FI80906C - Foerfarande foer extraktion av intakt rekombinant-human-immuninterferonprotein. - Google Patents

Description

1 80906

Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin uuttamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen muuttumat-5 toman yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin uuttami seksi, joka proteiini on oleellisesti vapaa proteolyysi-fragmenteistaan, tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista. Uutto suoritetaan reagenssil-la, kuten guanidiinihydrokloridilla, joka alentaa pro-10 teaasien eli entsyymien aktiivisuutta vaikuttamatta halu tun proteiinin aktiivisuuteen. Guanidiinihydrokloridiuut-toa seuraavat muut puhdistusvaiheet voivat olla sellaisia, jotka ovat tuttuja proteiinien puhdistamiseen liittyvän alan ammattimiehelle.

15 Kuvio 1 valaisee ihmisen puhdistetun yhdistelmä- immuuni-interferonin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryy-liamidigeeli-elektroforeesia (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuhteissa (A) (0,7 M β-merkaptoetanoli) ja ei-pelkis-tävissä olosuhteissa (B).

20 Kuviossa 2 verrataan keskenään ihmisen yhdistelmä- immuuni-interferonin ennustettua aminohappojärjestystä sekä 15 ja 16 kilodaltönin (K) rlFN-a-lajia koodaavaa todellista DNA-jaksoa.

Kuvio 3 valaisee 15 K:n ja 18 K:n rlFN-a-lajin 25 C-terminaalisten peptidien HPLC-erotusta CNBr-käsittelyn jälkeen.

Tähän mennessä on kehitetty monenlaisia menetelmiä interferonina tunnetun, virusten vastaisista proteiineista koostuvan ryhmän uuttamiseksi ja puhdistamiseksi.

30 Tällä hetkellä tunnetaan kolme pääryhmää interferoneja: IFN-α (valkosolu), IFN-B (sidekudos) ja IFN-y* (immuuni). Vaikka eri interferoniryhmät saattavat olla sukua toisilleen virusten vastaisten, jakaantumista estävien ja rakenteellisten ominaisuuksiensa suhteen, ei tähän mennessä 35 ole pystytty kehittämään yhtenäistä menetelmää kaikkien T.

2 80906 näiden ryhmien uuttamiseksi ja puhdistamiseksi. Monilla menetelmillä, jotka soveltuvat valkosolu-interferonin uuttamiseen ja puhdistamiseen muita proteiineja ja solujät-teitä sisältävästä raakaseoksesta, ei todellakaan onnis-5 tuttaisi uuttamaan sidekudos- tai immuuni-interferonia samanlaisesta preparaatista.

Tunnettujen puhdistusmenetelmien uuttovaiheessa mikro-organismit, jotka ovat tuottaneet, usein yhdistelmä-tekniikan kautta, haluttua "vierasta" proteiinia, hajote-10 taan tavallisesti mekaanisesti (so. äänikäsittelyllä) tai kemiallisesti. Tämän mekaanisen tai kemiallisen hajotuksen aikana vapautuu seokseen kuitenkin myös erilaisia solun proteaaseja. Proteaasit ovat sitten vapaita vaikuttamaan entsymaattisesti seoksen sisältämään "vieraaseen” 15 proteiiniin ja hajottamaan sitä. Proteaasit voivat siten estää "vieraan" proteiinin puhdistamisen homogeeniseksi valmiiksi ja biologisesti aktiiviseksi muodoksi.

Tämän Keksinnön tavoitteena on sen vuoksi saada aikaan menetelmä, jolla ei ole tähänastisten uuttomenetel-20 mien puutteita ja jonka avulla saadaan muuttumaton immuu-ni-interferoniketju ja jolla proteolyyttisestä hajoamisesta seuraavat fragmentit poistetaan puhdistetuista immuuni-interferonipreparaateista.

Nyt on havaittu immuuni-interferonin suhteen, että 25 millään aiemmin kuvatulla tavanomaisella menetelmällä, kuten äänikäsittelyä tai kemiallista hajotusta käyttäen, toteutettava uutto ei tuota immuuni-interferonia, jolla on muuttumaton tai täydellinen aminohappoketju. Vasta viime aikoina on yhdistelmätekniikka edistynyt siihen pisteeseen, 30 että on mahdollista tuottaa riittäviä määriä rlFN- ]f*:a sen karakterisoimiseksi ja sen aminohappojärjestyksen määrittämiseksi. Käytettäessä tavanomaisia tunnettuja menetelmiä rIFN-Χ-preparaattien uuttamiseen ja määritettäessä puhdistetun materiaalin aminohappojärjestys havaittiin, että 35 puhdistettu preparaatti koostui itse asiassa joukosta toisilleen läheisiä proteiinilajeja, joilla oli eri molekyyli- 3 80906 paino. Lisäksi on aminohapposekvenssianalyysillä havaittu, että nämä proteiinilajit koostuvat itse asiassa immuuni-interferonin muuttumattoman muodon ja sen proteolyysi-fragmenttien yhdistelmästä. Toistaiseksi ei siten ole 5 kyetty uuttamaan ja puhdistamaan immuuni-interferonia niin, että olisi saatu homogeenista, muuttumatona, muista proteolyysifragmenteista vapaata immuuni-interferonia .

On havaittu, että rlFN- 'jf'rn hajoaminen voidaan 10 estää käyttämällä reagenssia, kuten esimerkiksi guanidiini-hydrokloridia, joka alentaa proteaasien eli entsyymien aktiivisuutta ja joka ei vaikuta rIFN-"p:n aktiivisuuteen, puhdistusprosessin ensimmäisessä vaiheessa, uuttovaiheessa, jotta saadaan homogeenisia ja muuttumattomia molekyylejä.

15 Jäädytettyjen solujen äänikäsittelyllä, ilman guanidiini-hydrokloridin mukanaoloa, on saatu pääasiassa proteolyysi-tuotetta (15 K:n rIFN-]P:a), josta IFN~T^:n C-terminaali-set aminohappotähteet nro 132-146 puuttuvat. Muuttumattoman molekyylin aminohappojärjestys ja N-terminaalinen jak-20 so vastasivat DNA-jakson perusteella odotettuja. rlFN-T1:^ koodaava DNA-emäsjakso, jota käytetään läpi koko tämän selityksen, on viitteessä 1 kuvatun kaltainen.

On yllättävästi todettu, että immuuni-interferoni säilyttää biologisen aktiivisuutensa guanidiinihydroklori-25 diuuttovaiheen jälkeen, vaikkakin guanidiinihydrokloridi tuhoaa biologisen aktiivisuuden, kun sitä lisätään puhdistettuun immuuni-interferonipreparaattiin. On edullista, että tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa transformoidut mikro-organismit suspendoidaan guanidiinihydroklo-30 ridiin.

