 timer. Så ble cellulosen grundig vasket med fysio-logisk saltvann, og 550 enheter/ml IFN-y fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet nedenunder ble tilsatt dette. Etter 3-4 timers reaksjon ble supernatanten samlet og det erholdte IFN-y ved metoden omtalt nedenunder, tilsatt. Etter 3-4 timers reaksjon ble supernatanten samlet og IFN-aktiviteten deri ble målt med den cytopatiske effekt (CPE) avlesningsmetode ved bruk av en mikroplate (Applied M.icro-biology 16_, 1706 (1968)). Således ble 50 pl MEM plassert i hver brønn på en 96 brønners mikroplate og 50 pl av IFN-prøven ble satt til den første brønnen, etterfulgt av seriemessig to gangers fortynning. Til hver således fremstilt brønn ble 50 pl av en WISH cellesuspensjon (4 x 10^ celler/ml) i 20 % FCS-holdig MEM tilsatt, og inkubering ble utført i en karbondioksyd gassinkubator ved 37°C i 24 timer. Deretter ble 50 pl av et vesikulært stomatittvirus (New Jersey-stamme) preparat justert til en konsentrasjon på 2000TCID^q: midlere vevskultur-infeksjonsdose) tilsatt hver brønn og inkubering ble utført i en karbondioksydinku-bator ved 37°C. Ca. 35 timer senere, når cellene i den IFN prøvefrie brønn viste 100 % CPE, ble hver brønn observert mikroskopisk for bestemmelse av CPE, og den resiproke verdi av fortynningsfaktoren for IFN-prøven i den brønn hvori 50 % CPE ble notert, ble referert til som IFN-styrken. ;IFN-y-prøven som brukes var supernatanten oppsamlet 72 timer etter stimulering av humanperifere lymfocytter med 40 ug/ml konkanavalin A og 15 ng/ml 12-0-tetra-decanoylforbol-13-acetat. Hver ml av denne kultursupernatant inneholdt 4400 enheter human IFN-y* (varme- og syrelabilt). Hvis antistoffer med bindiingskapasitet til IFN-y foreligger i den klonede cellekultursupernatant, skulle da tilsatt IFN-y binde til antistof f ene på cellulosen, og reduksjon i IFN-y" - aktivitet i supernatanten skulle opptre. Som resultat fant man for klone y 2-11, relativ sterk bindingsaktivitet til IFN-y og 50-75 % av det tilsatte IFN-y (550 enheter/ml) var bundet til antistoffer (Tabell 3).

Eksempel 7

Bukyæskedannelse ved monoklonale antistoffproduserende hybridomas

Bukvæskedannelse ble bevirket ved intraperitoneal inokkulering av BALB/c mus intraperitonealt forbehandlet med 0,5 ml mineralolje med 1 x 10^ y 2-11.1 klonceller i stand til å produsere antistoffer med IFN-y-aktivitet. 10 dager etter intraperitoneal administrering av hybridomas, ble bukvæsken tatt og undersøkt med hensyn til antistoffaktivitet opptil IO<7>gangers fortynning. Mens antistoffaktivitet hos den tilsvarende klonecellekultur-supernatant ble påvist opptil 10 4 gangers fortynning,

førte dannelsen av bukvæske til en ca. 1000 gangers økning i antistoffaktivitet.

Eksempel 8

Monoklonal antistoffrensing

Ved bruk av 4 ml bukvæske fremstilt i eksempel 7

som utgangsmateriale, ble monoklonal antistoffrensing ut-ført ved metoden til Staehelin et al. (Journal of Biologi-cal Chemistry 256, 9750 (1981)). Således ble buk-

væsken først sentrifugert ved 10000 opm i 15 minutter for å fjerne fibrinlignende substanser, og så fortynnet med fosfatbuffer-saltvann (PBS: 8,1 mM NaH2P04, 1,5 mM

