JPH06500001A - Ｐａｃａｐに対する抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （２３）　ｒｌ請求項１６記載モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細 胞。

（２４）　請求項１７記載のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞 。

（２５）　ＨＮ請求項１８記載モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細 胞。

（２６）　請求項１９記載のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞 。

（２７）　請求項２０記載のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞 。

（２８）ＰＡＣＡＰとＰ　Ａ　ＣＡ　Ｐ　＠夏休に対する抗体と、被検液および 標識化ＰＡＣＡＰとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ＰＡＣＡＰの 割合を測定することを特徴とする、被検液中のＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ部分ペプ チドあるいはＰＡＣＡＰ前駆体の定量法。

（２９）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 に被検液を接触させた後、標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に 対する抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とす る、被検液中のＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ部分ペプチドあるいはＰＡＣＡＰ前駆体 の定量法。

（３０）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体、請求項７記載の抗体あるいは請求項８記載の抗体に属す るポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体あるいは、それらの複合物で あり、他方が請求項９記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノグロ ーナル抗体である、請求項２９記載の定量法。

（３１）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体あるいは請求項７記載の抗体に属するポリクローナル抗体 あるいはモノクローナル抗体あるいは、それらの複合体であり、他方が請求項８ 記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求 項２９記載の定量法。

（３２）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル−ナ ル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求項２９記載の定量法。

（３３）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 あるいは標識化されたＰＡＣＡＰあるし）はＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一 方が請求項６記載の抗体あるいは請求項７記載の抗体に属するポリグローナル抗 体あるいはモノクローナル抗体であり、他方が請求項１４記載の抗体に属するポ リクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求項２９記載の定量法。

（３４）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰ’ＡＣＡＰ前駆体に対する抗 体、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一 方がＰＡ−ＩＮａ、ＰＡ−３Ｎａ、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２Ｃａ のいずれか、あるいはそれらの複合物であり、他方がＰＡ−ＩＣａである請求項 ３０記載の定量法。

（３５）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−ＩＮａ。

ＰＡ−３Ｎａ％ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａのいずれか、あるいはそれらの複合 物であり、他方がＰＡ−２Ｃａである請求項３１記載の定量法。

（３６）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰ　Ａ、　ＣＡ　Ｐ前駆体に対 する抗体、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗 体の一方がＰＡ−５Ｎａであり、他方がＰＡ−６Ｎａである請求項３２記載の定 量法。

（３７）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−ＩＮａ、ＰＡ−３Ｎａ％ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａのいずれか、ある いはそれらの複合物であり、他方が請求項１４記載の抗体に属するポリクローナ ル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求項３３記載の定量法。

（３８）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 がＰＡ−２Ｃａであり、標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰ　Ａ　ＣＡ　Ｐ　前 駆体に対する抗体がＰＡ−６Ｎ　ａである請求項３５記載の定量法。

明細書 ＰＡＣＡＰに対する抗体およびその用途且ユニ亙糞 本発明はＰＡＣＡＰに結合特異性を有する点で有用かつ新規な抗体に関する。更 に詳しくは、抗原抗体反応に基づくＰＡＣＡＰの測定法の開発、あるいはＰＡＣ ＡＰが関与する疾患の診断、治療に有用な抗体に関する。

脳の視床下部、下垂体から分泌されるホルモンには種々のものが知られている。

甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ　ｒｅｌｅａｓｉｎ ｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）や黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌｅｕｔｅｎｉｚｉｎ ｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、ソマトスタチン （Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔ ｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒ ｍｏｎｅ）、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）などがその例で、これらの作 用については詳細な研究がなされている。最近、これら以外の新しい視床下部由 来の生理活性物質が、アデニレートサイクラーゼアクティヴイティ（ａｄｅｎｙ ｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を指標にして探索され、その結 果、ヒツジ視床下部より、これまでには報告されていない、３８個のアミノ酸残 基からなるペブタイドが発見された。このペブタイドはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ３と 命名され、下記の構造を有する。

Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ＴｙｒＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＶａｌＬｅｕ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｎ　Ｌｙｓ−ＮＨ。

また、ヒツジ、ヒト両者のＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，の成熟部分のアミノ酸配列は同 一、前駆体においてはアミノ酸の置換があることがヒツジＰＡＣＡＰ３８ＮＨ， のｃＤＮＡの特許出願（特願平１−１５５７９１号、同１−２８４７７１号）、 およびヒトＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のｃＤＮＡの部分構造の特許出願（特願平１− ２５９９２４号）から明らかにされている。ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のｃＤＮＡの 配列中に示される連続した塩基性アミノ酸の位置から、前駆体から切り出される ペプチドとしてＰＡＣＡＰ３８ＮＩ（、の他にもＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，が存在す ると推測される。

事実、その後の研究から、羊視床下部よりＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，以外にもＰＡＣ ＡＰ２７ＮＨ，が単離された。構造を以下に示す。

ＰＡＣＡ、Ｐ２７ＮＨ ｔ（ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ 　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ−Ｎ Ｈ。

以下、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，とＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，とを総称してＰＡＣＡＰと 表わす。

ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を含むＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＮ端部の２８アミノ酸残基 は脳腸管ペブタイドとして有名なバソアクティブ・インテステイナル・ポリペプ チド（Ｖ　Ｉ　Ｐ　：　ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｏｌ ｙｐｅｐｔｉｄｅ）と６８％の相同性を示す。しかしながら、ＰＡＣＡＰのアデ ニレートサイクラーゼ活性化能は、ＶＩＰのそれを少なくとも１０００倍を上ま わると報告されている。

このように、ＰＡＣＡＰの作用はＶＩＰと異なることが予想され、その生理的役 割、病態との関連に深い関心が寄せられている。

上述したように、ＰＡＣＡＰに対する関心が高まっているにもかかわらず、これ まで、ＰＡＣＡＰの視床下部以外の存在部位、血漿レベル等、基本的な生理的情 報はほとんど得られておらず、病態との関連も不明である。この主たる原因とし て、これまでＰＡＣＡＰを特異的に認識するモノクローナル抗体が作製されてお らず、さらにＰＡＣＡＰを特異的かつ高感度に測定する免疫学的測定法が開発さ れていないことが挙げられる。これらの免疫学的手法は、ＰＡＣＡＰの研究。

特に代謝経路、分泌機構、リセプターシステム、病態との関連等に関する研究を 総合的に行う上で最も有効な手段の一つと考えられ、該手法の確立が各界から切 望されていた。

また、これまで、ＰＡＣＡＰのような低分子ペプタイドの測定には、通常１種類 の抗体を用いる競合法のラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）あるいは、エンザイ ムイムノアッセイ（ＥＩＡ、酵素免疫測定法）が開発され、用いられてきた。

一方、２種類の抗体を用いるサンドイツチ法による免疫測定法は、競合法と比較 し、（１）２種類の抗体を月いるため、測定系の特異性が向上し、（２）被測定 物質に対し、大過剰の抗体を用いるため非特異的妨害因子の影響を受けにくい等 の利点を有している。しかしながら、これまで、ＰＡＣＡＰのような、ジスルフ ィド結合を有さない低分子量のベブタイドがサンドイツチ法により高感度に測定 されるかどうか、全く不明であった。即ち、ＰＡＣＡＰのようなジスルフィド結 合を有さない低分子の場合、２組の抗体の結合部位が互いに立体障害等、影響を 及ぼす程近傍であり、高感度なサンドイツチ法を設定することが困難である可能 性が考えられた。

且豆辺ｌ且 本発明者等は、ＰＡＣＡＰに結合し、Ｐ　Ａ　ＣＡ’Ｐの部分ペブタイドおよび ＶＩＰに対し異なる反応特異性を有するポリクローナルおよびモノクローナル抗 体を作製し、該抗体を用いてＰＡＣＡＰを高感度にかつ特異的に検出し、がっＰ ＡＣＡＰ３８ＮＨ，とＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、！：を分別室ＪｉＬ得６免疫測定 法を開発した。

すなわち、本発明はＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ部分ペブ部分ドブタイドＡＰ前駆体 、あるいはＶＩＰに結合性を有するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体 を産生ずるハイブリドーマ細胞、および該抗体を用いた競合法あるいはサンドイ ツチ法によるＰＡＣＡＰの免疫測定法に関する。

璽工五交皇皇盈ユ 第１図はマウス抗血清中のＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，に対する抗体価を測定したグラ フである。

第２図は家兎抗血清中のＰＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，に対する抗体筒を測定 したグラフである。

第３図は本発明抗体を用いた競合法−酵素免疫測定法にょるＰＡＣＡＰ３８なら びに関連ペブタイドの測定結果を示したグラフであり、本発明抗体の認識部位が 明らかにされたグラフである。

第４図、第５図および第６図は本発明抗体を用いたサンドイッチ法−酵素免疫測 定法によるＰＡＣＡＰ、３８ＮＨ，の検出結果を示したグラフである。

第７図は本発明のサンドイッチ法−酵素免疫測定法におけるＰＡＣＡＰならびに 関連ペプタイドの反応性をみたグラフである。

第８．９、ｌＯおよび１１図は本サンドイツチ法−酵素免疫測定法におけるＰＡ ＣＡＰ２７ＮＨ，ならびに関連ペプタイドの反応性をみたグラフである。

第１２図はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，４ｍ対スル抗ＰＡＣＡＰ抗体の中和能を培養細 胞を用いて調べた結果を示している。

第１３図はヒト・ブレプローＰＡＣＡＰ　ｃＤＮＡを含有する発現プラスミドで 形質転換した大腸菌の生産物のイムノプロット分析を示す図である。

丘工旦旦１上里見 ＰＡＣＡＰの部分ペブタイドとしては、ＰＡＣＡＰの部分配列を有するものであ ればどのようなペプタイドでもがまゎないが、例えば、ＰＡＣＡＰのＮ端部分に 相当するベプタイド、例えば、以下の配列を有するＰＡＣＡＰ　（１−１３）Ｈ ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔ ｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｙｒ あるいは、ＰＡＣＡＰのＮ端部分から中央部分に相当するペプタイド、例えば ＰＡＣＡＰ　（４−２７） Ｇｌｙ　Ｔｉｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＴ ｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔ ｙｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ あるいは、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＣ端部分がら中央部分に相当するベブタイド 、例えば、以下の配列を有するＰＡＣＡＰ　（１４−３８） Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＬ ｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｎ　ＡｒｇＶａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ あるいは、ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，のＣ端部分に相当するペブタイド、例え ば、以下の配列を有するＰＡＣＡＰ　（３１−３Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒ ｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＬｙｓあるいはＰＡＣＡＰ２７の中央部分がらＣ 端部分に相当するペブタイド、例えば、以下の配列を有するＰＡＣＡＰ　（１１ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＬｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ−ＮＨ。

等が挙げられる。これらのベプタイドのうち、ＰＡＣＡＰ（３１−３８）および ＰＡＣＡＰ　（１１−２７）　のＣ末端はアミド体であることが好ましく、他の ベプタイドのＣ末端は、アミド体でも、遊離カルボン酸体でもかまわない。アミ ド体についてはＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，のようにＮＨ，を付けて表わ しており、また遊離カルボン酸体については何も付けなイカ、ＰＡＣＡＰ　（３ １−３８）ＯＨ（７）Ｊ：うにｏＨを付けて表わしている。

ＰＡＣＡＰ前駆体の例としては次の式で表わされるアミノ酸もしくはその一部の アミノ酸からなるヒトＰＡＣＡＰの前駆体が含まれる： Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｈ ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＴｙｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｌｌｅ　Ａｒｇ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ 　ＧｌｙＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 ＡｒｇＡｌａ　ＡｌａＡｌａ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌ ａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＶａｌＡｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ 　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＶａｌＬｅｕ　 Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　 Ｇｉｎ　５ｅｒＬｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＧｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓ ｐ　Ａｌａ　’Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＨｉｓ　Ｓｅ ｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅ ｒ　ＡｒｇＴｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ 　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ本発明者等はＰＡＣＡ Ｐに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製すべく種々研究 の結果、大きくは５つのクラスに分類される抗体を確立した。

クラス■に分類される抗体は、ＰＡＣＡＰのＮ端部分を認識する、即ち、ＰＡＣ ＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨオ、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）、ＰＡＣＡ Ｐ　（４−２７）と反応し、且つＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、ＰＡＣＡ Ｐ　（３１−３８）ＮＨ，とは反応しない。

クラス■に分類される抗体は、ＰＡＣＡＰのＮ端部分から中央部分に至る領域と 認識する、即ち、ＰＡＣＡＰ３８、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（４− ２７）と反応し、且つＰＡＣＡＰ　（１−１３）、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８） ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，とは反応しない。

クラス■に分類される抗体は、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＣ端部分から中央部分に 至る領域と認識する、即ち、ＰＡＣＡＰ３８Ｎ、Ｈ，、ＰＡＣＡＰ　（１４−３ ８）ＮＨ，と反応し、且つＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）、 ＰＡＣＡＰ（４−２７）、ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，とは反応しない。

クラス■に分類される抗体は、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＣ端部分を認識する、即 ち、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　 （３１−３８）ＮＨ，と反応し、且つＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（４ −２７）、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）とは反応しない。

