FI80906C - Foerfarande foer extraktion av intakt rekombinant-human-immuninterferonprotein. - Google Patents
Foerfarande foer extraktion av intakt rekombinant-human-immuninterferonprotein. Download PDFInfo
- Publication number
- FI80906C FI80906C FI843670A FI843670A FI80906C FI 80906 C FI80906 C FI 80906C FI 843670 A FI843670 A FI 843670A FI 843670 A FI843670 A FI 843670A FI 80906 C FI80906 C FI 80906C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- rifn
- protein
- antibody
- ifn
- extraction
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 25
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 title description 8
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 4
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 14
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 9
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 7
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 7
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 6
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 6
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 6
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 4
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 101710172804 K protein Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- -1 hydrogen halides Chemical class 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CC2(O)C(C=C(CO)CC3(O)C2C=C(C)C3=O)C4C(C)(C)C14OC(=O)C FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 2-pyridinylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=N1 BPSNETAIJADFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1CC(C(=O)O)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 1
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000051179 human NCKIPSD Human genes 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000043 hydrogen iodide Inorganic materials 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Chemical compound C1=CC2CC1C1C2C(=O)N(O)C1=O ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108010083127 phage repressor proteins Proteins 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/249—Interferons
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
- Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Laminated Bodies (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Lock And Its Accessories (AREA)
Description
1 80906
Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin uuttamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen muuttumat-5 toman yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin uuttami seksi, joka proteiini on oleellisesti vapaa proteolyysi-fragmenteistaan, tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista. Uutto suoritetaan reagenssil-la, kuten guanidiinihydrokloridilla, joka alentaa pro-10 teaasien eli entsyymien aktiivisuutta vaikuttamatta halu tun proteiinin aktiivisuuteen. Guanidiinihydrokloridiuut-toa seuraavat muut puhdistusvaiheet voivat olla sellaisia, jotka ovat tuttuja proteiinien puhdistamiseen liittyvän alan ammattimiehelle.
15 Kuvio 1 valaisee ihmisen puhdistetun yhdistelmä- immuuni-interferonin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryy-liamidigeeli-elektroforeesia (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuhteissa (A) (0,7 M β-merkaptoetanoli) ja ei-pelkis-tävissä olosuhteissa (B).
20 Kuviossa 2 verrataan keskenään ihmisen yhdistelmä- immuuni-interferonin ennustettua aminohappojärjestystä sekä 15 ja 16 kilodaltönin (K) rlFN-a-lajia koodaavaa todellista DNA-jaksoa.
Kuvio 3 valaisee 15 K:n ja 18 K:n rlFN-a-lajin 25 C-terminaalisten peptidien HPLC-erotusta CNBr-käsittelyn jälkeen.
Tähän mennessä on kehitetty monenlaisia menetelmiä interferonina tunnetun, virusten vastaisista proteiineista koostuvan ryhmän uuttamiseksi ja puhdistamiseksi.
30 Tällä hetkellä tunnetaan kolme pääryhmää interferoneja: IFN-α (valkosolu), IFN-B (sidekudos) ja IFN-y* (immuuni). Vaikka eri interferoniryhmät saattavat olla sukua toisilleen virusten vastaisten, jakaantumista estävien ja rakenteellisten ominaisuuksiensa suhteen, ei tähän mennessä 35 ole pystytty kehittämään yhtenäistä menetelmää kaikkien T.
2 80906 näiden ryhmien uuttamiseksi ja puhdistamiseksi. Monilla menetelmillä, jotka soveltuvat valkosolu-interferonin uuttamiseen ja puhdistamiseen muita proteiineja ja solujät-teitä sisältävästä raakaseoksesta, ei todellakaan onnis-5 tuttaisi uuttamaan sidekudos- tai immuuni-interferonia samanlaisesta preparaatista.
Tunnettujen puhdistusmenetelmien uuttovaiheessa mikro-organismit, jotka ovat tuottaneet, usein yhdistelmä-tekniikan kautta, haluttua "vierasta" proteiinia, hajote-10 taan tavallisesti mekaanisesti (so. äänikäsittelyllä) tai kemiallisesti. Tämän mekaanisen tai kemiallisen hajotuksen aikana vapautuu seokseen kuitenkin myös erilaisia solun proteaaseja. Proteaasit ovat sitten vapaita vaikuttamaan entsymaattisesti seoksen sisältämään "vieraaseen” 15 proteiiniin ja hajottamaan sitä. Proteaasit voivat siten estää "vieraan" proteiinin puhdistamisen homogeeniseksi valmiiksi ja biologisesti aktiiviseksi muodoksi.
Tämän Keksinnön tavoitteena on sen vuoksi saada aikaan menetelmä, jolla ei ole tähänastisten uuttomenetel-20 mien puutteita ja jonka avulla saadaan muuttumaton immuu-ni-interferoniketju ja jolla proteolyyttisestä hajoamisesta seuraavat fragmentit poistetaan puhdistetuista immuuni-interferonipreparaateista.
Nyt on havaittu immuuni-interferonin suhteen, että 25 millään aiemmin kuvatulla tavanomaisella menetelmällä, kuten äänikäsittelyä tai kemiallista hajotusta käyttäen, toteutettava uutto ei tuota immuuni-interferonia, jolla on muuttumaton tai täydellinen aminohappoketju. Vasta viime aikoina on yhdistelmätekniikka edistynyt siihen pisteeseen, 30 että on mahdollista tuottaa riittäviä määriä rlFN- ]f*:a sen karakterisoimiseksi ja sen aminohappojärjestyksen määrittämiseksi. Käytettäessä tavanomaisia tunnettuja menetelmiä rIFN-Χ-preparaattien uuttamiseen ja määritettäessä puhdistetun materiaalin aminohappojärjestys havaittiin, että 35 puhdistettu preparaatti koostui itse asiassa joukosta toisilleen läheisiä proteiinilajeja, joilla oli eri molekyyli- 3 80906 paino. Lisäksi on aminohapposekvenssianalyysillä havaittu, että nämä proteiinilajit koostuvat itse asiassa immuuni-interferonin muuttumattoman muodon ja sen proteolyysi-fragmenttien yhdistelmästä. Toistaiseksi ei siten ole 5 kyetty uuttamaan ja puhdistamaan immuuni-interferonia niin, että olisi saatu homogeenista, muuttumatona, muista proteolyysifragmenteista vapaata immuuni-interferonia .
On havaittu, että rlFN- 'jf'rn hajoaminen voidaan 10 estää käyttämällä reagenssia, kuten esimerkiksi guanidiini-hydrokloridia, joka alentaa proteaasien eli entsyymien aktiivisuutta ja joka ei vaikuta rIFN-"p:n aktiivisuuteen, puhdistusprosessin ensimmäisessä vaiheessa, uuttovaiheessa, jotta saadaan homogeenisia ja muuttumattomia molekyylejä.
15 Jäädytettyjen solujen äänikäsittelyllä, ilman guanidiini-hydrokloridin mukanaoloa, on saatu pääasiassa proteolyysi-tuotetta (15 K:n rIFN-]P:a), josta IFN~T^:n C-terminaali-set aminohappotähteet nro 132-146 puuttuvat. Muuttumattoman molekyylin aminohappojärjestys ja N-terminaalinen jak-20 so vastasivat DNA-jakson perusteella odotettuja. rlFN-T1:^ koodaava DNA-emäsjakso, jota käytetään läpi koko tämän selityksen, on viitteessä 1 kuvatun kaltainen.
On yllättävästi todettu, että immuuni-interferoni säilyttää biologisen aktiivisuutensa guanidiinihydroklori-25 diuuttovaiheen jälkeen, vaikkakin guanidiinihydrokloridi tuhoaa biologisen aktiivisuuden, kun sitä lisätään puhdistettuun immuuni-interferonipreparaattiin. On edullista, että tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa transformoidut mikro-organismit suspendoidaan guanidiinihydroklo-30 ridiin.