KH2P04, 2,7 mM KC1, 137 mM NaCl; pH 7,2) til en konsentrasjon, ved hvilken ultrafiolett absorpsjon ved 280 nm (A28Q) ville ligge fra 12 til 14. Deretter ble mettet, vandig ammoniumsulfat satt til den fortynnede prøve til en sulfatkonsentrasjon på 47 %. Blandingen ble rørt ved 4°c i 60 minutter for å bevirke utsalting og ble så sentrifugert (10000 opm, 15 minutter), hvilket ga en utfelling. Utfellingen ble oppløst i 20 mM tris-buffer (pH 7,9) inneholdende 50 mM NaCl og dialysert mot 2 liter av samme buffer. 2 timer senere ble dialyseløsningen erstattet med en ny 2 liters porsjon av samme løsning, og dialysen ble fortsatt ytterligere 15 timer. Deretter ble fellingen fjernet ved sentrifugering ved 10000 opm i 15 minutter, og supernatanten ble justert til en konsentrasjon slik at A1on-verdien ble 20-30. Denne prøven ble fraksjonert på

£o U

en DEAE-cellulosekolonne (8 ml, whatman DE52' ekvilibrert med en tilstrekkelig mengde tris-buffer (pH 7,9) inneholdende 50 mM NaCl, idet eluering ble foretatt med tris-buffer inneholdende 50 mM NaCl ved en strømningshastighet på 1,5

ml/minutt. Under disse betingelser ble antistoffaktiviteten hovedsakelig påvist i effluentfraksjoner. Bekreftelse på at

den rensede prøve er antistoff ble foretatt med SDS-PAGE-metoden som beskrevet av Laemmli et al., Nature 227, 680

(1970). Således ble noen av fraksjonene fremstilt ved ammo-niumsulfatutsalting og DEAE-cellulosefraksjonering, redusert med 2-merkaptoetanol etterfulgt av 17 % SDS-gelelektro-forese ved 30 volt i 24 timer. I overensstemmelse med antistoff aktivi tettoppene , ble to bånd notert i stillinger tilsvarende molekylvekter på ca. 55 kilodaltons (H-kjede) og ca. 28 kilodaltons (L-kjede). Den således rensede antistoff-fraksjon 17 ble undersøkt med hensyn tilIFN-y-bindende aktivitet ved tilsetning av IFN-y (2200 enheter/ml). Det ble funnet at ca).. 50 % IFN-y var bundet til antistoffet (Tabell 4).

Eksempel 9

Underklasse som monoklonale antistoffer tilhører

Renset antistoff-fraksjon 17 (Eksempel 8) ble fortynnet 10 ganger og underkastet en immunoutfellingsreaksjon i agar (Ouchterlony test: Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford 1964) ved bruk av geiteanti-nius IgGl, G2a, G2b og G3 antistoffer (Miles), slik at IgG-underklassen som de y 2-11.1 monoklonale antistoffer kan tilhøre, kunne identifiseres. Et enkelt tydelig bånd ble funnet mellom det monoklonale antistoff og geitantimus IgG2b antistoffet, mens ingen bånddannelse kunne finnes mellom det monoklonale antistoff og anti-antistoffer. Føl-gelig ble det monoklonale antistoff funnet å tilhøre IgG2b (Tabell 5).

Eksempel 10

25 ml (65,3 mg) av det monoklonale antistoff fra effluent-fraksjonene, renset ved fremgangsmåten i Eksempel 8, ble dialysert natten over mot 0,1 M NaHCO^ (pH 8,3). Separat ble 25 ml AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) grundig vasket med vann ved bruk av et glassfilter, op<p>slemmet i 0,1 M NaHC03(pH

8,3) og blandet med ovennevnte antistoff. Blandingen ble forsiktig rørt ved 4°C i 4 timer for å oppnå reaksjon, og fikk så stå ved 4°C natten over. AFFI-GEL 10 ble vasket godt med 0,1 M NaHC03(pH 8,3) ved bruk av et glassfilter. Gelen ble tilsatt 25 ml av en løsning (pH 8,0) inneholdende 0,1 M etanolamin og 0,15 M NaCl. Blandingen ble rystet ved 4°C i 1 time for å blokkere mulige gjenværende

ikke-omsatte aktive grupper. Så ble gelen vasket godt med PBS og oppslemmet i 25 ml 0,1 % NaN3~holdig PBS. Suspensjonen ble lagret ved 4°C. Basert på mengden tilsatt antistoff og mengden av antistoff i det gjenvunnede fil- • trat, fant man at antistoffet var konjugert til gelen i en konsentrasjon på 2,35 mg/ml gel. En kolonne ble pakket med reaksjonsproduktet fremstilt på denne måte, og brukt som en antistoffkolonne.