Tämän keksinnön mukainen antiproteolyyttinen aine voi olla mikä tahansa guanidiniumsuola. Sellaisia guanidi-niumsuoloja ovat suolat, joita guanidiini muodostaa orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, tai mine-35 raalihappojen, kuten vetyhalogeenidien, so. vetybromidien, vetyfluoridin ja vetyjodidin kanssa. Edullinen guanidi- 4 80906 niumsuola on guanidiinihydrokloridi. Guanidiniumsuolan pitoisuus mikro-organismeja käsiteltäessä ei ole ratkaiseva; mitä tahansa tehoavaa määrää voidaan käyttää. On kuitenkin edullista, että mikro-organismien käsittelyyn 5 käytetään 3-7 M guanidiniumsuolaliuosta ja että kyseistä suolaliuosta käytetään noin 3 - 9-kertaisesti siihen tila-vuusmäärään nähden, joka vastaa grammaa transformoituja mikro-organismeja. Suolan pitoisuus voidaan säätää sekoittamalla suola liuottimeen, esimerkiksi veteen tai vettä 10 sisältävään puskuriin, kuten ammoniumasetaatti- tai pyri-diini-etikkahappopuskuriin tai vastaavaan. On myös selvää, että tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa voidaan käyttää muitakin proteaasi-inhibiittoreita, kuten ureaa tai tio-syanaattia.

15 Puhdasta rlFN-^.’a saadaan lopulta puhdistamalla E.coli-supernatantti suoraan uuton ja sopivan laimennuksen jälkeen, edullisesti puhdistusvaiheella, jossa käytetään monoklonaalista vasta-ainetta. Uutto- ja puhdistusprosessi voidaan automatisoida laajamittaista tuotantoa varten. Näin 20 keksintö tekee mahdolliseksi saada ensimmäisen kerran suuria määriä homogeenista rlFN-^ra ja mahdollistaa siten laajamittaiset kliiniset kokeet, biologiset tutkimukset, röntgenkristallografiän ja rakenne-toiminta-tutkimukset.

Muita edullisia suoritusmuotoja valaistaan seuraa-25 vassa selityksessä ja esimerkeissä.

E.colissa tuotettu ihmisen immuuni-interferoni uutetaan edullisesti jäädytetystä solumassasta 7 M guani-diinihydrokloridilla ja puhdistetaan sopivin puhdistuskei-noin, kuten esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta si-30 sältävissä affiniteettipylväissä. Puhdistettua interferonia, jonka näennäinen molekyylipaino on 18000 daltonia (18 K) SDS-PAGE:11a, on saatu guanidiiniuuttoa käyttämällä, kun taas äänikäsittelyllä ilman guanidiinin mukanaoloa eristettiin lajeja, joiden molekyylipaino oli alempi (pääla-35 jeilla noin 15000 daltonia, 15 K). Sekä 18 K:n että 15 K:n 5 80906 proteiinin aminoterminaalinen jakso vastasi tätä ihmisen immuuni-interferoniproteiinia koodaavan DNA-jakson perusteella ennustettua jaksoa.

C-terminaalinen jakso määritettiin analysoimalla 5 ja sekventoimalla puhdistettu C-terminaalinen peptidi CNBr-käsittelyn jälkeen. 18 K:n rIFN-”]P:sta saadun C-terminaa-lisen peptidin aminohappokoostumus ja -järjestys vastasivat rlFN-'^ :n ennustettua jaksoa, mikä osoittaa 18 K:n lajin olevan muuttumaton molekyyli. Toisaalta 15 K:n rlFN-^rn 10 C-päästä vapautui CNBr:lla käsiteltäessä erilainen pepti-difragmentti. Aminohappokoostumus- ja -järjestysanalyysin perusteella tämä erilainen peptidi vastasi aminohappotähteitä nro 121-131, mikä osoittaa 15 K:n lajin olevan prote-olyysituote.

15 Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fer- mentointiprosesseissa vastaanottajana käytettävä mikro-organismi on, ellei toisin mainita, Escherichia coli K-12, kanta 294, jota kuvataan GB-patenttijulkaisussa 2 055 382A ja joka on talletettu 28. lokakuuta 1978 the American Type 20 Culture Collectioniin numerolla ATCC 31446. Lisäksi kaikki tämän keksinnön yhteydessä suoritettu yhdistelmä-DIft-työskentely toteutettiin the National Institutes of Healthin sovellettavissa olevien ohjeiden mukaisesti.

Tämän keksinnön piiriin kuuluu kuitenkin paitsi 25 edellä mainitun E.coli K-12 -kannan 294 käyttö myös muiden tunnettujen E.coli-kantojen, kuten E.coli MA210 tai E.coli RRl (ATCC nro 31343)-kannan, tai muiden mikro-organismien, joista monia on yleisesti saatavissa tai talletettuina hyväksyttyihin mikro-organismien talletuslaitoksiin, kuten 30 the American Type Culture Collectioniin ja saatavissa niistä (ks esimerkiksi ATCC-luettelo), käyttö.

Monoklonaalisia vasta-aineita valmistettiin synteettistä polypeptidiä vastaan, joka koostui rlFN- 7^:n 16 viimeisestä C-terminaalisesta aminohappotähteestä, so. ami-35 nohappotähteistä nro 131-146. Yhtä monoklonaalisista vasta- 6 80906 aineista (Mo Τ'* 2-11.1) käytettiin rlFN- P:n puhdistamiseen. Tarkemmin määritellen tässä käytetyt monoklonaaliset vasta-aineet ja affiniteettipylväs valmistettiin EP-hakemusjulkaisussa 103 898 kuvatulla tavalla.

5 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin.

Esimerkki 1

Antigeeninä käytettävän kantajaproteiini-polypep- tidi-kompleksin synteesi

Polypeptidi H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-10 Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH liitettiin tyroglobulii-niin (tästä eteenpäin TG) Goodfriendin et ai. /Science 144 (1964) 1334/ esittämällä menetelmällä.

Itse peptidi voidaan valmistaa tavanomaisin peptidi-synteesimenetelmin. Voidaan käyttää joko kiinteäfaasi- tai 15 nestefaasimenetelmää, vaikkakin nestefaasissa toteutettava synteesi on edullinen monissa tapauksissa. Tällaisia pep-tidisynteesimenetelmiä kuvaavat esimerkiksi Schröder ja Liibke teoksessa "The Peptides", osa 1, Academic Press,

New York, USA, 1966; Izumiya et ai. teoksessa "Peptide 20 Synthesis", Maruzen, Tokio, Japani, 1975; tai Haruaki Yajima teoksessa "Experiments in Biochemistry", osa 1, s. 207-400, Tokyo Kagaku Dojin, 1977; ja niihin kuuluvat muun muassa atsidimenetelmä, kloridimenetelmä, happoanhyd-ridimenetelmä, sekahappoanhydridimenetelmä, DCC-menetelmä, 25 aktiivinen esteri-menetelmä, menetelmä, jossa käytetään

Woodward-reagenssi K:a, karbodi-imidatsolimenetelmä, hape-tus-pelkistysmenetelmä ja DCC/lisäaine (esim. HONB, HOBt, HOSu)-menetelmä.