クラスＶに分類される抗体は、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，のＣ端部分を認識する、即 ち、ＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ。

に対する抗体である。

クラスＩに属する抗体は、さらに、Ｉａ、およびｒｂに分類される。即ち、Ｉａ は、ＶＩＰと ０．５％以下の交差反応性しか示さず、Ｉｂは、ＶＩＰと０．５％以上の交差反 応性を示す。

クラス■の抗体の多くはＶＩＰと０．５％以下の交差反応性しか示さず、クラス ｍ、クラス■およびクラスＶの抗体の多くは、ＶＩＰと０．０１％以下の交差反 応性しか示さない。

これらの抗体は、通常の組織染色あるいは競合法の免疫測定法に用いることがで きる。さらに、本発明者らは、優れた免疫測定法を開発すべく種々研究の結果、 これらのモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体２種類を組み合わせ るサンドイツチ法による免疫測定法を開発した。

本発明のサンドイツチ法によるＰＡＣＡＰの免疫測定法においては、１次反応（ 固相用抗体と被検物質との反応）および２次反応（標識化抗体と被検物質との反 応）に用いられる抗体は、それぞれポリクローナル抗体またはモノクローナル抗 体であってもよいが、好ましくは、その一方がＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＮ端部分 （クラス■）、Ｎ端部分から中央部分に至る領域（クラスｎ）、Ｃ端部分から中 央部分に至る領域（クラスｍ）、あるいはＣ端部分（クラス■）を認識する抗体 であって、他方が、その抗体が認識する領域以外を認識する抗体が用いられる。

即ち、本発明者らは、本発明のサンドイツチ法による免疫測定法において、クラ スＩとグラス■、クラス■とクラス■、グラスＩとクラス■の抗体の組み合わせ 、即ち、１次配列上隣接しない抗体と組みあわせるサンドイツチ法においてＰＡ ＣＡＰ３８ＮＨ，が高感度に検出されることを見い出した。さらに、本発明者ら は、クラスＩとクラス■、クラス■とクラス■、クラスｍとクラス■の抗体の組 みあわせ、即ち、互いに１次配列上隣接する抗体を組みあわせるサンドイツチ法 においても、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が検出され、特に、クラス■とクラスｍの抗 体を組みあわぜるサンドイツチ法において、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が高感度に検 出されることを見い出した。さらに、該サンドイツチ法による免疫測定法は、Ｐ ＡＣＡＰ３８ＮＨ，に特異的であり、例えば、クラスＨに属するモノクローナル 抗体の１種であるＰＡ−６Ｎａおよびクラスｍに属するモノクローナル抗体の１ 種であるＰＡ−２Ｃａを用いるサンドイツチ法による免疫測定法においては、Ｖ ＩＰおよびＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，と相同性を有する他のベブタイド、たとえば以 下の配列を有する生長ホルモン放出ホルモン（ＧＲＦ） Ｔｙｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａ　１　ａ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ ｓｎ−５ｅ　ｒ−Ｔｙ’ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｙ− Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　］　］ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＧ ｌ　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｍｅ　ｔ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　 ｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−５ｅｒ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ。

や以下の配列を有する代表的消化管ホルモンであるセクレチン Ｈｉ　５−Ｓｅ　ｒ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ− Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅ　ｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　 ｙ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ 　ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ。

（Ｍ、Ｗ、　３０３９．４） に対する交差反応性はいずれも０．００１％以下であることが見い出された。

本発明のサンドイツチ法によるＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，の免疫測定法においては、 １次反応および２次反応に用いられる抗体は、それぞれポリクローナル抗体また はモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、その一方がＰＡＣＡＰ２ ７ＮＨ，のＮ端部分（クラス■）、Ｎ端部分から中央部分に至る領域（クラス■ ）、あるいはＣ端部分（クラスＶ）を認識する抗体であって、他方が、その抗体 が認識する領域以外を認識する抗体が用いられる。本発明のサンドイツチ法によ る免疫測定法ニオイテモ、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，をＶＩＰ。

ＧＲＦあるいはセクレチンとの交差反応なく（交差反応性０゜００１％以下）検 出し得る。

さらにクラス■および■のいずれかと、クラスｍおよびクラス■のいずれかとを 組み合わせるサンドイツチ法による免疫測定法はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，に特異的 で、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，とは交差反応せず、一方、クラスｒあるいはＨのいず れかとクラスＶとを組み合わせるサンドイツチ法によるＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，の 免疫測定法はＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，とそれぞれ重量比では０．２２〜３． ６％、モル比では０．３１〜５％の交差反応性しか示さないことから、これらの 測定法を用いることにより、ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，とＰＡＣＡＰ２７ＮＩ （、とを分別定量することが可能である。

本発明のポリクローナル抗体の調製は一般に免疫抗原のＰＡＣＡＰまたはＰＡＣ ＡＰの部分ペプタイドとキャリアー蛋白との複合体をつくり、このものを動物に 接種して免疫を行い、該免疫動物から抗ＰＡＣＡＰまたはＰＡＣＡＰの部分ペブ タイド抗体含有物を採取、抗体の分離精製を行うことによる。

本発明のモノクローナル抗体の調製に当っては、上記免疫動物から抗体価の高い 個体を選び、最終免疫２〜５日後に膵臓あるいはリンパ節を採取、それらに含ま れる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、安定的に力価の高い抗体を産生ずる ハイブリドーマを選択し、モノクローナルなハイブリドーマを得ることによる。

免疫抗原としては、天然精製標品、合成標品等いずれも使用でき、ＰＡＣＡＰお よびそれらの一部分が用いられる。また免疫抗原として、ＰＡＣＡＰの構造を含 む化合物、あるいはＰＡＣＡＰの一部分の構造を含む化合物が用いられる場合も ある。

本発明に記載されている種々のペプチドは、ペプチド合成の公知の常套手段で製 造しうるものであり、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。ペプチ ド合成の方法としては、例えば以下の報告に記載された方法がある。Ｂ、　Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄ　［ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイエティ（Ｊ、Ａ ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）、８５　２１４９（１９６３）コ、　Ｍ、　Ｂｏ ｄａｎｓｚｋｙ及びＭ、　Ａ、０ｎｄｅｔｔｉ　［ペプチドシンセーシス（Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ、ＮｅＷ　Ｙｏｒｋ、１９６６年コ、５ｃｈｒｏｄｅｒ及びＬｕｂｋｅ 　［ザペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）、　Ａｃａｄｅ＋ｕｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６５年］、泉屋信夫他［ペプチド合成の基礎と実験、 丸善■、■９８５年コ矢島治明及び榊原俊平［生化学実験講座１、タンパク質の 化学ＩＶ、　２０５．１９７７年］等。

例えば固相法によりＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，あるいはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，の部分 ペプチドを合成する場合には、不溶性樹脂として当該技術分野で知られたもの、 例えばグロロメチル樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−オキシメ チルフェニルアセタミドメチル樹脂等これら何れかの樹脂を用い、ＰＡＣＡＰ３ ８ＮＨ，あるいはＰＡＣＡＰ３８ＮＨ。

の部分ペプチドのＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次縮合する。次い でフッ化水素処理で全保護基を除去して、高速液体グロマトグラフィー等のそれ 自体公知の方法による精製後、目的とするＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，あるいはＰＡＣ ＡＰ３８ＮＨ，の部分ペプチドを得ることが出来る。

例えば、Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基をＢＯＣ基で保護し、セリン およびスレオニンの水酸基はＢｚｌ基で、グルタミン酸、アスパラギン酸のω− カルボン酸はＯＢ２１基、リジンのε−アミノ基はＣＩ−Ｚ基で、チロシンの水 酸基はＢｒ−Ｚ基でアルギニンのグアニド基はＴｏｓ基で、ヒスチジンのイミダ ゾール基はＴｏｓ基で保護する方法で製造することが出来る。

本発明明細書においてアミノ酸等を略号で表示する場合、Ｉ　Ｕ　Ｐ　Ａ　Ｃ− Ｉ　Ｕ　Ｂ　Ｃｏｍｍ１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎ ｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ り、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示 しなければＬ一体を示すものとする。

ＰＡＭ　：フェニルアセタミドメチル ＢＨＡ　：ベンツヒドリルアミン Ｂｏｃ　：ｔ−ブチルオキシカルボニルＣ１−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシ カルボニルＢｒ−Ｚ：２−プロモーベンジルオキシカルボニルＢｚｌ　：ベンジ ル ０Ｂｚｌ：ベンジルエステル Ｔｏｓ：ｐ−）ルエンスルホニル ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカルボジイミド１１ｅ　：イソロイシン Ｓｅｒ　：セリン Ｔｈｒ　：スレオニン Ｇｌｕ　：グルタミン酸 Ａｓｐ　：アスパラギン酸 Ｐｈｅ　：フェニルアラニン Ａｓｎ　：アスパラギン Ｇｉｎ　：グルタミン 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白との蛋白複合体 に関し、キャリアー蛋白の種類およびキャリアーとハブテンとの混合比は、キャ リアーにカプリングさせて免疫したハブテンに対して抗体が効率よく出来れば、 どの様なものをどの様な比率でカプリングさせてもよいが、例えば、牛血清アル ブミンや牛サイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハブテン１に対し０． １〜２０．好ましくは１〜５の割合でカブルさせる方法が用いられる。

またハブテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることが出来 るが、グルタルアルデビトやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオー ル基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が好都合に用いられる。

縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体ある いは担体、希釈剤とともに投与される。

投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロインドアジュバントや不完全フ ロインドアジュバントを投与してもよい。

投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計３〜１０回程度行われる。

用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられる。

抗体は上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水（好ましくは血液）などか ら採取される。抗血清中の抗ＰＡＣＡＰ抗体価の測定は、例えば後記の標識化Ｐ ＡＣＡＰと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことによりなされる。抗体の分離精製は免疫グロブリンの電気泳動法、イオン交 換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ適法、抗原抗体結合物 あるいはプロティンＡあるいはプロティンＧなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。

このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主たる成分とし、ＩｇＭ％　ＩｇＡ 等、他の免疫グロブリンも含む。

一方、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫された温血動物、たとえ ばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に膵臓また はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させる ことにより、抗ＰＡＣＡＰ抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融 合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎ ａｔｕｒｅ）、里、４９５（１９７５）　］に従い実施できる。融合促進剤とし てはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが 、好ましくはＰＥＧが用いられる。

骨髄腫細胞としてはたとえばＮ５−１．Ｐ３Ｕ１，５Ｐ２１０などがあげられる が、特にＰ３Ｕｌが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（肺臓細胞） 数と骨髄細胞数との好ましい比率は１．１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ま しくはＰＥＧ１００Ｏ〜Ｐ　Ｅ　Ｇ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加 され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜ＩＯ分間インキュベートす ることにより効率よく細胞融合を実施できる。

抗ＰＡＣＡＰ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で きるが、たとえばＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ部分ベブ部分ドブタイドせた固 相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に西洋ワサ ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用 いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また はプロティンＡを加え、固相に結合した抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体を検出 するＥＩＡ法、抗免疫グロブリン抗体またはプロティンＡを吸着させた固相にハ イブリドーマ培養上清を添加し、ＨＲＰで標識したＰＡＣＡＰを加え、固相に結 合した抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ法などがあげられる。

抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒボキサンチン、 アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛脂児血清を含む動物細 胞用培地（例、ＲＰＭ１１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体 価は、上記の抗血清中の抗ＰＡＣＡＰ抗体価の測定と同様にして測定できる。

抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の分離精製は上記のポリクローナル抗体の分離 精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。

ＰＡＣＡＰの一部領域と反応する抗ＰＡＣＡＰポリクローナル抗体は、その一部 領域に相当するペプチドをハブテンとして免疫し上記の方法で調製することもで きるが、ＰＡＣＡＰをハブテンとして用いて調製された抗ＰＡＣＡＰポリクロー ナル抗体から、その一部領域に相当するペプチドを結合したカラムによるアフィ ニティクロマトグラフィを用いて調製することもできる。

また、ＰＡＣＡＰの一部領域と反応する抗ＰＡＣＡＰ抗体を産生ずるハイブリド ーマおよび、ＰＡＣＡＰとは反応するがその一部領域とは反応しない抗ＰＡＣＡ Ｐモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマの選別はたとえばその一部領域 に相当するペプチドとハイブリドーマが産生ずる抗体との結合性を測定すること により行うことができる。

上記で得られた抗ＰＡＣＡＰモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて 、ＰＡＣＡＰの測定ないし組織染色等を行ない得る。これらの目的には、抗体分 子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）いＦａｂ’、あるい はＦａｂ画分を用いてもよい。

ＰＡＣＡＰの測定法には通常、以下に述べる競合法が用いられるが、前述した理 由によりサンドイツチ法を用いるのが好ましい。

競合法においては、本発明で得られた抗ＰＡＣ’ＡＰ抗体と、被検液および標識 化ＰＡＣＡＰとを競合的に反応させたのち、抗体に結合した標識化ＰＡＣＡＰの 割合を測定することにより、被検液中のＰＡＣＡＰを定量する。