Tämän keksinnön mukainen antiproteolyyttinen aine voi olla mikä tahansa guanidiniumsuola. Sellaisia guanidi-niumsuoloja ovat suolat, joita guanidiini muodostaa orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, tai mine-35 raalihappojen, kuten vetyhalogeenidien, so. vetybromidien, vetyfluoridin ja vetyjodidin kanssa. Edullinen guanidi- 4 80906 niumsuola on guanidiinihydrokloridi. Guanidiniumsuolan pitoisuus mikro-organismeja käsiteltäessä ei ole ratkaiseva; mitä tahansa tehoavaa määrää voidaan käyttää. On kuitenkin edullista, että mikro-organismien käsittelyyn 5 käytetään 3-7 M guanidiniumsuolaliuosta ja että kyseistä suolaliuosta käytetään noin 3 - 9-kertaisesti siihen tila-vuusmäärään nähden, joka vastaa grammaa transformoituja mikro-organismeja. Suolan pitoisuus voidaan säätää sekoittamalla suola liuottimeen, esimerkiksi veteen tai vettä 10 sisältävään puskuriin, kuten ammoniumasetaatti- tai pyri-diini-etikkahappopuskuriin tai vastaavaan. On myös selvää, että tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa voidaan käyttää muitakin proteaasi-inhibiittoreita, kuten ureaa tai tio-syanaattia.
15 Puhdasta rlFN-^.’a saadaan lopulta puhdistamalla E.coli-supernatantti suoraan uuton ja sopivan laimennuksen jälkeen, edullisesti puhdistusvaiheella, jossa käytetään monoklonaalista vasta-ainetta. Uutto- ja puhdistusprosessi voidaan automatisoida laajamittaista tuotantoa varten. Näin 20 keksintö tekee mahdolliseksi saada ensimmäisen kerran suuria määriä homogeenista rlFN-^ra ja mahdollistaa siten laajamittaiset kliiniset kokeet, biologiset tutkimukset, röntgenkristallografiän ja rakenne-toiminta-tutkimukset.
Muita edullisia suoritusmuotoja valaistaan seuraa-25 vassa selityksessä ja esimerkeissä.
E.colissa tuotettu ihmisen immuuni-interferoni uutetaan edullisesti jäädytetystä solumassasta 7 M guani-diinihydrokloridilla ja puhdistetaan sopivin puhdistuskei-noin, kuten esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta si-30 sältävissä affiniteettipylväissä. Puhdistettua interferonia, jonka näennäinen molekyylipaino on 18000 daltonia (18 K) SDS-PAGE:11a, on saatu guanidiiniuuttoa käyttämällä, kun taas äänikäsittelyllä ilman guanidiinin mukanaoloa eristettiin lajeja, joiden molekyylipaino oli alempi (pääla-35 jeilla noin 15000 daltonia, 15 K). Sekä 18 K:n että 15 K:n 5 80906 proteiinin aminoterminaalinen jakso vastasi tätä ihmisen immuuni-interferoniproteiinia koodaavan DNA-jakson perusteella ennustettua jaksoa.
C-terminaalinen jakso määritettiin analysoimalla 5 ja sekventoimalla puhdistettu C-terminaalinen peptidi CNBr-käsittelyn jälkeen. 18 K:n rIFN-”]P:sta saadun C-terminaa-lisen peptidin aminohappokoostumus ja -järjestys vastasivat rlFN-'^ :n ennustettua jaksoa, mikä osoittaa 18 K:n lajin olevan muuttumaton molekyyli. Toisaalta 15 K:n rlFN-^rn 10 C-päästä vapautui CNBr:lla käsiteltäessä erilainen pepti-difragmentti. Aminohappokoostumus- ja -järjestysanalyysin perusteella tämä erilainen peptidi vastasi aminohappotähteitä nro 121-131, mikä osoittaa 15 K:n lajin olevan prote-olyysituote.
15 Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fer- mentointiprosesseissa vastaanottajana käytettävä mikro-organismi on, ellei toisin mainita, Escherichia coli K-12, kanta 294, jota kuvataan GB-patenttijulkaisussa 2 055 382A ja joka on talletettu 28. lokakuuta 1978 the American Type 20 Culture Collectioniin numerolla ATCC 31446. Lisäksi kaikki tämän keksinnön yhteydessä suoritettu yhdistelmä-DIft-työskentely toteutettiin the National Institutes of Healthin sovellettavissa olevien ohjeiden mukaisesti.
Tämän keksinnön piiriin kuuluu kuitenkin paitsi 25 edellä mainitun E.coli K-12 -kannan 294 käyttö myös muiden tunnettujen E.coli-kantojen, kuten E.coli MA210 tai E.coli RRl (ATCC nro 31343)-kannan, tai muiden mikro-organismien, joista monia on yleisesti saatavissa tai talletettuina hyväksyttyihin mikro-organismien talletuslaitoksiin, kuten 30 the American Type Culture Collectioniin ja saatavissa niistä (ks esimerkiksi ATCC-luettelo), käyttö.
Monoklonaalisia vasta-aineita valmistettiin synteettistä polypeptidiä vastaan, joka koostui rlFN- 7^:n 16 viimeisestä C-terminaalisesta aminohappotähteestä, so. ami-35 nohappotähteistä nro 131-146. Yhtä monoklonaalisista vasta- 6 80906 aineista (Mo Τ'* 2-11.1) käytettiin rlFN- P:n puhdistamiseen. Tarkemmin määritellen tässä käytetyt monoklonaaliset vasta-aineet ja affiniteettipylväs valmistettiin EP-hakemusjulkaisussa 103 898 kuvatulla tavalla.
5 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin.
Esimerkki 1
Antigeeninä käytettävän kantajaproteiini-polypep- tidi-kompleksin synteesi
Polypeptidi H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-10 Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH liitettiin tyroglobulii-niin (tästä eteenpäin TG) Goodfriendin et ai. /Science 144 (1964) 1334/ esittämällä menetelmällä.
Itse peptidi voidaan valmistaa tavanomaisin peptidi-synteesimenetelmin. Voidaan käyttää joko kiinteäfaasi- tai 15 nestefaasimenetelmää, vaikkakin nestefaasissa toteutettava synteesi on edullinen monissa tapauksissa. Tällaisia pep-tidisynteesimenetelmiä kuvaavat esimerkiksi Schröder ja Liibke teoksessa "The Peptides", osa 1, Academic Press,
New York, USA, 1966; Izumiya et ai. teoksessa "Peptide 20 Synthesis", Maruzen, Tokio, Japani, 1975; tai Haruaki Yajima teoksessa "Experiments in Biochemistry", osa 1, s. 207-400, Tokyo Kagaku Dojin, 1977; ja niihin kuuluvat muun muassa atsidimenetelmä, kloridimenetelmä, happoanhyd-ridimenetelmä, sekahappoanhydridimenetelmä, DCC-menetelmä, 25 aktiivinen esteri-menetelmä, menetelmä, jossa käytetään
Woodward-reagenssi K:a, karbodi-imidatsolimenetelmä, hape-tus-pelkistysmenetelmä ja DCC/lisäaine (esim. HONB, HOBt, HOSu)-menetelmä.
IFN-'pin 131-146-fragmentin valmistusta kuvataan 30 yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 103 898.
2,5 mg mainittua polypeptidiä sekoitettiin 3,75 mg: aan TG:a, ja sen jälkeen kun oli lisätty 2 ml 40 mM fosfaattipuskuria, seosta sekoitettiin hyvin jäävedessä. Seokseen lisättiin vähitellen pisaroittain liuos, joka sisälsi 35 30,4 mg karbodi-imidihydrokloridia 200 ml:ssa tislattua 7 80906 vettä. Sen jälkeen seosta sekoitettiin jäävedessä 3 tuntia. Reaktion mentyä loppuun tuotetta dialysoitiin riittävässä määrin tislattua vettä vastaan, jonka jälkeen se kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 4,7 mg proteiinikompleksia.