Eksempel 11

E.coli RRl (pRK148cIts, pRC231/IFI-900) (konstruksjon av denne rekombinante organisme er beskrevet i detalj i europeisk patentansøkning nr. 99084) ble brukt for rlFN-y-produksjon. Plasmidene pRK248cItsog pRC231/IFI-900 inneholdt temperatursensitiv Lambda-repressor og henholdsvis IFN-y-gener. Ekspresjon av rIFN-y-gen var under kontroll av P -promotoren.

Li

Kulturer natten over av E.coli RRl (pRK248cIts>pRC231/- IFI-900) ble dyrket i LB-medium ved 30°C. En liter av kulturen natten over ble fortynnet til 10 liter med minimal M-9 medium inneholdende casaminosyrer. Ved logaritmisk vekst ble kulturen forandret fra 30 til 42°C, og fikk fortsette å vokse ved 42°C i 2-3 timer. Bakteriene ble isolert ved sentrifugering og bakterieklumpene ble lagret ved -20°C inntil bruk. Alle fermenteringer og prosesser ble utført ifølge rekombinant DNA forskrifter fra National Institutes of Health.

Monoklonale antistoffer ble fremstilt mot syntetisk 131-146 C-terminalt peptid av rIFN-y på den ovenfor beskrevne måte. Monoklonalt antistoff Mo y 2-11.1 ble brukt for rensing av rIFN-y. Den monoklonale antistoffkolonne ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 10.

14

Karboksymetylering av rIFN-y ved C-jodeddiksyre ble utført i nærvær av 6 M guanidin-HCl som beskrevet i henvisning (3). Reagensoverskudd ble fjernet ved HPLC på C8 re- versfasekolonne. Karboksypeptidase-nedbrytning ble utført i 0,2 M NH^HCO-j som beskrevet i henvisning (4).

rIFN-y ble behandlet med CNBr (100 ganger molart overskudd over metionin) i 70 % maursyre som beskrevet i henvisning (5). CNBr-peptider ble adskilt ved HPLC på en C-18 revers-fasekolonne. En lineær gradient på 0-70 % CH3CN i 0,1 % trifluoreddiksyre ble brukt for peptideluering.

Protein- eller peptidprøver ble hydrolyser i 20-24 timer i forseglede, N2-spylte, evakuerte rør i konstantkokende HC1 inneholdende 4 % tioglykolsyre. Aminosyreanalyser ble utført ved bruk av en fluorescamin aminosyreanalysator som beskrevet i henvisning (6).

En ABI (Applied Biosystem, Inc.) gassfasesekvensanalysator 470A ble brukt for sekvensanalyser av karboksymetylerte proteiner som beskrevet i henvisning (7). Prøver av PTH-aminosyrer ble identifisert ved reversfase-HPLC på en ultrakule-ODS-kolonne som beskrevet i henvisning (8).

Alle rensetrinn ble utført ved 4°C. Frosne celler (25 g) ble oppslemmet i 3 volumdeler (75 ml) 7 M guanidin-HCl (pH 7). Blandingen ble rørt 1 time, og så sentrifugert i 1 time ved 30000 x g. Supernatanten ble fortynnet 10 ganger med Dulbecco's fosfatbufret saltvann (PBS) eller 0,15 M natri-umboratbuffer (pH 9,5) og deretter sentrifugert 30 minutter ved 30000 x g. Alternativt ble frosne celler (25 g) oppslemmet i 1,5 volumdeler (37,5 ml) 0,15 M natriumborat-buffer (pH 9,5) og rørt i 1 time. Blandingen ble ultralyd-behandlet 5 ganger i 30 sekunder og så sentrifugert i 1 time ved 30000 x g. Supernatantene fra hver guanidin-HCl-ekstraksjon eller ultralydbehandling ble blandet 1 time på en roterende ryster med 25 ml kiselgel og forvasket med PBS. Blandingen ble satt på en kolonne og kolonnen ble vasket med 20-30 kolonnevolumer 1 M NaCl. Kolonnen ble så eluert med 0,5 M tetrametylammoniumklorid i 0,01 M natrium-boratbuffer (pH 8,0). Interferonaktivitet ble eluert i ca. 200 ml og skilt i 4 porsjoner. Hver porsjon ble satt på en monoklonal antistoff (y 2-11.1) -affinitetskolonne (4 ml's søylevolum) ekvilibrert med PBS. Etter vask med 10 kolonnevolumer PBS-buffer, ble kolonnen eluert med enten 1 M guanidin-HCl eller 50 % etylenglykol inneholdende 1 M NaCl og 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0). Interferonaktivitet ble eluert i de første 20 ml.