IFN-'pin 131-146-fragmentin valmistusta kuvataan 30 yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 103 898.

2,5 mg mainittua polypeptidiä sekoitettiin 3,75 mg: aan TG:a, ja sen jälkeen kun oli lisätty 2 ml 40 mM fosfaattipuskuria, seosta sekoitettiin hyvin jäävedessä. Seokseen lisättiin vähitellen pisaroittain liuos, joka sisälsi 35 30,4 mg karbodi-imidihydrokloridia 200 ml:ssa tislattua 7 80906 vettä. Sen jälkeen seosta sekoitettiin jäävedessä 3 tuntia. Reaktion mentyä loppuun tuotetta dialysoitiin riittävässä määrin tislattua vettä vastaan, jonka jälkeen se kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 4,7 mg proteiinikompleksia.

5 Esimerkki 2

Entsyymiin sidotun antigeenin valmistaminen vasta-aineiden määrittämiseen käytettävää EIA-testiä (Enzyme Immunoassay) varten EIA-testiin tarvittava entsyymiin sidottu antigeeni 10 valmistettiin Kitagawan et ai. ^Journal of Biochemistry 79 (1976) 2337 mukaisesti.

(i) Maleimidiryhmän liittäminen polypeptidiin

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu polypeptidi (350 nmol) liuotettiin 1 ml:aan 100 mM fosfaattipuskuria 15 (pH 6,8), ja tämä liuos lisättiin liuokseen, joka sisälsi 585 pg (1,75 pmol) N-(4-karboksisykloheksyylimetyyli)maleimi-di-N-hydroksisukkinimidiesteriä 70 pl:ssa N,N-dimetyyliform-amidia. Seosta sekoitettiin 30°C:ssa 30 minuuttia. Reaktion mentyä loppuun suoritettiin fraktiointi Sephadex G-25-kolon-20 nissa, jolloin saatiin 185 nmol polypeptidifraktiota, johon polypeptidiin oli liittynyt maleimidiryhmä.

(ii) Maleimidiryhmän sisältävän polypeptidin liittäminen /3-D-galaktosidaasiin.

Maleimidiryhmän sisältävä polypeptidi (16,5 nmol) 25 sekoitettiin 3,3 nmol:iin y^-D-galaktosidaasia. 4°C:ssa tapahtuneen 18 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 412,5 nmol ^S-merkaptoetanolia reaktion päättämiseksi. /3-D-galaktosi-daasiin liitetty polypeptidi saatiin fraktioimalla Sepha-rose 6B-kolonnissa ja käytettiin myöhempiin kokeisiin.

30 _Es imerkki 3

Immunisointi

Kullekin kuudelle BALB/C-hiirinaaraalle, joiden ikä oli 7-8 viikkoa, annettiin ihon alle 40 pg (proteiinin mukaan laskettuna) esimerkin 1 mukaista, antigeeninä toirai-35 vaa proteiinikompleksia sekoitettuna huolellisesti Freun- 8 80906 din täydelliseen apuaineeseen (Freund's complete adjuvant) (ensimmäinen immunisointi). 2 viikon kuluttua ensimmäisestä immunisoinnista hiirille annettiin jälleen ihon alle sama annos antigeeniä kuin edellä, sekoitettuna hyvin Freund'in 5 epätäydelliseen apuaineeseen (Freund's incomplete adjuvant) (toinen immunisointi). Taas 2 viikon kuluttua tehtiin kolmas immunisointi samalla tavalla kuin toinenkin. 6 vuorokauden kuluttua kolmannesta immunisoinnista hiiristä otettiin osaverinäytteet, ja seerumin vasta-ainepitoisuudet mää-10 ritettiin jäljempänä kuvattavalla EIA-menetelmällä /vrt.

Immunopharmacolocy 1 (1978) 3/. Hiirellä nro T- 2 oli suurin vasta-ainepitoisuus, ja sille tehtiin viimeinen immunisointi antamalla laskimoon 120 pg antigeeniä liuotettuna 0,5 ml:aan natriumkloridin vesiliuosta.

15 Kunkin hiiren vasta-ainepitoisuudet esitetään taulu kossa 1.

Taulukko 1

Antipeptidi-vasta-ainemäärät immunisoiduissa hiirissä 20 B/T %

Hiiri Ensimmäinen Toinen Kolmas n:o immunisointi immunisointi immunisointi _(lj_(2i_(3)_ 1 2 3 4 5 6 - (4 N.D. 24,5 2 25 2 N.D. (5 19,3 35,3 3 - N.D. 24,5 4 N.D. 1,3 1,7 5 N.D. 1,8 5,0 6 - N.D. 0,8 30 Normaali hiiri_0,6_0,1_N.D.__ (1) Seerumin laimennussuhde 1/1 000 (2) Seerumin laimennussuhde 1/6 300 (3) Seerumin laimennussuhde 1/7 800 35 4) - = Havaittavuusrajän alapuolella 5) N.D. = Ei määritetty B/T = (Sidottu entsyymiaktiivisuus/lisätty kokonaisentsyy-miaktiivisuus) x 100 9 80906 EIA-menetelmä

Vasta-aineaktiivisuus määritettiin esimerkin 2 mukaisella proteiinikompleksilla immunisoitujen hiirien seerumista tai hybridoomasupernatantista EIA-menetelmällä /immu-5 nology 1 (1978) 3/. Sen mukaisesti seerumi tai hybridooma-supernatantti laimennettiin puskurilla A (20 mM Na^PO^-.n suhteen, 100 mM NaCl:n suhteen, 0,1 % NaH^sa, 1 mM MgCl2:n suhteen, pH 7,0), 100 f*1 tätä laimennosta sekoitettiin 100 pl:aan entsyymiin sidottua polypeptidijohdannaista 10 (esimerkki 2), ja reaktion annettiin edetä 24°C:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 100 pl 3-%ista selluloosaa, johon oli liitetty kaniinin hiirenvastaista IgG:a, ja reaktion annettiin jatkua 24°C:ssa 4 tuntia. Reaktion mentyä loppuun selluloosa pestiin hyvin puskurilla A, joka sisälsi 0,5 % 15 Tween 20:a, sitten lisättiin 500 pl liuosta, joka sisälsi 20 pg/ml 4-metyyliumbelliferyyli-/6-D-galaktosidia, ja 37°C: ssa tapahtuneen 2 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 3 ml 1Q0 mM karbonaattipuskuria (pH 10,5) reaktion päättämiseksi. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin fluorometrillä (eksi-20 taatio 365 nm; emissio 450 nm).