5 Esimerkki 2
Entsyymiin sidotun antigeenin valmistaminen vasta-aineiden määrittämiseen käytettävää EIA-testiä (Enzyme Immunoassay) varten EIA-testiin tarvittava entsyymiin sidottu antigeeni 10 valmistettiin Kitagawan et ai. ^Journal of Biochemistry 79 (1976) 2337 mukaisesti.
(i) Maleimidiryhmän liittäminen polypeptidiin
Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu polypeptidi (350 nmol) liuotettiin 1 ml:aan 100 mM fosfaattipuskuria 15 (pH 6,8), ja tämä liuos lisättiin liuokseen, joka sisälsi 585 pg (1,75 pmol) N-(4-karboksisykloheksyylimetyyli)maleimi-di-N-hydroksisukkinimidiesteriä 70 pl:ssa N,N-dimetyyliform-amidia. Seosta sekoitettiin 30°C:ssa 30 minuuttia. Reaktion mentyä loppuun suoritettiin fraktiointi Sephadex G-25-kolon-20 nissa, jolloin saatiin 185 nmol polypeptidifraktiota, johon polypeptidiin oli liittynyt maleimidiryhmä.
(ii) Maleimidiryhmän sisältävän polypeptidin liittäminen /3-D-galaktosidaasiin.
Maleimidiryhmän sisältävä polypeptidi (16,5 nmol) 25 sekoitettiin 3,3 nmol:iin y^-D-galaktosidaasia. 4°C:ssa tapahtuneen 18 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 412,5 nmol ^S-merkaptoetanolia reaktion päättämiseksi. /3-D-galaktosi-daasiin liitetty polypeptidi saatiin fraktioimalla Sepha-rose 6B-kolonnissa ja käytettiin myöhempiin kokeisiin.
30 _Es imerkki 3
Immunisointi
Kullekin kuudelle BALB/C-hiirinaaraalle, joiden ikä oli 7-8 viikkoa, annettiin ihon alle 40 pg (proteiinin mukaan laskettuna) esimerkin 1 mukaista, antigeeninä toirai-35 vaa proteiinikompleksia sekoitettuna huolellisesti Freun- 8 80906 din täydelliseen apuaineeseen (Freund's complete adjuvant) (ensimmäinen immunisointi). 2 viikon kuluttua ensimmäisestä immunisoinnista hiirille annettiin jälleen ihon alle sama annos antigeeniä kuin edellä, sekoitettuna hyvin Freund'in 5 epätäydelliseen apuaineeseen (Freund's incomplete adjuvant) (toinen immunisointi). Taas 2 viikon kuluttua tehtiin kolmas immunisointi samalla tavalla kuin toinenkin. 6 vuorokauden kuluttua kolmannesta immunisoinnista hiiristä otettiin osaverinäytteet, ja seerumin vasta-ainepitoisuudet mää-10 ritettiin jäljempänä kuvattavalla EIA-menetelmällä /vrt.
Immunopharmacolocy 1 (1978) 3/. Hiirellä nro T- 2 oli suurin vasta-ainepitoisuus, ja sille tehtiin viimeinen immunisointi antamalla laskimoon 120 pg antigeeniä liuotettuna 0,5 ml:aan natriumkloridin vesiliuosta.
15 Kunkin hiiren vasta-ainepitoisuudet esitetään taulu kossa 1.
Taulukko 1
Antipeptidi-vasta-ainemäärät immunisoiduissa hiirissä 20 B/T %
Hiiri Ensimmäinen Toinen Kolmas n:o immunisointi immunisointi immunisointi _(lj_(2i_(3)_ 1 2 3 4 5 6 - (4 N.D. 24,5 2 25 2 N.D. (5 19,3 35,3 3 - N.D. 24,5 4 N.D. 1,3 1,7 5 N.D. 1,8 5,0 6 - N.D. 0,8 30 Normaali hiiri_0,6_0,1_N.D.__ (1) Seerumin laimennussuhde 1/1 000 (2) Seerumin laimennussuhde 1/6 300 (3) Seerumin laimennussuhde 1/7 800 35 4) - = Havaittavuusrajän alapuolella 5) N.D. = Ei määritetty B/T = (Sidottu entsyymiaktiivisuus/lisätty kokonaisentsyy-miaktiivisuus) x 100 9 80906 EIA-menetelmä
Vasta-aineaktiivisuus määritettiin esimerkin 2 mukaisella proteiinikompleksilla immunisoitujen hiirien seerumista tai hybridoomasupernatantista EIA-menetelmällä /immu-5 nology 1 (1978) 3/. Sen mukaisesti seerumi tai hybridooma-supernatantti laimennettiin puskurilla A (20 mM Na^PO^-.n suhteen, 100 mM NaCl:n suhteen, 0,1 % NaH^sa, 1 mM MgCl2:n suhteen, pH 7,0), 100 f*1 tätä laimennosta sekoitettiin 100 pl:aan entsyymiin sidottua polypeptidijohdannaista 10 (esimerkki 2), ja reaktion annettiin edetä 24°C:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen lisättiin 100 pl 3-%ista selluloosaa, johon oli liitetty kaniinin hiirenvastaista IgG:a, ja reaktion annettiin jatkua 24°C:ssa 4 tuntia. Reaktion mentyä loppuun selluloosa pestiin hyvin puskurilla A, joka sisälsi 0,5 % 15 Tween 20:a, sitten lisättiin 500 pl liuosta, joka sisälsi 20 pg/ml 4-metyyliumbelliferyyli-/6-D-galaktosidia, ja 37°C: ssa tapahtuneen 2 tunnin reaktion jälkeen lisättiin 3 ml 1Q0 mM karbonaattipuskuria (pH 10,5) reaktion päättämiseksi. Fluoresenssi-intensiteetti mitattiin fluorometrillä (eksi-20 taatio 365 nm; emissio 450 nm).
Solufuusio
Kolmen vuorokauden kuluttua viimeisestä immunisoinnista (esimerkki 3) hiiren ^-2 perna poistettiin, suoda-25 tettiin paineen avulla ruostumatonta terästä olevan verkon läpi jasuspendoitiin MEM:iin (Eagle's minimum essential medium), jolloin saatiin pernasolususpensio. Solufuusioon käytettiin BALB/C-hiiristä saatuja P3-x63.Ag8.Ui-(P3U1)-myeloomasoluja ^Current Topics in Microbiology and Immuno-30 logy 81 (1978) 1J. Solufuusio tehtiin Köhlerin ja Milstei-nin /Nature 256 (1975) 495-497/ alkuperäisellä menetelmällä. Sen mukaisesti pernasolut ja P3Ul-solut pestiin erikseen kolmesti seerumivapaalla MEMrllä ja sekoitettiin suhteessa 5:1 (solujen lukumääräsuhde). Seosta sentrifugoitiin 35 nopeudella 800 rpm 15 minuuttia, jolloin solut laskeutuivat.
10 80906
Supernatantin huolellisen poiston jälkeen sedimentti erotettiin varovasti, lisättiin 0,3 ml 45 % polyetyleenigly-koli (PEG) 6 000 (Koch-Light), ja seoksen annettiin seistä 37°C:een temperoidussa vesihauteessa 7 minuuttia solu-5 fuusion aikaansaamiseksi. Sen jälkeen siihen lisättiin MEM:ä nopeudella 2 ml/min. Kun kaikkiaan 12 ml MEM:ä oli lisätty, saatua seosta sentrifugoitiin nopeudella 600 rpm 15 minuuttia, jonka jälkeen supernatantti poistettiin. Solusedimentti suspendoitiin RPMI-1640-väliaineeseen, johon 10 oli lisätty 10 % vasikan sikiöseerumia (RPMI 1640-10FCS). niin että pitoisuudeksi tuli 2 x 10 P3Ul-solua/ml, ja 24 syvennyksen monimaljasysteemin (Linbro) kuhunkin 144 syvennykseen siirrostettiin 1 ml suspensiota. Siirrostuksen jälkeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa 5 % CC^sa sisältävässä 15 kaasuinkubaattorissa. 24 tunnin kuluttua aloitettiin HAI-selektiivinen viljely lisäämällä kuhunkin syvennykseen 1 ml HAT-väliaineella täydennettyä RPMI 1640-10FCS-väli--4 -7 ainetta (1 x 10 M hypoksantiinin, 4 x 10 M aminopetrii--5 nin ja 1,6 x 10 M tymidiinin suhteen). HAT-selektiivis-20 tä viljelyä jatkettiin korvaten 1 ml vanhaa väliainetta 1 ml:11a HAT-väliainetta 3, 5 ja 7 vrk:n kuluttua viljelyn aloittamisesta. Hybridoomien kasvu havaittiin 10-14 vrk:n kuluttua solufuusiosta. Kasvatusliemen muututtua keltaiseksi (noin 1 x 10^ solua/ml) supernatantti kerättiin, ja 25 siitä tutkittiin vasta-aineen läsnäolo EIA-menetelmällä.