該ＰＡＣＡＰの標識剤あるいは後記の抗体の標識剤としては、放射性同位元素、 酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば °”■、“”Ｉ、”Ｈ１＋４ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大き なものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカ リフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質と しては、フルオレスカミン、フルオレラセンイソチオシアネートなどが、発光物 質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが それぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいはＰＡＣＡＰと８（識剤との結合にビ オチン−アビジン系を用いることもできる。

上記の標識剤の活性の測定に当っては、抗体に結合した標識化ＰＡＣＡＰと遊離 の標識化ＰＡＣＡＰとを分離（以後Ｂ／Ｆ分離と略す）する必要があるが、標識 剤として酵素を用いた場合には、このための試薬に不溶化した抗ＰＡＣＡＰ抗体 に対する抗体あるいは不溶化したプロティンＡ等の活性吸着剤が有利に用いられ る。例えば、抗ＩｇＧ抗体（抗ＰＡＣＡＰ抗体に対する抗体に相当）を固相とし て用い、これと反応性のある上記抗体を介して標識化ＰＡＣＡＰを固相にある抗 ＩｇＧ抗体に結合させ、該固相上の標識剤を測定することによって行なうことが できる。標識剤として酵素を用いた場合には、不溶化担体上の酵素活性の測定に は通常の比色法あるいは蛍光法が用いられる。標識剤にラジオアイソトープ等を 用いた場合には、Ｂ／Ｆ分離に上記の試薬以外にも不溶化しない抗ＰＡＣＡＰ抗 体に対する抗体、硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール 等の試薬が用いられる。いずれの方法においても上清中あるいは沈降物中の標識 剤の活性を測定する。

上記の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵 素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体 としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリス チレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げ られる。

競合法においては、抗ＰＡＣＡＰ抗体、被検液、標識化ＰＡＣＡＰ、およびＢ／ Ｆ分離用試薬は、どのような順序に反応させることも可能であり、また全部ある いは一部を同時に反応させてもよいが、少なくとも標識化ＰＡＣＡＰは、被検液 と抗ＰＡＣＡＰ抗体との反応と同時に、あるいは反応後に遅れて反応系に加えら れることが好ましい。

ただし硫酸ナトリウム、デキストラン炭末、ポリエチレングリコール等のＢ／Ｆ 分離試薬は主として反応系の最後に用いられる。

一方、サンドイツチ法においては不溶化した抗ＰＡＣＡＰ抗体に被検液を接触（ 反応）させ（１次反応）、さらに標識化抗ＰＡＣＡＰ抗体を反応させ（２次反応 ）だのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＰＡＣ ’ＡＰ量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよい し時間をずらして行なってもよい、標識化剤および不溶化の方法は前記のそれら に準じることができる。

２次反応に用いられる抗ＰＡＣＡＰ抗体としては、１次反応に用いられる抗ＰＡ ＣＡＰ抗体とはＰＡＣＡＰの該抗体と結合する部位が相異なる抗体が好ましく用 いられる。

即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体はそれぞれポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体であってもよいが、例えば、１次反応で用いられる抗 体が、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＣ端部を認識する（クラス■）場合、２次反応で 用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、即ち、Ｎ端部（クラスＩ）、Ｎ端部 から中央部分に至る領域（クラス■）、あるいはＣ端部から中央部分に至る領域 （クラス■）を認識する抗体が用いられる。

サンドイツチ法による免疫測定法においては、固相用抗体および標識用抗体いず れもいかなるクラス、サブクラスのものでもよく、また、抗体活性が保持されて いるなら、それらからＦｃ’　あるいはＦｃ領域を除去したＦ（ａｂ’）、画分 、Ｆａｂ’　画分あるいは、Ｆａｂ画分でもよい。

サンドイツチ法による免疫測定法において、モノクローナル抗体を用いる場合、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要は なく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよ い。　また、本発明で得られた抗体を用いる免疫測定法は、ＰＡＣＡＰが関与す る疾患の診断および予後管理に使用し得る。

被検試料としては、血漿、血清、尿、脳を髄液、腹水、胸水、羊水等の体液や、 痰、便などが使用し得る。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩衝液で希 釈あるいは抽出後濃縮し、イムノアッセイの試料とし得る。試料の希釈あるいは 抽出に用いられる溶媒としてはどのような緩衝液あるいは有機溶媒を用いてもよ いが、好ましくはイムノアッセイ用緩衝液、水、生理食塩水、酢酸緩衝液、アセ トン、グロロホルムーメタノールあるいは、界面活性剤を含むこれらの溶液が用 いられ、抽出後、加熱処理される場合もある。また、濃縮は、試料を直接減圧下 、あるいは常圧、窒素気流下濃縮してもよいし、また試料をイオン交換あるいは 逆相クロマトグラフィー用担体あるいは抗ＰＡＣＡＰ抗体結合担体に添加したの ち、適当な溶出液で溶出後、減圧下あるいは常圧、窒素気流下濃縮しても良い。

逆相クロマトグラフィー用担体としてはＣ２、Ｃ８、Ｃ１８あるいはフェニルカ ートリッジが用いられるが、濃縮用担体として特に好ましくは、抗ＰＡＣＡＰ抗 体結合担体が用いられる。濃縮物はイムノアッセイ用緩衝液に溶解後、イムノア ッセイの試料とする。

さらに、本発明で得られた抗ＰＡＣＡＰ抗体はＰＡＣＡＰの免疫組織染色法等に も用いる事ができる。その方法は、例えば標識化抗ＰＡＣＡＰ抗体を用いる直接 法、抗ＰＡＣＡＰ抗体および抗ＰＡＣＡＰ抗体に対する抗体の標識化されたもの を用いる間接法等に準することができる。

また、さらに本発明で得られた抗ＰＡＣＡＰ抗体のうちＰＡＣＡＰのアデニレー トサイクラーゼ活性化能を中和し得る抗体は、ＰＡＣＡＰの特異的中和抗体とし て使用し得る。

抗ＰＡＣＡＰ抗体の中からＰＡＣＡＰの作用を特異的に抑制する抗体をスクリー ニングする方法としては、ＰＡＣＡＰの薬理作用を検出するいかなる方法を用い ることも可能であり、例えば、下垂体の初代培養や褐色細胞腫細胞株ＰＣＩ２ｈ を含む各種細胞培養系において、ＰＡＣＡＰのアデニレートサイクラーゼ活性化 能を指標とする生体外の測定系、あるいは、ＰＡＣＡＰの実験動物の血圧降下活 性を指標とする生体内の測定系などが挙げられる。

得られたＰＡＣＡＰの作用を特異的に抑制する抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭい かなるクラスのものでもよく、またそれらからＦｃ’　あるいはＦｃ領域を除去 したＦａｂ’　あるいはＦａｂ画分あるいはその重合体でもよい。また、ＰＡＣ ＡＰの作用を特異的に抑制し得るモノクローナル抗体の可変遺伝子部と、ヒトイ ムノグロブリン定常遺伝子部とを融合させ、組み換え体として発現させたキメラ 抗体を用いることもできる。

なお、後述の実施例８で得られたハイブリドーマ細胞は平成２年２月２７日から 財団法人発酵研究所（ＩＦ○）に、そして平成２年３月１６日から通商産業省工 業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に以下の受託番号で寄託されている。

ハイブリドーマ細胞　Ｉ　Ｆ　ＯＦＥＲＭ−ＢＰ（ＦＲＩ）ＰＡ−ＩＮ　５０２ ２５　２８１１ ＰＡ−３Ｎ　５０２２６　２８１２ ＰＡ−５Ｎ　５０２２７　２８１３ ＰＡ−６Ｎ　５０２２８　２８１４ ＰＡ−２Ｃ５０２２９２８１５ ＰＡ−ＩＣ５０２３０２８１６ なお以下の実施例では、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞 名の後にａを付けた形で表している。

参　Ｉ　ＰＡＣＡＰ３８ＮＨのム 市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アブライドバイオシステムズ社製）　１．０４ｇ 　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アブライドバイオシステム ズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、 樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏａ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン で処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏａ−Ａｓｎ、Ｂｏａ−Ｌ ｙｓ（Ｃ１−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ −Ｇｉｎ、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏａ−Ｌｅ ｕ−、Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、　Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂ ｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）。

Ｂｏａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｐｈｅ、　Ｂｏｃ−１１ｅ、　Ｂｏａ− Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配列通り順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで 活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたは、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じア ミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し 、保護ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，樹脂２．４２　ｇを得た。

この保護ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，樹脂０．５１ｇをｐ−クレゾール０．６ｇ共存下 無ホフッ化水素５ｍΩで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、 残渣をエチルエーテル５ｍｆｆで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水６ｍΩ で抽出した。

不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５＋＋＋Ｑ、で洗浄した。濾液、洗液を合し、 ２〜３ｍＱに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ９０ｃｍ）のカラム に付し、５０％−酢酸で溶出した。

主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％トリフルオロ酢酸水Ｌｏｏｍ 　Ｑに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ１２Ｏ５−５０樹脂カラム（＋、６Ｘ７ｃ ｍ）に付し、０．１％トリフルオロ酢酸水と５０％アセトニトリル（０，１％ト リフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。

主要画分を合し、凍結乾燥し、６０■の白色粉末を得た。これを０．０５Ｍ−酢 酸アンモニア水２０ｍ　Ｑに溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（ＩＸ ６ｃｍ）に付し、０．０５　ＭからＩ。

ＯＭ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再度Ｙ ＭＣ−ＯＤＳカラム（２，６Ｘ７ｃｍ）に付し、０〜４０％までのアセトニトリ ル水溶液（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行い、アセ トニトリル２８〜３０％の区分を集め凍結乾燥し、白色粉末２１．６■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　２．９０（３）、　Ｔｈｒ　Ｏ，８４（１）、　Ｓｅｒ　２，１０（３ ）、　Ｇｌｕ　２．２１（２）、　Ｇｌｙ　２，００（２）、　Ａｌａ　３．２ ９（３）、　Ｖａｌ　３．１９（３）、　Ｍｅｔ　１．０１（１）、　ｌ１ｅＯ ，８７（１）、　Ｌｅｕ　２，０９（２）、　Ｔｙｒ　３．９４（４）、　Ｐｈ ｅ　０１９２（１）、　Ｌｙｓ　７゜１８（７）、　Ｈｉｓ　０．９６（１）、 　Ａｒｇ　４，１９（４）質量分析による（Ｍ＋Ｈ）４５３０ ＨＰＬＣ溶出時間　１９．６分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２ＯＡ）溶離液：Ａ液（ ０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセト ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流速　：１、ＯｍＱ／分 ２　ＰＡＣＡＰ２７ＮＨのム 市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アブライドバイオシステムズ社製）　１．０４ｇ 　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アブライドバイオシステム ズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−ＬｅｕをＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合し た後、樹脂上のＢｏＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、ア ミノ基を遊離させ、このアミノ基に。

Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、 　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ｇｌｙ、　Ｂｏ Ｃ−Ｌｅｕ、　Ｂｏａ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、　Ｂｏｃ−３ｅｒ（Ｂｚｌ ）、　Ｂｏａ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ− Ｐｈｅ、　Ｂｏｃ−１１ｅ、　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ２７ＮＨ ，のアミノ酸配列通り順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣ または、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後 、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，樹脂 ２．３１ｇを得た。

この保護ＰＡＣＡＰ２７ＮＨヨ樹脂０．７９ｇをｐ−クレゾール１．２ｇ共存下 無水フッ化水素１（ｉｎＱで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去 し、残渣をエチルエーテル５ｎ＋Ｑで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ ｍＱで抽出した。

不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５＋ｎＱで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜 ３＋ｎＱに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ７５ｃｍ）のカラムに 付し、５０％−酢酸で溶出した。

主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％トリフルオロ酢酸水１００ｍ Ｑに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ１２０　５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ７ａ ｎ）に付し、０．１％トリフルオロ酢酸水と５０％アセトニトリル（０，１％ト リフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合し、再 度ＹＭＣ−ＯＤＳカラム（２，６％７ｃｍ）に付し、１５〜３５％までのアセト ニトリル水溶液（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出を行い 、アセトニトリル３０〜３２％の区分を集め凍結乾燥した。これを０．０５Ｍ− 酢酸アンモニア水２０ｍ２に溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（ＩＸ ６ｃｍ）に付し、水から０．３３Ｍ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出 した。主要画分（０，１８〜０．２２　Ｍ）を合して凍結乾燥し、白色粉末２０ ■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　１．９６（２）、　Ｔｈｒ　Ｏ，９４（１）、　Ｓｅｒ　２．５７（３ ）、　Ｇｌｕ　１．０７（１）、　ＧｌｙＯ，９５（１）、　Ａｌａ　３．００ （３）、　Ｖａｌ　１．９６（２）、　Ｍｅｔ　０．８８（１）、　ｌ１ｅＯ， ８８（１）、　Ｌｅｕ　１，９３（２）、　Ｔｙｒ　２．８７（３）、　Ｐｈｅ 　００９０（１）、　Ｌｙｓ　２゜９＋（３）、　Ｈｉｓ　Ｏ，９４（１）、　 Ａｒｇ　２．１７（２）質量分析による（Ｍ　＋　Ｈ）　３１４６．７ＨＰＬＣ 溶出時間　２１．２分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−○Ｄ　Ｓ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２ＯＡ）溶離液：Ａ液 （０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセ トニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流速　：　１．ＯｍＱ／分 ＃　３　ＰＡＣＡＰ２７０ＨＨｉｓＳｅｒＡｓ　Ｇｌ　１ｌｅＰｈｅＴｈｒ　Ａ ｓ　Ｓｅｒ　Ｔ　ｒ　Ｓｅｒ　Ａｒ　Ｔ　ｒ　Ａｒ　Ｌ　ｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　 Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌ　ｓＬ　ｓ　Ｔ　ｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌ ｅｕ−ＯＨのム市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ，−ＰＡＭ樹脂（アプライドバイ オシステムズ社製）　０．６０ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合 成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル４３ＯＡ　）を使用し、合成した 。