Solufuusio

Kolmen vuorokauden kuluttua viimeisestä immunisoinnista (esimerkki 3) hiiren ^-2 perna poistettiin, suoda-25 tettiin paineen avulla ruostumatonta terästä olevan verkon läpi jasuspendoitiin MEM:iin (Eagle's minimum essential medium), jolloin saatiin pernasolususpensio. Solufuusioon käytettiin BALB/C-hiiristä saatuja P3-x63.Ag8.Ui-(P3U1)-myeloomasoluja ^Current Topics in Microbiology and Immuno-30 logy 81 (1978) 1J. Solufuusio tehtiin Köhlerin ja Milstei-nin /Nature 256 (1975) 495-497/ alkuperäisellä menetelmällä. Sen mukaisesti pernasolut ja P3Ul-solut pestiin erikseen kolmesti seerumivapaalla MEMrllä ja sekoitettiin suhteessa 5:1 (solujen lukumääräsuhde). Seosta sentrifugoitiin 35 nopeudella 800 rpm 15 minuuttia, jolloin solut laskeutuivat.

10 80906

Supernatantin huolellisen poiston jälkeen sedimentti erotettiin varovasti, lisättiin 0,3 ml 45 % polyetyleenigly-koli (PEG) 6 000 (Koch-Light), ja seoksen annettiin seistä 37°C:een temperoidussa vesihauteessa 7 minuuttia solu-5 fuusion aikaansaamiseksi. Sen jälkeen siihen lisättiin MEM:ä nopeudella 2 ml/min. Kun kaikkiaan 12 ml MEM:ä oli lisätty, saatua seosta sentrifugoitiin nopeudella 600 rpm 15 minuuttia, jonka jälkeen supernatantti poistettiin. Solusedimentti suspendoitiin RPMI-1640-väliaineeseen, johon 10 oli lisätty 10 % vasikan sikiöseerumia (RPMI 1640-10FCS). niin että pitoisuudeksi tuli 2 x 10 P3Ul-solua/ml, ja 24 syvennyksen monimaljasysteemin (Linbro) kuhunkin 144 syvennykseen siirrostettiin 1 ml suspensiota. Siirrostuksen jälkeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa 5 % CC^sa sisältävässä 15 kaasuinkubaattorissa. 24 tunnin kuluttua aloitettiin HAI-selektiivinen viljely lisäämällä kuhunkin syvennykseen 1 ml HAT-väliaineella täydennettyä RPMI 1640-10FCS-väli--4 -7 ainetta (1 x 10 M hypoksantiinin, 4 x 10 M aminopetrii--5 nin ja 1,6 x 10 M tymidiinin suhteen). HAT-selektiivis-20 tä viljelyä jatkettiin korvaten 1 ml vanhaa väliainetta 1 ml:11a HAT-väliainetta 3, 5 ja 7 vrk:n kuluttua viljelyn aloittamisesta. Hybridoomien kasvu havaittiin 10-14 vrk:n kuluttua solufuusiosta. Kasvatusliemen muututtua keltaiseksi (noin 1 x 10^ solua/ml) supernatantti kerättiin, ja 25 siitä tutkittiin vasta-aineen läsnäolo EIA-menetelmällä.

Tällä tavalla tutkittiin supernatantit niistä 141 syvennyksestä, joissa hybridoomakasvua oli havaittu. Kahdessa syvennyksessä ( Y^-ll ja '"pJ-lOO) havaittiin voimakas vas-ta-aineaktiivisuus ja kahdessa muussa (^2-62 ja J^2-70) 30 heikko vasta-aineaktiivisuus.

Esimerkki 5 Kloonaus

Kolmessa positiivisen tuloksen vasta-aineaktiivi-suustestissä antaneessa syvennyksessä (^2-11, ^2-62 ja 35 ^2-100) olleet hybridoomat kloonattiin rajoittavan laimen- 11 80906 nuksen menetelmällä. Sen mukaisesti hybridoomasolut sus-pendoitiin RPMI 1640-20FCS-väliaineeseen, niin että pitoisuudeksi tuli vähintään 2 hybridoomasolua/ml, ja suspensio jaettiin 0,1 ml:n annoksina 96-syvennyksisen mikro-5 maljan syvennyksiin. Mainitun jaon yhteydessä kuhunkin syvennykseen lisättiin 5 x 10^ BALB/C-hiiren tymosyyttiä syöttösoluiksi. Tämän tuloksena havaittiin solujen jakautuminen noin 2 viikon kuluessa. Sen jälkeen supernatantti kerättiin, ja siitä tutkittiin vasta-aineiden läsnäolo 10 esimerkissä 3 kuvatulla EIA-menetelmällä. Vasta-aineaktii-visuutta havaittiin 8:ssa 19:stä 'f'2-ll-syvennyksestä saadusta kloonista, 3:ssa 54:stä Y*2-62-syvennyksestä saadusta kloonista ja 5:ssä 47:stä f^-lOO-syvennyksestä saadusta kloonista (taulukko 2).

12 80906

Taulukko 2

Kloonattujen hybridoomien antipeptidi-vasta-aineaktiivi-visuus 5

Hybridooma nro B/T (%) γ 2-11 1 6Θ 10 2 31 3 63 6 68 7 67 9 69 15 12 42 18 60 γ 2-62 14 20 20 16 21 34 16 Ύ 2-100 2 69 25 3 70 16 56 25 80 46 33 30 Hyperimmuunin hiiren seerumi 35 13 80906

Esimerkki 6

Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapa- siteetti IFN- T:aan

Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapasi-5 teetti IFN- T :aan määritettiin seuraavalla menetelmällä.

300 pl:aan liuosta, joka sisälsi 3% kaniinin antihiiri-IgG-vasta-aineeseen liitettyä sellullosaa, lisättiin 300 jul vil-jelmäsupernatanttia, joka oli saatu syvennyksistä Y2_H' ^2-62 ja ^2-100 olevista 2 tai 3 kloonatusta solulinjas 10 ta, ja reaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa 12 -20 tuntia. Sen jälkeen selluloosa pestiin huolellisesti fysiologisella suolaliuoksella, ja siihen lisättiin 550 yk-sikköä/ml edellä mainitulla menetelmällä saatua IFN~T:a· 3-4 tunnin reaktioajan jälkseen supernatantti kerättiin, 15 ja sen IFN-T-aktiviisuus määritettiin sytopaattiseen vaikutukseen perustuvalla menetelmällä käyttäen mikromaljaa ^Applied Microbiology 16 81968) 1706_7· Sen mukaisesti kuhunkin 96-syvennyksisen mikromaljan syvennykseen asetettiin 50 pl MEM:ä ja ensimmäiseen syvennykseen pantiin 50 μΐ 20 IFN-näytettä, mitä seurasi kaksinkertainen sarjalaimennus. Kuhunkin näin preparoituun syvennykseen lisättiin 50 μΐ 5 WISH-solususpensiota (4 x 10 solua/ml) 20 % FCS:a sisältävässä MEM:ssä, ja inkuboitiin CC^-kaasuinkubaattorissa 37°C:ssa 24 tuntia. Sne jälkeen kuhunkin syvennykseen li-25 sättiin 50 pl preparaattia, joka sisälsi rakkulaista suu- tulehdusta aiheuttavaa virusta (New Jersey-kanta) pitoisuutena 2 000 TCID^q (TCID^q = kudosviljelmän infektoiva kes-kivertoannos), ja inkuboitiin CC^-inkubaattorissa 37°C:ssa. Noin 35 tunnin kuluttua, kun IFN-näytettä sisältämättömän 30 syvennyksen soluissa havaittiin 100 %:n CPE, kukin syvennys tutkittiin mikroskooppisesti CPE:n arvioimiseksi, ja maljan, jossa havaittiin 50 %:n CPE, sisältämän IFN-näyt-teen laimennuskertoimen käänteislukua pidettiin IFN-tiit-terinä.

35 Käytetty IFN-T-n^yte oli supernatantti, joka oli 14 80906 kerätty 72 tunnin kuluttua siitä, kun ihmisen ääreislym-fosyytit oli stimuloitu konkanavaliini A:11a (40 jug/ml) ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatilla (15 ng/ml).

1 ml tätä viljelmäsupernatanttia sisälsi 4400 yksikköä 5 ihmisen IFN-^Pra (lämpö- ja happoherkkää). Jos kloonattuja soluja sisältävän viljelmän supernatantti sisältää vasta-aineita, joilla on sitomiskapasiteettia irN-T^n suhteen, lisätyn IFN- T: n pitäisi sitoutua selluloosalla oleviin vasta-aineisiin ja supernatantin IFN- 'P -aktiivi-10 suuden pitäisi laskea. Tuloksena oli, että kloonilla 7*2-11 havaittiin olevan suhteellisen voimakas IFN-"p:n sitomiskyky ja että 50-75 % lisätystä IFN-"P: s ta (550 yk-sikköä/ml) sitoutui vasta-aineisiin (tauluko 3).

15 Taulukko 3 IFN-^-aktiivisuuden absorboituminen monoklonaalisiin vasta-aineisiin _______

Hybridoomaviljelmä IFN-jäännösaktiivisuus _______ _ _(U/ml)_ __________ 20 Koe 1 Koe 2 γ 2-11,1 138 275 γ 2-11,2 207 N.D.

γ 2-11,6 N.D. 275 γ 2-62,2 275 550 25 γ 2-62,3 275 550 γ 2-100,2 550 N.D.

γ 2-100,3 550 N.D.

550 550 30 Esimerkki 7

Monoklonaalista vasta-ainetta tuottavien hybridoo-mien aiheuttama askiitesin muodostuminen Askiitesin muodostuminen aiheutettiin inokuloimalla vatsaontelonsisäisesti BALB/C-hiiret, jotka oli esikäsitel-35 ty vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml:11a mineraaliöljyä, joka 6 nr\ 15 80906 sisälsi 1 x 10 ^)2-ll-kloonisolua, joilla oli kyky tuottaa IFN- Y* :n sitomisaktiivisuuden omaavia vasta-aineita.

10 vuorokauden kuluttua hybridoomien vatsaontelonsisäises-tä antamisesta askiitesneste kerättiin, ja siitä tutkit- 7 5 tiin vasta-aineaktiivisuus 10 -kertaiseen laimennukseen asti. Vaikka vastaavan kloonisoluviljelmän vasta-aineak-tiivisuus havaittiin aina 10 -kertaiseen laimennukseen asti, johti askiitesin muodostus noin tuhatkertaiseen vasta-aineaktiivisuuden nousuun.

10 Esimerkki 8

Monoklonaalisen vasta-aineen puhdistus Monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin Staehe-linin et ai. menetelmällä /Journal of Biological Chemistry 258 (1981) 97507 käyttäen lähtöaineena 4 ml esimerkin 7 mu-15 kaisesti saatua askiitesnestettä. Tämän menetelmän mukaisesti askiitesnestettä sentrifugoitiin ensin 15 minuuttia nopeudella 10 000 rpm fibriinimäisten aineiden poistamiseksi siitä, ja sen jälkeen neste laimennettiin fosfaattipus-kuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS: 8,1 mmol/1 20 Nal^PO^, 1,5 mmol/1 K^PO^, 2,7 mmol/1 KC1 ja 137 mmol/1 NaCl; pH 7,2) pitoisuuteen, jossa UV-absorptio aallonpituudella 280 nm olisi 12-14 (A2qq). Laimennettuun näytteeseen lisättiin sen jälkeen kyllästettyä ammoniumsulfaatin vesiliuosta siten, että sulfaattipitoisuudeksi tuli 47 %.

25 Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 60 minuuttia suolan erottumisen aikaansaamiseksi, ja sen jälkeen se sentrifugoitiin (10 000 rpm, 15 min), jolloin saatiin sakka. Sakka liuotettiin 20 mM Tris-puskuriin (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl:a, ja dialysoitiin samaa puskuria (2 1) vastaan. Kahden tun-30 nin kuluttua dialysointiliuos korvattiin tuoreella 2 l:n erällä samaa liuosta, ja dialyysiä jatkettiin vielä 15 tuntia. Senjälkeen sakka erotettiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 rpm, ja supernatantin pitoisuus säädettiin vastaamaan A280~arvoa 20-30. Tämä näyte fraktioi-35 tiin DEAE-selluloosapylväässä (8 ml, Whatman DE^)· j°ka oli 16 80 906 tasapainotettu riittävällä määrällä Tris-puskuria (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl:a, eluoiden 50 nmol/1 NaCl:a sisältävällä Tris-puskurilla virtausnopeuden ollessa 1,5 ml/min. Näissä olosuhteissa vasta-aineaktiivisuutta ha-5 valttiin pääasiassa effluenttifraktioissa. Se, että puhdistettu näyte oli vasta-aine, varmistettiin Laemmlin et ai. /Nature 227 (1970) 680^ SDS-PAGE-menetelmällä. Sen mukaisesti eräät fraktioista, jotka oli saatu ammoniumsulfaatti-erotuksella ja DEAE-selluloosa-fraktioinnilla, pelkistet-10 tiin 2-merkaptoetanolilla, jota seurasi elektroforeesi 17 % SDS-geelillä jännitteellä 30V 24 tuntia. Vasta-aineaktii-visuushuippujen kanssa sopusoinnussa olevina havaittiin kaksi vyöhykettä asemissa, jotka vastasivat suunnilleen molekyylipainoja 55 kilodaltonia (H-ketju) ja 28 kilodal-15 töniä (L-ketju). Näin puhdistetusta vasta-ainefraktiosta 17 tutkittiin IFN- y>:n sitomisaktiivisuus lisäämällä IFN-Y' (22QQ yksikköä/ml). Tällöin havaittiin, että noin 50 % IFN-rjp:sta sitoutui vasta-aineeseen (taulukko 4).