Tällä tavalla tutkittiin supernatantit niistä 141 syvennyksestä, joissa hybridoomakasvua oli havaittu. Kahdessa syvennyksessä ( Y^-ll ja '"pJ-lOO) havaittiin voimakas vas-ta-aineaktiivisuus ja kahdessa muussa (^2-62 ja J^2-70) 30 heikko vasta-aineaktiivisuus.
Esimerkki 5 Kloonaus
Kolmessa positiivisen tuloksen vasta-aineaktiivi-suustestissä antaneessa syvennyksessä (^2-11, ^2-62 ja 35 ^2-100) olleet hybridoomat kloonattiin rajoittavan laimen- 11 80906 nuksen menetelmällä. Sen mukaisesti hybridoomasolut sus-pendoitiin RPMI 1640-20FCS-väliaineeseen, niin että pitoisuudeksi tuli vähintään 2 hybridoomasolua/ml, ja suspensio jaettiin 0,1 ml:n annoksina 96-syvennyksisen mikro-5 maljan syvennyksiin. Mainitun jaon yhteydessä kuhunkin syvennykseen lisättiin 5 x 10^ BALB/C-hiiren tymosyyttiä syöttösoluiksi. Tämän tuloksena havaittiin solujen jakautuminen noin 2 viikon kuluessa. Sen jälkeen supernatantti kerättiin, ja siitä tutkittiin vasta-aineiden läsnäolo 10 esimerkissä 3 kuvatulla EIA-menetelmällä. Vasta-aineaktii-visuutta havaittiin 8:ssa 19:stä 'f'2-ll-syvennyksestä saadusta kloonista, 3:ssa 54:stä Y*2-62-syvennyksestä saadusta kloonista ja 5:ssä 47:stä f^-lOO-syvennyksestä saadusta kloonista (taulukko 2).
12 80906
Taulukko 2
Kloonattujen hybridoomien antipeptidi-vasta-aineaktiivi-visuus 5
Hybridooma nro B/T (%) γ 2-11 1 6Θ 10 2 31 3 63 6 68 7 67 9 69 15 12 42 18 60 γ 2-62 14 20 20 16 21 34 16 Ύ 2-100 2 69 25 3 70 16 56 25 80 46 33 30 Hyperimmuunin hiiren seerumi 35 13 80906
Esimerkki 6
Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapa- siteetti IFN- T:aan
Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiskapasi-5 teetti IFN- T :aan määritettiin seuraavalla menetelmällä.
300 pl:aan liuosta, joka sisälsi 3% kaniinin antihiiri-IgG-vasta-aineeseen liitettyä sellullosaa, lisättiin 300 jul vil-jelmäsupernatanttia, joka oli saatu syvennyksistä Y2_H' ^2-62 ja ^2-100 olevista 2 tai 3 kloonatusta solulinjas 10 ta, ja reaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa 12 -20 tuntia. Sen jälkeen selluloosa pestiin huolellisesti fysiologisella suolaliuoksella, ja siihen lisättiin 550 yk-sikköä/ml edellä mainitulla menetelmällä saatua IFN~T:a· 3-4 tunnin reaktioajan jälkseen supernatantti kerättiin, 15 ja sen IFN-T-aktiviisuus määritettiin sytopaattiseen vaikutukseen perustuvalla menetelmällä käyttäen mikromaljaa ^Applied Microbiology 16 81968) 1706_7· Sen mukaisesti kuhunkin 96-syvennyksisen mikromaljan syvennykseen asetettiin 50 pl MEM:ä ja ensimmäiseen syvennykseen pantiin 50 μΐ 20 IFN-näytettä, mitä seurasi kaksinkertainen sarjalaimennus. Kuhunkin näin preparoituun syvennykseen lisättiin 50 μΐ 5 WISH-solususpensiota (4 x 10 solua/ml) 20 % FCS:a sisältävässä MEM:ssä, ja inkuboitiin CC^-kaasuinkubaattorissa 37°C:ssa 24 tuntia. Sne jälkeen kuhunkin syvennykseen li-25 sättiin 50 pl preparaattia, joka sisälsi rakkulaista suu- tulehdusta aiheuttavaa virusta (New Jersey-kanta) pitoisuutena 2 000 TCID^q (TCID^q = kudosviljelmän infektoiva kes-kivertoannos), ja inkuboitiin CC^-inkubaattorissa 37°C:ssa. Noin 35 tunnin kuluttua, kun IFN-näytettä sisältämättömän 30 syvennyksen soluissa havaittiin 100 %:n CPE, kukin syvennys tutkittiin mikroskooppisesti CPE:n arvioimiseksi, ja maljan, jossa havaittiin 50 %:n CPE, sisältämän IFN-näyt-teen laimennuskertoimen käänteislukua pidettiin IFN-tiit-terinä.
35 Käytetty IFN-T-n^yte oli supernatantti, joka oli 14 80906 kerätty 72 tunnin kuluttua siitä, kun ihmisen ääreislym-fosyytit oli stimuloitu konkanavaliini A:11a (40 jug/ml) ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaatilla (15 ng/ml).
1 ml tätä viljelmäsupernatanttia sisälsi 4400 yksikköä 5 ihmisen IFN-^Pra (lämpö- ja happoherkkää). Jos kloonattuja soluja sisältävän viljelmän supernatantti sisältää vasta-aineita, joilla on sitomiskapasiteettia irN-T^n suhteen, lisätyn IFN- T: n pitäisi sitoutua selluloosalla oleviin vasta-aineisiin ja supernatantin IFN- 'P -aktiivi-10 suuden pitäisi laskea. Tuloksena oli, että kloonilla 7*2-11 havaittiin olevan suhteellisen voimakas IFN-"p:n sitomiskyky ja että 50-75 % lisätystä IFN-"P: s ta (550 yk-sikköä/ml) sitoutui vasta-aineisiin (tauluko 3).
15 Taulukko 3 IFN-^-aktiivisuuden absorboituminen monoklonaalisiin vasta-aineisiin _______
Hybridoomaviljelmä IFN-jäännösaktiivisuus _______ _ _(U/ml)_ __________ 20 Koe 1 Koe 2 γ 2-11,1 138 275 γ 2-11,2 207 N.D.
γ 2-11,6 N.D. 275 γ 2-62,2 275 550 25 γ 2-62,3 275 550 γ 2-100,2 550 N.D.
γ 2-100,3 550 N.D.
550 550 30 Esimerkki 7
Monoklonaalista vasta-ainetta tuottavien hybridoo-mien aiheuttama askiitesin muodostuminen Askiitesin muodostuminen aiheutettiin inokuloimalla vatsaontelonsisäisesti BALB/C-hiiret, jotka oli esikäsitel-35 ty vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml:11a mineraaliöljyä, joka 6 nr\ 15 80906 sisälsi 1 x 10 ^)2-ll-kloonisolua, joilla oli kyky tuottaa IFN- Y* :n sitomisaktiivisuuden omaavia vasta-aineita.