樹脂上のＢｏＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基 を遊離させた後、このアミノ基に、各２ｍｍｏｌｅのＢｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ −Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂ。

ｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏａ−Ｌｅｕ、　Ｂｏａ−Ａ ｌａ、　Ｂｏａ−Ｍｅｔ、　Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｐｈｅ、　Ｂｏｃ−１ｉｅ 。

Ｂｏｃ−Ｈｉｓ　（Ｔｏｓ）　をＰＡＣＡＰ２７のアミノ酸配列通り順にＨＯＢ ｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたは、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性 化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水酢酸で アセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ２７−ＯＣＨ，−ＰＡＭ樹脂１．２５　ｇを得た 。

この保護ＰＡＣＡＰ２７−ＯＣＨ，−ＰＡＭ樹脂０．６５　ｇをｐ−クレゾール １．０ｇ共存下無水フッ化水素６ｍＱで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素 を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５＋＋＋Ｑで２回洗浄した後、残渣を５０ ％−酢酸水５ｍαで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍＱで洗浄し た。

濾液、洗液を合し、２〜３ｍＱ、に減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２ ％７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留 去の後、残留物を、０．１％トリフルオロ酢酸水１００ｍ　Ｑに溶解し、ＹＭＣ −ＯＤＳ　ＡＭＩ２Ｏ５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ　７　ｃｍ）　４．、付し 、０．１％トリフルオロ酢酸水と５０％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ 酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、 白色粉末９０　ｍｇを得た。再度ＹＭＣ−〇ＤＳカラム（２，６％７ｃｍ）に付 し、１５〜４０％までのアセトニトリル水溶液（０，１％トリフルオロ酢酸含有 ）の直線型濃度勾配溶出を行い、アセトニトリル２５〜２８％の区分を集め凍結 乾燥した。これを０．０５Ｍ−酢酸アンモニア水２０ｍ　Ｑに溶解し、ＣＭ−セ ルロファインの樹脂カラム（ＩＸ６ｃｍ）に付し、０゜０５Ｍから０．３３Ｍ− 酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、 白色粉末２０■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　２．０３（２）、　Ｔｈｒ　０．９６（１）、　Ｓｅｒ　２．６６（３ ）、　Ｇｌｕ　１．０８（１）、　ＧＩＶ　１．０１（１）、　Ａｌａ　３．０ ５（３）、　Ｖａｌ　１．９８（２）、　Ｍｅｔ　０．９４（１）、ｌ１ｅＯ， ９４（１）、　Ｌｅｕ　２．００（２）、　Ｔｙｒ　２．９６（３）、　Ｐｈｅ 　Ｏ，９５（１）、　Ｌｙｓ　２゜９９（３）、　Ｈｉｓ　１，０３（１）、　 Ａｒｇ　２．２５（２）質量分析による（Ｍ　＋　Ｈ）３１４７．９ＨＰＬＣ溶 出時間　１８．６９分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５＋２０Ａ）（４，６Ｘ　１ ００） 溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ 酢酸含有アセトニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）流速　：　１．ＯｍＱ／分 １−Ｉ　ＰＡＣＡＰ　１４−３８　ＮＨのム市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アブ ライドバイオシステムズ社製）　１．０４ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、 ペプチド合成機（アブライドバイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、 合成した。

最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し 、樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレ ンで処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏａ− Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂ。

ｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏａ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏｃ−Ｌ ｅｕ、　Ｂｏａ−Ａｌａ、　Ｂｏａ−ＭｅｔをＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ ，のアミノ酸配列通り順ニＨＯＢｔ／ＤＣＣテ活性化シ縮合した。さら４：ＤＣ Ｃまたハ、　ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をし た後、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（１４−３ ８）　ＮＨ，樹脂２．００　ｇを得た。　コノ保護ＰＡＣＡＰ　（１４−３８） ＮＨ，樹脂０．４８ｇをｐ−クレゾー／Ｌ、０．４８ｇ共存下無水フッ化水素５ ｍＱ、でＯ’Ｃ１６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチル エーテル５ｍＱで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ｍΩで抽出した。不 溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍΩで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍ Ｑに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ７５ｃｍ）のカラムに付し、 ５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％ト リフルオロ酢酸水ｌｏｏｍ　Ｑに溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ１２’Ｏ５−５ ０樹脂カラム（２，６Ｘ７ＣＩＩ＋）に付し、０．１％トリフルオロ酢酸水と３ ０％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配 で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末２０．２■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　１．０１（１）、　Ｇｌｕ　２．０１（２）、　Ｇｌｙ　１．００（１ ）、　Ａｌａ　３．０１（３）、　Ｖａｌ　２．８５（３）、　Ｍｅｔ　０．８ ６（１）、　Ｌｅｕ　２．０８（２）、　Ｔｙｒ　１．９８（２）、　Ｌｙｓ６ ．３７（７）、　Ａｒｇ　３．２４（３）質量分析による（Ｍ　＋　Ｈ）　３ｏ ｏ３．６ＨＰＬＣ溶出時間　１３．１分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２０Ａ）溶離液：Ａ液（ ０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセト ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）流速　：　１．ＯｍＱ／分 １−２　ＰＡＣＡＰ　１−１３　０Ｈのム市販のＢｏａ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）− ０ＣＨ，−ＰＡＮ樹脂（アブライドバイオシステムズ社製）　０．８７ｇ　（０ ，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アブライドバイオシステムズ社製 モデル４３０Ａ　）を使用し、合成した。

樹脂上のＢｏＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基 を遊離させた後、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｔｙ ｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ｇｌｙ、　Ｂｏａ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）’、　Ｂｏｃ −Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、　ＢｏＣ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ｐｈｅ、　Ｂ ｏｃ−１１ｅ、　Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）をＰＡＣＡＰ　（１−１３）（７） ７ミ／酸配列通Ｕ　順ニＨＯＢｔ／ＤＣＣテ活性化し縮合した。さらにＤＣＣま たは、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、 未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ（１−１３）ＯＣ Ｈ，−ＰＡＭ樹脂１．８６ｇを得た。

この樹脂０．７０　ｇをｐ−クレゾール０．８１　ｇ共存下無水フッ化水素１０ ｍＱで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエー テル５ｍｆｆで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５ＩｎＱで抽出した。不 溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍＱで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍ Ｑに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ７５ｃｍ）のカラムに付し、 ５０％−酢酸水で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０．１％ トリフルオロ酢酸水１００ｍ　ｆ２に溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ１２０　５ −５０樹脂カラム（２，６×７ｃｍ）に付し、０．１％トリフルオロ酢酸水と３ ３％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配 で溶出した。主要画分を合し、再度同じカラム条件で精製、主要画分を集め凍結 乾燥し、白色粉末３８■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　２．００（２）、　Ｔｈｒ　０１９３（１）、　Ｓｅｒ　２．４３（３ ）、　Ｇｌｕ　１．０５（１）、　Ｇｌｙ　Ｉ、００（１）、　Ｔｙｒ　１，８ ２（２）、　Ｐｈｅ　１．０２（１）、　Ｈｉｓ　１，１３（＋）、　Ａｒｇｌ 、１２（１） 質量分析による（Ｍ　＋　Ｈ）　１５４７．５ＨＰＬＣ溶出時間　１２．３分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−ＯＤＳ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２０Ａ）溶離液：Ａ液（ ０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセト ニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分）流速　：　１．０ｍ２７分 １−３　ＰＡＣＡＰ　４−２７　０ＨのＡ市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ，−Ｐ ＡＭ樹脂（アプライドバイオシステムズ社製）　０．６０ｇ　（０，５ｒｎ　ｍ ｏｌｅ）を用い、ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル４３ ０Ａ）を使用し、合成した。

樹脂上のＢｏＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、アミノ基 を遊離させた後、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）、　Ｂｏｃ−Ｖ ａｌ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂ ｒ−Ｚ）。

Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、　 Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、　Ｂｏａ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｔｈｒ （Ｂｚｌ）、　Ｂｏｏ−Ｐｈｅ、　Ｂｏａ−１ｉｅ、をＰＡＣＡＰ　（４−２７ ）のアミノ酸配列通り順にＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣ または、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後 、未反応のアミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ　（４−２７） ＯＣＨ。

−ＰＡＭ樹脂１．０８ｇを得た。

この保護ＰＡＣＡＰ　（４−２７）ＯＣＨ，−ＰＡＭ樹脂０．２９ｇをｐ−クレ ゾール０．４９ｇ共存下無水フッ化水素５＋＋ｌＩで０℃、６０分間処理した後 、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ｍＱで２回洗浄した後、残 渣を５０％−酢酸水５＋ｎＱで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５＋ ＋＋Ｑで洗浄した。濾液、洗液を合し、２〜３ｍａに減圧濃縮し、セファデック スＬＨ−２０（２Ｘ７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要 画分を集め減圧留去の後、残留物を、Ｏ１１％トリフルオロ酢酸水１００ｍＱに 溶解し、ＹＭＣ−ＯＤＳＡＭ１２０　５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ７ｃｍ）に 付し、１５％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）と５０％アセト ニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型濃度勾配で溶出した 。主要画分を集め凍結乾燥し、白色粉末３３■を得た。これを０．０５Ｍ−酢酸 アンモニア水２０ｍ　Ｑに溶解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム（ＩＸ６ ｃｍ）に付し、水から０．３０　Ｍ−酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出 した。主要画分（０，１８〜０．２２Ｍ）を合して凍結乾燥し、白色粉末３３■ を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　１，０２（１）、　Ｔｈｒ　０．９８（１）、　Ｓｅｒ　１．７８（２ ）、　Ｇｌｕ　１，０７（１）、　ＧＩＶ　１．０２（１）、　Ａｌａ　３．０ ４（３）、　Ｖａｌ　１．８９（２）、　Ｍｅｔ　０．８１（１）、　ｌ１ｅＯ １８９（１）、　Ｌｅｕ　２，００（２）、　Ｔｙｒ　２．９１（３）、　Ｐｈ ｅ　Ｏ，９０（１）、　Ｌｙｓ　２゜８９（３）、　Ａｒｇ　２．２０（２）質 量分析による（Ｍ＋Ｈ）　２８０８．５ＨＰＬＣ溶出時間　１４．５分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−○Ｄ　Ｓ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２ＯＡ）溶離液：Ａ液 （０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセ トニトリル） を用いＡ液からＢ液のｌ］Ｉ線型濃度勾配溶出（３５分）流速　：　１．ＯｍＱ ／分 １−４　ＰＡＣＡＰ　３１−３８　ＮＨのム市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アブ ライドバイオシステムズ社製）　０．９８ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、 ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル４３０Ａ）を使用し、 合成した。

最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ−Ｚ）をＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、 樹脂に縮合した後、樹脂上のＢｏａ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン で処理し、アミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏａ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ｌ ｙｓ（ＣＩ−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏｃ −Ｇｌｎ、　Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）をＰＡＣＡＰ（３１−３８）　ＮＨ， （７）７；　／酸配列通り順ニＨＯＢｔ／ＤＣＣテ活性化し縮合した。さらにＤ ＣＣまたは、ＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をし た後、未反応の７ミノ基は無水酢酸でアセチル化し、保護ＰＡＣＡＰ　（３１− ３８）ＮＨ，樹脂２．００　ｇを得た。

この保護ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，樹脂０．４３　ｇをｐ−クレゾール ０．６ｇ共存下無水フッ化水素５ｍＱで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素 を減圧留去し、残渣をエチルエーテル５ＩＩＩＱで２回洗浄した後、残渣を５０ ％−酢酸水５ｍＱで抽出した。不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ｍΩで洗浄し た。

濾液、洗液を合し、２〜３ｍＱに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ ７５ｃｍ）のカラムに付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去 の後、残留物を、Ｏ０１％トリフルオロ酢酸水ｌｏｏｍαに溶解し、ＹＭＣ−〇 ＤＳ　ＡＭＩ２０　５−５０樹脂カラム（２，６Ｘ７ｃｍ）に付し、０．１％ト リフルオロ酢酸水と３３％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の 間での直線型濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末４５ ■を得た。