20 Taulukko 4 Näyte Laimennus IFN-jäännösaktiivisuus (U/ml) 10"1 1100 Y2-ll,l fraktio 17 _2 ,, ΛΛ 1 10 1100 25 -3 10 2200 10-4 2200 10"1 2200

Anti-IgE:n monoklo- _2 naalinen vasta-aine 2200 30 -3 10 ä 2200 10'4 2200 1 *" .......... ' ' ........" ' ' ..........- ' —..............

17 80906

Esimerkki 9

Alaryhmä, johon monoklonaalinen vasta-aine kuuluu

Puhdistettu vasta-ainefraktio 17 (esimerkki 8) 5 laimennettiin 10-kertaiseen tilavuuteen, ja sille tehtiin immuunisaostusreaktio agarissa (Ouchterlony-testi: Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford, (1964) käyttäen vuohen antihiiri-IgGl-, IgG2a-, IgG2b- ja IgG3-vasta-ainetta (Miles), jotta voitiin identifioida se 10 Igl-alaryhmä, johon 7^2-11,1 monoklonaaliset vasta-aineet mahdollisesti kuuluisivat. Yksi selvä vyöhyke havaittiin monoklonaalisen vasta-aineen ja vuohen anti-hiiri-IgG2b-vasta-aineen välillä, kun taas monoklonaalisen vasta-aineen ja muiden anti-vasta-aineiden välillä ei havaittu vyöhyke-15 muodostusta. Mainitun monoklonaalisen vasta-aineen todettiin siis kuuluvan ryhmään IgG2b (Taulukko 5).

Taulukko 5

Monoklonaalisen vasta-aineen alaryhmä 20 Antigeeni Vasta-aine Saostumis- ___käyrä_ Tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine (fraktio 17) Anti-IgGl

Anti-IgG2a 25 " Anti-IgG2b + " Anti-IgG3

Esimerkki 10 25 ml (65,3 mg) esimerkin 8 mukaisella menetelmäl-30 lä puhdistettua, effluenttifraktioista saatua monoklonaa-lista vasta-ainetta dialysoitiin 0,1 M NaHCO^ra (pH 8,3) vastaan. 22 ml AFFI-GEL 10:tä (Bio-Rad) pestiin erikseen huolellisesti vedellä lasisuodatinta käyttäen. Geeliin lisättiin 25 ml liuosta (pH 8,0), joka sisälsi 0,1 mol/1 35 etanoliamiinia ja 0,15 mol/1 NaCl:a. Seosta ravistettiin 18 80906 4°C:ssa 1 tunti mahdollisesti jäljellä olevien reagoimattomien ryhmien sitomiseksi. Sen jälkeen geeli pestiin hyvin PBSrllä ja suspendoitiin 25 ml:aan PBS:ä, joka sisälsi 0,1 % NaN^ia. Suspensiota säilytettiin 4°C:ssa. Lisätyn 5 vasta-ainemäärän ja kerätyn suodoksen sisältämän vasta-ainemäärän perusteella todettiin, että vasta-aine sitoutui geeliin suhteessa 2,35 mg vasta-ainetta/ml geeliä. Pylvääseen pakattiin tällä tavalla saatua tuotetta, ja sitä käytettiin vasta-ainepylväänä.

10 Esimerkki 11 rlFN-f:n tuotantoon käytettiin E. coli RRl:a pRK248cI^g, pRC231/IFI-900) (tämän yhdistelmäorganismin muodostamista kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 99 084). Plasmidit pRK248cItg ja pRC231/IFI-900 15 sisälsivät lämpöherkän Lambda-repressorin geenin ja vastaavasti IFN- -geenin. rlFN- Y -geenin ilmentyminen oli PL~promoottorin kontrollin alainen.

E. coli RRl:a (pRK248cIts, pRC231/lFI-900) kasvatettiin yön yli LB-liemessä 30°C:ssa. 1 1 yön yli kasvatet-2Q tua viljelmää laimennettiin 10 l:ksi minimal M-9-väliai- neella, joka sisälsi kasaminohappoja. Logaritmisessa kasvuvaiheessa viljelylämpötila nostettiin 30°C:sta 42°C:seen ja kasvatusta jatkettiin 42°C:ssa 2-3 h. Bakteerit kerättiin sent-rifugoimalla ja bakteeripelletit säilytettiin -20°C:ssa käyt-25 töönasti. Kaikki fermentoinnit ja muut menettelyt tehtiin the

National Institutes og Health'n yhdistelmä-DNA-ohjeiden mukaan.

Edellä kuvatulla tavalla valmistettiin monoklonaali-sia vasta-aineita rIFN-Y:n synteettistä C-terminaalista 131-146-peptidiä vastaan. Monoklonaalista vasta-ainetta Mo 30 Y 2-11.1 käytettiin rlFN- Y :n puhdistamiseen. Monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä kolonni valmistettiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla.

rlFN- V:n karboksimetylointi ^C-jodietikkahapolla tehtiin 6 M guanidiinihydrokloridin läsnäollessa viitteen 35 (3) mukaisesti. Ylimääräinen reagenssi poistettiin HPLC:llä 19 80906 C8-vastafaasikolonnissa. Karboksipeptidaasihajotus tehtiin 0,2 M NH^HCO^sssa viitteessä (4) kuvatulla tavalla.

rlFN- Τ'käsiteltiin CNBr:lla (100-kertainen mooli-ylimäärä metioniiniin nähden) 70 % muurahaishapossa viit-5 teen (5) mukaisesti. CNBr-peptidit erotettiin IIPLC:llä C-18-vastafaasikolonnissa. Peptidien eluointiin käytettiin lineaarista gradienttia 0 —> 70 % CH-jCN 0,1 % tri-fluorietikkahaoossa.

Proteiini- tai peptidinäytteitä hydrolysoitiin 10 20-24 h suljetuissa, typellä käsitellyissä, tyhjiksi ime tyissä putkissa vakiolämpötilassa kiehuvassa HCl:ssa, joka sisälsi 4 % tioglykolihappoa. Aminohappoanalyysit tehtiin käyttäen fluoresamiiniaminohappoanalysaattoria viitteessä (6) kuvatulla tavalla.

15 Karboksimetyloitujen proteiinien sekvenssianalyy siin käytettiin ABI (Applied Biosystem, Inc)-kaasufaasi-sekvensoijaa 470A viitteen (7) mukaisesti. PTH-aminohappo-näytteet identifioitiin vastafaasi-HPLC:llä käyttäen Ultra-sphere ODS-kolonnia viitteessä (8) kuvatulla tavalla.

20 Kaikki puhdistusvaiheet toteutettiin 4°C:ssa. Pa kastetut solut (25 g) suspendoitiin kolminkertaiseen tilavuuteen (75 ml) 7 M guanidiinihydrokloridia (pH 7). Seosta sekoitettiin 1 h, ja sentrifugoitiin sitten 1 h 30 000 x g. Supernatantti laimennettiin 10-kertaiseen 25 tilavuuteen Dulbeccon'n fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) tai 0,15 M natriumboraatti-puskurilla (pH 9,5), ja sentrifugoitiin sitten 30 min 30 000 x g. Vaihtoehtoisesti pakastetut solut (25 g)

: suspendoitiin 1,5-kertaiseen tilavuuteen (37,5 ml) 0,15 M

30 natriumboraattipuskuria (pH 9,5) ja sentrifugoitiin sitten 1 h 30 000 x g. Joko guanidiinihydrokloridiuutos-ta tai äänikäsittelystä saatua supernatanttia sekoitettiin 1 h pöyröravistimessa 25 ml:n kanssa piidioksidia ja esi-pestiin PBS:llä. Seos kaadettiin pylvääseen ja pylväs 35 huuhdottiin 20 - 30-kertaisella tilavuudella 1 M NaCl.

20 80906

Sitten kolonni eluoitiin 0,01 M natriumboraatti-puskurilla, joka sisälsi 0,5 mol/1 tetrametyyliammonium-kloridia (pH 8,0). Interferoniaktiivisuus eluoitui n. 200 ml:n erässä ja otettiin talteen 4 fraktiona. Kukin frak-5 tio laitettiin monoklonaalista vasta-ainetta (^2-11.1) sisältävään affiniteettikolonniin (kerroksen tilavuus 4 ml), joka oli tasapainotettu PBS:llä. Kun kolonni oli pesty 10-kertaisella tilavuudella PBS-puskuria, se eluoitiin joko 1 M guanidiinihydrokloridilla tai 50 % etyleeniglykolilla, 10 joka sisälsi 1 mol/1 NaClra ja 20 mmol/1 natriumfosfaatti- puskuria (pH 7,0). Interferoni eluoitui ensimmäisten 20 ml:n mukana.

SDS-PAGE tehtiin Laemmlin (viite 8) kuvaamalla tavalla. Proteiini määritettiin fluoresamiinianalyysillä 15 käyttäen referenssiaineena kiteistä naudan seerumialbumii-nia. Interferoniaktiivisuus määritettiin sytopaattisen vaikutuksen estotestillä käyttäen rakkulaista suutulehdusta aiheuttavaa virusta ja ihmisen WISH-soluja viitteen (19) mukaisesti. Kaikki interferonitiitterit ilmoitetaan refe-20 renssiyksikköinä/ml kalibroituna referenssiainetta vastaan (osittain puhdistettu ihmisen immuuni-interferoni).

Yhteenveto uutto-puhdistus-menettelystä esitetään taulukossa 6. Kokonaissaanto oli 25-32 % ja puhdistuminen noin 100 - 769-kertainen keskimääräisen spesifisen aktiivisuu-25 den ollessa 1 x 10^ yksikköä/mg. rIFN-T^*:n kokonaissaanto oli 3-4 kertaa suurempi käytettäessä guanidiiniuuttoa. Viimeisen puhdistusvaiheen SDS-PAGE esitetään kuvassa 1. Materiaalilla, joka oli puhdistettu guanidiiniuutteesta, esiintyi yksi vyöhyke noin 18 000 daltonin kohdalla (18 K:n 3Q rIFN- ^), kun taas materiaalilla, joka saatiin äänikäsit-telystä, esiintyi päävyöhyke noin 15 000 daltonin kohdalla (15 K:n rlFN-^ ) ja pienempi vyöhyke noin 17 000 daltonin kohdalla (kuv. IA). Ei-pelkistävällä geelillä muodostui rlFN- ^p:n dimeerejä ja oligomeerejä (kuv. IB).

35 18 K:n rlFN-^Y'* oli homogeenista ja aminohappokoos tumus sopi yhteen DNA-jakson perusteella ennustetun kanssa.

2i 80906 15 ja 18 K:n rlFN-^n aminohappokoostumus annetaan taulukossa 7. Usealle sadalle pikomoolille pelkistettyä ja karboksimetyloitua 15 ja 18 K:n proteiinia suoritettiin Edman-hajotus automaattisessa proteiini/peptidi-kaasufaasi-^ sekvensoijassa. 17 ja 18 K:n proteiinin 32 ja vastaavas ti 26 ensimmäistä tähdettä sisältävä N-terminaalinen aminohappoketju oli DNA-jakson perusteella ennustetun 14 ...

mukainen (kuvio 2) . C-karboksimetyloidut kystennit havaittiin sekvenssianalyysien ensimmäisessä ja kolman-10 nessa syklissä. N-terminaalista metioniinia ei havaittu.

18 ja 15 K:n rlFN- "p :n N-terminaalinen aminohappoanalyysi osoitti, että aminohappojärjestys kummankin proteiinin tällä alueella vastaa DNA-jakson perusteella ennustettua.

Myös C-terminaaliset peptidit on karakterisoitu sen määrit-15 tämiseksi, onko tällä alueella tapahtunut poistumisia tai muutoksia. Karboksipeptidaasi A (CPA)-pilkkomisseoksen aminohappoanalyysi osoitti, että seriiniä ja/tai glutamii-nia (C-terminaalisia aminohappoja) vapautui 18 K:n rlFN-p sta, kun taas 15 K:n rlFN-^p ei pilkkoutunut CPA:n vaiku-2Q tuksesta samoissa olosuhteissa. Koska Ser-Gln on rIFN-p:n C-terminaalinen jakso, ilmeni, että 18 K:n lajilla on muuttumaton C-pää, kun taas 15 K:n lajilla on erilainen C-terminaalinen tähde (Lys), joka ei lohkea CPA:11a.

DNA-jakson perusteella ennustetut C-terminaaliset 25 tähteet varmistettiin lisäksi analysoimalla ja sekventoi-malla C-terminaaliset peptidit CNBr-käsittelyn jälkeen. C-terminaaliset peptidit erotettiin HPLCtllä käyttäen C-18-vastafaasikolonnia (kuv. 3). 15 K:n rlFN- 'p :sta saatiin terävä peptidipiikki (piikki II), joka eluoitui gradientin 30 alkuosassa, ja tämä peptidi puuttui 18 K:n rlFN-"P :n CNBr-pilkkomisseoksesta. Tämän peptidin aminohappoanalyysi osoitti, ettei tässä peptidissä ollut homoseriiniä tai homoserii-nilaktonia ja sen täytyy siksi olla 15 K:n proteiinin C-terminaalinen CNBr-peptidi. Aminohappoanalyysin perusteella 35 (taulukko 8) tämä peptidi vastasi IFN- 'pm aminohappotäh- 22 8 0 9 0 6 teitä 121-131 (arginiinia ei ollut havaittavissa). Näiden 11 aminohapon järjestys varmistettiin sekvenssianalyysillä (kuv. 2). 18 K:n rlFN- "p :n ollessa kyseessä havaittiin suhteellisen leveä piikki eluution loppuvaiheessa. Tämä 5 piikki jakautui lisäksi kahdeksi piikiksi kapeaa gradient-tia käytettäessä. Aminohappoanalyysit osoittivat, että ensimmäinen piikki on 18 K:n proteiinin C-terminaalinen CNBr-peptidi (taulukko (8|f ja että aminohappokoostumus vastaa aminohappotähteitä 138-146. Näiden 9 aminohapon järjestö tys varmistettiin sekvenssimäärityksellä (kuv. 2). 15 K:n proteiinin C-terminaalisen aminohapon määritettiin olevan lysiini.

Nämä tulokset osoittavat, että 18 K:n laji on muuttumaton rlFN-^P -molekyyli, kun taas 15 K:n laji on proteo-15 lyysituote. Peptidisidos aminohappotähteiden 131 ja 132 (Lys-Arg) välillä on katkennus 15 K:n lajissa.

Taulukko 6 ___rIFN-^^;n puhdistus_ _

Spesi- 20 Puhdistusvaihe Kokonaisprote- Kokonais- finen Puhdis- Saanto iini (mg) aktiivisuus aktiivi- tuminen (%) (yksikköä) suus, (-kert.) (yks/mg) I. Guanidiiniuutto

Supematantti 2, 806 2,5x10® 9xl04 - 100 25 Piidioksidi 90 1,0X10® 1X106 11 40

Monoklonaalinen vasta-aine 8 0,8xl08 lXlO7 110 32 II. Aänikäsittelv 3Q Supematantti 6,136 8,0xl07 l,3xl04 - 100

Piidioksidi 87 4,5xl07 5,2xl06 400 5 6

Monoklonaali- nen vasta- 7 7 aine 2 2 >0x10' 1,0x10' 769 25 23 80906

Taulukko 7 15 K:n ja 18 K:n rIFN- :n aminohappokoostumus (tähteiden lkm) 5 18K (1-146) 15K (1-131).

Asp 20,9 (20) 19,9 (20)

Thr 5,1 (5) 4,9 (5) 10 Ser 9,8 (11) 6,7 (9)

GlU 18,5 (18) 15,1 (16)

Pro * (2) * (2)

Gly 5,9 (5) 5,6 (4)

Ala 8,2 (8) 7,3 (7) 15 Cys * (2) * (2)

Vai 9,1 (8) 9,1 (8)

Met 4,7 (4) 3,8 (3)

Ile 7,2 (7) 6,6 (7)

Leu 10,5 (10) 9,6 (9) 20 Tyr 5,5 (5) 4,8 (5)

Phe 10,3 (10) 8,2 (9)

His 1,8(2) 2,5 (2)

Lys 19,9 (20) 16,9 (19)

Arg 8,6(8) 5,6(3) 25 Trp * (1) * (!)

Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perusteella ennustetun tähteiden lukumäärän.

30 *) Ei määritetty 24 80906

Taulukko 8 15 K:n ja 18 K:n rlFN- ^rn C-terminaaliset CNBr-peptidit

5 15K 18K

Thr 0,9 (1)

Ser 1/1 (1) 0,84 (1)

Glu 1/1 (1) 1,1 (1)

Pro * (1) 10 Gly 1,5 (1) 1,3 (1)

Ala 2,4 (3) 1,1 (1)

Leu 1,0 (1) 1,1 (1)

Phe 1,0 (1)

Lys 1,9 (2) 2,8 (3) 15

Sijainti ketjussa 121-131 138-146

Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perus-20 teella ennustetun tähteiden määrän.

*) Ei-määritelty.

25 80906

Kirjallisuusviitteet: 1) P. W. Gray et ai., Nature 295 (1982), ss. 503 - 508 2) T. Stahelin et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981), ss. 9750 - 9754 3) G. Allen, Sequencing of Protein and Peptides (1981), ss. 30 - 31, North-Holland Publishing Co., Amsterdam, New York 4) R. P. Amber, Methods in Enzymology 11 (1967), ss. 436 - 445 5) R. A. Wolfe ja S. Stein, Modern Methods in Pharmacology (1982), ss. 55 - 57; Alan R. Liss, Inc., New York 6) S. Stein ja L. Brink, Methods in Enzymology 79 (1981), ss. 20 - 25 7) R. M. Hewick, M. W. Hunkapillar, L. E. Hodd Ja W. I. Dreyer, J. Biol. Chem. 256 (1981), ss. 7990 - 7997 8) D. Hawke, P-M. Yang ja J. E. Shively, Anal. Biochem. 120 (1982), ss. 302 - 311 9) U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), ss. 680 - 685 10) S. Rubinstein, P. D. Familetti ja S. Petska, J. Virol. 37 (1981), ss. 755 - 758.

Claims (5)

1. 26 80906
2. 1. Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmä-immuuni -inter f eroniproteiinin uuttamiseksi, joka proteiini 5 on oleellisesti vapaa proteolyysifragmenteistaan, tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista, tun nettu siitä, että uutto suoritetaan guanidiinihydrokloridilla .
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että transformoidut E. coli-solut suspendoidaan guanidiinihydrokloridiliuokseen.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiinihydrokloridiliuok-sen konsentraatio on vähintään noin 4 mol/1. I5 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen muuttumattoman valmiin yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin molekyyli-paino on noin 18 000 daltöniä.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että transformoituja E. coli-So-luja sisältävä preparaatti jaetaan guanidiinihydroklori-dikäsittelyn jälkeen supernatanttifraktioksi ja solujäte-fraktioksi . 27 80906