SDS-PAGE ble utført som beskrevet av Laemmli (henvisning 9). Protein ble bestemt ved fluorescaminanalyse med krys-tallinsk bovinserumalbumin som referansestandard. Interferonaktivitet ble målt ved en cytopatisk effektinhiber-ingsmåling med vesikulær stomatittvirus og human-WISH-celler som angitt i henvisning 10. Alle interferonstyrker er uttrykt i referanseenheter/ml kalibrert mot referanse-standarden for partsielt renset humanimmuninterferon.

En sammenfatning av ekstraksjonsrenseprosessen er gitt i tabell 6 (side 25). Totalutbyttet var 25-32 % og rensingen var ca. 100-769 ganger med en gjennomsnittlig spesifikk

7

aktivit pa 1 x 10 enheter/mg. Totalutbyttet av rIFN-y var 3-4 ganger høyere med guanidinekstraksjon. SDS-PAGE av siste rensetrinn er vist i figur 1. Materialet som er renset fra guanidinekstraksjonen viste ett eneste bånd ved ca. 18000 daltons (18K rIFN-y), mens materialet fra ultra-lydbehandingsprosessen ga et hovedbånd ved ca. 15000 daltons (15K rIFN-y) og et lite bånd ved ca. 17000 daltons (figur IA). På ikke-reduserende gel ble dimere og oligomere av rIFN-y dannet (figur IB).

18K rIFN-f var homogent og aminosyresammensetningen var i overensstemmelse med det man forventet fra DNA-sekvensen. Aminosyresammensetninger av 15K og 18K rIFN-y er angitt i tabell 7. Flere hundre picomol redusert og karboksymetylert 15K og 18K protein, gjennomgikk Edman-nedbrytning i en automatisk gassfaseprotein/peptidsekvenanalysator. Aminosyre-N-terminalsekvensene til de første 32 og 26 rester av 15K og henholdsvis 18K proteinene var i overensstemmelse med det som ble forventet fra DNA-sekvensen (figur 2).

14

C-karboksymetylerte cysteiner ble påvist i første og tredje syklus av sekvensanalyser. Ikke noe N-terminalt metionin ble påvist. N-terminalsekvensanalyse av 18K og 15K rIFN-y viste at sekvensen for dette området hos begge proteiner er identisk med det som ble forventet fra DNA-sekvensen. De C-terminale peptider har også blittkarakterisertfor å bestemme om noen delesjoner eller forandringer forekommer i dette området. Aminosyreanalyse og karboksypeptidase A (CPA) nedbrytningsblanding tyder på at serin og/eller glutamin (C-terminale aminosyrer) ble frigjort fra 18K rIFN-y, mens 15K rIFN-y ikke ble nedbrutt av CPA under de samme betingelser. Da Ser-Gln er den C-terminale sekvens av rIFN-y viste 18K typene seg å ha intakte C-ender, mens 15K typene hadde en forskjellig C-terminalrest (Lys) som ikke spaltes av CPA.

De forventede C-terminale rester ut fra DNA-sekvensene ble videre bekreftet ved analyse og sekvensering av de C-terminale peptider etter CNBr-behandling. C-terminale peptider ble separert på HPLC C-18 reversfasekolonnen (figur 3). En skarp peptidtopp (topp II), eluert fra den tidlige del av gradienten erholdtes fra 15K rIFN-y, og dette peptidet manglet i CNBr-nedbrytningsblandingen av 18K rIFN-y. Aminosyreanalyse av dette peptid viste at dette peptid ikke hadde noe homoserin eller homoserinlacton, og derfor måtte være det C-terminale CNBr-peptid av 15K proteinet. Basert på aminosyreanalyse (Tabell i), tilsvarte dette peptidet aminosyrerester nr. 121-131 av IFN-y (ikke noe arginin var påviselig. Sekvensen av de 11 aminosyrer ble bekreftet ved sekvensanalyse (figur 2). I tilfellet 18K rIFN-y erholdtes en relativt bred topp i den tidlige del av elueringen. Denne topp ble videre separert i to topper med en flat gradient. Aminosyreanalysene viste at den første toppen er det CNBr C-terminale peptid av 18K proteinet (Tabell 8), og arninosyresammensetningen tilsvarer aminosyrerester nr. 138-146. Sekvensen av de 9 aminosyrer ble bekreftet ved sek-vensbestemmelse (figur 2). Den C-terminale aminosyre av 15K proteinet ble funnet å være lysin.