アミノ酸分析値 Ａｓｐ　１，０２（１）、　Ｇｌｕ　１．０５（１）、　Ｖａｔ　１．００（１ ）、　Ｔｙｒ　Ｏ，９０（１）、　Ｌｙｓ　２．９８（３）、　Ａｒｇ　１．１ ２（１）質量分析による（Ｍ　十Ｈ）　１０６２．７ＨＰＬＣ溶出時間　１１． ６分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−〇Ｄ　Ｓ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２０Ａ）溶離液：Ａ液 （０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセ トニトリル）を用いＡ液からＡ：Ｂ（４：１）混合液へ直線型濃度勾配溶出（２ ０分） 流速　：　１．Ｏ＋ｎＱ／分 １−５　Ｃｓ”　ＰＡＣＡＰ　Ｉ　ｌ−２７ＮＨの皇亘 市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライドバイオシステムズ社製）　０．６６ｇ 　（０，５ｍ　ｍｏｌ）を用い、ペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ 社製モデル４３０Ａ）を使用し、合成した。

最初のアミノ酸、Ｂｏｃ−ＬｅｕをＨＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し、樹脂に縮合し た後、樹脂上のＢＯＣ基を５０％トリフルオロ酢酸／塩化メチレンで処理し、ア ミノ基を遊離させ、このアミノ基に、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、　Ｂｏｃ−Ａｌａ、　Ｂ ｏａ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ｌｙｓ（Ｃ１−Ｚ）、　Ｂｏａ−Ｍｅｔ 、　Ｂｏｃ−Ｇｉｎ、　Ｂｏａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、　Ｂｏａ−３ｅｒ（Ｂｚｌ ）、　Ｂｏａ−Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ）を目的ペプチドのアミノ酸配列通り順にＨ ＯＢｔ／ＤＣＣで活性化し縮合した。さらにＤＣＣまたは、Ｉ（ＯＢｔ／ＤＣＣ で活性化した同じアミノ酸誘導体で再度縮合をした後、未反応のアミノ基は無水 酢酸でアセチル化し、保護［Ｃｙｓ”］　ＰＡＣＡ　Ｐ　（１１−２７）ＮＨ， 樹脂１．２０ｇを得た。

この保護樹脂０．６０　ｇをｐ−クレゾール１，０ｇ共存下無水フッ化水素１０ ｍＱで０℃、６０分間処理した後、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチルエー テル５ｍｆｉで２回洗浄した後、残渣を５０％−酢酸水５＋＋＋Ｑで抽出した。

不溶物を濾去し、５０％−酢酸水５ＩＩＩＱで洗浄した。濾液、洗液を合し、２ 〜３ｍＱに減圧濃縮し、セファデックスＬＨ−２０（２Ｘ７５ａｎ）のカラムに 付し、５０％−酢酸で溶出した。主要画分を集め減圧留去の後、残留物を、０． １％トリフルオロ酢酸水１００＠Ａに溶解し、ＹＭＣ−００Ｓ　ＡＭ１２０　５ −５０樹脂カラム（２゜６Ｘ　７　ｃＴｌｌ）に付し、０．１％トリフルオロ酢 酸水と５０％アセトニトリル（０，１％トリフルオロ酢酸含有）の間での直線型 濃度勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末７０■を得た。ア ミノ酸分析値 Ｓｅｔ　０．９２（１）、　Ｇｌｕ　１．０７（１）、　Ａｌａ　２．００（２ ）、　Ｖａｌ　１．９６（２）、　Ｍｅｔ　０．８８（１）、　Ｌｅｕ　１．９ ３（２）、　Ｔｙｒ　１．８７（２）、　Ｌｙｓ　２，９１（３）、　Ａｒｇ２ ．１７（２） 質量分析による（Ｍ　十Ｈ）　２１２７．９ＨＰＬＣ溶出時間　２０．８分 カラム条件 カラム：　ＹＭＣ−〇Ｄ　Ｓ　（ＡＭ−３０１，Ｓ−５１２０Ａ）溶離液：Ａ液 （０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（０，１％−トリフルオロ酢酸含有アセ トニトリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分）流速　：１．釦Ｑ／分 ’　２−Ｉ　ＰＡＣＡＰ３８ＮＨむ　の　１上記参考例１で得られたＰＡＣＡＰ ３８ＮＨ，と牛チログロブリン（ＢＴＧ）との複合体を作製し、免疫原とした。

即ち、ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，２，８ｍｇとＢ　Ｔ　Ｃ８，４ｍｇとを１ｍ ｇの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，９に溶解させ、最終濃度、０゜０４％のグ ルタルアルデヒドを加え、室温で２時間反応させた。

反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。

実施例２−２ ＰＡＣＡＰ　１１−２７　ＮＨ’の 上記実施例１−５で得られた［Ｃｙｓ”）ＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ，と ＢＴＧとの複合体を作製し免疫原とした。

即ち、ＢＴＧ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，９）　１．４ｍｌ に溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド（Ｇ　Ｍ　Ｂ　 Ｓ　）２．２ｍｇ（８μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｍと混合し、室温で ４０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マ レイミド基の導入されたＢＴＧ１２ｎ＋ｇと　［Ｃｙ　ｓ”ＩＰＡＣＡＰ　（１ １−２７）ＮＨ，３，０＋ｏｇとを混合し、４℃で３日間反応させた。反応後、 生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。

３−Ｉ　ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ−ＢＴＧムの６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに 上記実施例２−１記載の免疫原ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，−ＢＴＧ複合体８０μｇ／ 匹を完全フロインドアジュバントとともに皮下免疫した。以後４週問おきに同量 の免疫原を不完全フロインドアジュバントとともに２〜３回追加免疫した。

実施例３−２　ＰＡＣＡＰ　１１−２７　ＮＨ−ＢＴＧ皇左二Ａ反 雄性家兎に、上記実施例２−２記載のＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ，−ＢＴ Ｇ複合体４００μｇ／羽を完全フロインドアジュバントとともに皮下免疫した。

以後４週問おきに同量の免疫原を不完全フロインドアジュバントとともに６回追 加免疫した。

４−１　ワサビバーオ　シダーゼ　ＨＲＰＰＡＣＡＰ３８ＮＨの 上記参考例１で得られたＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，とＨＲＰとを架橋し、酵素免疫測 定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）の標識体とした。

即ち、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，１８０ｎ　ｍｏｌ　をｓｏｏμｇの０．１Ｍリン酸 緩衝液、ｐＨ６，８に溶解させ、Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　４５０ｎ　＋ｕｏｌ　を含む ＤＭＦ溶液５０μ２と混合し、室温で３０分反応させた。反応後、セファデック スＧ−１５カラムで分画を行ないマレイミド基の導入されたポリペプチド１００ ｎ　ｍｏｌを得た。

一方、ＨＲＰ７．９ｍｇ　（２００ｎ　ｍｏｌ）を０．１５Ｍ食塩を含む０．０ ２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８，０，９５＋＋＋Ｑに溶解させ、５ＰＤＰ〔Ｎ− スクシニミジル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート）　１，５４ｍ ｇ　（４，９μｍｏｌ）　を含むＤＭＦ溶液５０１．ｔＬ２と混合したのち室温 ４０分間反応させた。反応後、ジチオスレイトール８．２ｍｇ　（５３μｍｏｌ ）を含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝液、ｐ　Ｈ４，５，０、３３ｍ　Ｑを加え、室温２０ 分反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画を行ない、ＳＨ基の導 入された酵素６■（１００ｎ　ｍｏｌ）を得た。

次に、マレイミド基導入ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，１００ｎ　ｍｏｌとＳＨ基 導入ＨＲＰ　１ｏｏｎ　ｍｏｌとを混合し、４℃、■６時間反応させた。反応後 ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ 標識化ＰＡＣＡＰ３８を得た。

４−２　ＨＲＰ　化ＰＡＣＡＰ’　１１−２７　ＮＨＪ針甑製 ＨＲＰ　８　ｍｇ　（２００ｎ　ｍｏｌ）　を９５０μｍの０．１Ｍリン酸緩衝 液、ｐＨ６，８に溶解させ、Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓ　１．４ｍｇ　（５μｍｏｌ）を含 むＤＭＦ溶液５０μＱと混合し、室温で４０分間反応させたのち、セファデック スＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入さ れたＨ　ＲＰ　３，３ｍｇ（７８ｎ　ｍｏｌ）と実施例１−５で作製された［Ｃ ｙｓ”ＩＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ，０，６５＋ｎｇ（３１０ｎｍｏｌ） とを混合し、４℃で１日反応させた。

反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４　（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し 、ＨＲＰ標識化（Ｃｙ　ｓ”ＩＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ，を得た。

５−１　マウス　血゛　の　の マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリ ン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗 体（Ｉ　ｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍα含む０，１Ｍ炭酸緩衝液 、ｐＨ９゜６溶液を９６ウエルマイクロプレートに１００μΩずつ分注し、４℃ で２４時間放置した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄したのち、ウェルの余剰の 結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳを３ ００μΩずつ分注し、少なくとも４℃で２４時間処理した。

上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウェルにバッフ ァーＥ［１０％ブロックエース、２■／ｍＱ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０． ４Ｍ　ＮａＣ１，２ｍＭＥＤＴＡおよび０，１％　ＮａＮ、を含む０．０２Ｍリ ン酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，０］　５０μαおよびバッファーＥで希釈したマウス抗 ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，抗血清５０μΩを加え４℃で１６時間反応させた。

次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例４−１で作製したＨＲＰ 標識化ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，［２ｍｇ／＋ＱＢ　Ｓ　Ａ、　０．１５Ｍ　Ｎ　ａ 　Ｃｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０（バッファーＨ）で２００倍 希釈］１００μΩを加え、室温で６時間反応させた。反応後ＰＢＳで洗浄したの ち、固相上の酵素活性を測定するため０．２％オルソフェニレンジアミン、０． ０２％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５，５を１００μΩずつ 分注し、室温で１０分間反応させた。４規定硫酸１００μαを加え、反応を停止 させたのち、４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社製 ）で測定し結果を第１図に示す。免疫した８匹のマウスのうち４匹に抗ＰＡＣＡ Ｐ３８抗体価の上昇が認められた。

５−２　血′　の　の 家兎抗血清中の抗体価を同様の方法により測定した。抗ウサギイムノグロブリン 抗体（Ｉ　ｇＧ画分、カッペル社製）結合マイクロプレートを、上記実施例５− １記載の方法により作製した。該プレートに、バッファーＥ　５０μαおよびバ ッファーＥで希釈した家兎抗ＰＡＣＡＰ　（１１−２７）ＮＨ。

抗血清５０μ２を加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで 洗浄したのち、上記実施例４−２で作製したＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ　（１１− ２７）ＮＨ，（バッファーＨで２００倍希釈）　１００μαを加え、室温で６時 間反応させた。

反応後ＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を、ＴＭＢマイクロウェルパー オキシダーゼ基質システム（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆　ＰＥＲＲＹ　ＬＡＢ、　 ｒＮｃ、フナコシ薬品（株）取扱い）を用いて測定した。吸光度（４５０ｎｍ） の測定にはプレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）を用いた。結果を第 ２図に示す。免疫した総ての家兎に高い抗体価が検出されたゆ６ム 比較的高い抗体価を示したマウス庖５に対して２００μｇの免ｇ！原を生理食塩 水０．２５ｍ　Ｑに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行 なった。最終免疫４日後のマウスから膵臓を摘出し、ステンレスメツシュで圧迫 、ろ過し、イーグルス・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊 させ、膵臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウ ス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３゜Ａｇ８．０１　（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カ レント　トピックスインマイグロバイオロジーアンドイムノロジー、旦、１（１ ９７８）］、細胞融合は、原注〔ネイチャー、て匝、４９５（１９５７）］に準 じて行なった。即ち、肺臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥ Ｍで３度洗浄し、肺臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、８ ００回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後 、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　６０００　（ コツ本ライト社製）を０．３ｍＱ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を 行なった。融合後細胞に毎分２ｍＱの割合でＭＥＭを添加し、合計１２ｔｘ　Ｑ のＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿 物をｌＯ％牛脂児血清を含有するＧＩＴメディウム（和光紬薬）（ＧＩＴ−１０ ＦＣ３）　にＰ３Ｕ１が１ＩＩＩＱ当す２　ＸＩＯ’ｆｉｌ、−す６．Ｊ。

うに浮遊し、２４穴マルチデイシユ（リンプロ社製）にｌウェルｌａＱずつ１２ ０ウエルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスフラン器中培養した 。２４時間後ＨＡＴ　（ヒボキサンチンｌＸｌ０”Ｍ、アミノプテリン４ｘｌＯ −”Ｍ、チミジン１゜６ｘｔｏ−”Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０ＦＣ３培地（ＨＡ Ｔ培地）をｌウェル当り１ｍ１２ずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開 始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３．６．９日後に旧液を１ｒｓＱ捨てたあ と、１＋ｎＱのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増 殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約１ｘｔｏ’ セル／　ｍ　Ｑ　）、上清を採取し、抗体価を測定した。