10 vuorokauden kuluttua hybridoomien vatsaontelonsisäises-tä antamisesta askiitesneste kerättiin, ja siitä tutkit- 7 5 tiin vasta-aineaktiivisuus 10 -kertaiseen laimennukseen asti. Vaikka vastaavan kloonisoluviljelmän vasta-aineak-tiivisuus havaittiin aina 10 -kertaiseen laimennukseen asti, johti askiitesin muodostus noin tuhatkertaiseen vasta-aineaktiivisuuden nousuun.
10 Esimerkki 8
Monoklonaalisen vasta-aineen puhdistus Monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin Staehe-linin et ai. menetelmällä /Journal of Biological Chemistry 258 (1981) 97507 käyttäen lähtöaineena 4 ml esimerkin 7 mu-15 kaisesti saatua askiitesnestettä. Tämän menetelmän mukaisesti askiitesnestettä sentrifugoitiin ensin 15 minuuttia nopeudella 10 000 rpm fibriinimäisten aineiden poistamiseksi siitä, ja sen jälkeen neste laimennettiin fosfaattipus-kuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS: 8,1 mmol/1 20 Nal^PO^, 1,5 mmol/1 K^PO^, 2,7 mmol/1 KC1 ja 137 mmol/1 NaCl; pH 7,2) pitoisuuteen, jossa UV-absorptio aallonpituudella 280 nm olisi 12-14 (A2qq). Laimennettuun näytteeseen lisättiin sen jälkeen kyllästettyä ammoniumsulfaatin vesiliuosta siten, että sulfaattipitoisuudeksi tuli 47 %.
25 Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 60 minuuttia suolan erottumisen aikaansaamiseksi, ja sen jälkeen se sentrifugoitiin (10 000 rpm, 15 min), jolloin saatiin sakka. Sakka liuotettiin 20 mM Tris-puskuriin (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl:a, ja dialysoitiin samaa puskuria (2 1) vastaan. Kahden tun-30 nin kuluttua dialysointiliuos korvattiin tuoreella 2 l:n erällä samaa liuosta, ja dialyysiä jatkettiin vielä 15 tuntia. Senjälkeen sakka erotettiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudella 10 000 rpm, ja supernatantin pitoisuus säädettiin vastaamaan A280~arvoa 20-30. Tämä näyte fraktioi-35 tiin DEAE-selluloosapylväässä (8 ml, Whatman DE^)· j°ka oli 16 80 906 tasapainotettu riittävällä määrällä Tris-puskuria (pH 7,9), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCl:a, eluoiden 50 nmol/1 NaCl:a sisältävällä Tris-puskurilla virtausnopeuden ollessa 1,5 ml/min. Näissä olosuhteissa vasta-aineaktiivisuutta ha-5 valttiin pääasiassa effluenttifraktioissa. Se, että puhdistettu näyte oli vasta-aine, varmistettiin Laemmlin et ai. /Nature 227 (1970) 680^ SDS-PAGE-menetelmällä. Sen mukaisesti eräät fraktioista, jotka oli saatu ammoniumsulfaatti-erotuksella ja DEAE-selluloosa-fraktioinnilla, pelkistet-10 tiin 2-merkaptoetanolilla, jota seurasi elektroforeesi 17 % SDS-geelillä jännitteellä 30V 24 tuntia. Vasta-aineaktii-visuushuippujen kanssa sopusoinnussa olevina havaittiin kaksi vyöhykettä asemissa, jotka vastasivat suunnilleen molekyylipainoja 55 kilodaltonia (H-ketju) ja 28 kilodal-15 töniä (L-ketju). Näin puhdistetusta vasta-ainefraktiosta 17 tutkittiin IFN- y>:n sitomisaktiivisuus lisäämällä IFN-Y' (22QQ yksikköä/ml). Tällöin havaittiin, että noin 50 % IFN-rjp:sta sitoutui vasta-aineeseen (taulukko 4).
20 Taulukko 4 Näyte Laimennus IFN-jäännösaktiivisuus (U/ml) 10"1 1100 Y2-ll,l fraktio 17 _2 ,, ΛΛ 1 10 1100 25 -3 10 2200 10-4 2200 10"1 2200
Anti-IgE:n monoklo- _2 naalinen vasta-aine 2200 30 -3 10 ä 2200 10'4 2200 1 *" .......... ' ' ........" ' ' ..........- ' —..............
17 80906
Esimerkki 9
Alaryhmä, johon monoklonaalinen vasta-aine kuuluu
Puhdistettu vasta-ainefraktio 17 (esimerkki 8) 5 laimennettiin 10-kertaiseen tilavuuteen, ja sille tehtiin immuunisaostusreaktio agarissa (Ouchterlony-testi: Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford, (1964) käyttäen vuohen antihiiri-IgGl-, IgG2a-, IgG2b- ja IgG3-vasta-ainetta (Miles), jotta voitiin identifioida se 10 Igl-alaryhmä, johon 7^2-11,1 monoklonaaliset vasta-aineet mahdollisesti kuuluisivat. Yksi selvä vyöhyke havaittiin monoklonaalisen vasta-aineen ja vuohen anti-hiiri-IgG2b-vasta-aineen välillä, kun taas monoklonaalisen vasta-aineen ja muiden anti-vasta-aineiden välillä ei havaittu vyöhyke-15 muodostusta. Mainitun monoklonaalisen vasta-aineen todettiin siis kuuluvan ryhmään IgG2b (Taulukko 5).
Taulukko 5
Monoklonaalisen vasta-aineen alaryhmä 20 Antigeeni Vasta-aine Saostumis- ___käyrä_ Tämän keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine (fraktio 17) Anti-IgGl
Anti-IgG2a 25 " Anti-IgG2b + " Anti-IgG3
Esimerkki 10 25 ml (65,3 mg) esimerkin 8 mukaisella menetelmäl-30 lä puhdistettua, effluenttifraktioista saatua monoklonaa-lista vasta-ainetta dialysoitiin 0,1 M NaHCO^ra (pH 8,3) vastaan. 22 ml AFFI-GEL 10:tä (Bio-Rad) pestiin erikseen huolellisesti vedellä lasisuodatinta käyttäen. Geeliin lisättiin 25 ml liuosta (pH 8,0), joka sisälsi 0,1 mol/1 35 etanoliamiinia ja 0,15 mol/1 NaCl:a. Seosta ravistettiin 18 80906 4°C:ssa 1 tunti mahdollisesti jäljellä olevien reagoimattomien ryhmien sitomiseksi. Sen jälkeen geeli pestiin hyvin PBSrllä ja suspendoitiin 25 ml:aan PBS:ä, joka sisälsi 0,1 % NaN^ia. Suspensiota säilytettiin 4°C:ssa. Lisätyn 5 vasta-ainemäärän ja kerätyn suodoksen sisältämän vasta-ainemäärän perusteella todettiin, että vasta-aine sitoutui geeliin suhteessa 2,35 mg vasta-ainetta/ml geeliä. Pylvääseen pakattiin tällä tavalla saatua tuotetta, ja sitä käytettiin vasta-ainepylväänä.
10 Esimerkki 11 rlFN-f:n tuotantoon käytettiin E. coli RRl:a pRK248cI^g, pRC231/IFI-900) (tämän yhdistelmäorganismin muodostamista kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 99 084). Plasmidit pRK248cItg ja pRC231/IFI-900 15 sisälsivät lämpöherkän Lambda-repressorin geenin ja vastaavasti IFN- -geenin. rlFN- Y -geenin ilmentyminen oli PL~promoottorin kontrollin alainen.
E. coli RRl:a (pRK248cIts, pRC231/lFI-900) kasvatettiin yön yli LB-liemessä 30°C:ssa. 1 1 yön yli kasvatet-2Q tua viljelmää laimennettiin 10 l:ksi minimal M-9-väliai- neella, joka sisälsi kasaminohappoja. Logaritmisessa kasvuvaiheessa viljelylämpötila nostettiin 30°C:sta 42°C:seen ja kasvatusta jatkettiin 42°C:ssa 2-3 h. Bakteerit kerättiin sent-rifugoimalla ja bakteeripelletit säilytettiin -20°C:ssa käyt-25 töönasti. Kaikki fermentoinnit ja muut menettelyt tehtiin the
National Institutes og Health'n yhdistelmä-DNA-ohjeiden mukaan.