Disse resultater viser at 18K typene var det intakte rIFN-y molekyl, mens 15K typene var et proteolyttisk produkt. Pep-tidbåndet mellom aminosyrerester nr. 131 og 132 (Lys-Arg) ble spaltet på 15K typene.

Eksempel 12

Tryptisk peptidkart av 18K rIFN- y

Tryptisk peptidkartlegging av 18K rIFN-y ble utført. 18K rIFN-y (43 pg) ble nedbrutt med TPCK-trypsin (1,1 pg, Worthington (USA)) ved 37°C i 18 timer i 147 pl 25 mM ammoniumacetat-NaOH (pH 8,0). 2-merkaptoetanol (0,6 pl) ble satt til nedbrytningsblåndingen og inkuberingen ble fortsatt i 2 timer. For å stoppe reaksjonen ble 53 pl 1 % trifluoreddiksyre (TFA) tilsatt. Hele den nedbrutte prøve ble kromatografert på en ultrakule-oktyl-kolonne (5 pm, 4,6 x 250 nm, Altex (USA)) ekvilibrert med 0,2 % TFA-5 % CH3CN. Eluering ble foretatt ved 1,0 ml/minutt med en lineær gradient på 5-70 % CH3CN ved 30°C. Effluenten ble styrt ved den fluorometriske metode ved bruk av fluorescamin. Det resulterende kart er å finne i figur 4.

Eksempel 13

Bestemmelse av den C- terminale aminosyre av 18K rIFN- y

Den C-terminale aminosyre av 18K rIFN-y ble målt med hydra-zinolyse ifølge metoden til Narita et al. (J. Biochem.

(Tokyo) 5_9, 170 (1966 )). 18K rIFN-y (185 pg) ble oppvarmet ved 100°C i 6 timer med vannfritt hydrazin. Det fryse-tørkede hydrazinolysat ble oppløst i vann, og benzaldehyd ble tilsatt. Blandingen ble rystet kraftig i 1 time ved romtemperatur og så sentrifugert. Supernatanten ble fryse-tørket og aminosyren analysert. Man fant imidlertid ingen aminosyre. Dette resultat er i overenstemmelse med det faktum at den C-terminale aminosyre i 18K typene er glutamin.

HENVISNINGER

1. Gray, P.W., et al., Nature 295, 503-508 (1982)

2. Stahelin, T., et al., J. Biol Chem. 256, 9750-9754

(1981) 3. Allen, G., Sequencing of Protein and Peptides, sidene 30-31 (1981), North-Holland Publishing Co., Amsterdam, New York 4. Amber, R.P., Methods in Ezymology 11, 436-445 (1967) 5. Wolfe, R.A. og Stein, S., Modern Methods in Pharmaco-logy, sidene 55-77 (1982), Alan R. Liss, Inc., New York, NY. 6. Stein, S. og Brink, L., Methods in Enzymology, 79.. 20_ 25 (1981) 7. Hewick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hodd, L.E. og DreyerW.I., J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981) 8. Hawke, D., Yuan, P-M., og Shively, J.E., Anal. Biochem. 120, 302-311 (1982)

9. Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)

10. Rubinstein, S., Familletti, P.C., og Pestka, S., J. Virol. 3_7, 755-758 (1981 ).

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av intakt, rekombinant human immun-ixiterferon (Mrø=18CO0 Da) i hovedsak fritt for proteolytiske fragmenter derav, fra transformerte E. coli-celler inneholdende dette protein,karakterisert vedå ekstrahere det intakte, rekombinante human immun-interferon fra de transformerte E. coli-celler ved å suspen-dere E. coli-cellene i en oppløsning med et guanidinium-salt eller urea og rense det resulterende ekstraherte interferon ved å bruke en monoklonal-antistoff-affinitetskolonne bestående av monoklonale antistoff rettet mot et 131-146 C-terminalt peptid av human immun-interferon.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det anvendes en oppløsning av guanidin-HCl.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det anvendes en oppløsning av 4 M guanidin-HCl.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at E. coli-cellene suspenderes i minst 3 volumdeler av guanidinium-salt- eller urea-oppløsningen for hvert gram av E. coli som anvendes.