JPS60107569A - 新規ポリペプチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規ポリペプチドおよびその用途に関する。

ケーラーとミμヌタインにょシ開発され（ネイチャー、
第２５６巻、４９５頁、１９７５年）、近年盛んになっ
て来たハイプリドーマを用いたモノクローナル抗体の製
造法は、各々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗
体が得られることや、粗精製標品に対して得られた抗体
について吸収操作を必要としないことなどのすぐれた特
徴をもっている。まなこの他に、抗体取得という面から
も、ハイプリドーマの腹水化によシ、高力価の抗体が、
自由に、多食に、しかも常に均質な標品を再現性よく得
られるなど多くの利点がある。この様な意味からハイプ
リドーマによるモノクローナル抗体取得の手法は、多方
面にわたってその有用性が高く評価されている。また、
その使い方も単に抗原検出にとどまらず、抗体力ツム作
製を通じて、微量成分の精製に用いたシ〔ネイチャー、
２８５゜４４６−４５０．（１９８０年）〕、更には、
診断薬、治療薬への応用〔ヨーロピアン　リサーチμ　
オブ　イムノロジー、９．９４−９６゜（１９７９）、
）も展開されている。

ヒトのインターフェロン（工Ｆ１ｔＴ）には、抗原的に
異なるα、β、γ型の少くとも３種のタイプが存在する
ことが知られている〔ネーチャー。

２８６．１１０．（＋９８０））。γ型インターフェロ
ン（ＩＦＮ−γ）については、マイト−ジエンや抗原刺
激によって、主としてＴリンパ球から産生されることが
判ってお夛、別名免疫インク−フェロン（エーエＦＮ）
とも呼ばれている〔ザインターフェロン　システム、ス
プリンガー社。

ニューヨーク、１１頁−２６頁、１９７９年〕。

工ＦＮ−γは生体内で、種々の免役反応にともなって産
生されることが予想され、免疫調節に重要な役割を果＆
していると考えられている。また、■ＦＨ−γの性質と
しては、β型インターフェロン（工ＦＮ−α）やβ型イ
ンターフェロン（工ＦＮ−β）と抗原性が異なることや
、誘超剤の種類が異なることの他に、酸や熱に対する安
定性が悪いことなども判っている〔ザ　インターフェロ
ンシステム、スゲリンガ−社、ニューヨーク、１１頁−
２６頁、　（、１９７９）　）。

一般的に工ＦＮは、生体の産生する抗つィμス作用をも
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
ｉ！４：をもっことが証明されておシ、特に抗腫瘍効果
を有する点で注目されている〔ブラッド１．Σ５，７１
１−７２１．（１９８０）；同誌、わ、８７５−８８４
．（１９８０））。

＠瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増殖を直
接抑制する方法と、宿王の免疫反応を介して、間接的に
腫瘍を抑制する方法が考えられ、後者の場合、例えばナ
チュフ！キラー細胞（ＮＫ）や、マクロファージの活性
化、或いはキラーＴ創胞の活性化などが考えられる。寮
際、工ＦＨには直接作用の他に、この様な種々の免疫増
強活性があることが証明されている〔パイオケミカ　エ
トバイオフイジカ　アクタ、５１６，２３１−２４７、
（１９７８））。ＩＦＮ−γはインビトロでのこれら抗
腫瘍につながる各種の活性、およびインビボに於ける抗
腫瘍活性が、工ＦＮ−αや工ＦＮ−βに比べ最かに高い
ことから、その重要性が強く指摘されている〔七μフー
イムノロジー。

す、３９０−３９４．（１９８０）〕。

然しなから、インビトロで誘導される工ＦＮ−γの力価
は一般に低いことや適切な工ＦＨ−γ産生株軸胞がほと
んどないこと、さらに熱や酸に対する安定性が悪いため
精製がむつかしいことなどのために工ＦＮ−γの大量生
産およびｍ製は工ＦＮ−αや工ＦＮ−βに比べ大幅に遅
れている。

最近、天然の工ＦＮ−γが単一に出来たという報告があ
るが（グロシジング　オプ　ナショナルアカデミ−オプ
　サイインク、７９．１８２０−１８２４．（１９８２
）：）、活性の回収が大変悪く、よ勺効果的な精製法が
待望されている。

一方最近に至り、ヒトエＦＮ−γ遺伝子のクローニング
が報告され、少くとも工ＰＭ−γの一種として、１４６
個のアミノ酸から成る約１７キロダμトンの分子種が、
大腸菌で作られる様になった〔ネーチャー、２９５．５
０３−５０８　。

（１９８２）；ヌクレイツク　アシッズ　リサーチｉ０
，２４８７−２５０１．１９８２）］ので、遺伝子組み
換え法を用いた１ＦＮ−γの大量生産が期待出来る様に
なったが、抗体を用いない通常の精製法で単一化するこ
とは大変な困難が予想される。

この様な視点から、各種の工ＦＮ−γに対するモノクロ
ーナル抗体を得ることは、分子種間の対応をつけるのに
重要なだけでなく、天然の、或いは遺伝子組み換え法に
よる大腸菌などで作らせたエＦＮ−γｔ−精製する上に
極めて強力な武器となる。最近に至シ、天然の工ＦＮ−
γに対するモノクローナル抗体の取得が報告され〔ネー
チャー。

２９６．２５８−２５９　、（１９８２）；ザ　エンポ
ジャーナμ、２，１５２了−１５３０、（１９８３））
。

後者の報告では該抗体が天然のＩＦＮ−γの精製や定量
に用いられることが報告されたが、遺伝子組み換え法に
より得られた１ＦＮ−７に対するモノクローナル抗体を
取得することは、遺伝子組み換え法により作られた工Ｆ
Ｎ−γをより効率よく精製したり、よシ感度よく検出し
たシする上に極めて重要である。また、モノクローナル
抗体を用いて工ＦＮ−γを精製したル検出する上におい
て、その抗体がペプチドのどの部分を認識しているかを
確かめ、認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を
取得し、それらを目的に応じて使い分けることができれ
ば、その応用価値は急増する。上述した報告においては
、得られたモノクローナル抗体が工ＦＮ−γのどの部分
を認識しているかは全く不明である。ごく最近に至り、
工ＦＮ−γのＮ末端１番目から２０番目迄のアミノ酸配
列に相当する合成ペプチドに対する抗体の取得が報告〔
ジャーナμ　オプ　イムノロジー、１２９　。

２３５７−２３５９　（１９８２））されたが、報告に
よる抗体は兎で作製されたポリクローナル抗体である。

ポリクローナル抗体に比べ、モノクローナル抗体は供給
面（抗原ｇ識部位、抗体価。

親和性等に関して、常に一定のものを随時、多量に供給
し得る）ですぐれているのみならず、工ＦＮ−γの精製
、検出等の応用面でも結果の再現性が最かに高く有効で
ある。

本発明者らは、構造遺伝子のヌクレオチド配列から推定
されたヒトエＦＮ−γのアミノ酸配列に関する報告〔ヌ
クレイツク　アシフズ　リサーチ１０．２４８７−２５
０１（１９８２））をもとに、そのアミノ酸配列のＮ末
端側の部分構造を有する式 （５） ％式％ （） ） （ Ｃ式中、Ｘは結合手または式Ｚ−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　（Ｚ
は＜ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖にお
いてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有する
ペプチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙは’Ｆｓｎ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ａｓｐ　Ａｅｎ（９１ｙで示されるペプチド鎖に
おいてそのＮ末端から数えて１〜１１個のアミノ酸を有
するペプチドもしくはアミノ酸残基を示す〕で表わされ
るポリペプチドを化学的に合成し、さらにキャリヤー蛋
白と化学結合させ蛋白複合体とした。

ここで得られたポリペプチド゛または蛋白複合体で哺乳
動物を免疫し、取り出したりンバ球と同種または異種の
リンパ球様稲胞株とを澗胞融合によシハイプリドーマと
し、これをクローン化した。

ここで得られたハイプリドーマを哺乳動物に接種し、モ
ノクローナル抗体を生成蓄積せしめ、これを採取して前
記のポリペプチドに対するモノクロ−すμ抗体を製造し
た。

さらに、ここで得られるモノクローナル抗体を利用し、
粗ヒトエＰＭ−γ含有物からとトエＦＮ−γを精製する
方法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩ人）法ならびに
エンザイムイムノアッセイ（Ｅ工Ａ）法によシヒトＩＥ
ａＮ−γを検出する方法を確立し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、新規ポリペプチド（１）。

その蛋白複合体、新規りｐ−ン化されたハイブリドーマ
、新規モノクローナル抗体およびこれらの製造法、さら
に該モノクローナル抗体の用途を提供するものである。

前記ポリペプチド（１）に関し、Ｙ　ｉＪ、Ａｅｎ　Ａ
ｌａＧ１７であることが好ましく、これに加えＸが式Ｚ
−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　（Ｚは前記と同意義）、ト９ワけ＜
Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏでおることが好ましい。またポ
リペプチドＣＩ）はアミノ酸残基数として１２〜２６個
であることが好ましい。

当該ポリペプチドは、ペプチド合成の常套手段で製造し
うる。同相合成法、液相合成法のいずれによってもよい
が、液相合成法が有利な場合が多い。このようなペプチ
ドの合成の手段は、たとえば、”　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ＋３　”第１巻１９６６）。

５ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｂｋｅ著＋　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、８．
Ａ、　＠るいは“ペプチド合成”。

泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５）、あるいは“生化
学実験講座、第１巻、２０７頁−４００頁”矢島治明著
、東箪化学同人株式会社（１９７７年）に記載されてお
ル、たとえば、アジド法、クロフィト法、酸無水物法、
混合酸無水物法、ＤＣＣ法。

活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カ
ルポジイミダゾ−μ法、酸化還元法、ＤｃＣ／アディテ
ィブ（例、ＨＯＮＢ、　ＨＯＢｔ、　ＨＯ８ｕ）法など
があげられる。

ポリペプチド（１）は、いずれも保護されていてもよい
、（ａｌポリベグチドの一部に相当する反応性力μホキ
シル基を有する原料と、（ｂ）ポリペプチド（１）の残
部に相当する反応性アミノ基を有する原料をペプチド合
成の常套手段で縮合させ、生成する縮合物が味ｗ基を有
する場合、その保護基を常套手段で脱離させることによ
シ製造しうる。

原料の反応に関与すべきでない官能基の＃、護および保
護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能
基の活性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜
選択しうる。

原料の１ミノ基の保護基としては、たとえば力μポペン
ゾキシ、ｔ−ブチμオキシカμボニμ。

ｔ−アミμオキシカμボニμ、イソポμ二μオキシカル
ボニμ、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボ二μ、２−
クロル−ベンジμオキ７カｐボニル。

アダマンチμオキシカμボニμ、トリフμオロアセチμ
、フタリｆｉ／ｌホμミ／ｌ／　、　Ｏ−ニトロフエニ
μス／Ｌ／　７．ニル、ジフェニルホスフイノチオイ！
。

４−メトキシ−２，３，６−ドリメチルベンゼンスμホ
ニ〃などがらげられる。力μホキシル基の保護基として
は、たとえばア〃キｐエステ／Ｌ／（例、メチル、エチ
ル、プロピ／Ｌ／、ブチμ、ｔ−ブチｐなどのエステ／
９基）、ベンジμニスｆμｍ、ｐ−ニトロベンジμエス
テμ基、ｐ−メトキシベンジルエ７．？μ基、Ｐ−クロ
ルベンジルエステｙｖＭ。

ベンズヒドリμエステ／ｌ／基、力μボベンゾキシヒド
ヲジド基、ｔ−ブチμオキシカμボニμヒドフジド基、
トリチμヒドフジド基などがあげられる。

原料の力ρホキシル基の活性化され念ものとしては、た
とえば対応する酸無水物、アジド、活性エステμ（ペン
タクロロフェノ−／Ｌ’、ｐ−二トロフェノー１ｔ／、
Ｎ−ハイドロキシサクシンイミド。

Ｎ−ハイドロキシベンズトリアシーμ、Ｎ−７１イドロ
キシ−５−）ｐポμネンー２，３−シカｐボキシイミド
などとのエステ／Ｌ／）などがあげられる。

ペプチド結合形成反応は脱水剤（例、シンクロヘキシル
カルボジイミド、力！ポジイミダゾール等の力μポジイ
ミド試薬）の存在下ｌＣ実施しうる場合がある。

本ペプチド縮合反応は溶媒の存在下に行うことができる
。溶媒としては、ベグチド縮合反応に使用しうろことが
知られているものから適宜選択されうる。たとえば無水
または含水のジメチルホルムアミド、ジメチμヌμホキ
サイド、ピリジン。

クロロホμム、ジオキサン、ジクロルメタン、テトヲハ
イドロ７フン、酢酸エチμ、■−メチμピロリドンある
いはこれらの適宜の混合物などがあげられる。

反応温度はペプチド結合形成反応に使用されうることか
知られている範囲から適宜選択され、通常約−４０℃−
約６０℃、好ましくは約−２０℃−約０°Ｃの範囲から
適宜選択される。

本縮合反応終了後、生成物が保護基を有している場合、
それは常法により離脱できる。かかる常法としては、た
とえば還元的方法（例、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
）、アンドリンス（例、トリフルオロ酢酸、フフ化水素
、メタンヌμホン酸あるいは、チオアニソ−μ等の含硫
化金物の存在下、上記の酸あるいは、その混合物による
アンドリンス）などがあげられる。

上記のようにして製造された本発明のペプチドは、反応
終了後混合物から、通常のペプチドの分離手段、抽出１
分配、カフムクロマトグフフィーなどによシ採取できる
。。

ポリペプチドの蛋白複合体に関し、キャリヤー蛋白の種
類およびキャリヤーとハブテン（この場合ペプチド）と
の混合比は、キャリヤーにカプリングさせて免疫したハ
プテンに対して抗体が効率よく出来れば、どの様なもの
をどの様な比率でカプリングさせてもよいが、例えばヒ
ト又は牛血清アルブミンや牛サイログロブリンちるいは
ヘモシアニン等を重量比でハブテン１に対し０．１〜２
０、好ましくは１〜５の割合でカブμさせる方法が用い
られる。

ま念、ハプテンとキャリヤーのカプリングには、種々の
縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒドや
力μポジイミド等が好都合に用いられる。

ポリペプチド（１）または蛋白複合体を用いて免疫する
に際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊。

兎、モμモット、フット、マウス等の実験動物が使われ
るが、モノクローナμ抗体を得るためには、ラット、マ
ウスが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する
場合、皮下、腹腔内、静脈内。

筋肉内、皮肉等のいずれのμ−トからでも可能であるが
、主として皮下、腹腔内−９静脈内に（とシわけ皮下）
注入するのが好ましい。また、接種間隔、接種量等も可
変度は高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間
隔で２〜８回接種し、最終免疫後、１〜５日、好ましく
は２〜４日後の牌粗胞を用いる方法がよく用いられる。

接種量は１回にベグチド量として、マウヌ当！！７０．
１μｍｇ以上、好ましくは１０μｇ〜３００／１ｇ用い
ることが望ましい。又、牌臓を摘出する場合はその前に
、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で
、リンパ球源として肺臓細胞を用いる融合実験を行うこ
とが望ましい。

又、免疫の方法として、ポリペプチドＣＩ）または蛋白
複合体で哺乳動物を免疫する方法について述べたが、例
えば工ＦＮ−γ、好ましくは遺伝子組み換え法によシ大
腸菌を用いて作製した工ＦＮ−γ（以後ｒ工ＦＮ−γと
記す）をＭ製し１、精製ｒ工ＦＮ−γをまず接種した後
、上記ポリペプチドＣＩ）または蛋白複合体で哺乳動物
を免疫するか、又はその逆にポリペプチド（１）又は蛋
白複合体で免疫した後、精製ｒ工ＦＮ−γを哺乳動物（
・：追加接種することもできる。該免疫方法の中、ｒＩ
ＦＮ−γを接種した後、ポリペプチド（１）又は蛋白複
合体で免疫する当発明による免疫方法は、前者単独で免
疫する方法に比べ、特定のポリペプチド部分を認識する
抗体を取得する上でとりわけ効率がよい。この方法は単
にＩＦＮ−γとその特定のペプチド部分との関係だけで
なく、他の分子についてもその特定部位を認識する抗体
を取得したい場合の有効な免疫方法として応用可能であ
る。

上記リンパ球とリンパ球様細胞株との細胞融合は、例え
ば免疫したマウスのリンパ球（トシゎけ牌臓測胞由来の
もの）をヒポキサンチン−グアニンーホスホリボシμト
フンヌフエフーゼ欠損（ＨＧＲＲ’［’−）や、チミジ
ンキナーゼ欠損（ＴＫ−）の様なマーカーを持った適切
な同種または異種（好ましくは同種）のミエローマ等の
、リンパ球様細胞株との間で融合させる。融合には、セ
ンダイウイ！ヌ１ポリエチングリコ−／ｌ／（ＰＥＧ　
）等の融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキ
シド（ＤＭ８０）その他の融合促進剤を加えることも可
能である。ＰＲＧの重合度は、ふつう１０００〜６００
０　、時間は０．５〜３０分、濃度は１０％〜８０％等
が用いられるが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ５
０００を３５〜５５％で４〜１０分処理することによフ
、効率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒボ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン培地〔ＨＡＴ培
地；ネイチャー、　２５６　、４９５−４９７　、（１
９７５））等を用いて、選択的に増殖させることが出来
る。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養上清は、目的と
する抗体産生があるか否かについてヌクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に
行うことが出来る。即ち、ＲＩＡ法またはＥＩＡ法等の
方法で調べることが出来るが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例として
、Ｅ工Ａを用いる方法について述べる。固相にｒＩＦＮ
−γ又はポリペプチド（１）を常法に従って固定（例え
ば９６大のマイクロタイ／−プレートを固相として用い
るとマμチヌキャン等を用いた迅速な測定が可能となシ
有利である）させておき、これに測定しない培養上清や
、マウスの血清を加え、一定時間、定温（以下４〜４０
℃を示す）で反応させる。この後、反応物をよく洗った
後、酵素で標識した抗マウス抗体（山羊、兎などのポリ
クローナル抗体に例えばホースフディツシュペルオキシ
ダーゼ等の酵素を結合したものを市販品として入手出来
る）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物をよ
く洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温で反応さ
せ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光度等で測定
することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつｒ工ＦＮ−γへの結合能や
免疫に用いたペプチドに対する抗体活性のみられたウェ
ルの細胞は、限界稀釈法等にょシクローニングを行うこ
とが望ましい。クローン化された細胞の上清について同
様にスクリーニングを行い抗体価の高いウニμの細胞を
増やすことによシ、免疫したペプチドと反応性を示すモ
ノクローナル抗体産生ハイプリドーマクローンがｍられ
る。

これらクローンの産生ずる抗体が天然の工ＦＮ−γ（例
えばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホμボーｐエス
テル等で堵４したもの；以後ｎ工ＦＮ−γと記す）およ
びｒ工ＦＮ−γを吸収する能力について生物活性を用い
て調べることができる。その方法として有利に用いられ
る一例を次に述べるが、もちろん種々の変法も可能であ
る。例えばウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を七μ
ロースビーズ等の担体に常法に従いカプリングさせてお
き、これに測定したいハイグリドーマ上清またはマウス
の血清を加え、一定時間、定温で反応はせる。この後反
応物をよく洗い一定量の工ＦＮ−γを加える。工ＦＮ−
γとして、例えばｎ工ＦＮ−γやｒ工ＦＮ−γを加えた
後、一定時間。

定温で反応させ、反応上清中に含まれる工ＦＮ−γの活
性を測定する。この様にして目的とする抗体の工ＦＮ−
γ活性の吸収能を測定することが出来る。

次に、これらクローンの産生ずる抗体が、ｒ工ＦＮ−γ
＋ｎ工ＦＮ−γのもっ抗ウィルス作用（以後ＡＶＡと略
す）を中和する能力があるか否かを調べることもできる
。中和活性のある抗体の取得は、該抗体が直接生物活性
に関連した部位を認識していることになるので、工ＦＮ
−γを含むサンプルから、工Ｉ’ｍ−γを精製したシ、
ＥＩＡ法やＲＩＡ法を用いて定：ｉｉしたシする上に於
て、極めて重要である。抗体の中和活性は例えば次の様
にして測ることができる。即ち、一定量の工ＦＮ−γに
対して大過剰量の抗体を加え、一定時間、一定温度で反
応させた後、反応物を後述するＡＶＡにて測定すること
ができる。

このようにしてクローン化されたハイプリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。例えば
、液体培地たとえばＲＰＭニー１６４０に０．１〜４０
％の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、好ましくは
３〜５日間培養することによシ□、培養液から該モノク
ローナμ抗体を得ることができるが、この他にマウス等
の適切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、
腹水を採取することにより、細胞培養土清よシも凶かに
高力価の抗体を、多量に効率よく取得することが出来る
。このためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル
等を前もって接種したＢＡＬＢ／Ｃ等のマウスに１×１
０〜１×１０　個、好ましくは５Ｘ１０５〜２　Ｘ　＋
　０６　個のハイグリドーマを腹腔内等に接種し、７〜
２０日後、好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取
する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、Ｄ
ＥＡＥ−七μｐ−ヌカフムクロマト等により、容易にモ
ノクローナμ抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離す
ることが出来る。

本発明のモノクローナμ抗体は、下記の性状をする。

（１）ポリペプチドＣＩ）と結合する。

（２）　工ＦＮ−γ分子およびそのＣ末端部分を欠くフ
フグメントと結合し、工ＦＮ−αや工ＦＮ−βとは結合
しない。

（３）　工ＦＮ−７の生物学的活性を中和する。

（４）オフタロニー法による検定により工ｇＧｌのサグ
クフスの抗体に属する。

（５）’８ＤＳ−ポリアクリρアミトゲμ電気泳動にお
いて、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖に完全に一
致する２本のバンドのみを示す。

なお本モノクローナμ抗体は安全に製造、使用保管する
ことができる。

本発明によシ得られるモノクローナル抗体は、ＥＩＡ法
〔イ；ムノグミヌトリー、ｌｊ　、４２９−４３６（＋
９７６））或いはＲＩＡ法〔サイエンス。

１５８．１５７０−１５７２（１９６γ）〕を活用する
ことによル、生体中の、或いは試験管内での１０１の工
ＦＮ−γの検出に用いることが出来ることの他に、たと
えば抗体力ツムを作製することにより、今迄大変困難と
されていた天然の、或いは遺伝子組みかえによシ作られ
る工ＦＮ−γを、非常に効率良く精製するのに使用する
ことができる。

当発明において得られたモノクローナル抗体を工ＦＮ−
γの定量に用いる場合、例えば当抗体と工ＦＮ−γを含
む資料とを一定時間、定温で反応させた後、予め同種に
固定した工ＦＮ−γに上記反応物を加え一定時間、定温
で反応させ洗った後、酵素標識した抗マウス抗体を加え
反応させ、更に酵素基質を加え一定時間反応させマルチ
スキャンを用いた色素１の定量を行うことによｐ間接的
にＩＦＮ−γ量を測定するいわゆるＥＬ工ＳＡ　（エン
ザイム　リンクド　イムノソルベントアツセイ）法等に
よる測定が可能である。

又、これらのモノクローナル抗体は工ＦＮ−γのＮ末端
部分を認識する抗体であるので、例えばこれらの抗体と
別個に、工ＦＮ−γのＣ末端部分を認識する抗体を用い
て、これら各々の抗体を第１抗体、第２抗体として用い
、第１抗体を固相に固定し、これに測定したい工ＦＮ−
γを含む試料を加え、一定時間、定温で反応させよく洗
った後、例えば酵素標識した第２抗体を加え、一定時間
。

定温で反応させ、さらに酵素基質を加えて一定時間反応
させた後、マルチスキャン等を用い比色法によル定屋す
る、いわゆるサンドウィッチ法にょる定ゑが可能となル
、この場合、Ｎ末、Ｃ末の両末端部分を含む完全分子の
みを測定することができる。この方法によれば、例えば
大腸菌等で作らせた工ＦＮ−γ等がプロテアーゼ等によ
る分解を部分的に受けていた場合にも完全分子のみを測
定することができるので大変有利に用いることができる
。例えば、合成Ｃ末端ペプチドで免疫したマウス牌臓細
胞とリンパ球様細胞株との澗胞融合によ、９Ｃ末端ペプ
チドを認識する抗体を取得し〔特願昭５８−１７６０９
１号（出願日、昭和５８年９月２２日）明細書参照〕、
当発明の抗体と組み合わせて有利に用いることができる
。もちろん第２抗体として、Ｃ末端部分以外の認識部位
を有する別なモノクローナル抗体や、ポリクローナμ抗
体なども目的に応じて有利に使い分けることができる。

これらの反応において、酵素標識抗体の代シに１２５工
などのラジオアイトープ標識抗体を用いたＲ工Ａによる
定量法も可能であるし、また個々の反応ステップについ
ては種々の変法はもちろん可能であシ、当発明に記載し
た方法に限定されるものではない。

また本発明において得られるモノクローナル抗体を用い
て工ＦＮ−γを効率よく精製することができる。該モノ
クローナル抗体はしかるべき担体に化学的に結合させ、
カラムに充填し抗体カラムとして有利に使用できる。

抗体カラムの作製は、例えばハイプリドーマを接種した
腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗体
を適切な担体とカプリングさせることによシ、以下の様
な方法でできる。

用いる担体は、カプリングの後に工ＦＮ−γが特異的に
効率よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであ
ればどの様なものでもよいが、−例として蛋白の一級ア
ミンが結合し易い様に活性化されたアガロ−スゲμビー
ズ、例えばアフイゲ／ｌ／−１０（バイオツド社製）な
どが以下に述べる様な方法で好都合に用いられる。アフ
イゲｐ−１０と抗体との反応は、０．００１〜ＩＭ、好
ましくは０．１Ｍのバイカーボネート等の緩衝液中で反
応を行なう。反応条件は０８〜２０℃、１０分〜２４時
間、揺々のｐＨが可能であるが、好ましくは４℃、４時
間＋ｐＨ３〜１０の条件が用いられる。混合するアフイ
ゲ／ｌ／−１０と抗体の量比は、アフイゲＩＶ　１　ｗ
ｅに対し抗体量が約５０１ｑ位迄は多ければ多い程多く
の抗体がつくので、この範囲内でいくらでもよいが、結
合効率およびアフイニテイカラムクロマトグフフィーに
おけるＭ製動率を考慮して１０〜３０ｑの抗体が好都合
に用いられる。この様にしてできた抗体−担体結合物は
、反応に用いた緩衝液でよく洗った後、数日放置するか
、もしくは最終濃度０．０５Ｍのエタノールアミン・塩
酸を加え４°Ｃで１時間反応させる等の方法によシ、残
存する未反応の活性基金ブロックした後、適切なカラム
につめることによシ、抗体カラムとして使用できる。

上記した抗体力ツムで精製するに際しては、たとえばヒ
ト免疫インター　フェロン蛋白質含有資料を中性附近の
緩衝液、たとえばリン酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に
溶解して抗体カラムに吸着させる。次にカラムを同じ緩
衝液で洗浄したのち、工’ＩＰＨ−γを溶出する。溶出
液としては、例えばグアニジン塩（塩酸塩、硫酸塩など
）や尿素等のたん白変性剤を含む溶液、チオシアン化カ
リなどカオトロピックイオンを含む溶液１弱酸性溶液た
とえば酢酸溶液、ポリエチレングリコールを含む溶液、
資料にくらべ抗体に、より結合し易いペプチドを含む溶
液、高濃度塩溶液などおよびこれらの組み合せた溶液な
どが用いられ、ヒトＴＦＨ−Ｔの分解をあまシ促進しな
いものが好ましい。

カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。

必要によフ再度上記の抗体カラムによる精製操作を行な
うことができる。

ここで得られるヒトエＦＮ−γ蛋白質溶液は透析に付し
、必要によシこれを凍結乾燥によシ粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソμピトー／ｌ’、マンニ
ドーｐ、デキストロース、マμドース、グリ七ロールな
どの安定剤を加えることができる。

該抗体力ツムを用いれば、工ＦＮ−γをコードする塩基
配列を含有する形質転換体等を用いる工ＦＮ−γを製造
、精製する際に生成するＣ末端部分を欠いた１５に、１
６に、１７にスピーシーズなど各種工ＦＮ−１７フグメ
ントやこれらフラグメントを複数含有する組成物〔カポ
ン、　Ｄ、Ｊ、ら。

第３回　アニュア〜　インターナシ璽ナル　コンブレス
　７オア　インターフェロン　リサーチ（１９８２）、
マイアミ、フロリダ；米国特許出願第５３４，０３８号
（出願日、１９８３年９月２０日）明ｉ書および米国特
許出願第５３３，８７６号（出願日、１９８３年９月２
０日）明細書参照〕の精製も有利に実施することができ
る。

本発明のポリペプチド（Ｉ）は、ヒトエＦＮ−γアミノ
酸配列のＮ末端側に存在するシスティンを含有しないも
のである。したがって、当該ペプチドを用いた免疫処理
によシ製造されるモノクローナル抗体は、システィンに
対する認識能を有しないことを特徴とするものである。

そもそも工ＦＮ−γは通常の存在状態では、１位のシス
ティンおよび３位のシスティンにょｐｓ−８結合で多量
化しているので、システィンに対する認識能を有するモ
ノクローナル抗体のこの能力はかかる工ＦＮ−γの精製
、検出には寄与し得ない。

本発明のモノクローナル抗体は、かかる不要な結合能を
有しないものであシ、この特性のために、有利に工ＦＮ
−γ単量体、多量体および工ＦＮ−γのＣ末端部を欠く
各種７フグメントの精製、検出に用いることができる。

すなわち同時に混存する他のシスティン含有蛋白質や蛋
白分解物と結合しないため、上記の精製、検出において
、正確、有利に使用することができる。

本願明細豊中記載したウィルス活性測定は、ヒト羊膜由
来ｗ工ＳＨＭｆＵ胞に対する水泡性ロ内炎つイμス（Ｖ
ＳＶ）の細胞変性効果阻止試験によった。

なおここで工ＦＨの活性としてのＵ　／　ｍｅ　（ユニ
ッ）　／　ｍｅ　）の出し方は以下の様に行った。ユニ
ットの確定した国際榛準工ＦＮ−αと白血球由来の粗工
ＦＮ−γをヒト羊膜由来ＦＬ細胞株に対するｖｓｖｏ細
胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その力価の比較か
ら白血球由来粗工］ｉ’Ｎ−γの力価を決定し工ＦＮ−
γの標準品とした。目的とする資料中の工ＦＮ−γの力
価算定のためには、常にこの標準工ＦＮ−γを並べて前
述のＷＩＳＥｔ−ｖＳｖの系でアッセイを行い、その比
率から力価を算出した。

また本願明細書ウニＦＨ−γのＣ末端部分を欠くフラグ
メントとは、例えば成熟型工Ｅ’Ｎ−γ分子のＮ末端ア
ミノ酸から１３１番目までのアミノ酸残基を含み１３２
番目以降のいずれかの部分で切断された前記の１５ｘ、
１６におよび１７にスビシーズやその他各種のポリペプ
チドを意味する。

本願明細書において、アミノ酸、ペプチド、ｔＳ護基、
活性基、その他に関し略号で表示する場合、それらは工
ＵＰＡＣ−工Ｕ　Ｂ　（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる
略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので
あシ、その例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し
光学異性体があシうる場合は、特に明示しなければＬ体
を示すものとする。

ＤＮＡ　：　デオキシリボ核酸 Ａ　：　デオキシアデニル酸 Ｔ　：　チミジμ酸 Ｇ　：　デオキシグアニル酸 Ｃ：　デオキシシチジμ酸 ＲＮＡ　、　リボ核酸 ｄＡＴＰ、　デオキシアデノシン玉リン酸ｄＴＴＰ：　
チミジン三リン酸 ｄＧ’Ｉ’Ｐ　：　デオキシグアノシン三リン酸ｄｃＴ
Ｐ：　デオキシシチジン三リン酸ＡＴＰ、　アデノシン
三リン酸 ＢＤＴＡ：　エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ：　ドデシル硫酸ナトリウム Ｌｙｓ　：　リジン Ａｓｐ　：　アスパツギン酸 Ａｅｎ　：　アスパラギン Ｇｌｕ　：　グルタミン酸 ＜Ｇｌｕ：　ピログルタミン酸 Ｇｌｎ　ニ　グルタミン Ｐｒｏ　＝　グロリン Ｈ１日：　ヒスチジン Ｇ１７　：　グリシン Ａｌａ　：　アラニン Ｖａｌ　：　バリン Ｌｅｕ　：　ロイ７ン Ｓｅｒ　：　セリン Ｔｙｒ　ニ　チロシン Ｐｈｅ　：　フェ二μアフ二ン ２　：　力μボベンゾキン ＢｏＣ：ｔ−プトキシカ〜ポニμ ０Ｂｕｔ：　ｔ−ブチルエステμ ０Ｂｚｌ　：　ベンジルエステμ ＯＮＢ：　Ｎ−ヒドロキＶ−５−ツルボｐネン−２，３
−ジカルボキシイミドエステルＤＣＣ：　Ｎ、Ｎ’−ジ
シクロへキシｐカμポジイミド Ｗ８ＣＤ−ＨＣＩ：　Ｉ　−：ｒ−ｆ／Ｌ／−３−（３
−ジメチＡ／７ミ／グロピＡ／）力μポジイミド・塩酸
塩 ＨＯＮＢ二　Ｎ−ヒドロキシ−５−ノμホルネン−２，
３−シカμボキシイミド １１０Ｂｔ：　Ｍ−ヒドロキシベンゾトリアゾールＤＣ
ＨＡ：、Ｓ）シクロヘキシルアミンＤＭＦ：　Ｎ、Ｎ−
ジメチμホμムアミド以下、実施例および参考例によ多
本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制
限される覗のではない。

な訃夾施例において開示するマウス　Ｂ　ハイプリドー
マｗｉｒ　２−７６．５３は、パス”／−、ｙ研究所〔
７フンス国パリ〕のＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託番号宛■−
２５７として寄託されている。

以下の実施例において、薄層クロマトグツフィーは、メ
μり社製シリカゲルプレート６０　Ｆ２５４を用い、下
記の展開溶媒を用いた。

Ｒｆｌ：クロロホルム：メタノー／Ｉ／：酢酸＝９：１
：０．５ Ｒｆ２：　りｖｘａｙｙｖｈ：ｉｐノー）ｖ：水−７：
　３：０．５ Ｒｆ３：　ｎ−ゲタノー／Ｉ／：ピリジン：酢酸：水＝
３０：２０７６：２４ Ｒｆ’　：酢酸エチ／Ｌ／　：　１１−ブタ／−／ｌ’
：ｉＮ酸：水−１：　１　：　１：１ 実施例１ （１）　Ｚ−Ａｅｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ　の製
造Ｚ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ８　ｆをメタノ−／ｌ／　５０
０　ｍｌに溶解し、パラジウム黒を触媒として還元した
く以下の接触還元もすべてパラジウム黒を触媒としな〕
。

触媒をろ去し、溶媒を留去した残留物を、Ｚ−Ａｌａ−
ＯＨ５，７ｇ、ＨＯＮＢ　６．５Ｆとともに酢酸エチμ
とジオキサン（１，：、１）の混合溶媒３００ｍ１に溶
解し、水冷下にＤＣＣ６，８ｆｔ加え、４時間攪拌し、
さらに室温で１２時間攪拌した。析出物をろ去し、溶媒
を留去した残留物を酢酸エチル３００ｇ／に溶解し、５
％ＨａＨＣｏｙ、水、０．２ＦＭＣＩ、水で洗い無水硫
酸ナトリウムで乾燥したのち、溶媒を留去し念。残留物
をメタノ−／ｌ’４００ｔｓｌに溶解し、先と同様に還
元し、Ｚ−Ａｓｎ−０１（８、Ｏｆ　、ＨＯＮＢ　８．
１Ｆと共にＤＭＦ２００ｇＩＩｔに溶解した。水冷下に
ＤＣＣ６，８Ｆを加え、０°Ｃ１４時間、室温１６時間
攪拌した。析出物をろ去し、収量＆、１（６６，３％）
Ｒｆｏ、５２融点　１８９−１９０°Ｃ 〔α）ｉ５−２９．８°　（Ｃ−０，３２，メタノール
） 元素分析　Ｃ２１Ｈ３００７”４　として計算値：　ｃ
、５５．９９；　ａ、６．７１；　Ｎ、１２．４４分析
値：　ｃ、５５．９５；　Ｈ，６，７８；　Ｎ、１２．
４３（ｉ　）　Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
ＯＢｕｔ　の製造Ｚ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕ
ｔ４．１ｆ’ｉＤＭＦ’２００ｍ１に溶解し、接触還元
した。触媒をろ去した溶液にＺ−Ｐｈｅ−ＯＨ３，３ｆ
　、　ＨＯＮＢ　２．４　ｆを加え、さらに冷却下にＤ
ＣＣ２，５ｆｆ加え０℃で４時間、室温で１２時間かき
まぜた。析出物をろ去し、溶媒を留去した残留物をアセ
トニトリμとメタノールから結晶化し、さらにメタノー
ルで再結晶した。

収量３．８２ｇ（６８，５％）ＲｆｌＱ、５６融点　２
１０−２１２℃（分解） ｃ　ａ　〕３５−２８．９°（ｃ＝０．３７．メタノ−
／Ｉ／）元素分析　Ｃ３ｏＨ３９０８Ｈ５として計算値
：　ｃ、６０，２９；　Ｈ，６，５８；　Ｎ、１１．７
２分析値：　Ｃ，５９，９８；　ｎ、６．３９；　１ｆ
、１１．７３（Ｉｔ　）　Ｚ−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ａ１．ａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ３．６１ｆをＤＭＦ２
００ｇ／に溶解し接触還元した。触媒をろ去した溶液に
、Ｚ−’Ｉ’ｙｒ−ＯＨ（Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＨ−ＤＣＨＡ
　３　、７Ｆよシ調製）、ＨＯＮＢ　＋、５２Ｆを加え
、冷却下にＤｅｃｌ、７Ｆを加え０℃で４時間、室温で
１２時間反応した。不溶物をろ去し溶媒を留去した残留
物にアセトニトリμを加え結晶化し、メタノ−μよシ再
結晶した。

収量３．７２ｆＩ（７３，８％）Ｒｆｌｏ、３８融点　
２４２−２４３℃（分解） ｃ　ａ　）２５−３４．７°（ｃ−０、２８、メタノ−
／Ｉ／）元素分析　Ｃ３９Ｈ４８０□。Ｈ６として計算
値二〇、６１．５６；　Ｈ，ｆｉ、ａ１３ｉ　Ｎ、１１
．０５分析値：　ｃ、６１．２９；　Ｈ＋６．１９；　
Ｎ、ＩＯ，８６（ｌｖ　）　Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−Ｔ
７ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ　−０Ｂｕｔの
製造 Ｚ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ’１ａ−Ｇｌｙ−ＯＢ
ｕ　１．９ｇをＤＭＦ１００ゴに溶解し接触還元した。

触Ｖ＆をろ去した溶液にＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−ＯＨ１
，０５Ｖ　、１ｉＯＮＢ　６４４ダを加え、冷却下にＤ
Ｃ０６５２岬を加え、０℃で４時間、室温で１２時間攪
拌した。不溶物をろ去し、溶媒を留去した残留物にアセ
トニ）すμを加え結晶化し、メタノールよシ再結晶した
。

収Ｊｉ１．９Ｆ（７６，９％）Ｒｆｌｏ、３９融点　２
１３℃（分解） ５ 〔α都　−３４，２°（ｃ＝０．４０．　メタノ−／Ｉ
／）元素分析　Ｃ５０Ｈ６８０１３Ｎ８　”　Ｔ　”２
０　として計算値：　ｃ、６０．１６；　ａ、６．９７
；　ｎ、１１．２３分析値：　Ｃ，６０，２６ｉ　Ｈ＋
６．８３；　Ｎ、１０．７９（Ｖ　）　Ｚ−Ｌｙｅ（Ｂ
ｏａ）−Ｌｙｅ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ　Ａｅｎ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔ　Ｌ７）製造Ｚ−Ｌｙｅ　（
Ｂｏｃ　）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−ＯＢｕｔｌ、８ｆ！をＤＭＦ１００ｙ／に溶解し接触
還元した。

触１ｔ−６去した溶液にＺ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−ＯＨ７
６２’ｊ’とＨｏｗＢ４３３＃を加え、冷却下にＤｅｃ
４５４１１ｇを加え、Ｏ”Ｃ１４時間、室温で１２時間
攪拌した。不溶物をろ去し溶謀金留去した残留物にアセ
トニトリμを加え粉末としてろ取し、メタノ−μで洗っ
た。

収量１．８２ｆ（８２，２％）Ｒｆｌｏ、４１融点　〉
２５０°Ｃ Ｃｅｔ　）、”−２６，０°（ｃ−０，３０，）ＩＩ／
−）Ｖ）元素分析　Ｃ６，Ｈ８８０□６Ｎｌｏとして計
算値：Ｃ９６０，１８；　Ｈ，７，２９＋　Ｎ、１１．
５１分析値：　ｃ、５９．９５；　ａ、７．２８；　ｉ
、１１．１９（ｖｌ　）　Ｂｏａ−Ａａｎ−Ｌｅｕ−Ｏ
ＢＺＩ　の製造Ｈ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ・ｐＴｓＯＨ７、
８７ｆ　＋　Ｂｏａ−Ａｓｎ−ＯＨ４，６４ｇ、ｕｏｉ
Ｂ　５．４１　）リエチルアミン３ｇ？をＤＭｒ３００
ｇｌに溶解し冷却下にＤＣＣ４，５４ｆを加え、０°Ｃ
で４時間、室温で８時間かきまぜた。析出物をろ去し溶
媒を留去して得られた残留物を酢酸エチ１５００ｍｌに
溶解し、５％’−ＨａＨＣＯ３水、　Ｑ、１ｍ　ＨＣｌ
、水で洗い無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去
し結晶を得、アセトニトリμよシ再結晶した。

収量７．１Ｆ（８１，５％）Ｒｆｌｏ、７６融点　１４
０−１４１℃ 元素分析　Ｃ２２Ｈ３３０６Ｎ３として計算値：　ｃ、
６０．６７；　Ｈ，７，６４；　ｙ、９．６５分析値：
　ｃ、６０．５７＋　ａ、７．３３；　Ｎ、９．２９（
ｖｉ　）　Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−
ＯＢｚ’：Ｌの製造Ｂｏａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ
　４　、３６　ｆ　ｆ　トリフルオロ酢酸３００１１ｔ
に溶解し、１０分後に溶媒を留去して得られた残留物に
エーテμを加えろ取した。乾燥ののち酢酸エチルとジオ
キサン（１：１）の混合溶媒２００　ｍｌに溶解し、ト
リエチルアミン１．５ばて中和した。この溶液にＺ−Ｇ
ｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＮＢ（Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−
０Ｈ−ＤＣＨＡ　５．２ｆよシ調製したＺ−Ｇｌｕ（Ｏ
Ｂｕｔ）−ＯＨ，ＨＯＮＢ　２　、１６ｆ　、　ＤＣＣ
２，２７ｆよシ合成）ｔ−加え２０時間攪拌した。

溶媒を留去したのち酢酸エチμ３００ｇ１に抽出し５％
　ＮａＨＣＯ３水、　Ｑ　、　２Ｎ　ＨＣｌ、水で洗い
無水硫酸す【リウムで乾燥しな。溶媒を留去し残留物に
アセトニトリ／ｌ／を加えろ取した。

収量５．１Ｆ（７８，０％）ＲｆｌＯ，７７融点　１７
６−１７８°Ｃ ｃ　ａ　）ｉ５−Ｂ２．ｓｏ（ｃ−０，３１，メタノ−
μ）元素分析　Ｃ３４Ｈ４６０Ｑ　１４　として計算値
：　ｃ、６２．３７；　Ｌ７．０８＋　Ｎ、８．５６分
析値：　ｃ、６２．６８＋　Ｈ，７，３５；　Ｎ、８．
３９（Ｖｌｉ　）　Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌ　４　．６　ｆ　をメタノ−
／’２００ｇ？と酢酸１００ｍ１Ｏ混合溶ａＫ　溶Ｍし
接触還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残留物をト
リエチルアミン１．１ｇ／と共に５０％含水ＤＭＦ　９
００ｓｒ／に溶解し、Ｚ−Ａｌａ−ＯＮＢ（Ｚ−Ａｌａ
−ｏｎ　１．８８ｇ、ＨＯＮＢ　１．８２ｆ、Ｄｃｃ　
１．９１ｆよ多合成）を加え攪拌した。１６時間後溶媒
を留去し残留物に酢酸エチルとアセトニトリ！各１００
ｇ？を加えて粉末としてろ取し、アセトニトリμで洗っ
た。

収量３．７８ｆ（８４，６％）Ｒｆｌ　０．＋８融点　
２１３−２１４℃（分解） 〔α）２５−３９．１６（Ｑ−０，４６，メタノ−／Ｌ
／）元素分析　Ｃ３ｏＨ４゜０□。Ｈ５として計算値：
　ｃ、５６．６８；■、７．１４ｉ　Ｎ、１１．０２分
析値：ｃ、５６．７５；　Ｈ，７，１８；　Ｎ、１１．
３１（ｌｘ　）　ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）　−Ａｌａ−
Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造 Ｚ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｅｎ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ３、５ｆをメタノ−／ｌ／３００ｇｔに溶解し、接触
還元した。触媒をろ去し溶媒を留去したのち、トリエチ
ルアミン０−Ｂ２５ｙｔｌと共に５０％含水−ＤＭＦ　
５００ｇ／に溶解し、この溶液にＺ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ
）−ＯＮＢ　（Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ　）−ＯＫ・ＤＣ
ＨＡ　３　、４２　ｆより調製した２−Ｇｌｕ（ＯＢｕ
ｔ）−ＯＫ、　ＨＯＮＢ　１．４３ｆ　、ＤＣＣｌ、５
ｇよシ合成）を加え１６時間攪拌した。溶媒を留去し、
酢酸１　ｔｔｔｔと共にＤＭＦＩ００ｒ？に溶解したの
ち音に濃縮しアセトニトリμを加え結晶化し、アセトニ
トリルよシ再結晶した。

収ｆｉ３．８ｇ（８４，２％）Ｒｆｌｏ、１６融点　２
０９−２１０℃（分解） 〔α）：Ｃ５−３２−１’　（ｃ　”　０．２２　、メ
タノ−μ）元素分析　Ｃ３９Ｈ６００１３Ｈ６として計
ｘｉ　：　Ｃ，５６，０６；　Ｈ，７，３７；　Ｎ、１
０．２４分析値：　Ｃ，５６，３６；　Ｈ，７，５６；
　Ｎ、　９．９４（Ｘ　）Ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ）−Ｇｌ
ｕ（ＣＩＢｕｔ　）−Ａｌａ７Ｇ１ｕ（ＯＢｕｔ）−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造 Ｚ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）　−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ
）　−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ２，４６ｆｅｐＭｒと酢酸
（１：Ｉ）の混合溶媒３０口ｗｌに溶解し接触還元した
。触媒をろ去し溶媒を留去した残留物を、トリエチルア
ミン１．０ｍｌとともに５０％含水ＤＭＦ　５００ｍ１
に溶解し、ｚ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−０１ｆＢ（Ｚ−Ｌｙ
ｅ（Ｂｏａ）−ＯＨ１、３７１。

ＨｏＮ’ｓ　７７ＢＭｆ　、ＤＣＣ８１７９！Ｌ１２；
）ｋｍえ１６時間反応した。溶媒を留去したのち１０％
酢酸含有ＤＭＦ２００ｇｌに溶解し不溶物をろ去したの
ち溶媒を再び留去した。残留物にアセトニトリルを加え
ろ過し、メタノ−μと水から再結晶した。収量２．（１
（６３，５％）Ｒｆｌｏ、＋６融点　２２７”Ｏ（分解
） 〔α〕ζ５−３２．５°（ｃ−０，３１，メタノ−μ）
元素分析　Ｃ３０Ｈ８００１６’８　’士＆２０　とし
て計算値：　Ｃ，５６，７５ｉ　Ｈ，７，７２ｉ　Ｎ、
１０．５９分析値：　ｃ、５６．８３；　Ｌ７．５６＋
　ａ、１０．５６（ｘｉ　）Ｚ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ（Ｂｏ
ａ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ
）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造Ｚ−Ｌｙｅ（Ｂｏｃ）
−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）　−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨｌ　、　９５　ｆ　（ｉｌ”　
Ｄ　Ｍ　Ｆと酢酸（１：　１）の混合溶媒３００ｒｘｌ
に溶解し接触還元した。触媒をろ去し溶媒を留去した残
留物をトリエチルアミン０．６ｔｘｌと共に１０％−含
水ＤＭＦ　３００Ｈｌに溶解し、Ｚ−Ｖ’ａ１−ＯＮＢ
　（Ｚ−Ｖａｌ−ＯＨ５６０岬、　ＨＯＮＢ４８２ｖ１
ｇ、ＤＣＣ５０６ｑより合成）を加え１６時間攪拌した
。溶媒を留去し残留物を１０％酢酸含有ＤＭＦ２００ｉ
ｔに溶解し不溶物をろ去したのち溶媒を留去した。残留
物にアセトニドｖｙｖを加えろ取し、メタノ−々と水か
ら再沈殿した。

収量１．５５Ｆ（７２，８％）Ｒｆｌｏ、１６融点　２
３７−２３９°Ｃ（分解） Ｃａ　）２５−３４．１°（ｃ−０，４５，メタノ−／
Ｉ／）元素分析　Ｃ５５Ｈ８９０１７Ｈ９として計算値
：　ｃ、５７．５２；　ａ、？、８１；　Ｎ、ＩＯ，９
８分析値：　ｃ、５７．３４；　Ｈ，７，８７；　ｍ、
１０．８７（ｘｌｌ　）　Ｚ−Ｔｙｒ−４ａｌ−Ｌｙｓ
（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｌａ　−Ｇｌｕ（
ＯＢｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨの製造Ｚ−Ｖａｌ−
Ｌｙｓ　（Ｂｏａ　）−Ｇｌｕ（０Ｂｕｔ）−Ａｌａ−
Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ１、３６ｆ
を酢酸１００＊／に溶解し接触還元した。触ｔＩＸをろ
去し溶媒を留去した残留物をトリエチルアミン０．３６
ｇ／とともにＤＭＦ３５０ｄに溶解し、この溶液にＺ−
Ｔｙｒ−ＯＮＢ　（Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＲ−ＤＣＨＡ　７７
５　ｗｌよりｇ製したＺ−Ｔｙｒ　ＯＨ＋ＨＯＨＢ　３
３７Ｉｖ、ＤＣＣ３５４”Ｆよシ合成）を加え１６時間
撹拌した。溶媒を留去し、１０％酢酸含有ＤＭＦ２００
ｔ／に溶解し不溶物をろ去し念のち再び溶媒を留去した
。残留物にアセトニトリｌｖｔ加えろ取し、メタノ−μ
と水から再沈殿した。

収量１．２１Ｆ（７６，９％）　Ｒｆｌｏ、１＋融点　
２３５−２３７℃（分解） ２５　。

〔α）Ｄ　−２６−２（ｃ＝０−３４．メｌ’／−ＩＶ
）元素分析　Ｃ６４１９Ｂ　０１９　ＮＩＯとして計算
値：　Ｃ，５Ｂ、６１；　）１，７．５３；　ｍ、１０
．６８分析値：　ｃ、５Ｂ、４５；　Ｈ＋７．８５；　
Ｎ、ＩＯ，９０（ｘｌ　）　Ｚ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙ
ｓ（Ｂｏａ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）　−Ａｌａ−Ｇｌｕ
（０Ｂｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ　）
−Ｌｙｅ　（Ｂｏａ　）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｕｔの製造Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−ＯＢｕｔ６０９　＃ｔ−ＤＭＦ　５　Ｑ　ｍｅに溶解
し接触還元した。触媒をろ去した溶液ｌにＺ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ　）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ　）
−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−０１
（６５６Ｉｖ、　ＨＯＢｔ　２９７４を加え溶解し、氷
−食塩浴中で冷却した。冷却下ＷＳＣＤ−ＨＣ１２１１
ダ、トリエチルアミン０．１６ｍ１を加え４°Ｃの低温
室で４８時間攪拌した。溶媒を留去し、析出物にアセト
ニトリμと酢酸エチρとエーテル（１：　−１：　１　
）の混合浴［を加えろ取した。

収量０．８Ｆ（６７，３％）Ｒｆ２０．６８融点　〉２
５０℃ ＣｔＺ）ｉ５＋１．９°（ｃ＝０．１１．　、ＤＭＦ　
）元素分析　Ｃ１：Ｌ７Ｈ１７８０３２Ｎ２０として計
算値：　ｃ、５９．１２；　Ｈ，７，５５；腕、１１．
７９分析値：　Ｃ，５９，０８；　ａ、７．４０＋　Ｎ
、ｌ＋、５゜（ＸＩＶ）　Ｂｏａ−Ｇ］、ｎ−Ａｓｐ（
ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−ＯＨの製造Ｂｏａ−Ａｓｐ（ＯＢ
ｚｌ）−Ｐｒｏ−ＯＨ−ＤＣＨＡ　３．Ｏ７ｆよシ調製
したＢｏｃ−Ａ８ｐ（ＯＢＺＩ）−Ｐｒｏ−ＯＨをトリ
フ矧１酢酸３０ｍ１に溶解し１０分後に溶媒を留去する
。

６Ｎ塩酸−ジオキサン“１　ｗｅを加えよくかきまぜた
のちエーテ／Ｌ’を加え沈殿を得、ろ取した。乾燥した
のち、トリエチルアミン１．５１１１と共にＤＭＦｉ０
０＊／に溶解し、この溶液にＢｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＮＢ（
Ｂｏａ　−Ｇｌｎ−ＯＨ１、５ｇ、　ＨＯＮＢ　１．３
Ｆ　、ＤＣＣｌ、３６Ｆより合成）を加え２０時間攪拌
した。

溶媒を留去し残留物にエーテルと５％Ｈａ　ＨＣＯ３水
各１０ロゴを加え溶解し、水層を冷却下ＩＮ　ＨＣＩで
ＰＨ２とし酢酸エチ１Ｖ２００．ｔｇｌで抽出し、水洗
したのち乾燥した。溶媒を留去し残留物をアセトニトリ
μよυ結晶化し、同じ溶媒で再結晶した。

収量１．２９Ｆ（４６，９％）Ｒｆｌｏ、２３融点　＋
２９−１３０℃ 〔αイ５−５７．５°（ｃ＝０．４２．メタノ−μ）元
素分析　Ｃ２６Ｈ３６０９Ｎ４　とシテ計算値：　Ｃ！
、５６．９２；　Ｈ，６，６１；　Ｎ、１０．２１分析
値：　Ｃ，５６，８０；　Ｈ，６，４５；　ａ、１０．
０１（ＸＶ）４Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−ＯＰＬの製造 Ｚ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ　（Ｂｏ　ｃ　）　−Ｇｌ
ｕ　（０Ｂｕｔ）　−Ａｌａ−Ｇｌｕ（０Ｂｕｔ）−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　（Ｂｏｃ　）−Ｌｙｓ　（Ｂｏ
ａ　）−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
ＯＢｕｔｌ　７５ｅｌｆを１０％含水ＤＭＦ３００＊ｊ
に溶解し接触還元した。触媒をろ去し、溶媒を留去した
残留物をＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｐｒｏ
−ＯＨ６’１ｔＨｆ　、　ＨＯＢ　ｔ　４９’ｌと共に
Ｎ−メチルピロリドン１０ゴに溶解し、冷却下にＷＳＣ
Ｄ−ＨＣＩ　３４ｙｌｔ　、）リエチμアミン０．０３
１を加え２０時間反応した。溶媒を留去し残留物に水を
加え沈殿を得、ろ取乾燥した。収量１４５Ｉｆ（６９，
０％）　これを５％−含水トリフルオロ酢酸１５ｇ＋？
に溶解し室温で６０分装いたのち溶媒を留去し２０％含
水酢酸５０ｗ１に溶解し接触還元した。触媒をろ去し溶
媒を留去し念残留物を水２００ｍＫ溶解し、２８％７：
／モーフ水１ＯＮｌｆ：加え３０分静置し、溶ｔｓを留
去し酢酸ｅ性にし凍結乾燥した。これを５Ｎ酢酸１ｙｉ
ｌに溶解し、同じ溶媒で充填したセファデックスＬＨ−
２０（２Ｘ８５１）のカラムに付し展開した。６７〜９
６．４ｘｔの区分を集め凍結乾燥した。これをざらにＴ
ｓＫ−Ｌ８−４１０のカラム（２，１４Ｘ７．５国＋２
．１４ｘ３０ｃｍ）を用いるＨＰＬＣで！！７１！！！
！！シ目的物を得た。収量３６Ｗ（３５，３％） ｕｆ３０．２７．　Ｒｆ’　０．１８ （Ｃ１”Ｊ？）６−５９．８６（ｃ−０，１７，０，ｌ
Ｎ−＃−酸）アミノ酸分析：　Ｌｙｓ　２−９４（３）
、　Ａｒ＋ｐ　’３．０５（３）。

Ｇｌｕ　３．１Ｈ３）、　Ｐｒｏ　０．９５（１）、　
Ｇｌｙ　１．０（１）。

Ａｌａ　１．９７（２）、　Ｖａｌ　０．８８（１）、
　Ｌｅｕ　Ｏ，９９（１）。

Ｔｙｒ　１．６２（２）、　Ｐｈｅ　Ｏ，９８（１）（
平均回収率６８．１％） 実施例２　免疫原の調製 実施例１で得られた工ＦＮ−γＮ末（４−２１）ペプチ
ド（以下工ＦＮ−γＮｐ）とウシサイログロブリン（以
下ＴＧ）の結合は、ガロインドらの方法に準じて行な−
った〔ホルモンメタポリツクリサーチ、８，２４１　（
１９７６）　）。即ち１ＦＮ−γＮＰ　２．５３ηをＴ
Ｇ　３．８１ツと混合し、２阿どの２００ｍＭの７オス
７エートバツフｙ　’ｃｌＪＩＩ工、氷水中でよく攪拌
した。これに蒸留水で２．５％濃度になるよう希釈した
グμター〃アμデハイド２００μｅを、１滴ずつゆっく
シと加えた後、３時間氷水中で攪拌しながら反応させた
。反応後、蒸留水で透析を充分に行ない、凍結乾燥を行
なって免疫原とした。

なお、ｍ製されたｒ工ＦＮ−γは特願昭５８−１７６０
９１号明和嘗記載の方法に準じて作製した。

実施例３　免疫 実施例２で得たｒ工ＦＮ−γを、タンパク量として３０
Ｆｇ、フロイントコンプリートアジュバント（ＦＣＡ）
とよく混合し、Ｔ〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウヌの皮
下に接種した（初回接種）。初回接種の２週後、同量の
ｒＩｒ賃￥’７０インドインコンプリートアジュバント
（Ｆ工Ａンとよく混合し、皮下に接種した（二次接種）
。三次・四次接種は２週間隔で二次接種と同じ方法で行
なった。

五次、六次接種は、実施例２で得た工ＦＮ−γＨｐ−Ｔ
Ｇ結合物をタンパク量として３０Ｆｇ、Ｆ工Ａとよく混
合し、皮下に２週間隔て接種した。六次接種の二週後、
ｒ工ＦＮ−γ２５μｇ　、工ＦＮ−ＩＮＸ’−’ｌｌ’
Ｇ結金物２０μｇを０．５ｄの生理食塩水に浮遊させ、
静脈内に最終免疫を行なった。

実施例４　ＥＬ工ＳＡ法を用いた抗体アッセイ法実施例
３の方法で免疫したマウス血清あるいは実施例５で得ら
れるハイブリドーマ培養上清中の抗体活性はエンザイム
　リンクド　イムノソーベント　アッセイ（ＥＬ工ＳＡ
）法を用いて栓塞した。

即ち、実施例２で記載のｒＩＦＮ−７またはＩＦＮ−γ
ＮＰを１５μｇ、／ｗｅになるよう０．１Ｍ重次酸ナト
リウムを含有したリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浮遊さ
せ、９６ウエμマイクロプレートの各ウニμに１００μ
θずつ分注し、４°Ｃで２４時間反応させた。反応後、
ウニμの余剰の結合部位をふ式ぐため２％牛血清アμプ
ミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を１００μβずつ分注
し、４°Ｃで２４時間処理し、ＥＬ工ＳＡに使用するプ
レートを作製した。

以上のように調製したプレートに血清あるいはハイグリ
ドーマ培養上清１００μｌ’ｒ加え、２４℃で３時間反
応させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラ
ディシュペμオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスイ
ムノグロブリン抗体を各ウェルに１００μｌ加え、室温
で３時１ｍ１反応させ念。反応終了後、各ウニ〃をリン
酸ＩＷ衝液でよく洗浄し、１ｒＪｔｌの０．１Ｍクエン
酸緩衝液に２２岬のオルソフェニレンジアミン、１０μ
ｅのＨ２Ｏ２を加えた酵素基質溶液１００μｅを各ウェ
ルに加えて、酵素反応を室温で１５分行ない、４規定硫
酸で反応を停止させた。反応停止後、タイターチックマ
ルチスキャン（７０−社製）を用いて波長４９２ｎｍで
発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。

実施例５　細胞融合および抗体のアッセイ実施例３の最
終免役の３日板マウスの牌ｌｌ＃ｉ′ｔ−摘出し、ヌテ
ンレスメッシュで圧迫、濾過し、イーグμズ・ミニマム
・エッセンシャ〃メディウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、ｎ
ｕｔｌｓｉ胞浮遊液を得た。

細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＥ／Ｃマウス由来
ミエローマ細胞Ｐ３−ｘ６３　、ｈｇＢ、ｒＢ（Ｐ２Ｈ
４）を用いた〔カレント　トピックヌイン　マイクロバ
イオロジー　アンド　イムノロジー、８１ｉ−７，（１
９７８））。細胞融合は、含有脛臓軸胞およびＰ２Ｈ４
をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、牌臓
和胞とＰ３Ｕｌ数の比率を５：１になるよう混合して、
８００回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈殿させた
。

上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポ
リエチレングリコ−／Ｌ／（ＰＥＧ）６０００（コｙ　
ホ７　イ）　社Ｎ　）　ｆ　Ｏ、３ｗｅ　加工、３７°
Ｃｍ水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細
胞に毎分’１ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１２ｇ
１０ｎｇｍを加えた後６００回転１５分間遠心して上清
を除去した。この細胞沈殿物音１０％牛脂児血清を含有
するＲＰＭ工１６４ｏメディウム（ＲＰＭ工１６４０−
１０ＦＣ８）にＰ３Ｕｌが１　ｍｌ当Ｄ２Ｘ　Ｉ　Ｏ個
になるよう浮遊し、２４ｍ１ずつ１２０ウニμに播種し
た。播種後、細胞を３Ｔ″Ｃで５％炭酸ガヌ７フン器中
培養した。２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１ｘｌ
ＯＭ。

アミノプテリン４ＸｌＯＭ、チミジン１．６×５ １０　Ｍ）を含んだＰＲＭ工１６４０−１０　ｙｅｓ培
地（ＩｉＡＴ培地）を１ウニμ当Ｄｊｔｌずつ添加する
ことにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培
養は、培養開始３．５．７日後に旧液をＩＭｔ捨てたあ
と、ｌ＋ｔのＨＡＴ培地を添加することによシ継続した
。ハイプリドーマの増殖は、細胞融合後１０〜１４日で
播種した全ウニμに認められ、培養液が黄変したとき（
約Ｉ　Ｘ　１０６／＋？）、上清を採取し、ｒＩＦＮ−
γをコートしたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法
（実施例４記載）で、抗体の有無を検討した。抗体活性
は、１２０ウニμ中１５ウニμに認められたく第１図）
。

次に、得られたこれら１５ウニρからの抗体のうち、工
ＦＮ−γのＮ末部をｇ識する抗体を選択するため、各々
の上清５０μｅ　と、工ＦＮ−γＮＰネか？ｔ　Ｔ　Ｉ
Ｆ　ｈｒ−γＣ中ｒｌｌｌ−ＩＡｆ；１ペプ手ド（以下
工ＦＮ−ＴＣＰ）Ｃ特願昭５８−１７６０９１号（出願
日、昭和５８年９月２２日）明細書参照〕をそれぞれ２
０μｇ、／１ｔｒｌに調製したもの５０μｅとを混合し
、３７℃で１時間反応させた後、この混合液中の抗体価
を、上記のＥＬＩＳＡ法で検討した。なお対照は工ＦＮ
−γＮＦまたは工ＦＮ−ＴＣＰ溶液の代シにＨＡＴ培地
を用いた。この実験でもし、抗体が工ＦＮ−γＮ末部を
認識するものならば、■ＦＮ−γＨＦにより抗体の活性
基がマスクされ、マイクロプレート上のｒ工ＦＮ−γに
結合しない筈である。結果は、１５ウニμ中いくつかの
ウェルの抗体のｒ工ＦＮ−γへの結合が工ＦＮ−γＮＰ
によって阻害されることが分シ、このうちＷＮ、２−７
６では著量に抑制式れた。また対照として用いた工ＦＮ
−ＴＣ末部を認識するγ３−１１．１モノクローナμ抗
体〔特願昭５８−１７６０９１号（出願日、昭和５８年
９月２２日）明細書参照〕は、工ＦＮ−γｃｐによシ著
量に抑制された（第１表）。

第１表 ハイプリドーマ培養上清中の各抗体の 認識部位の特異性 なお、ｒ工Ｆ４−γ単独で過免疫したマウスの牌臓細胞
を用いた融合実験からは、工ＦＮ−γＮＰに結合し、か
つｒ工ＦＮ−γに結合する抗体を産生ずるハイプリドー
マを得ることができなかった。

実施例６　クローニング 実施例５で得られたＷＮ−ｒ２−７６ハイプリドーマを
、限界希釈法によシクローニングを行なった。即ち、ハ
イプリドーマが２個／　ｔｘｌになるようＲＰＭニー２
０ＦＣ８に浮遊させ、９６大マイクロプレート（ヌンク
社製）に１ウニμｌ）、０．１１ずつ分注した。分注す
る際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウヌの胸腺
細胞をウニμ当ｐ５Ｘ１０　個になるように加えた。こ
のようにして、約２週間後には細胞の増殖が認められる
ようになシ、上清を採取して、抗体の有無を実施例４記
載のＥＬ工８Ａ法で調べた。その結果、得られた７１ク
ローン中１０クローンに抗体活性を認め、これらの抗体
全てが、ｒ工ＦＮ−γおよび工ＦＮ−γＮＦを認識する
ことが分った（第２図）。

ｍ鎗桐７　波汰畠ルハノプＩＩ　Ｋ−マの噌素／ト’ｍ
　ｒび腹水からの抗体精製 クローニングによって得られたマウス　Ｂ　ハイプリド
ーマＷＮγ２−７６．５３Ｍ胞Ｉ　Ｘ　１０６個を、あ
らかじめ０．５ゴのミネラルオイ／Ｌ’を腹腔内に投与
しておいたＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に接種すること
によシ腹水化を行なった。ハイプリドーマ全腹腔に投与
して１０日後、腹水を採取した。得られた腹水７メｌか
ら、ステーリンら〔ジャーナμ　オプ　バイオロジカル
ケミストリー、２５６．９７５０−９７５４．（１９８
１））の方法に準じてモノクローナμ抗体を精製した。

まず腹水からフィブリン様物質を除去するため１０．０
００回転１５分間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水Ｃ
Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　８　、１　ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４，１
，５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，２，７ｍＭ　ＭＣＩ、　１３
７ｍＭ　Ｎａ１１．　ｐＨ７，２）で２８０ｎｍの紫外
部吸収（Ａ２８ｏ）が１２〜１４の値を示す濃度に希釈
した。希釈後サンプルに飽和硫酸アンモニウム溶液を４
７％の濃度になるように加え、４°Ｃ″′Ｃ攪拌しなが
ら６０分間塩析を行ない、その後遠心（１０，０００回
転。

１５分間）を行なって沈澱物を得た。沈澱物を５０ｍＭ
ＮａＣ１含有２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７，９）に
溶遊し、同溶液２１に対して透析を行なった。２時間後
、２ｅの新しい同じ透析液に換え、さらに１５時間透析
を行なった。透析後、沈澱を除去するため１０，０００
回転１５分間遠心金行ない、上清をＡ２８０の値が２０
〜３０の濃度になるように調整した。このサンプμを充
分量の５０ｍＭ−ＮａＣ１含有トリス緩衡溶液で順化し
た１３ｍ？のＤＥＡＥセルロースカフムカラットマンＤ
Ｅ５２）にかけ、５０ｍＭ　ＮａＣ１含有トリス緩衝溶
液でよく洗った後、５０　ｍＭ　−５００ｍＭ　ＮａＣ
１を含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用いて１．５ｇｔ
１分の流出速度で分画を行なって素通シ分画を濃縮し、
モノクローナル抗体ＷＮγ２−７６．５３を得た。抗体
の純度の確認にはフエムリらの方法ロネイチャー、　２
２７　、６８０−６８５．（１９７０）、）に準じて５
Ｄ８−ポリアクリルアミトゲ／Ｉ／電気泳動を用いた。

すなわち硫安塩析し、ＤＥＡ１ｉｉセμロースカフムで
素通シした分画を、２−メルカプトエタノ−μで還元を
行ない１０％ＳＤＳゲμ。

１８０ポμト、２．５時間泳動を行なった。その結果、
分子量約５２キロダノＶトン前後にＨ鎖、約２８キロダ
ルトン前後にＬ鎖の２つのバンドが認められた（第３図
）。

実施例８　モノクローナル抗体の工Ｆ　Ｎ−γに対する
結合能および中和能 実施例７で精製式れたモノクｐ−すμ抗体ＷＮγ２−７
６．５３が、１ＦＮ−７に結合し、かつ中和する能力が
あるかどうかを次の方法で検討した。

結合能：ウサギ抗マウヌエｇＧ抗体を結合させた３％セ
ルロース溶液５００μｇＫ精製した抗体を５００μｌ（
約２５μＢの抗体含有）加え、４°Ｃで２４時間反応さ
せた。反応後七〃ロースを生理食塩水でよく洗浄し、１
１００　Ｕ／ｌｅｌの工ＦＮ−γを加え、４°Ｃで２４
時間反応ちせ、上清中の１ＦＮ活性を測定した。工ＦＮ
−γサンプρとして、実施例２記載のｒＩＦＮ−γおよ
びヒト末梢血リンパ球ヲコンカナバリンＡ４０μｇ、　
／ｄト１２−〇−テトフデカノイル−ホｐポール−１３
−アセテート１５ｒＩｇ／ｊＩｌで刺激して７２時間後
採取した上清（ｎＩＦＮ−γ）を用いた。また対照とし
て５００μｅの工ＦＮ−Ｚ（ナマρバ細胞をセンダイウ
イルメｌ０ＩＩＡユニットで刺激して４８時間後の培養
上清で５５０ＴＪ／肩／の工ＦＮ−αを含む）　、　５
００１１１１　Ｃｌ１１ｉ’Ｎ−β（リ−−ｔ＜イオモ
レキュフー・リサーチヲポラトリーズ社から購入したも
のｌ１００Ｕ／ｇｔの工１ｉ”Ｎ−ρを含む）を用いた
。ＩＦＮ活性の測定は、マイクログレートを用いた細胞
変性効果（ＣＰＫ）！Ｊ−ディング法で測定したしアブ
フィト　マイクロバイオロジー。

１６．１７０６−１７０７．（１９６８）、ｌ。すなわ
ち、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）全てのウェ
ルに５０μｅのＭＥＭｇ入れ、最初のウニμにＩＦＨサ
ンプμを５０μｅ加えて、連続的に２倍希釈を行なった
。このようにした各ウニ〃に、Ｗ工ＳＲ則胞を２０％Ｆ
Ｃ８含有ｔＥＭに１ｍｌ肖！り４１０５個になるよう調
整した細胞浮遊液５０μｅを加え、２４時間、３７℃、
戻酸ガスフラン器で培養した。培養後、水泡性ロ内炎つ
イμスにュージャーシー株）を２００（ＩＴｃより５０
（ティッシューカμチュアイン７エクテイングドーズ５
０）ＫなるようＭＥＭで調整し、その５０μｇｔ−各々
のウニμに加え、３７°Ｃ９炭酸１ｆ７フフン器内で培
養した。約３５時間後、１１Ｍサンプルを加えていない
ウニρの細胞が１００％ＣＰＥを起こした時点で、各ウ
ニμのＣＰＥｆｔ顕微鏡で観察し、５０％のＣＰＥを起
こしているウニｙの工ＦＮ−サンプμの希釈数の逆数を
もって工ＦＨの力価とした。

中和能二上記の２種のＩＦＮ−γ（ｎＩＦＮ−γ。

ｒＩＦＮ−７）、工ＦＮ−ａおよび工ＦＮ−β（力価は
何れも上記と同じ）それぞれ５００μｅに、Ｍ製した抗
体５００μβ（約２５μｇの抗体含有）を加え、４℃で
２４時間反応させた。反応後反応液中の工ＦＮ活性’１
ｃＰＥリーディング法で測定した。

以上の試験から、ＷＮＮ２２７６．５３モノクロ一ナμ
抗体は、ｒｒＦＭ−７の約９０％＋　ｎ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−
Ｔの約６０％を結合させた（第２表）。また当抗体は、
ｒＩＦＮ−γの約９０％、ｎＩＦＮ−γの約６０％を中
和した（第３表）。一方工ＦＮ−α、βに対しては、結
合能も中和能も示さなかった（第２，３表）。

第３表 実施例９　モノクローナル抗体のサブクラスＷＮγ２−
７６．５３モノクローナル抗体のサブクラスは、実施例
７の方法で精製した抗体とウサギ抗マウスエｇＧｌ、Ｇ
２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ３抗体（マイμス社）との寒天内沈降
反応（イムノロジカルメソッド　ゲμ　ディ７ユージヨ
ンテクニツクブフツクウエμオツクスフオード　１９６
４年）で検討した。結果は、モノクローナル抗体とウサ
ギ抗マワスエｇＧｌ抗体との間に著量な１つのバンドが
認められ、他の抗マウヌＩｇＧ　抗体との間には、バン
ドの形成はみられなかった（第４表）。

従って当モノクローナμ抗体は、■ｇＧｌサブクラスに
属するものであることが判明した。

第４表 実施例１０本発明のモノクローナル抗体を用いたＷＮｒ
２−７６．５３モノクロ一ナμ抗体に対する資料中のＩ
ＦＮ−γと同相に固定されたｒＩＦＮ−γとの競合によ
る定量法 実施例４に記載の方法でｒＩＦＮ−γを結合させ念プＶ
−トに、最大量結合する抗体の約５０％量の抗体を含む
１００μｌの抗体（ｗＮ／２−７６゜５３）溶液と種々
の濃度（７，２８，ｉｌｌ。

４４５．１．８Ｘ１０３．７１０３．２．９Ｘ１０’　
、１ｘｌＯ，４，５Ｘ１０　Ｕ／ば）に調製したｒＩＦ
Ｎ−γを３７°Ｃで１時間反応させた混合液を加え、室
温で３時間反応させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄
し、ホースフディシュベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラ
ベルした抗マウヌエｇＧ抗体を１００μｌ加え室温で反
応させた。

反応終了後、ウェルを生理食塩水でよく洗い、実施例４
記載の方法で酵素反応全行ない色素量をタイターテック
マρチスキャンで定量した。第４図は、その結果を示し
たもので不法を用いることによや、約１０〜５ＸＩ０３
　Ｕ／＊／濃度の工ＦＮ−γが定量可能であった。

（１１）サンドウィッチ法 得られた工ＦＮ−γＮ末端部を認識するモノクローナル
抗体ＷＮγ２−７６．５３と実施例５記載のＩＦＮ−γ
Ｃ末端部を認識するモノクローナル抗体γ３−１１．１
を用いたサンドイツチ法にょる工ＦＮ−γの定量を試み
た。即ち、ＷＮｒ２−７６．５３抗体を１５μｇ／ｌ＋
ｌｌになるよう０．１Ｍ重次酸ナトリウムを含有したリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浮遊させ、この１００μβ
を９６ウエルマイクロプレートの各ウニｐに分注し、４
℃で２４時間反応はせた。反応後、ウニμの余剰の結合
部位をふさぐため２％Ｂ８Ａ含有リン酸緩衝液を１００
μｅずつ分注し、４℃で２４時間処理した。以上のよう
に処理したプレートに、種々の濃度（７，２Ｘ１０３．
１．８Ｘ１０３＋４．５×１０２．１．１Ｘ１０２．２
８，７Ｕ／ｇｉに調製したｒ工ＦＮ−γを加え、室温で
３時間反応させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、
ナカネらの方法〔ザ　ジャーナ！　オグ　ヒヌトケミヌ
トリー　アンド　サイトケミストリー、２２゜１０８４
−１０９１　＋（１９７４））を用いてＨＲＰで’７ベ
／Ｌ／した７３−　＋　ｌ　、ｌ抗体ｋ１００μｆｆ加
え、室温で３時間反応きせた。反応終了後、ウニμを生
理食塩水でよく洗った後、以下実施例４記載と同様の方
法で酵素反応を行ない、色素念をマルチスキャンで定量
した。第５図は、その標準曲線を示したもので、この様
にして工ＦＮ−γの定量が可能であることが判明した。

実施例１１　抗体カラムの調製 実施例γの要領で精製されな素通シ分画のモノクローナ
μ抗体３７ｇｔ（６６Ｗ）を４°Ｃで０．ＩＭ　ＮａＨ
ＣＯ３−０、１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ７，９）に対して
一晩透析を行った。一方、アフイゲＩｖ−１０（バイオ
・フド社）１２ゴをグフスフイμターを用いて充分水洗
を行った後、０　、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，
３）に浮遊させ前記抗体とを混合し、４°Ｃで５時間、
ゆっく９撹拌しながら反応させた。

その後、グフスフイμターを用いてＱ　、ＩＭ　ＮａＴ
ｌＣ０３−Ｑ　、　１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，３）で
よく洗浄した。反応させたゲμに０．１Ｍエタノールア
ミン−０，１５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，０）　ｔ　２５
ｔｔｔｌ加え、４°Ｃ，１時間攪拌し、残存するかも知
れない未反応の活性基をグロックした。その後ゲ／Ｌ／
をＰＢＳでよズ洗浄し、０．１％ＮａＮ３　′ｆ：含む
Ｐ　Ｂ　Ｓ　２５’ｔｘｔＫＩＪ濁り、　４°Ｃで保存
した。加えた抗体量と回収されたろ液中の抗体量から、
ゲ／Ｌ／ｌ　ｍｅ当Ｄ５．ＯＭｙの抗体が結合している
ことが判明した。この様にして得た反応物をカラムに充
め、抗体カラムとして使用した。

実施例１２　本発明のモノクローナル抗体を用いたｒ工
ＦＮ−γの精製 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲＩ　／　ＰＲＫ　２４８　ｃ工ｔｓ
　、ＦＳＲＣ２３１／工ＦＮ−γ　ε特願昭５８−４９
６８１号（出願臼、昭和５８年３月２３日）明細書参照
〕の凍結保存菌体１ｆを７Ｍ塩酸グアニジンを含むａ、
０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７、２）　３ｍ？に懸濁し、
４°Ｃで１時間攪拌した。得られた懸濁液を１０，０Ｏ
ＯＸｆで２０分間遠心分離して上清３屑ｔを得た。得ら
れた上清３ｒｘｌにＯ、ｌ　４Ｍ　Ｎａ（，１および０
．００３Ｍ　ＫＣＩ　を含む０．０１Ｍリン酸Ｍ衝液（
ｐＨ７，４）２０７ｄを加えて上清を希釈した。この希
釈液を１０．０００Ｘｆ　、Ｉ　Ｏ分間遠心分離して不
溶物を除いたのち、実施例１１で得た抗体力ツム（ＷＮ
ｒ２−７６．５３．カラム容積８　ｍｌ　）にかけた。

０．５Ｍ塩酸グアニジンを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７、０）　２４ｇｌでカラムを洗浄した。ついで
、２．０Ｍ塩酸グアニジンを含む０．０２Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）２０ｄでカラムからｒ工Ｆ　ＩＪ−γ
を溶出し、ｒ工ＦＮ−γを含む溶出液１０ゴを得た（蛋
白量５．３り、比活性３．２ＸｌＯ’Ｕ／ｑ）。この溶
出液を８ＤＳ−ポリアクリμアミトゲｆＶ電気泳動にか
けた結果、標品として用いた成熟型ｒ工ＦＮ−７［１８
Ｋｒ工ＦＮ−ｒ；　米国特許出願第５３４０４０号（出
願臼１９８Ｂ年９月２０日）明細書参照〕と同じ移動度
を示す位置に蛋白のバンドが検出された。なお、他に蛋
白のバンドはほとんど認められなかった。

実施例１３　モノクローナμ抗体を用いた＋５ＫｒＩＦ
Ｎ−γの精製 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＲ１／Ｆ）ＲＫ２４８０工ｔｓ＋　ｐ
Ｒｃ２３１／工Ｆ１ｉ−γ工時１ｉ５８−４９６８１号
（出願臼、昭和５８年３月２３日）明細書参照〕の凍結
保存菌体２５ｆを１０％シュ９　ロー　ス＋　０　、’
ｌ　ＭＮａＣｌ　、　Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｌ　
ＯｍＭヌベμミジンおよび２ｍＭフェニルメチルス／Ｌ
／　７　オニルフルオフイドを含むＱ　、　０５　Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）２５０酩に懸濁し、均
一な懸濁液となった時点でリゾチーム５０岬を添加して
４℃で１時間撹拌した後、３７°Ｃで５分間保温し、こ
れを更に０°Ｃで４０秒間超音波破砕器で処理した。こ
の溶菌液を２　ａ、ｏ　ｏ　ｏ　ｘ　ｙで３０分間遠心
分離して上溝２５０ｍ１を得た。この上清に１　ｍＭ　
ＫＤＴＡおよび０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０　、０２
　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）（ＴＥＮ）５
００ｆｆｌを加えて上清を希釈したのち、この希釈液を
実施例１１で得た抗体力ラム４０ｇ１にかけた。’Ｉ’
ＥＮ１２０＃＋？でカラムを洗浄したのち、さらに１　
、　ＯＭ　ＮａＣ１および０．１％ＴｗｅＣｎ２０を含
む０　、０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）
　１２０ｍｌで洗浄した。ついで、２Ｍ塩酸グアニジン
を含む０　、０５　Ｍ　’Ｉ’ｒｉｓ−ＨＣＩ　１２０
ｔｔｌで抗つイμス活性を有するポリペプチド画分６’
Ｏｍｌを溶出した。

（蛋白量１３．３１１ｆ、比活性２゜７　Ｘ　１０６Ｕ
／’ＩＩ）該両分を還元条件　５Ｏ８−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析した結果、分子量約１６．
０００および約１５．０００付近に２木の主要蛋白バン
ドが、分子量約１８．００　（ｌおよび約１７．０００
付近にうすい蛋白のバンドがそれぞれ検出された。該画
分に５倍遺（ｖ　／　ｖ　）のエタノ−／Ｌ’を添加し
４°Ｃで１６時間放置後、析出した蛋白を遠心分離によ
り集め、少量の２％ＳＤＳ。

１０％グリセロ−ｐおよび２％ジチオスＶイトールを含
む０　、０６２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ６，
８）に溶解した。この溶解液を常法に従って調製用ＳＤ
Ｓポリアクリμアミドゲル電気泳動（１２，５％ゲル、
厚さ３鱈）にかけた。一枚のヌフプゲμ当り約０．４す
の蛋白量をかけて電気泳動した。電気泳動後、ゲ／ｌ／
’ｅ０．１％２マシーブリリアントプルーＲ−２５０に
より染色し分子量約１５．０００付近に泳動しな蛋白の
バンドをカミソリで切り出したのち、和かくくだいて０
．０５％ＳＤＳｍ液（ｐＨ７，４）に懸濁させ念。この
１％濁液を４°Ｃで４８時間撹拌したのち、ｒ紙濾過に
よシ得られたｐ液に９倍量（ｖ／ｖ）のエタノ−／ｌ／
を添加した。

生じた沈澱を遠心分離によシ集めて、少量の０．１％Ｓ
ＤＳ溶液に溶解した（蛋白量１．３ｑ、比活性１．ＤＸ
１０６　Ｕ／ダ）。該溶液を還元条件下の８ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、標
品として用いた１５Ｋｒ工ＦＮ−７７フグメント〔米国
特許出願第５３４０３８号（出願日、１９８３年９月２
０８　）明釉書参照〕と同じ移動度を示す位置（分子量
約１５，０００に相当する位置）に１本の蛋白のバンド
が検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例５に記載したハイプリドーマ上溝のｒＴ
ＥＮ−７との結合能測定の結果を、第２図は実施例６に
記載した工ＦＮ−γＮＦに対する抗体産生ハイグリドー
マ各クローンの産生ずる抗体の活性比較の結果を、第３
図は実施例７で得とれた精製モノクローナμ抗体ＷＨγ
２−７６．５３の５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲ／ｌ／
電気泳動の結、果を、第４図は実施例１０（１）の本発
明モノクローナμ抗体を用いる競合法による工ＦＮ−γ
のえ量の結果を、第５図は実施例１０　（ｉｉ　）の２
種のモノクローナμ抗体を用いるサンドウィッチ法によ
る１ＦＮ−γ定量の結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）式 （） ％式％ （） ＜　ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖にお
   いてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有する
   ペプチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙは億〕 Ａａｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
   ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ（０− Ｇ１７でボされるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしくはア
   ミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチド。 （２〕式 （ ％式％ （） Ｃ式中、又は結合手または式サーＡｅｐ９ｒ・（２は＜
   ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖において
   そのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有するペプ
   チドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙはｆｃ） Ｇ１７で示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしくはア
   ミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドとキャリ
   ヤー蛋白との蛋白複合体う（３）　Ｃａ）式 （６） ％式％ ＜　ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖にお
   いてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有する
   ペプチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙは［Ｎ） ＡｓｆｌＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖ
   ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ（Ｃ〕− Ｇ１７でボされるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜１−１個のアミノ酸を有するペプチドもしくは
   アミノ酸残基金示す〕で表わされるポリペプチドまなは
   ポリペプチド（１）とキャリャー蛋白との蛋白復な体で
   免疫した哺乳動物のリンパ球と、（ｂ）同種または異種
   のリンパ球様測胞株とからなるクローン化されたハイプ
   リドーマ。 （４）Ｃ一式 （ ％式％ （） ） （） 〔式中、又は結合手または式Ｚ−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　（Ｚ
   は＜ＧｌｕまたはＧｉｎ　）で示されるペプチド鎖にお
   いてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有する
   ペプチドもしくはアミノ酸残基金示し、Ｙは改Ｊ ら数えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしく
   はアミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドもし
   くはポリペプチド（Ｉ）とキャリヤー蛋白との蛋白複合
   体で免疫した哺乳動物のリンパ球と、（ｂ）同種または
   異種のリンパ球様則胞株とを細胞融合し、得られる融合
   細胞からポリペプチド（１）に対するモノクローナル抗
   体を産生するハイプリドーマを選択し、これをクローニ
   ングすることを特徴とする該リンパ球と該リンパ球様箱
   胞株とからなるクローン化されたハイプリドーマの製造
   法。 （５）式 （） ％式％ （ ＜ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖におい
   てそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有するペ
   プチドもしくはアミノ酸残基金示し、ＹはＩＮ） Ｇｌｙで示されるペプチド鎖においてそのＮ末端から数
   えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしくはア
   ミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対する
   モノクローナル抗体。 （６）　ヒトγ型インターフェロンおよびそのＣ末端部
   分を欠くフラグメントと結合する特許請求の範囲第５項
   記載のモノクローナル抗体。 （７ン　粗製のヒトγ蚕インターフェロンま念は（およ
   び）そのＣ末端部分を欠くフラグメントを、式％式％ ） （） （） 〔式中、Ｘは結合手または式Ｚ−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　（Ｚ
   は＜ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖にお
   いてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有する
   ペプチドもしくはアミノ酸残基を示し、Ｙはｍ ら数えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしく
   はアミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対
   するモノクローナル抗体を用いて精製することを特徴と
   するヒトγ型インターフェロンまたは（および）そのＣ
   末端部を欠くフラグメントの精製法。 （３）抗体として式 （ ％式％ （１） 、Ｃ式中、工は結合手まえは式＋ｐｉＡ８ｐ（ψ、。、
   ２は＜ＧｌｕまたはＧｌｎ　）で示されるペプチド鎖顛
   おいてそのＣ末端から数えて１〜３個のアミノ酸を有ら
   数えて１〜１１個のアミノ酸を有するペプチドもしくは
   アミノ酸残基を示す〕で表わされるポリペプチドに対す
   るモノクローナル抗体を用いることを特徴とするラジオ
   イムノアッセイ法またはエンザイムイムノアッセイ法に
   よるヒトγ型インターフェロンまたは（および）そのＣ
   末端部を欠くフラグメントの検出法。