Edellä kuvatulla tavalla valmistettiin monoklonaali-sia vasta-aineita rIFN-Y:n synteettistä C-terminaalista 131-146-peptidiä vastaan. Monoklonaalista vasta-ainetta Mo 30 Y 2-11.1 käytettiin rlFN- Y :n puhdistamiseen. Monoklonaalista vasta-ainetta sisältävä kolonni valmistettiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla.
rlFN- V:n karboksimetylointi ^C-jodietikkahapolla tehtiin 6 M guanidiinihydrokloridin läsnäollessa viitteen 35 (3) mukaisesti. Ylimääräinen reagenssi poistettiin HPLC:llä 19 80906 C8-vastafaasikolonnissa. Karboksipeptidaasihajotus tehtiin 0,2 M NH^HCO^sssa viitteessä (4) kuvatulla tavalla.
rlFN- Τ'käsiteltiin CNBr:lla (100-kertainen mooli-ylimäärä metioniiniin nähden) 70 % muurahaishapossa viit-5 teen (5) mukaisesti. CNBr-peptidit erotettiin IIPLC:llä C-18-vastafaasikolonnissa. Peptidien eluointiin käytettiin lineaarista gradienttia 0 —> 70 % CH-jCN 0,1 % tri-fluorietikkahaoossa.
Proteiini- tai peptidinäytteitä hydrolysoitiin 10 20-24 h suljetuissa, typellä käsitellyissä, tyhjiksi ime tyissä putkissa vakiolämpötilassa kiehuvassa HCl:ssa, joka sisälsi 4 % tioglykolihappoa. Aminohappoanalyysit tehtiin käyttäen fluoresamiiniaminohappoanalysaattoria viitteessä (6) kuvatulla tavalla.
15 Karboksimetyloitujen proteiinien sekvenssianalyy siin käytettiin ABI (Applied Biosystem, Inc)-kaasufaasi-sekvensoijaa 470A viitteen (7) mukaisesti. PTH-aminohappo-näytteet identifioitiin vastafaasi-HPLC:llä käyttäen Ultra-sphere ODS-kolonnia viitteessä (8) kuvatulla tavalla.
20 Kaikki puhdistusvaiheet toteutettiin 4°C:ssa. Pa kastetut solut (25 g) suspendoitiin kolminkertaiseen tilavuuteen (75 ml) 7 M guanidiinihydrokloridia (pH 7). Seosta sekoitettiin 1 h, ja sentrifugoitiin sitten 1 h 30 000 x g. Supernatantti laimennettiin 10-kertaiseen 25 tilavuuteen Dulbeccon'n fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) tai 0,15 M natriumboraatti-puskurilla (pH 9,5), ja sentrifugoitiin sitten 30 min 30 000 x g. Vaihtoehtoisesti pakastetut solut (25 g)
: suspendoitiin 1,5-kertaiseen tilavuuteen (37,5 ml) 0,15 M
30 natriumboraattipuskuria (pH 9,5) ja sentrifugoitiin sitten 1 h 30 000 x g. Joko guanidiinihydrokloridiuutos-ta tai äänikäsittelystä saatua supernatanttia sekoitettiin 1 h pöyröravistimessa 25 ml:n kanssa piidioksidia ja esi-pestiin PBS:llä. Seos kaadettiin pylvääseen ja pylväs 35 huuhdottiin 20 - 30-kertaisella tilavuudella 1 M NaCl.
20 80906
Sitten kolonni eluoitiin 0,01 M natriumboraatti-puskurilla, joka sisälsi 0,5 mol/1 tetrametyyliammonium-kloridia (pH 8,0). Interferoniaktiivisuus eluoitui n. 200 ml:n erässä ja otettiin talteen 4 fraktiona. Kukin frak-5 tio laitettiin monoklonaalista vasta-ainetta (^2-11.1) sisältävään affiniteettikolonniin (kerroksen tilavuus 4 ml), joka oli tasapainotettu PBS:llä. Kun kolonni oli pesty 10-kertaisella tilavuudella PBS-puskuria, se eluoitiin joko 1 M guanidiinihydrokloridilla tai 50 % etyleeniglykolilla, 10 joka sisälsi 1 mol/1 NaClra ja 20 mmol/1 natriumfosfaatti- puskuria (pH 7,0). Interferoni eluoitui ensimmäisten 20 ml:n mukana.
SDS-PAGE tehtiin Laemmlin (viite 8) kuvaamalla tavalla. Proteiini määritettiin fluoresamiinianalyysillä 15 käyttäen referenssiaineena kiteistä naudan seerumialbumii-nia. Interferoniaktiivisuus määritettiin sytopaattisen vaikutuksen estotestillä käyttäen rakkulaista suutulehdusta aiheuttavaa virusta ja ihmisen WISH-soluja viitteen (19) mukaisesti. Kaikki interferonitiitterit ilmoitetaan refe-20 renssiyksikköinä/ml kalibroituna referenssiainetta vastaan (osittain puhdistettu ihmisen immuuni-interferoni).
Yhteenveto uutto-puhdistus-menettelystä esitetään taulukossa 6. Kokonaissaanto oli 25-32 % ja puhdistuminen noin 100 - 769-kertainen keskimääräisen spesifisen aktiivisuu-25 den ollessa 1 x 10^ yksikköä/mg. rIFN-T^*:n kokonaissaanto oli 3-4 kertaa suurempi käytettäessä guanidiiniuuttoa. Viimeisen puhdistusvaiheen SDS-PAGE esitetään kuvassa 1. Materiaalilla, joka oli puhdistettu guanidiiniuutteesta, esiintyi yksi vyöhyke noin 18 000 daltonin kohdalla (18 K:n 3Q rIFN- ^), kun taas materiaalilla, joka saatiin äänikäsit-telystä, esiintyi päävyöhyke noin 15 000 daltonin kohdalla (15 K:n rlFN-^ ) ja pienempi vyöhyke noin 17 000 daltonin kohdalla (kuv. IA). Ei-pelkistävällä geelillä muodostui rlFN- ^p:n dimeerejä ja oligomeerejä (kuv. IB).
35 18 K:n rlFN-^Y'* oli homogeenista ja aminohappokoos tumus sopi yhteen DNA-jakson perusteella ennustetun kanssa.
2i 80906 15 ja 18 K:n rlFN-^n aminohappokoostumus annetaan taulukossa 7. Usealle sadalle pikomoolille pelkistettyä ja karboksimetyloitua 15 ja 18 K:n proteiinia suoritettiin Edman-hajotus automaattisessa proteiini/peptidi-kaasufaasi-^ sekvensoijassa. 17 ja 18 K:n proteiinin 32 ja vastaavas ti 26 ensimmäistä tähdettä sisältävä N-terminaalinen aminohappoketju oli DNA-jakson perusteella ennustetun 14 ...
mukainen (kuvio 2) . C-karboksimetyloidut kystennit havaittiin sekvenssianalyysien ensimmäisessä ja kolman-10 nessa syklissä. N-terminaalista metioniinia ei havaittu.
18 ja 15 K:n rlFN- "p :n N-terminaalinen aminohappoanalyysi osoitti, että aminohappojärjestys kummankin proteiinin tällä alueella vastaa DNA-jakson perusteella ennustettua.
Myös C-terminaaliset peptidit on karakterisoitu sen määrit-15 tämiseksi, onko tällä alueella tapahtunut poistumisia tai muutoksia. Karboksipeptidaasi A (CPA)-pilkkomisseoksen aminohappoanalyysi osoitti, että seriiniä ja/tai glutamii-nia (C-terminaalisia aminohappoja) vapautui 18 K:n rlFN-p sta, kun taas 15 K:n rlFN-^p ei pilkkoutunut CPA:n vaiku-2Q tuksesta samoissa olosuhteissa. Koska Ser-Gln on rIFN-p:n C-terminaalinen jakso, ilmeni, että 18 K:n lajilla on muuttumaton C-pää, kun taas 15 K:n lajilla on erilainen C-terminaalinen tähde (Lys), joka ei lohkea CPA:11a.