７　ハ　ブリ゛−マのスクリーニング 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイグロブレートにバッファーＥ５０μαと ハイブリドーマ培養上清５０μＣとを加え、室温で６時間反応させた。プレート をＰＢＳ″Ｃ−洗浄したのち、上記４で作製したＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ３８Ｎ Ｈ，［バッファーＨで２００倍に希釈］１００μαを加え、４℃で１６時間反応 させた。次に、プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を上記実施 例５−１記載の方法により測定した。

このようにして、ハイブリドーマの増殖が認められた全１２０ウエルの上清を調 べたところ、１８ウエルに抗体価が認められた。

８　クローニング 抗体活性が陽性を示したウェルのうち、Ｎｏ、４４、Ｎｏ、４９、Ｎｏ。

９７、Ｎｏ、１１３の各ハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付し た。即ち、ハイブリドーマが１．５個／ｍΩになるようＲＰＭ　Ｉ　１６４０− ２０Ｆ　ＣＳに浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）にｌウェル当 り０．２ｍβずつ分注した。分注する際、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマ ウスの胸腺細胞をウェル当り５×ｌＯ°個になるように加えた。約１週間後には 細胞の増殖が認められるようになり、上清中の抗体価を上記実施例５記載のＥＩ Ａ法により調べたところ、Ｎ’ｏ、４４のハイブリドーマでは３０クローン中２ ８クローンが、Ｎｏ、４９のハイブリドーマでは５０クローン中４７クローンが 、Ｎｏ、９７のハイブリドーマでは５０クローン中４９クローンが、　Ｎｏ、１ １３のハイブリドーマでは５０クローン中４８クローンが抗体を産生じていた。

これらのクローンのうち、Ｎｏ、４４−２より得られたクローンＰＡ−６Ｎおよ びその産生ずるモノクローナル抗体ＰＡ−６Ｎ　ａ　、　Ｎｏ、４９−３より得 られたクローンＰＡ−Ｉ　Ｎおよびその産生ずるモノクローナル抗体ＰＡ　−Ｉ 　Ｎａ、　’Ｎｏ、９７−２より得られたクローンＰＡ−２Ｃおよびその産生ず るモノクローナル抗体ＰＡ　−２Ｃａ、　Ｎｏ、１１３−５より得られたクロー ンＰＡ−５Ｎおよびその産生ずるモノクローナル抗体ＰＡ−５Ｎａに注目し、以 下の実験を実施した。

また、同様にして、免疫中の他のマウスの肺臓細胞を用いて細胞融合実験を実施 し、Ｎｏ、２８−１２より得られたクローンＰＡ−ＩＣおよびその産生するモノ クローナル抗体ＰＡ−ＩＣａおよびＮｏ、１０−３より得られたクローンＰＡ− ３Ｎおよびその産生ずるモノクローナル抗体Ｐ　Ａ　−３Ｎ　ａにも注目し、以 下の実験を実施した。

９　のモノクローナル　の　１ ミネラルオイル０．５ａ＋Ａを腹腔内投与されたマウス、あるいは未処置マウス （ＢＡＬＢ／Ｃ）に上記ハイブリドーマ　１〜３Ｘ］Ｏ”セルフ匹を腹腔的注射 したのち、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。

ス１　ｌＯモノ　ローナル　の 上記実施例９調製腹水よりプロティン−Ａカラム、あるいはジエチルアミノエチ ル（ＤＥＡＥ）−セルロースカラムによりモノクローナル抗体を精製した。

即ちＰＡ−ＩＮの腹水６ｍΩを等量の結合緩衝液（３，５ＭＮａＣ１，０，０５ ％Ｎ　ａ　Ｎ、を含む１．５Ｍグリシン、ｐ　Ｈ９，０）で希釈したのち、あら かじめ結合緩衝液で平衡化したプロティン−Ａ−セファロース（ファルマシア製 ）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０，０５％ＮａＮ、を含む０，１Ｍク エン酸緩衝液、ｐ　Ｈ３，０）で溶出した。以上の操作により、２８■の特異抗 体を得た。

同様にして、ＰＡ−５Ｎの腹水５＋ｎｆｉより２３■の特異抗体を、ＰＡ−６Ｎ の腹水７．５ｍαより１３■の特異抗体を、また、ＰＡ−ＩＣの腹水＋４ｍ　Ｑ より、４５■の特異抗体を得た。

一方、ＰＡ−３Ｎの腹水２０ｍ　Ｑに最終濃度４５％の飽和硫安溶液を加え塩析 後、遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）し、沈殿画分を０．１５ＭのＮａＣｌ を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８（ＢＢＳ）Ｇ、、対し透析し、さらに、 ０．ＯＩＭ（７）Ｎ　ａ　Ｃｌを含む０．０１　Ｍリン酸緩衝液に対し透析した 。該抗体画分をＤＥＡＥセルロースカラム（２，５Ｘ１０ａｎ、ワットマン社製 ＤＥ−５２）に供し、ＮａＣ１濃度の直線勾配（０，ＯＩＭ−０，３５Ｍ）　１ ００ｍ１２で溶出した。以上の操作により特異抗体１３６■を得た。

同様にして、ＰＡ−２Ｇの腹水７．５ｍＱから特異抗体５７■を得た。

１１　モノクローナル　のクラス・サブクースの上記調製ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ， を５μｇ／ｍＲ１を含ムｏ、ＩＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６溶液を９６ウエルマイ クロプレートに１００μαずつ分注し、４℃で２４時間放置した。上記実施例５ −１で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさぎ ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，結合プレートを作製した。次に該プレートに、ＰＡ−ＩＮ 、ＰＡ−３Ｎ、ＰＡ−５Ｎ、ＰＡ−６Ｎ、ＰＡ−２ＣおよびＰＡ−ＩＣの培養上 清１００μｇを加え、室温で３時間反応させたのち、アイソタイプタイピン グキット（Ｍｏｕｓｅ−ＴｙｐｅｒＴＭＳｕｂ−１ｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔバ イオラッド社製）を用いるエンザイムーリンクトイムノソーペントアッセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）によってクラス、サブグラスを調べた。

その結果ＰＡ−］、Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２Ｃａ、およびＰＡ−ＩＣａは ＩｇＧ１、に、ＰＡ−５ＮａはＩｇＧ２ａ。

に、ＰＡ　３ＮａはＩｇＧ２ｂ、にであった。

１２Ｆａｂ′画の１ 上記実施例１Ｏ記載のＰＡ−６Ｎａをコロジオンバッグ（エムニス機器社製）で ８■７５００μ０にまで濃縮したのち、０．１ＭＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸緩 衝液に対し透析した。該抗体溶液にペプシン（シグマ社、２回結晶）０．４■を 加え、３７℃、１６時間反応させたのち、０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，８で 平衡化したスーパーロース１２カラムを用いるＦＰＬＣ（ファルマシア社製）で Ｆ（ａｂ’）、画分を精製した。

同様の手法により、上記実施例１０記載のＰＡ−ＩＣａ８，９■に０．４４５■ のペプシンを加え、Ｆ（ａ　ｂ’）　、画分を調製した。

１３　ＨＲＰ　ＰＡＣＡＰモノクロ−ル　の上目１ （１）ＰＡ−６Ｎａ　Ｆ（ａｂ’）、−ＨＲＰ上記実施例１２記載ＰＡ−６Ｎａ 　Ｆ（ａｂ’）、画分２．２■（２２ｎｍｏｌ）／ｍＱ、１ｍＱにＧ　Ｍ　Ｂ　 Ｓ　、　２６０　ｎｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｍを加え、室温で４０分反応させ た。反応液をセファテックスＧ−２５カラム（ＩＸ３０ｃｍ、溶離液、０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐ　Ｈ６，７）で分離し、得られたマレイミド基の導入されたＦ （ａｂ“）、両分１．５■と、上記実施例４−１記載の方法により調製されたＳ Ｈ基の導入されたＨＲＰ５．５■とを混合し、コロジオンバッグで約０．３＋＋ ＋Ωにまで濃縮したのち、４℃で１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ６，５を用いるクルトロゲルＡｃＡ３４カラム（１０ｍｍφ Ｘ４０Ｍ）に供し、Ｆ（ａｂ’）、　−ＨＲＰ複合体画分を精製した。　２８０ ｎｍと４０３ｎｒｎの吸光度から、Ｆ（ａ　ｂ’）、　１分子あたり２．４ケの ＨＲＰが導入されたことが確認された。

（２）ＰＡ−ＩＣａ　Ｆ（ａｂ’）、−ＨＲＰ同様の方法により、上記実施例１ ２に記載ＰＡ−１ｃａＦ（ａｂ’）、画分２．９■を用いて、Ｆ（ａｂ’）、− ＨＲＰ複合体を作製した。

（３）ＰＡ−２Ｃａ　ＩｇＧ−ＨＲＰ 上記実施例１０記載のＰＡ−２Ｃａ精製画分６．４ｍｇ　（４３ｎ　ｍｏｌに１ ５倍ｍｏｌのＧＭＢＳを加え、マレイミド基を導入後同様の方法により、ＳＨ基 を導入されたＨＲＰと反応させ、ＩｇＧ１分子あたり、２．４ケのＨＲＰが導入 された標識体を作製した。

１４　ムーＥＩＡ （１）ＰＡ−ＩＮａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例５記載の抗マウスイムノ グロブリン抗体結合マイグロブレートに、バッファーＨで５０倍に希釈したＰＡ −ＩＮ培１１上１５ｏμｆｆ、およびＰＡＣＡＰｔｐ、るいはＰＡＣＡＰＨ分ペ ブタイド、即ち、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡ　Ｐ　２７ＮＨ，、ＰＡＣＡ Ｐ　（４−２７）、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）Ｎ Ｈ，、ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，、あるいはＶＩＰのバッファーＨ溶液 ５０μΩを加え、室温で２時間反応させたのち、上記実施例４−１記載ＨＲＰ標 識化ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，（バッフ７’−ＨテｌＯＯ倍希釈）を５０μＣ 加え、４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素 活性を上記実施例５記載の方法により測定した。結果を第３図（ａ）に示す。

図中、−〇−がＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，を、−・−がＰＡＣＡＰ２７ＮＨＪ、−ム 一がＰＡＣＡＰ　（４−２７）ＯＨを、−履一がＰＡＣＡＰ　（２−１３）ＯＨ を、−△−がＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，を、−ローがＰＡＣＡＰ　（３ １−３８）ＮＨ，を、またー×−がＶＩＰの標準曲線を示す。

第３図（ａ）の結果から、ＰＡ−ＩＮａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ２ ７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）ＯＨ。

ＰＡＣＡＰ　（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、 ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（ 交差反応性０．１％以下、対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）ことから、ＰＡＣＡＰ３８ ＮＨ，のＮ端部分を認識する、クラスＩａの抗体であることが分った。

（２）ＰＡ−５Ｎａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例１４−（１）記載の方法 により、ＰＡ−５Ｎａを用いる（ＰＡ−５Ｎの培養上清７０倍希釈）競合法−Ｅ ＩＡを実施した。結果を第３図（Ｃ）に示す。この結果から、ＰＡ−５Ｎ　ａが 、ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１−１ ３）ＯＨ，ＰＡＣＡＰ　（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８ ）ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨおと反応せず、また、ＶＩＰとも反 応しない（交差反応性０．１％以下）ことから、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＮ端部 分を認識するクラスＩａの抗体であることが分った。

なお、ＰＡ−ＩＮａとＰＡ−５Ｎａとは、ＰＡ’ＣＡＰ（１−１３）ＯＨとの交 差反応性（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）において異っており、該交差反応性は前者 が後者の１０倍以上強い。

（３）ＰＡ−３Ｎａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例＋４−（１）記載の方法 により、（ＰＡ−３Ｎの培養上清５０倍希釈）ＰＡ−３Ｎａを用いる競合法−Ｅ ＩＡを実施した。結果を第３図（ｂ）に示す。この結果から、ＰＡ−３ＮａがＰ ＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ（１−１３）○Ｈ，Ｐ ＡＣＡＰ（４−２７）ＯＨと反応し、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、ＰＡ ＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，と反応せず、一方、ＶＩＰとは１％の交差反応性 を示す（対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）ことから、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＮ端部分 を認識するクラスＩｂの抗体であることが分った。

（４）ＰＡ−６Ｎａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例１４−（１）記載の方法 により、（ＰＡ−６Ｎの培養上清４０倍希釈）ＰＡ〜６Ｎａを用いる競合法−Ｅ ＩＡを実施した。結果を第３図（ｄ）に示す。この結果から、ＰＡ−６ＮａがＰ ＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（４−２７）ＯＨと 反応し、ＰＡＣＡＰ　（１−１３）ＯＨ，ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、 ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，と反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（ 交差反応性０．１％以下、対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）ことから、ＰＡＣＡＰ３８ ＮＨ，のＮ端部分から中央部分に至る領域を認識するクラス■の抗体であること が分った。

（５）ＰＡ−２Ｃａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例１４−（１）記載の方法 により、（ＰＡ−２Ｃの培養上清３４０倍希釈）ＰＡ−２Ｃａを用いる競合法− ＥＩＡを実施した。結果を第３　［１１（ｅ　）に示す。この結果から、ＰＡ− ２ＣａがＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，と反応し、 ＰＡＣＡＰ　２７　ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（４−２７）○Ｈ，ＰＡＣＡＰ　（１ −１３）ＯＨ，ＰＡＣＡＰ　（３１−３８）ＮＨ，と反応せず、また、ＶＩＰと も反応しない（交差反応性０．１％以下、対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）ことから、 ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，のＣ端部分から中央部分に至る領域を認識するクラス■の 抗体であることが分った。

（６）ＰＡ−ＩＣａを用いる競合法−ＥＩＡ上記実施例１４−（１）記載の方法 により、（ＰＡ−ＩＣの培養上清３５倍希釈）ＰＡ−ＩＣａを用いる競合法−Ｅ ＩＡを実施した。結果を第３図（ｆ）に示す、この結果から、ＰＡ−ＩＣａがＰ ＡＣＡＰ３８ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（１４−３８）ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（３１ −３８）ＮＨ，と反応し、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＰＡＣＡＰ　（４−２７）○ Ｈ，ＰＡＣＡＰ　（１−１３）ＯＨと反応せず、また、ＶＩＰとも反応しない（ 交差反応性０．１％以下、対ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，）ことから、ＰＡＣＡＰ３８ ＮＨ，のＣ端部分を認識するクラス■の抗体であることが分った。

以上、ＰＡ−ＩＮａ、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−３Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２Ｃ ａおよびＰＡ−ＩＣａを用いる競合法−ＥＩＡにより、それぞれ少なくとも４０ ０．１００．２００．２００．２０および２００＋）　ｇ　／ウェルのＰＡＣＡ Ｐ３８ＮＨ，を検出する（Ｂ／Ｂｏ＝８０％を与えるＰＡＣＡＰ濃度）ことが可 能であった。

１５　サン１イツチ　−ＥＩＡ （１）ＰＡ−６Ｎａ　Ｆ（ａｂ’）、−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ 上記実施例１０記載の精製したモノクローナル抗体ＰＡ−］Ｎａ、ＰＡ−３Ｎａ 、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２ＣａあるいはＰＡ−１ｃａ１５μｇ／ ｍＱを含む０，１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９，６溶液を９６ウエルマイグロプレート に１００μΩずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰の結合部位を ＰＢＳで４倍希釈したブロックエース３００μαを加え不活化した。

以上のように調製したプレートに、バッファーＥで希釈したＰＡＣＡＰ３８ＮＨ ，標準液１００μαを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち 、上記実施例＋３−（１）で作製したＨＰＲ標識化ＰＡ−６Ｎａ　Ｆ（ａｂ’） 、（バッファーＣで１００倍希釈）１００μαを加え、４℃で２４時間反応させ た。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例５記載の方法により固相上の酵素活性を 測定した。結果を第４図に示す。

ＰＡ−６Ｎａ（クラスｎ）Ｆ（ａ　ｂ’）、　−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法 −ＥＩＡにおいては、固相用抗体としてＰＡ−２Ｃａ　（クラス■）を用いた場 合が最も高感度であり、少なくとも０．４ｐ　ｇ　／ウェルのＰＡＣＡ　Ｐ　３ ８　Ｎｆ（、を検出することが可能であった。また、固相用抗体としてＰＡ−Ｉ Ｃａ（クラス■）を用いた場合２ｐｇ／ウェルの、また、ＰＡ−５Ｎａ　（クラ スＩａ）を用いた場合４０ｐ　ｇ　／ウェルのＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が検出され た。

以上の結果から、クラス■の抗体であるＰＡ−６Ｎａを標識体として用いた場合 、他のいずれのクラス（１次配列上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体 としてもサンドイッチ法−ＥＩＡが設定されること、とりわけ、クラスｍの抗体 であるＰＡ−２Ｃａを固相用抗体とするサンドイッチ法−ＥＩＡが高感度である ことが分った。

（２）ＰＡ−Ｉ　Ｃａ　Ｆ（ａ　ｂ’）、−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−Ｅ ＩＡ 上記（１）記載の各種抗体を感作したマイクロプレートと上記実施例１３−（２ ）記載のＨＲＰ標識化ＰＡ−ＩＣａＦ（ａｂ’）、とを用いるサンドイッチ法− ＥＩＡを上記（１）記載の方法により実施した。結果を第５図に示す。

ＰＡ−ＩＣａ（クラスｒＶ）　Ｆ（ａ　ｂ’）、　−ＨＲＰを用いるサンドイッ チ法−ＥＩＡにおいては、固相用抗体としてＰＡ−３Ｎａ　（クラスＩｂ）を用 いた場合が最も高感度であり、少なくともｌｐｇ／ウェルのＰＡＣＡＰ３８ＮＨ ，を検出することが可能であった。また、固相用抗体として、ＰＡ−ＩＮａ（ク ラスＩａ）、ＰＡ−５Ｎａ（クラスＩａ）、ＰＡ−６Ｎａ（クラス■）を用いた 場合、少なくとも２ｐｇ／ウェルのＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が検出された。さらに 、１次配列上隣接するクラス■の抗体を固相用抗体としても少なくとも８ｐｇの ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が検出された。

以上の結果から、クラス■の抗体であるＰＡ−１ｃａを標黒体として用いた場合 、他のいずれのクラス（１次配列上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体 としてもサンドイッチ法−ＥＩＡが設定されること、とりわけ、クラスＩｂの抗 体であるＰＡ−３Ｎａを固相用抗体とするサンドイッチ法−ＥＩＡが高感度であ ることが分った。

（３）ＰＡ−２Ｃ：ａ　ＩｇＧ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ 上記（１）記載の各種抗体を感作したマイクロプレートと上記実施例＋３−（３ ）記載のＨＲＰ標識化ＰＡ−２ＣａＩｇＧとを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡを 上記（１）記載の方法により実施した。結果を第６図に示す。

ＰＡ−２Ｃａ（クラスＩｌｌ）ＩｇＧ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ においては、固相用抗体としてＰＡ−３Ｎａ（クラスＩｂ）を用いた場合が最も 高感度であり、少なくとも２ｐｇ／ウェルのＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，を検出するこ とが可能であった。また、固相用抗体として、ＰＡ−ＩＮａ、ＰＡ−５Ｎａおよ びＰ　Ａ　−６Ｎ　ａを用いた場合には、４ｐｇ／ウェルの、またＰＡ−ＩＣａ を用いた場合には８０ｐ　ｇ　／ウェルのＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，が検出された。

以上の結果から、クラスｍの抗体であるＰＡ−２Ｃａを標識体として用いた場合 、他のいずれのクラス（１次配列上隣接するクラスも含む）の抗体を固相用抗体 としてもサンドイッチ法−ＥＩＡが設定されること、とりわけ、クラスＩｂの抗 体であるＰＡ−３Ｎａを固相用抗体とするサンドイッチ法−ＥＩＡが高感度であ ることが分った。

１６　サンドイッチ　−ＥＩＡの 上記実施例１５−（１）記載の、ＰＡ−２Ｃａを固相用抗体とし、ＰＡ−６Ｎａ 　Ｆ（ａｂ’）、−ＨＲＰを標識用抗体とするサンドイッチ法−ＥＩＡにおいて 、ＰＡＣＡＰ’３８ＮＨ，、ＶＩＰ、ＧＲＦ、およびセクレチンに対する反応性 を検討した。結果を第７図に示す。

図中、−ｏ　−ｈ＜、ＰＡＣＡ　Ｐ　３８　ＮＨ，（７）、−＠　−カＰ　ＡＣ ＡＰ２７ＮＨ，の、−ム−がＶＩＰの、−△−がＧＲＦの、またー■−がセクレ チンの濃度依存曲線を示す。

該測定法ニオイテハ、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、ＶＩＰ、ＧＲＦ、およびセクレチ ンに対する交差反応性はいずれも０．００１％であり、該測定法がＰＡＣＡＰ３ ８ＮＨ，に特異的であることが分った。

実施例１７　ＰＡＣＡＰ　１１−２７　ＮＨの家兎ＰＡＣＡＰ（１１−２７）Ｎ Ｈ，を精製するためのアフイニテイ固相を作製した。すなわち、［Ｃｙｓ”ＩＰ ＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，４，５ｍｇを２０ｍ１の０．５Ｍ食塩を含む０． １Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解させ、３ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂと 室温３時間反応させた０次に、未反応の活性基を００１Ｍトリス−塩酸緩衝液、 ｐＨ８で処理したのち、ＰＢＳに分散させ、カラムに充填した。

高い抗体活性が認められた家兎ＰＡＣＡ　Ｐ（１１−２７）ＮＨ１抗血清ＩＣ８ ｍｌ、２Ｃ８ｍｌおよび３Ｃ１６ｍｌ（第２図参照）を混合し、ＰＢＳ３２＋ｕ ｌを加えたのち、さらに５２ｍ１の飽和硫安を徐々に撹拌したのち、１２，０Ｏ ＯＸ　ｇで２０分間遠心し、沈殿を０．１５Ｍ食塩を含むホウ酸緩衝液、ｐＨ８ （以下ＢＢＳと略す）　２５ｍ１に溶解させたのちＢＢＳに対し４℃、２日間透 析した。透析後、上記カラムに付し、ＢＢＳで十分に洗浄したのち特異抗体を０ ．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４，５で溶出し、さらに０．１Ｍ食 塩を含む０．０５Ｍグリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ２，０で溶出した。その結果ｐ 　Ｈ４，５およびｐＨ２で溶出された画分にそれぞれ特異抗体５．４ｍｇおよび ６．７ｍｇが得旦ヱニエ盃 上記実施例１７記載の抗ＰＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，抗体より、石川らの方 法［ジャーナルオブアプライドバイオケミストリ−（Ｊ、　Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、）、　６　：　５６−６３（１９８４）］に従ってＦａｂ’　−ペルオ キシダーゼ標識体を作製した。

即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４，５に溶解した特異抗体５．６ｍｇにペプシ ン（シグマ社、２回結晶）１６０μｇを加え、３７℃、２００時間反応せたのち 、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５で平衡化したスーパーロース１２カラムを用いる ＦＰＬＣ（ファルマシア社製）でＦ（ａｂ’）、画分２．２ｍｇを得た。該両分 に、最終２０ｍＭのβ−メルカプトエチルアミンを加え、３７℃で９０分放置し たのち、反応液を５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，０で平 衡化したセファデックスＧ−２５カラムで分離し、Ｆａｂ’　画分を得た。

一方、上記実施例４−２記載の方法に従って調製したマレイミド化ＨＲＰ６ｍｇ と、上記抗ＰＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，Ｆａｂ’　画分全量とを混合し、４ ℃で２日間反応させたのち、０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６，５で平衡化したク ルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、ＨＲＰ標識化抗ＰＡＣＡＰ（１１、−２ ７）ＮＨ，Ｆ　ａ　ｂ’　を精製した。

（１）上記実施例１５記載のＰＡ−ＩＮａを固定したマイクロプレートに、バッ ファーＥで希釈したＰＡＣＡＰ２７ＮＨ６、ＰＡＣＡＰ（１−２７）ＯＨ，ＰＡ ＣＡＰ３８Ｎ）（、標準液ｌＯＯμαを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢ Ｓで洗浄したのち、上記実施例１８記載ＨＰＲ標識化抗ＰＡＣＡＰ（１１−２７ ）ＮＨ，Ｆ　ａ　ｂ’　（バッフｙ−Ｃで４００倍希釈）を加え、４℃で２４時 間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例５−２記載の方法により固相 上の酵素活性を測定した。結果を第８図に示す。

図中、−・−がＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を、−ム−がＰＡＣＡＰ　（１−２７）Ｏ Ｈを、−■−がＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，を、−〇−がＶＩＰの標準曲線を示す。第 ８図の結果から、この測定法により、０．２ｐｇ／ｗｅｌｌのＰＡＣＡＰ２７Ｎ Ｈ，を、ＰＡＣＡＰ　（１−２７）ＯＨと１１．５％の、またＰＡＣＡＰ３８Ｎ Ｈ，と重量比では０．９７％、モル比では１．３％の交差反応性で検出し得るこ とがわかった。

（２）上記実施例１５記載のＰＡ−３Ｎａを固定したマイクロプレートと、上記 実施例１８記載ＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，Ｆ　ａ　ｂ’とを 用いて、上記記載の方法によりサンドイッチ法−ＥＩＡを実施した。結果を第９ 図に示す。

この測定法により、０．２ｐｇ／ｗｅｌｌのＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を、ＰＡＣＡ Ｐ　（１−２７）ＯＨと１１％の、またＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，と重量比で０．２ ２％、モル比で０．３１％の交差反応性で検出し得ることがわかった。

（３）上記実施例１５記載のＰＡ−５Ｎａを固定したマイクロプレートと、上記 実施例１８記載ＨＲＰ標識化ＰＡ’ＣＡＰ（１１２７）ＮＨ，Ｆ　ａ　ｂ’とを 用いて、上記記載の方法によりサンドイッチ法−ＥＩＡを実施した。結果を第１ ０図に示す。

この測定法により、０．２ｐｇ／ｗｅｌｌのＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を、ＰＡＣＡ Ｐ　（１−２７）Ｏ’Ｈと４．１％の、またＰＡＣＡＰ３８ＮＨヨと重量比で０ ．４０％、モル比で０．５６％の交差反応性で検出し得ることがわかった。

（４）上記実施例１５記載のＰＡ−６Ｎａを固定したマイクロプレートと、上記 実施例１８記載ＨＲＰ標識化ＰＡＣＡＰ（１１−２７）ＮＨ，Ｆａｂ’とを用い て、上記記載の方法によりサンドイッチ法−ＥＩＡを実施した。結果を第１１図 に示す。

この測定法により、０．８ｐｇ／ｗｅｔｔのＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を、ＰＡＣＡ Ｐ　（１−２７）○Ｈと５．４％の、またＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，と重量比で３． ６％、モル比で５．００％の交差反応性で検出し得ることがわかった。

なお、いずれの測定法もＶＩＰと０．００１％以下の交差反応性しか示さなかっ た。

以上の結果から、これらの測定法を用いることにより、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，を 、ＰＡＣＡＰ　３８ＮＨ，と重量比テｏ、２２〜３．６％、モル比で０．３１〜 ５．０％の交差反応性で検出し得ることから、これらの測定法と、上記実施例１ ６記載の測定法とを組み合わせることにより、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，とＰＡＣＡ Ｐ３８ＮＨ，とを分別定量することが可能である。

実施例２０　ＰＡＣＡＰ　の　の　・ ラット副腎褐色細胞腫株ＰＣ−１２ｈ（大阪大学、蛋白研究所、車中博士より供 与）をコラーゲン処理した４８ウエルマルチウエルプレート（住友ベークライト 社製）上に、５×１０°セル／ウエルの割合で播き、１０％のＦｅ２を含むダル ベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で７〜ＩＯ日間培養した。

該プレートの培地を０．０５％のＢＳＡを含むハンクス液（ＨＢＳ　Ｓ　：　Ｈ ａｎｋｓ’　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）に変換し、３０ 分間培養したのち、抗ＰＡＣＡＰ抗体（最終濃度２．２０あるいは２００ｎＭ） とあらかじめ４℃で１時間反応させたＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，（最終濃度２　ｎＭ ）を加えた。さらに２時間培養したのち、培養上清中のｃＡＭＰ濃度をｃＡＭＰ 測定キット（アマジャム社製）で測定した。結果を第１２図に示す。図中、−〇 −がＰＡ−ＩＮａを、−△−がＰＡ−３Ｎａを、−ローがＰＡ−５Ｎａを、−■ −がＰＡ−６Ｎａを、−ム−がＰＡ−２Ｃａを、−・−がＰＡ−ＩＣａを表わす 。この結果から、これら６種類のモノクローナル抗ＰＡＣＡＰ抗体のうち、４種 類はＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，に対して中和能を有しており、その強さは、ＰＡ−２ Ｃａ（クラスｍの抗体）　）ＰＡ−Ｉ　Ｎ＞ＰＡ−３Ｎａ（クラス１ｂの抗体） の順であることがわかった。

本発明のＰＡＣＡＰの一次配列上連続した部位を認識する種々のモノクローナル 抗体を用いることにより、ＰＡＣＡＰの免疫化学的な性質が明らかにされた。ま た、これらの抗体を用いることにより、ＰＡＣＡＰあるいはその関連ペプタイド に対し特異性の異なる種々の競合法あるいはサンドイツチ法による測定系を設定 することが可能であり、とりわけ、種々のサンドイツチ法を組み合わせることに より、ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，とＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，とを高感度に分別定量する ことが可能となった。

実施例２１　ヒトＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗ＰＡＣＡＰモノクローナル抗体の 反応性に関する検討ヒトＰ　Ａ　ＣＡ　Ｐ　＃Ｊ駆夏体伝子を組み込んだプラス ミドｐＴＳ４０１を持つ大腸菌をｌ　ＯｍｌのＭ９培地（０，１％　ＮＺアミン 、ｏ、４％　グルコース、　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　を５０μｇ／ｍ１およびＣ ｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌを２５μｇ／ｍｌ含む）で３７℃下に培養し、６ ００ｎｍにおける吸光度が０．７まで菌体が増殖した時、終濃度０．４ｍＭとな るようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加してさらに３時 間培養を続けた後、５０００ｇ　１０分間の遠心で集菌した。

イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド添加直前の菌体をコントロール として集菌した。

菌体に１ｍｌのＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ含有ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒを加え 、１００℃で５分間沸騰させ、１６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ た。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により、ニトロセルロースフィルター へ蛋白を電気的に移し、抗ＰＡＣＡＰ？ウスモノクローナル抗体（ＰＡ−’Ｉ　 Ｎａ、　−Ｉ　Ｃａおよび一２Ｃａ）をそれぞれ反応させた後、二次抗体（抗マ ウスＩｇＧ−パーオキシダーゼ、ＣＡＰＰＥＬ社製）を反応させた。和光紬薬Ｐ ＯＤイムノスティンセットにより目的とする蛋白のバンドを発色、固定した。抗 ＰＡＣＡＰマウスモノクローナル抗体ＰＡ−ＩＮａおよびＰＡ−２Ｃａと反応す るバンドは分子量約１８，０００ダルトン付近に確認された。このバンドはヒト ＰＡＣＡＰをコードするｃＤＮＡから予想されるヒトＰＡＣＡＰ的夏体の分子量 とほぼ一致しており、抗ＰＡＣＡＰマウスモノクローナル抗体ＰＡ−ＩＮａおよ びＰＡ−２ＣａがヒトＰＡＣＡＰｆｎ夏体と反応することが明らかとなった。

■　６２５　１２５　２５　５　１ 抗血清希釈倍数 希釈倍数 第３図−１ ＰＡＣＡＰおよびＰＡＣＡＰ関連ベプタイド（Ｍ）第３図−２ ＰＡＣＡＰｔａよびＰＡＣＡＰ関連ベデ関連ビデタイト第４図 第５図 ＰＡＣＡＰ３８　ＮＨ２（Ｐ９／ｍＪ）第６図 ＰＡＣＡＰ　３８ＮＨ２（１）９／ｍｊ）第８図 ＰＡＣＡＰ　（ｐ９７ｍ夕） 第９図 ＰＡＣＡＰ　（ｐｃ＋／ｍ７） 第１０図 ＰＡＣＡＰ　（ｐｃ＋／ｍＪ） 第１１図 ＰＡＣＡＰ　（ｐｇ／ｍｊ） 第１２図 モ／　りｏ−ナルＫＰＡＣＡＰＫ体　（ｏＭ）第１３図 平成４年９月７９日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に結合性を有する抗体。
2. （２）ＰＡＣＡＰが［式１］のアミノ酸配列を有するＰＡＣＡＰ３８ＮＨ，であ る、請求項１記載の抗体。 ［式１］ 【配列があります】〔１〕
3. （３）ＰＡＣＡＰの前駆体が［式２］のアミノ酸配列で表わされるヒトＰＡＣＡ Ｐ前駆体あるいはその一部である、請求項１記載の抗体。 ［式２］ 【配列があります】〔２〕
4. （４）ＰＡＣＡＰが［式３］のアミノ酸配列を有するＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２であ る、請求項１記載の抗体。 ［式３］ 【配列があります】〔３〕
5. （５）［式３］で表わされるＰＡＣＡＰ２７および［式４］、［式５］、［式６ ］もしくは［式７］で表わされるＰＡＣＡＰの部分ペプタイドおよび［式８］で 表わされるバンアクテイブ・インチステイナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）の少な くとも１種類に結合性を有する請求項１記載の抗体。 ［式４］ＰＡＣＡＰ（４−２７） 【配列があります】〔４〕 ［式５］ＰＡＣＡＰ（１−１３） 【配列があります】〔５〕 ［式６］ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２【配列があります】〔６〕 ［式７］ＰＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２【配列があります】〔７〕 ［式８］ＶＩＰ（ヒト） 【配列があります】〔８〕
6. （６）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１−１３） 、ＰＡＣＡＰ（４−２７）と反応し、且つＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、Ｐ ＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２とは反応しない、ＰＡＣＡＰのＮ端部分を認識す る請求項１記載の抗体。
7. （７）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７） と反応し、且つＰＡＣＡＰ（１−１３）、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、Ｐ ＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２とは反応しない、ＰＡＣＡＰのＮ端部分から中央 部分に至る領域を記載する請求項１記載の抗体。
8. （８）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２と反応し、且つ ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２７）、ＰＡＣＡＰ（１−１３）、Ｐ ＡＣＡＰ（３１−３８）ＮＨ２、ＶＩＰとは反応しない、ＰＡＣＡＰ３８の中央 部分からＣ端部に至る領域を認識する請求項１記載の抗体。
9. （９）ＰＡＣＡＰ３８ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（１４−３８）ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（ ３１−３８）ＮＨ２と反応し、且つＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２、ＰＡＣＡＰ（４−２ ７）、ＰＡＣＡＰ（１−１３）、ＶＩＰとは反応しない、ＰＡＣＡＰ３８のＣ端 部分を認識する請求項１記載の抗体。
10. （１０）ＶＩＰと０．５％以下の交差反応性を示す請求項６記載の抗体。
11. （１１）ＶＩＰと０．５％以上の交差反応性を示す請求項６記載の抗体。
12. （１２）ＶＩＰと０．５％以下の交差反応性を示す請求項７記載の抗体。
13. （１３）ＶＩＰと０．５％以上の交差反応性を示す請求項７記載の抗体。
14. （１４）ＰＡＣＡＰ２７のＣ端部分ペプチド、即ち［式９］で表わされるＰＡＣ ＡＰ（１１−２７）に結合性を有する請求項４記載の抗体。 ［式９］ 【配列があります】〔９〕
15. （１５）ＰＡ−１Ｎａで標示される請求項１０記載のモノクローナル抗体。
16. （１６）ＰＡ−５Ｎａで標示される請求項１０記載のモノクローナル抗体。
17. （１７）ＰＡ−３Ｎａで標示される請求項１１記載のモノクローナル抗体。
18. （１８）ＰＡ−６Ｎａで標示される請求項１２記載のモノクローナル抗体。
19. （１９）ＰＡ−２Ｃａで標示される請求項８記載のモノクローナル抗体。
20. （２０）ＰＡ−１Ｃａで標示される請求項９記載のモノクローナル抗体。
21. （２１）ＰＡＣＡＰあるいは、ＰＡＣＡＰ前駆体に結合性を有するモノクローナ ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
22. （２２）請求項１５記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
23. （２３）請求項１６記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
24. （２４）請求項１７記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
25. （２５）請求項１８記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
26. （２６）請求項１９記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
27. （２７）請求項２０記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
28. （２８）ＰＡＣＡＰとＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体と、被検液および標識化Ｐ ＡＣＡＰとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ＰＡＣＡＰの割合を測 定することを特徴とする、被検液中のＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ部分ペプチドある いはＰＡＣＡＰ前駆体の定量法。
29. （２９）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 に被検液を接触させた後、標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に 対する抗体を接触させ、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とす る、被検液中のＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ部分ペプチドあるいはＰＡＣＡＰ前駆体 の定量法。
30. （３０）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体、請求項７記載の抗体あるいは請求項８記載の抗体に属す るポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体あるいは、それらの複合物で あり、他方が請求項９記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノクロ ーナル抗体である、請求項２９記載の定量法。
31. （３１）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体あるいは請求項７記載の抗体に属するポリクローナル抗体 あるいはモノクローナル抗体あるいは、それらの複合体であり、他方が請求項８ 記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求 項２９記載の定量法。
32. （３２）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体 であり、他方が請求項７記載の抗体に属するポリクローナル抗体あるいはモノク ローナル抗体である請求項２９記載の定量法。
33. （３３）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 あるいは標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 が請求項６記載の抗体あるいは請求項７記載の抗体に属するポリクローナル抗体 あるいはモノクローナル抗体であり、他方が請求項１４記載の抗体に属するポリ クローナル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求項２９記載の定量法。
34. （３４）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−１Ｎａ、ＰＡ−３Ｎａ、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａ、ＰＡ−２Ｃａの いずれか、あるいはそれらの複合物であり、他方がＰＡ−１Ｃａである請求項３ ０記載の定量法。
35. （３５）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−１Ｎａ、ＰＡ−３Ｎａ、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａのいずれか、ある いはそれらの複合物であり、他方がＰＡ−２Ｃａである請求項３１記載の定量法 。
36. （３６）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−５Ｎａであり、他方がＰＡ−６Ｎａである請求項３２記載の定量法。
37. （３７）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 、および標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体の一方 がＰＡ−１Ｎａ、ＰＡ−３Ｎａ、ＰＡ−５Ｎａ、ＰＡ−６Ｎａのいずれか、ある いはそれらの複合物であり、他方が請求項１４記載の抗体に属するポリクローナ ル抗体あるいはモノクローナル抗体である請求項３３記載の定量法。
38. （３８）担体上に不溶化したＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対する抗体 がＰＡ−２Ｃａであり、標識化されたＰＡＣＡＰあるいはＰＡＣＡＰ前駆体に対 する抗体がＰＡ−６Ｎａである請求項３５記載の定量法。