DNA-jakson perusteella ennustetut C-terminaaliset 25 tähteet varmistettiin lisäksi analysoimalla ja sekventoi-malla C-terminaaliset peptidit CNBr-käsittelyn jälkeen. C-terminaaliset peptidit erotettiin HPLCtllä käyttäen C-18-vastafaasikolonnia (kuv. 3). 15 K:n rlFN- 'p :sta saatiin terävä peptidipiikki (piikki II), joka eluoitui gradientin 30 alkuosassa, ja tämä peptidi puuttui 18 K:n rlFN-"P :n CNBr-pilkkomisseoksesta. Tämän peptidin aminohappoanalyysi osoitti, ettei tässä peptidissä ollut homoseriiniä tai homoserii-nilaktonia ja sen täytyy siksi olla 15 K:n proteiinin C-terminaalinen CNBr-peptidi. Aminohappoanalyysin perusteella 35 (taulukko 8) tämä peptidi vastasi IFN- 'pm aminohappotäh- 22 8 0 9 0 6 teitä 121-131 (arginiinia ei ollut havaittavissa). Näiden 11 aminohapon järjestys varmistettiin sekvenssianalyysillä (kuv. 2). 18 K:n rlFN- "p :n ollessa kyseessä havaittiin suhteellisen leveä piikki eluution loppuvaiheessa. Tämä 5 piikki jakautui lisäksi kahdeksi piikiksi kapeaa gradient-tia käytettäessä. Aminohappoanalyysit osoittivat, että ensimmäinen piikki on 18 K:n proteiinin C-terminaalinen CNBr-peptidi (taulukko (8|f ja että aminohappokoostumus vastaa aminohappotähteitä 138-146. Näiden 9 aminohapon järjestö tys varmistettiin sekvenssimäärityksellä (kuv. 2). 15 K:n proteiinin C-terminaalisen aminohapon määritettiin olevan lysiini.
Nämä tulokset osoittavat, että 18 K:n laji on muuttumaton rlFN-^P -molekyyli, kun taas 15 K:n laji on proteo-15 lyysituote. Peptidisidos aminohappotähteiden 131 ja 132 (Lys-Arg) välillä on katkennus 15 K:n lajissa.
Taulukko 6 ___rIFN-^^;n puhdistus_ _
Spesi- 20 Puhdistusvaihe Kokonaisprote- Kokonais- finen Puhdis- Saanto iini (mg) aktiivisuus aktiivi- tuminen (%) (yksikköä) suus, (-kert.) (yks/mg) I. Guanidiiniuutto
Supematantti 2, 806 2,5x10® 9xl04 - 100 25 Piidioksidi 90 1,0X10® 1X106 11 40
Monoklonaalinen vasta-aine 8 0,8xl08 lXlO7 110 32 II. Aänikäsittelv 3Q Supematantti 6,136 8,0xl07 l,3xl04 - 100
Piidioksidi 87 4,5xl07 5,2xl06 400 5 6
Monoklonaali- nen vasta- 7 7 aine 2 2 >0x10' 1,0x10' 769 25 23 80906
Taulukko 7 15 K:n ja 18 K:n rIFN- :n aminohappokoostumus (tähteiden lkm) 5 18K (1-146) 15K (1-131).
Asp 20,9 (20) 19,9 (20)
Thr 5,1 (5) 4,9 (5) 10 Ser 9,8 (11) 6,7 (9)
GlU 18,5 (18) 15,1 (16)
Pro * (2) * (2)
Gly 5,9 (5) 5,6 (4)
Ala 8,2 (8) 7,3 (7) 15 Cys * (2) * (2)
Vai 9,1 (8) 9,1 (8)
Met 4,7 (4) 3,8 (3)
Ile 7,2 (7) 6,6 (7)
Leu 10,5 (10) 9,6 (9) 20 Tyr 5,5 (5) 4,8 (5)
Phe 10,3 (10) 8,2 (9)
His 1,8(2) 2,5 (2)
Lys 19,9 (20) 16,9 (19)
Arg 8,6(8) 5,6(3) 25 Trp * (1) * (!)
Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perusteella ennustetun tähteiden lukumäärän.
30 *) Ei määritetty 24 80906
Taulukko 8 15 K:n ja 18 K:n rlFN- ^rn C-terminaaliset CNBr-peptidit
5 15K 18K
Thr 0,9 (1)
Ser 1/1 (1) 0,84 (1)
Glu 1/1 (1) 1,1 (1)
Pro * (1) 10 Gly 1,5 (1) 1,3 (1)
Ala 2,4 (3) 1,1 (1)
Leu 1,0 (1) 1,1 (1)
Phe 1,0 (1)
Lys 1,9 (2) 2,8 (3) 15
Sijainti ketjussa 121-131 138-146
Suluissa olevat luvut ilmoittavat DNA-jakson perus-20 teella ennustetun tähteiden määrän.
*) Ei-määritelty.
25 80906
Kirjallisuusviitteet: 1) P. W. Gray et ai., Nature 295 (1982), ss. 503 - 508 2) T. Stahelin et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981), ss. 9750 - 9754 3) G. Allen, Sequencing of Protein and Peptides (1981), ss. 30 - 31, North-Holland Publishing Co., Amsterdam, New York 4) R. P. Amber, Methods in Enzymology 11 (1967), ss. 436 - 445 5) R. A. Wolfe ja S. Stein, Modern Methods in Pharmacology (1982), ss. 55 - 57; Alan R. Liss, Inc., New York 6) S. Stein ja L. Brink, Methods in Enzymology 79 (1981), ss. 20 - 25 7) R. M. Hewick, M. W. Hunkapillar, L. E. Hodd Ja W. I. Dreyer, J. Biol. Chem. 256 (1981), ss. 7990 - 7997 8) D. Hawke, P-M. Yang ja J. E. Shively, Anal. Biochem. 120 (1982), ss. 302 - 311 9) U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), ss. 680 - 685 10) S. Rubinstein, P. D. Familetti ja S. Petska, J. Virol. 37 (1981), ss. 755 - 758.
Claims (5)
- 26 80906
- 1. Menetelmä ihmisen muuttumattoman yhdistelmä-immuuni -inter f eroniproteiinin uuttamiseksi, joka proteiini 5 on oleellisesti vapaa proteolyysifragmenteistaan, tätä proteiinia sisältävistä transformoiduista E. coli-soluista, tun nettu siitä, että uutto suoritetaan guanidiinihydrokloridilla .
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että transformoidut E. coli-solut suspendoidaan guanidiinihydrokloridiliuokseen.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että guanidiinihydrokloridiliuok-sen konsentraatio on vähintään noin 4 mol/1. I5 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen muuttumattoman valmiin yhdistelmä-immuuni-interferoniproteiinin molekyyli-paino on noin 18 000 daltöniä.
- 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että transformoituja E. coli-So-luja sisältävä preparaatti jaetaan guanidiinihydroklori-dikäsittelyn jälkeen supernatanttifraktioksi ja solujäte-fraktioksi . 27 80906
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/534,039 US4476049A (en) | 1983-09-20 | 1983-09-20 | Method for the extraction of immune interferon |
| US53403983 | 1983-09-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI843670A0 FI843670A0 (fi) | 1984-09-19 |
| FI843670L FI843670L (fi) | 1985-03-21 |
| FI80906B FI80906B (fi) | 1990-04-30 |
| FI80906C true FI80906C (fi) | 1990-08-10 |
Family
ID=24128466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI843670A FI80906C (fi) | 1983-09-20 | 1984-09-19 | Foerfarande foer extraktion av intakt rekombinant-human-immuninterferonprotein. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4476049A (fi) |
| EP (1) | EP0140127B1 (fi) |
| JP (1) | JPS6163295A (fi) |
| KR (1) | KR910006602B1 (fi) |
| AT (1) | ATE60622T1 (fi) |
| AU (1) | AU575588B2 (fi) |
| CA (1) | CA1214411A (fi) |
| DE (1) | DE3484043D1 (fi) |
| DK (1) | DK447584A (fi) |
| ES (1) | ES8608541A1 (fi) |
| FI (1) | FI80906C (fi) |
| GR (1) | GR80404B (fi) |
| HU (1) | HU196462B (fi) |
| IL (1) | IL72988A (fi) |
| MC (1) | MC1626A1 (fi) |
| NO (1) | NO159609C (fi) |
| NZ (1) | NZ209589A (fi) |
| PH (1) | PH20996A (fi) |
| PT (1) | PT79231B (fi) |
| ZA (1) | ZA846723B (fi) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5582824A (en) * | 1981-10-19 | 1996-12-10 | Genentech, Inc. | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon |
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
| US4604284A (en) * | 1983-09-20 | 1986-08-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous immune interferon fragment |
| US4681930A (en) * | 1983-09-20 | 1987-07-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immune interferon and a method for its extraction and purification |
| JPS6079000A (ja) * | 1983-10-04 | 1985-05-04 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| US4855238A (en) | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
| US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
| JPH0724596B2 (ja) | 1984-12-27 | 1995-03-22 | サントリー株式会社 | インタ−フェロンの精製方法 |
| HU201775B (en) * | 1984-12-27 | 1990-12-28 | Suntory Ltd | Process for purifying interferon |
| DE3511011A1 (de) * | 1985-03-27 | 1986-10-02 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von (alpha)-interferonen |
| US4873312A (en) * | 1985-04-25 | 1989-10-10 | Amgen | Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby |
| DE3580590D1 (de) * | 1985-05-29 | 1990-12-20 | Green Cross Corp | Herstellungsverfahren fuer heterogene proteine. |
| CA1339757C (en) | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| AU609824B2 (en) * | 1987-06-15 | 1991-05-09 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
| IT1219454B (it) * | 1988-02-17 | 1990-05-18 | Serono Cesare Ist Ricerca | Metodo di rottura alla metionina di polipeptidi contenenti pontidisolfuro |
| WO1990002175A1 (en) * | 1988-08-16 | 1990-03-08 | Novo Nordisk A/S | A method of producing polypeptides by culturing eukaryotic cells in the presence of protease inhibitors |
| DE4440001A1 (de) | 1994-11-09 | 1996-05-15 | Pacesetter Ab | Kontaktierung von Glaskohlenstoff-Elektroden |
| DE19755960C1 (de) * | 1997-12-16 | 1998-11-26 | Hoechst Ag | Verfahren zum Aufschluß von biologischem Material |
| DE102011051722A1 (de) | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Phoenix Conveyor Belt Systems Gmbh | Fördergurt mit einer Hybrid-Leiterschleife |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7404590A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het reactiveren van interferon. |
| NL7404589A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het stabiliseren van interferon. |
| US4357422A (en) * | 1980-08-14 | 1982-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of enhancing interferon production |
| US4414150A (en) * | 1980-11-10 | 1983-11-08 | Genentech, Inc. | Hybrid human leukocyte interferons |
| US4382027A (en) * | 1981-08-18 | 1983-05-03 | Meloy Laboratories, Inc. | Purification of human immune interferon |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| US4388234A (en) * | 1981-12-28 | 1983-06-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peptide isolation |
| ZA831094B (en) * | 1982-02-22 | 1983-11-30 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
| AU571460B2 (en) * | 1982-09-27 | 1988-04-21 | Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research | Alpha interferon dna, recombinant plasmid, engineered organism and alpha interferon polypeptide |
| GR79124B (fi) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc |
-
1983
- 1983-09-20 US US06/534,039 patent/US4476049A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-08-28 ZA ZA846723A patent/ZA846723B/xx unknown
- 1984-09-18 DE DE8484111131T patent/DE3484043D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-18 GR GR80404A patent/GR80404B/el unknown
- 1984-09-18 NZ NZ209589A patent/NZ209589A/xx unknown
- 1984-09-18 IL IL72988A patent/IL72988A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-09-18 AT AT84111131T patent/ATE60622T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-09-18 EP EP84111131A patent/EP0140127B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-19 PH PH31246A patent/PH20996A/en unknown
- 1984-09-19 DK DK447584A patent/DK447584A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-09-19 PT PT79231A patent/PT79231B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-09-19 KR KR1019840005713A patent/KR910006602B1/ko not_active Expired
- 1984-09-19 MC MC841727A patent/MC1626A1/fr unknown
- 1984-09-19 HU HU843511A patent/HU196462B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-09-19 FI FI843670A patent/FI80906C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-09-19 JP JP59196500A patent/JPS6163295A/ja active Pending
- 1984-09-19 ES ES536029A patent/ES8608541A1/es not_active Expired
- 1984-09-19 NO NO843749A patent/NO159609C/no unknown
- 1984-09-19 AU AU33302/84A patent/AU575588B2/en not_active Ceased
- 1984-09-19 CA CA000463541A patent/CA1214411A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR850002284A (ko) | 1985-05-10 |
| HUT35287A (en) | 1985-06-28 |
| MC1626A1 (fr) | 1985-09-26 |
| NO159609C (no) | 1989-01-18 |
| NO843749L (no) | 1985-03-21 |
| EP0140127A1 (en) | 1985-05-08 |
| FI80906B (fi) | 1990-04-30 |
| ES8608541A1 (es) | 1986-07-16 |
| US4476049A (en) | 1984-10-09 |
| DE3484043D1 (de) | 1991-03-07 |
| PH20996A (en) | 1987-06-22 |
| KR910006602B1 (ko) | 1991-08-29 |
| AU3330284A (en) | 1985-03-28 |
| AU575588B2 (en) | 1988-08-04 |
| EP0140127B1 (en) | 1991-01-30 |
| JPS6163295A (ja) | 1986-04-01 |
| FI843670L (fi) | 1985-03-21 |
| CA1214411A (en) | 1986-11-25 |
| ATE60622T1 (de) | 1991-02-15 |
| DK447584A (da) | 1985-03-21 |
| IL72988A0 (en) | 1984-12-31 |
| PT79231B (en) | 1986-11-18 |
| NO159609B (no) | 1988-10-10 |
| ES536029A0 (es) | 1986-07-16 |
| NZ209589A (en) | 1988-10-28 |
| FI843670A0 (fi) | 1984-09-19 |
| GR80404B (en) | 1985-01-21 |
| PT79231A (en) | 1984-10-01 |
| IL72988A (en) | 1990-02-09 |
| HU196462B (en) | 1988-11-28 |
| ZA846723B (en) | 1985-04-24 |
| DK447584D0 (da) | 1984-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI80906C (fi) | Foerfarande foer extraktion av intakt rekombinant-human-immuninterferonprotein. | |
| US5278286A (en) | Immune interferon | |
| EP0136620B1 (en) | Homogeneous immune interferon fragment | |
| US5214132A (en) | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor | |
| US6027720A (en) | G-CSF conjugate | |
| FI90983B (fi) | Menetelmä yhdistelmäinterferonipolypeptidien valmistamiseksi | |
| RU2252961C2 (ru) | Способ получения амидированного пептида | |
| US5714581A (en) | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor | |
| EP0418590B1 (en) | Antibodies, production thereof and use | |
| US5194592A (en) | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor | |
| FI80293B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av intakt rekombinent humanimmuninterferon. | |
| JPH06153985A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JP2779621B2 (ja) | モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，それらの製造法およびそれらの用途 | |
| JPS6167481A (ja) | 新規ハイブリドーマおよびその製造法 | |
| WO1992005796A1 (en) | Peptide inhibitors of neutrophil activation proteins | |
| NZ227372A (en) | Murine monoclonal antibodies to human ifnalpha |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG |