JP2022000049A - 抗ｐａｃａｐ抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドに対する抗体をコードする核酸、および該核酸を含むベクターを提供する。【解決手段】重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドに結合する抗体であって、該重鎖可変領域が相補性決定領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該軽鎖可変領域が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体をコードする核酸、および該核酸を含むベクター。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬の分野に属する。具体的には、本発明は、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）に対する抗体、そのような抗ＰＡＣＡＰ抗体を含む組成物、ならびに原発性頭痛（三叉神経・自律神経性頭痛を含む）、二次性頭痛、および片頭痛（慢性片頭痛を含む）を含む疼痛の治療のためのそのような抗体の使用方法に関する。

下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、三叉神経血管系、三叉神経節、脊髄、視床下部、および下垂体を含む神経系全体に分布する神経ペプチドである。ＰＡＣＡＰは、少なくとも２つのα−アミド化活性型で存在し、ＰＡＣＡＰ３８（配列番号１３）は、３８個のアミノ酸を含み、典型的には哺乳動物組織内のＰＡＣＡＰの最大９０％に相当するより一般的な活性型であり、ＰＡＣＡＰ２７（配列番号１４）は、ＰＡＣＡＰ３８と同じ２７個のＮ末端アミノ酸を含む。ＰＡＣＡＰは、神経保護、神経調節、神経性炎症、および侵害受容における役割、ならびに頭痛および片頭痛を含む疼痛を引き起こす役割を果たすと考えられている。

頭痛および片頭痛は、年間３７００万人の患者に影響を与え、３分の２超が未治療であると推定されている。原発性頭痛（複数可）は、異なるまたは別個の疾患または障害の結果として生じるものではない頭痛として分類される一方で、二次性頭痛（複数可）は、異なるまたは別個の根本原因（例えば、外傷、疾病、または他の障害）の結果として生じる頭痛として分類される。三叉神経・自律神経性頭痛（「ＴＡＣ」）は、反復性群発頭痛および慢性群発頭痛、発作性片側頭痛、持続性片側頭痛、ならびに片側神経痛様頭痛発作を含む原発性頭痛として分類される。片頭痛（複数可）は、「前兆を有しない」片頭痛（以前は「普通型片頭痛」と呼ばれた）および「前兆を有する」片頭痛（以前は「古典的片頭痛」と呼ばれた）を指す。慢性片頭痛（複数可）は、１ヶ月当たり１５日間以上の頭痛があり、そのうち少なくとも８日間が片頭痛であるものとして分類される。片頭痛の発生率が１ヶ月当たり２回以上の発症である場合、または片頭痛が患者の日課に著しく干渉する、かつ／もしくは急性薬物が有効ではない場合には、医師は、予防的治療選択肢を考慮することが推奨されている。しかしながら、現在まで、片頭痛予防のための治療選択肢は有効ではないことが多く、現在の予防的および急性治療選択肢（例えば、降圧剤、抗けいれん剤、抗うつ剤）は、低い有効性、および関連する身体障害性の副作用を有する。

ＰＡＣＡＰの構造は、抗ＰＡＣＡＰ抗体と同様に、当該技術分野で周知である（例えば、Ａ．Ｍｉｙａｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１７０：６４３−６４８（１９９０）を参照されたい）。例えば、米国特許第５，４８６，４７２Ａ号、国際特許出願公開ＷＯ／２０１２／１０６４０７Ａ３号、および米国特許出願公開第２０１６−３０４６０４号は全て、様々な抗ＰＡＣＡＰ抗体およびそれらの潜在的な使用を開示している。しかしながら、現在まで、ＰＡＣＡＰを標的とするいかなる抗体も、治療的使用には承認されていない。したがって、代替的な抗ＰＡＣＡＰ抗体に対する必要性が依然として存在している。具体的には、ＰＡＣＡＰを高い効力で中和し、持続した作用期間を提供し、原発性および二次性頭痛ならびに片頭痛（慢性片頭痛を含む）を含む疼痛を治療することができる、代替的な抗ＰＡＣＡＰ抗体に対する必要性が依然として存在している。全ての治療的処置と同様に、安全性および毒性が、依然として制限となっており、代替的な抗ＰＡＣＡＰ抗体は、許容できない免疫原性に付随してはならない。したがって、ヒトにおいて低減した免疫原性のリスクを提示する代替的な抗ＰＡＣＡＰ抗体に対する必要性が依然として存在している。そのような抗ＰＡＣＡＰ抗体はまた、好ましくは、開発、製造、および製剤化を促進するための良好な物理化学的特性も持つ。

本発明は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むヒトＰＡＣＡＰに結合する抗体を提供し、ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＶＲは、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５であり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８である。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ２は、残基１３にアスパラギン酸を含み、ＨＣＤＲ３は、残基８にアスパラギンを含み、ＬＣＤＲ１は、残基７にセリンを含み、ＬＣＤＲ２は、残基７にロイシンを含む。別の特定の実施形態では、ＨＣＤＲ２は、残基１３にアラニンを含み、ＨＣＤＲ３は、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１は、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２は、残基７にフェニルアラニンを含む。さらに特定の実施形態では、ＨＣＤＲ２は、残基１３にグルタミン酸を含み、ＨＣＤＲ３は、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１は、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２は、残基７にフェニルアラニンを含む。さらに特定の実施形態では、ＨＣＤＲ２は、残基１３にグルタミンを含み、ＨＣＤＲ３は、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１は、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２は、残基７にフェニルアラニンを含む。

本発明の実施形態は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むヒトＰＡＣＡＰに結合する抗体を提供し、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号９であり、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号１０である。特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、残基６２にアスパラギン酸および残基１０４にアスパラギンを含み、ＬＣＶＲは、残基３０にセリンおよび残基５５にロイシンを含む。他の特定の実施形態では、ＨＣＶＲは、残基６２にアラニンおよび残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲは、残基６２にグルタミン酸および残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲは、残基６２にグルタミンおよび残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。

さらなる実施形態では、本発明は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含むヒトＰＡＣＡＰに結合する抗体を提供し、ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号１であり、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号２である。特定の実施形態では、ＨＣは、残基６２にアスパラギン酸、残基１０４にアスパラギン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣは、残基３０にセリンおよび残基５５にロイシンを含む。他の特定の実施形態では、ＨＣは、残基６２にアラニン、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。他の特定の実施形態では、ＨＣは、残基６２にグルタミン酸、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、残基２３８にアラニンを含み、ＬＣは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。いくつかの特定の実施形態では、ＨＣは、残基６２にグルタミン、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、残基２３８にアラニンを含み、ＬＣは、残基３０にトリプトファンおよび残基５５にフェニルアラニンを含む。

本発明はさらに、本発明の抗体と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、原発性および二次性頭痛を含む頭痛などの疼痛を治療する方法であって、疼痛の治療を必要とする患者に、本発明の薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。さらなる実施形態では、原発性頭痛は、ＴＡＣである。さらなる実施形態では、本発明は、片頭痛を治療する方法であって、片頭痛の治療を必要とする患者に、本発明の薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、片頭痛は、慢性片頭痛である。さらに、本発明は、マスト細胞脱顆粒関連疼痛を治療する方法であって、マスト細胞脱顆粒関連疼痛の治療を必要とする患者に、本発明の抗体または薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかのそのような実施形態によれば、マスト細胞脱顆粒関連疼痛は、原発性または二次性頭痛および片頭痛のうちの１つである。

加えて、本発明は、原発性頭痛、二次性頭痛、および／または片頭痛などの疼痛を治療する方法であって、疼痛の治療を必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、原発性頭痛は、ＴＡＣである。いくつかの実施形態によれば、片頭痛は、慢性片頭痛である。

本発明はまた、療法における使用のための本発明の抗体も提供する。より具体的には、本発明は、疼痛の治療に使用するための本発明の抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、原発性頭痛、二次性頭痛、および／または片頭痛の治療に使用するための本発明の抗体を提供する。

本発明は、原発性頭痛、二次性頭痛、および／または片頭痛などの疼痛の治療のための薬物の製造における、本発明の抗体の使用を提供する。さらにより特定の実施形態では、原発性頭痛は、ＴＡＣである。いくつかの特定の実施形態では、片頭痛は、慢性片頭痛である。

本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸分子および発現ベクターにも関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、残基６２は、アスパラギン酸であり、残基１０４は、アスパラギンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンである。いくつかの実施形態では、残基６２は、アラニンであり、残基１０４は、スレオニンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンである。いくつかの実施形態では、残基６２は、グルタミン酸であり、残基１０４は、スレオニンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンである。さらなる実施形態では、残基６２は、グルタミンであり、残基１０４は、スレオニンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンである。

本発明の実施形態はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子も提供し、残基３０は、セリンであり、残基５５は、ロイシンである。いくつかの実施形態では、残基３０は、トリプトファンであり、残基５５は、フェニルアラニンである。

いくつかの実施形態では、本分子のＤＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基６２は、アスパラギン酸であり、残基１０４は、アスパラギンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンであり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基３０はセリンであり、残基５５はロイシンである。特定の実施形態では、本分子のＤＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基６２はアラニン、残基１０４はスレオニン、残基２３１はプロリン、残基２３７はアラニンであり、残基２３８はアラニンであり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基３０は、トリプトファンであり、残基５５は、フェニルアラニンである。特定の実施形態では、本分子のＤＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基６２は、グルタミン酸であり、残基１０４は、スレオニンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンであり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基３０は、トリプトファンであり、残基５５は、フェニルアラニンである。別の特定の実施形態では、本分子のＤＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基６２は、グルタミンであり、残基１０４は、スレオニンであり、残基２３１は、プロリンであり、残基２３７は、アラニンであり、残基２３８は、アラニンであり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、残基３０は、トリプトファンであり、残基５５は、フェニルアラニンである。さらに、本発明は、プロセスに従って調製された抗体を提供し、該プロセスは、本発明のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、抗体が発現されるような条件下で培養することと、該宿主細胞から本発明の抗体を回収することとを含む。

本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、その中に収容されるＣＤＲを介した抗原認識を主に担う約１００〜１２０個のアミノ酸の可変領域を含む。ＣＤＲには、フレーム領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。ＬＣの３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、ＨＣの３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含む。ある抗体が特定の抗原と結合する機能的能力は、６つのＣＤＲによって大きく影響される。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、およびＮｏｒｔｈ番号付け規則（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１））に基づいている。

ＬＣは、カッパまたはラムダとして分類され、これらは各々、当該技術分野で既知の特定の定常領域を特徴とする。本発明の抗体は、カッパＬＣを含む。ＨＣは、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして定義する。本発明の抗体は、ＩｇＧ ＨＣを含む。ＩｇＧ抗体は、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にさらに分けることができる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４である。各ＨＣのカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、エフェクター機能を低減する、各ＨＣの定常領域内の１つ以上の修飾を有する。より特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４であり、残基２３７および２３８の両方のアミノ酸アラニンを含むエフェクター機能を低減する、両方のＨＣの定常領域内の修飾を有する（残基番号付けは直線的であり、例示される配列番号１のＨＣに基づく）。さらにより特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧ４であり、残基２３７および２３８の両方のアミノ酸アラニンを含むエフェクター機能を低減する、両方のＨＣの定常領域内の修飾を有し、残基２３１のアミノ酸プロリンを含む安定性を促進する、両方のＨＣの定常領域内のさらなる修飾を有する（残基番号付けは直線的であり、例示される配列番号１のＨＣに基づく）。

本発明の抗体は、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）である。ｍＡｂは、例えば、ハイブリドーマ技術、組み換え技術、ファージ提示技術、合成技術、例えば、ＣＤＲ移植、またはそのような技術または当該技術分野で既知の他の技術の組み合わせによって産生することができる。本明細書で言及される場合、ｍＡｂは、単一のコピーまたはクローン（例えば、任意の真核生物、原核生物、もしくはファージのクローンを含む）に由来する抗体であり、それが産生される方法ではない。

抗体を産生および精製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ファージライブラリをスクリーニングすることができ、それにより、組み換えヒトＰＡＣＡＰとの相互作用について数千のＦａｂ断片をスクリーニングする。結果として生じる相互作用を回収、精製し、当該技術分野で周知の従来の方法を使用してアミノ酸配列を決定することができ、それにより、初期リード抗体を構築することができる。本発明の抗体は、１つ以上のヒトフレームワーク領域を含有するように設計されている。ヒトフレームワークの生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＮＧＴ）からそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）を通して、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ ｂｙ Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１（ＩＳＢＮ０１２４４１３５１）から得ることができる。特定の実施形態によれば、本発明の抗体に使用するための生殖系列ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はそれぞれ、３〜２３およびＯ１８を含む。

本発明の特定の実施形態では、抗体、または抗体をコードする核酸は、単離された形態で提供される。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞環境内に見出される他の高分子種を含まないか、または実質的に含まない、タンパク質、ポリペプチド、または核酸を指す。

本発明の抗体は、既知の方法を使用して調製および精製することができる。例えば、ＨＣ（例えば、配列番号１によって与えられるアミノ酸配列）およびＬＣ（例えば、配列番号２によって与えられるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）発現ベクター中に操作することができる。次いで、操作された免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中に安定してトランスフェクトすることができる。当業者であれば理解されるように、抗体の哺乳動物発現は、典型的には、Ｆｃ領域内の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化をもたらすであろう。安定したクローンは、ヒトＰＡＣＡＰに特異的に結合する抗体の発現について検証することができる。陽性クローンは、バイオリアクター内での抗体産生のために無血清培地へと増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水などの適合性のある緩衝液で平衡化したプロテインＡまたはＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに好都合に適用することができる。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗体を、例えば、ｐＨ勾配によって溶出させ、抗体画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出し、次いでプールする。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過されてもよい。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効率的に除去することができる。産生物は、例えば、−７０℃で直ちに凍結させても、凍結乾燥させてもよい。

本発明の抗体は、患者の治療に使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、あるクラスの疼痛（具体的には、原発性および二次性の両方の頭痛、ならびに片頭痛（慢性片頭痛を含む）を含む）を治療することが期待される。本発明の抗体は、原発性および二次性頭痛ならびに片頭痛を含む疼痛の治療に有用であることが期待されるが、そのような抗体はまた、他の疼痛の治療にも有用である可能性がある。本明細書で互換的に使用される場合、「治療」および／または「治療すること」および／または「治療する」は、本明細書に記載の障害の進行の緩徐化、妨害、抑止、制御、停止、または逆転が存在し得る全てのプロセスを指すことが意図されるが、全ての障害の症状の完全な排除を必ずしも示すものではない。治療は、ＰＡＣＡＰ活性の低減から利益を得るであろうヒトにおける疾患または病態の治療のための本発明の抗体の投与を含み、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわち、その発症を抑止することと、（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患もしくは障害の退縮を引き起こすか、またはその症状もしくは合併症を緩和することと、（ｃ）症状の疾患の発症を予防することとを含む。

本明細書で互換的に使用される場合、「患者」、「対象」、および「個体」という用語は、ヒトを指す。特定の実施形態では、患者は、ＰＡＣＡＰ活性の低減から利益を得るであろう疾患、障害、または病態（例えば、疼痛、例えば、原発性もしくは二次性頭痛、および／または片頭痛（慢性片頭痛を含む））をさらに特徴とする。別の実施形態では、患者は、上記の病態、またはＰＡＣＡＰ活性の低減から利益を得るであろう病態を発症するリスクがあることをさらに特徴とする。

本明細書で使用される場合、「結合する（または、に結合する）」という用語は、抗体とヒトＰＡＣＡＰのエピトープとの相互作用を指す。本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、本発明の抗体によって認識される抗原の別個の三次元部位を指す。

本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができ、本発明の抗体と、１つ以上の薬学的に許容される担体（複数可）および／または希釈剤（複数可）とを含む、薬学的組成物に組み込むことができる（例えば、一般に開業医に知られている製剤化技術の概要を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）。薬学的組成物に好適な担体には、本発明の抗体と組み合わせたときに分子の活性を保持し、かつ患者の免疫系とは非反応性である、任意の材料が含まれる。

本発明の抗体を含む薬学的組成物は、親経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）によって、本明細書に記載の疾患または障害のリスクがあるか、またはそれを呈する患者に投与することができる。本発明の薬学的組成物は、「有効」量または「治療有効」量（本明細書で互換的に使用される）の本発明の抗体を含有する。有効量は、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投与量および期間および投与手段で）を指す。抗体の有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに抗体が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。有効量はまた、本発明の抗体の任意の毒性効果または有害効果よりも治療的に有益な効果が上回る量である。

実施例１．例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体の操作および発現
本発明の抗ＰＡＣＡＰ抗体の構築時に、化学的および物理的安定性に関連する重要な問題に遭遇した。例えば、初期ヒト化構築物で遭遇する問題には、低い結合親和性、許容できない免疫原性、可変領域の脱アミド化、酸化、異性化、および低い効力が含まれる。

したがって、化学的および物理的修飾を操作して、本発明の抗体の結合親和性を改善し、ＨＣ二量体化を排除または低減し、免疫原性を低減し、かつ化学的および物理的安定性を改善するようにした。重鎖および軽鎖の両方の全体を通して、アミノ酸修飾を操作した。広範なタンパク質安定性研究もまた実行し、構築した抗体を、発現および熱安定性特性、ならびに結合親和性を含む他の特性についてスクリーニングした。元の構築物からの多数の修飾を含む以下の抗体は、高い結合親和性を持ち、化学的および物理的に安定しており、低い免疫原性を持ち、毎月の投与と一致する薬物動態特性を持つことが特定されている。本発明の抗体を含む修飾はいずれも、初期ヒト化構築物では特定されなかった。

本発明の例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体を、表１に提示する。例示される抗体には、配列番号１の重鎖および配列番号２の軽鎖、ならびにヒトＨＣフレームワーク３〜２３、およびフレームワークＯ１８を有するヒトカッパＬＣが含まれる。加えて、抗体の化学的および物理的安定性ならびに機能的特性を改善する、軽鎖および重鎖の両方における操作した修飾を、表１に提供する。例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体の様々な領域の関係は、以下のとおりである（アミノ酸の番号付けには、直線的な番号付けが適用され、可変ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づき、ＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則に基づくＨＣＤＲ２を除いて、周知のＮｏｒｔｈ番号付け規則に基づく）

以下の実施例およびアッセイは、本発明の抗体が原発性および二次性頭痛ならびに片頭痛を含む疼痛の治療に有用であることを実証している。しかしながら、以下の実施例は、限定ではなく例示として記載されており、当業者によって様々な修正がなされ得ることが理解されるべきである。

本発明の例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体は、本質的に以下のとおりに発現および精製され得る。表１に記載のＨＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（例えば、表１に提示される例示される抗体ＢのＨＣをコードする配列番号１１のＤＮＡ配列）および表１に記載のＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（例えば、表１に提示される例示される抗体ＢのＬＣをコードする配列番号１２のＤＮＡ配列）を含有するグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）を電気穿孔によってトランスフェクトする。この発現ベクターは、ＳＶ初期（サルウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞を５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミ（ＭＳＸ）でバルク選択にかける。ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用して、選択の厳密性を増加させる。宿主細胞ゲノムの転写活性領域に発現ベクターｃＤＮＡを組み込んだ細胞が、内在的レベルのＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にする。マスターウェルを、抗体発現についてスクリーニングし、次いで無血清懸濁培養物中で増殖させて、産生に使用する。抗体が分泌された浄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性のある緩衝液で平衡化したプロテインＡ親和性カラムに適用する。このカラムを１ＭのＮａＣｌで洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗体を、例えば、ｐＨ（約）３．５のクエン酸ナトリウムで溶出させ、画分を１Ｍのトリス緩衝液で中和する。抗体画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出し、次いでプールする。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効率的に除去することができる。本発明の例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体を、一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過する。これらのクロマトグラフィーステップ後の例示される抗体の純度は、９５％超である。本発明の例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体は、−７０℃で直ちに凍結させても、４℃で数ヶ月間保管してもよい。

実施例２．結合親和性
各抗体−抗原複合体の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を、動的排除９６ウェルプレートベースのアッセイ（Ｅｓｔｅｐ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１３，５：２７０−２７８から適応）を使用して決定する。簡潔には、例示される各抗体（表１に記載）の３倍希釈系列（各系列は、抗体ブランク対照を含む）を、７２９０ｐＭ〜４１ｆＭの開始濃度から調製する。試料を、３％（ｗ／ｖ）のブロッカーＡ溶液（ＭＳＤ、番号Ｒ９３ＡＡ−１）中で調製し、３０ｐＭのＮ末端ビオチン化ＰＡＣＡＰ２７（カスタム合成、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＮ末端ビオチン化ＰＡＣＡＰ３８（Ａｎａｓｐｅｃ、番号２３５９０）の固定最終抗原濃度を、各試料に添加する。１００μｌの体積の各抗原−抗体試料を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＥＫ−２０１０１）の個々のウェルに二連で添加する。プレートを、光学接着フィルム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号４３１１９７１）で密封し、３７℃で３〜４日間インキュベートして、試料の平衡を可能にする。分析前日に、９６ウェルＭＳＤ標準プレート（ＭＳＤ、番号Ｌ１５ＸＡ）の各列を、リン酸緩衝生理食塩水中３μｇ／ｍｌの濃度の、３０μｌの（滴定系列で使用される）対応する抗体でコーティングする（ＰＢＳ）。実験当日に、ＭＳＤ標準プレートを、１５０μｌのＰＢＳで１回洗浄し、ＭａｘＱ４４５０ベンチトップ振盪機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で４５分間、１５０μｌの３％の遮断剤Ａ溶液で遮断する。ＰＢＳで３回洗浄した後、（上記のように調製およびインキュベートした）５０μｌの各抗原−抗体試料をＭＳＤ標準プレートに添加し、３００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で１５０秒間インキュベートする。ＰＢＳで１回洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）の遮断剤Ａ溶液中で調製した５０μｌの１μｇ／ｍｌのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジン（ＭＳＤ、番号Ｒ３２ＡＤ−５）を添加し、ＭＳＤ標準プレーおよびプレートを、３００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で３分間インキュベートする。プレートをＰＢＳでさらに３回洗浄した後、１５０μｌ／ウェルの１Ｘ読み取り緩衝液（ＭＳＤ、番号Ｒ９２ＴＣ−２）を添加する。ＭＳＤ標準プレートは、ＭＥＳＯ Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ ＳＱ１２０／１３００機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して読み取る。データ分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン１２．５、Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行い、結合親和性（Ｋ_Ｄ）を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔに組み込まれた４つのパラメータのロジスティック曲線モデルを使用して決定する。結果を、表２に提供する。

実施例３．インビボでのＰＡＣＡＰ分解
インビボでの循環ＰＡＣＡＰ３８の分解を、ラットにおいて評価する。対照ＩｇＧ４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）または例示される抗体Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ）のうちの一方を、ラットに静脈内注射する。血漿中のベースラインＰＡＣＡＰ３８を各ラットについて評価し、次いでラットに６μｇ／ｋｇのＰＡＣＡＰ３８を静脈内注射する。ＰＡＣＡＰ３８注射後、血漿試料を１２０分間かけて収集し、ＰＡＣＡＰ３８の総レベル（抗体に結合しているものまたは未結合のもの）を、修正ＥＬＩＳＡ形式を介して決定する。簡潔には、９６ウェルＭＳＤプレート（ＭＳＤ、カタログ番号：Ｌ１５ｘＡ−１）を、ＰＢＳ中、３０μｌ／ウェルの１ｕｇ／ｍｌの抗ＰＡＣＡＰ３８抗体（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号Ｐ１７７５−０３Ｃ）でコーティングし、４０℃で一晩インキュベートする。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳ中、１５０μｌ／ウェルの３％の遮断剤Ａ（ＭＳＤカタログ番号Ｒ９３ＢＡ−２）で、６５０ｒｐｍで回転させながら、室温で１時間遮断する。その後、プレートを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄する。ＰＡＣＡＰ３８（Ｂａｃｈｅｍカタログ番号Ｈ４３０−０５００）の検量用試料を、２００μｇ／ｍｌのＨＢＲ１（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｎｃ、カタログ番号３ＫＣ５３３）および１０μｇ／ｍｌのビオチン−例示される抗体Ａを補充した、１部の希釈剤２（ＭＳＤカタログ番号Ｒ５１−ＢＢ−３）および３９部の希釈剤３（ＭＳＤカタログ番号Ｒ５１ＢＡ−３）を含有するアッセイ緩衝液を用いて、１０００ｐｇ／ｍＬで希釈する。１０００ｐｇ／ｍＬの検量用試料をアッセイ緩衝液で３倍連続希釈することによって、検量用試料の標準曲線を用意する。血漿試料を、２００μｇ／ｍＬのＨＢＲ１および１０μｇ／ｍＬのビオチン−例示される抗体Ａを補充した希釈剤３中に、４０倍に希釈する。２５μｌの異なる濃度の検量用試料および希釈した血漿試料を、アッセイプレートの個々のウェルに添加し、６５０ｒｐｍで回転させながら、室温で２時間インキュベートする。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、希釈剤３中、２５μｌの０．５μｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭＳＤカタログ番号Ｒ３２ＡＪ−１）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。次いで、プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、１５０μｌの２Ｘ読み取り緩衝液Ｔ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−３）を各ウェルに添加し、ＭＳＤプレートリーダーでシグナルを読み取る（検出可能なＰＡＣＡＰ３８レベルとして提示される結果、平均±平均値の標準誤差（ｎ＝２〜３））。結果を、表３に提示する。

表３に提示される結果は、例示される抗体Ａが静脈内注射時にＰＡＣＡＰ３８の分布を予防するが、インビボでのＰＡＣＡＰ３８の分解は予防しないことを実証している。

実施例４．ＰＡＣＡＰ２７、ＰＡＣＡＰ３８、またはＶＩＰ誘導性ｃＡＭＰの阻害
本発明の抗体によるＰＡＣＡＰ２７、ＰＡＣＡＰ３８、およびＶＩＰ誘導性ｃＡＭＰ刺激の中和を、ヒトＰＡＣ１（ＮＰ＿００１１８６５６４．１）またはヒトＶＰＡＣ２（ＮＰ＿００３３７３．２）のいずれかを発現するベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ−６１）内で評価する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を非酵素的細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ番号３１３１３１−０１４）で収集し、計数し、遠心分離し、アッセイ緩衝液中に１０，０００個の細胞／２５μｌになるまで再懸濁する。濃縮した細胞（２５μｌ中１０，０００個）を、９６ウェルプレートのウェルに添加する。

例示される抗体（表１に記載）を、１００μｌのアッセイ緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムを有するＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＨ３０２６８））、０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、番号Ａ７８８８）、５００μＭのＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉ５８７９）中で４倍の所望の最終濃度になるまで連続希釈する。希釈した例示される抗体を、（最終濃度の２倍の）アゴニストとともに室温で１５分間インキュベートする。アゴニストの最終濃度：ヒトＰＡＣ１中のＰＡＣＡＰ２７およびＰＡＣＡＰ３８について１００ｐＭ、ヒトＶＰＡＣ２中のＰＡＣＡＰ２７およびＰＡＣＡＰ３８について８００ｐＭ、ヒトＶＰＡＣ２アッセイでは８００ｐＭのＶＩＰ。その後、２５μｌの例示される抗体−アゴニスト溶液を、（細胞を含有する）９６ウェルプレートの個々のウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。各ウェル内のｃＡＭＰ形成を、ｃＡＭＰ ｆｅｍｔｏ２（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ５ＰＥＣ）を使用して決定する。２５μｌのｃＡＭＰ−ｄ２標準溶液（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ５ＰＥＣ）を各ウェルに添加した後、２５μｌの抗ｃＡＭＰ−クリプテート標準溶液を添加し、プレートを、暗所、室温で１時間インキュベートする。結果として生じるＨＴＲＦシグナルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ１２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、励起３３０ｎｍ）機器を使用して６６５および６２０ｎｍで測定し、６６５／６２０の比率をプロットして、ｃＡＭＰを定量化する（データは、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７を使用してプロットし、ＩＣ５０値は、組み込まれた４つのパラメータのロジスティック曲線モデル適合ルーチンを使用して決定する）。結果を、平均±平均値の標準誤差として表４に提供する。

実施例５．免疫原性分析
インシリコでの免疫原性評価を、Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅで調整したＥｐｉｍａｔｒｉｘスコアを含む、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｔ細胞エピトープ予測ソフトウェア（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＩＳＰＲＩ）Ｗｅｂベースポータル（Ｅｐｉｖａｘ，Ｉｎｃ．）内）で実行する。各抗体に関連する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のタンパク質配列を、別個に分析する。Ｅｐｉｖａｘによれば、Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅで調整したＥｐｉｍａｔｒｉｘスコアがゼロ超であるタンパク質配列は、より高い全体的な免疫原性を有する。ＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスターの免疫原性評価もまた、各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲに対して実行して、各抗体のＣＤＲ内のＴ細胞エピトープクラスターを特定する。２つ以上の隣接するＥｐｉＢａｒの存在によって定義されるＴ細胞エピトープクラスターの存在は、より高い全体的な免疫原性に関連する。ＮｏｒｔｈのＣＤＲの定義を使用すると、例示される抗体Ａ、Ｂ、またはＣでは、ＣＤＲ関連Ｔ細胞エピトープクラスターは特定されない。４つの隣接するＥｐｉＢａｒのＴ細胞エピトープクラスターは、比較抗体ＡＬＤ１．Ｈ（米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３０４６０４号に「Ａｂ１．Ｈ」と記載される）のＬＣＶＲのＣＤＲ２中で特定され、これは、比較抗体がより高い免疫原性を有することを示している。結果を、表５Ａ、５Ｂ、および５Ｃに提供する。

実施例６．マスト細胞脱顆粒誘導性ＰＡＣＡＰ放出の中和
ヒトマスト細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｍｅｄｉａ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）およびＳＣＦ／ＩＬ−６を使用して、ヒト臍帯血幹細胞から培養物中で分化する。アッセイ当日に、マスト細胞を、タイロード緩衝液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．４ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５．６ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および０．１％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）中、９６ウェル組織培養プレートのウェルに、５０μｌ当たり１００，０００個の細胞でプレーティングする。後述の例示される抗体の存在下または不在下で、細胞をＰＡＣＡＰ３８またはＰＡＣＡＰ２７で処理する。

１ウェル当たり２５μｌの４倍濃縮した例示される抗体（１５３μＭの例示される抗体の最終濃度）を添加することによって、単一点試験を実行する。１ウェル当たり２５μｌの４倍濃縮した抗体を、０〜１５３μＭの最終用量範囲（３倍希釈）になるように添加することによって、用量曲線試験を実行する。２５μｌの４倍濃縮したＰＡＣＡＰ３８またはＰＡＣＡＰ２７を、１μＭのＰＡＣＡＰ（３８または２７）の最終濃度になるまで各ウェルに添加した。アッセイ培地のみを未処理対照として使用し、ＩｇＧ４ ｍＡｂを陰性対照として使用する。試験は、三連で行う。９６ウェルプレートを、インキュベーター（３７℃）内に３０分間置く。インキュベーション後、３０μｌ／ウェルの上清を収集し、トリプターゼ活性を市販のアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定する。上清中のトリプターゼ放出パーセント（％）を、以下の等式によって計算する：（実験トリプターゼ放出−ビヒクル対照トリプターゼ放出）／（総トリプターゼ放出−ビヒクル対照トリプターゼ放出）×１００（式中、総トリプターゼ放出は、マスト細胞を凍結／解凍することによって得られる）。結果を、表６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに提供する。

実施例７．インビボでのＰＡＣＡＰ誘導性ｃＡＭＰ中和
インビボでのＰＡＣＡＰ誘導性血漿ｃＡＭＰ増加の中和を、ＣＤ−１マウスモデル（Ｅｎｖｉｇｏ）で評価する。簡潔には、雄のＣＤ−１マウスに、対照ＩｇＧ４抗体（Ｎ＝６）、対照ＩｇＧ４抗体＋ＰＢＳ／ロリプラムのみ（Ｎ＝５）、例示される抗体Ｂ（Ｎ＝５）、例示される抗体Ｃ（Ｎ＝５）、または例示される抗体Ｄ（Ｎ＝６）のいずれかを１０ｍｇ／ｋｇ皮下投与する。抗体治療の３日後、マウスに、ＰＡＣＡＰ３８（１３ｎｍｏｌ／ｋｇ）＋ロリプラム（１００ｕｇ／ｍＬ）を静脈内投与し、以前にＩｇＧ４対照抗体で治療した数匹のマウスには、（０．２％のエタノール、１％のＢＳＡ、５ｍｌ／ｋｇ、およびロリプラム（１００μｇ／ｍｌ）のみを含有する）ＰＢＳを静脈内投与する。ＰＡＣＡＰ３８治療の１０分後、ＥＤＴＡ含有チューブに血液を収集し、遠心分離によって血漿を分離する。市販のｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ．）を製造業者の指示に従って使用して、ｃＡＭＰの血漿レベルを決定する。統計分析は、一元ＡＮＯＶＡ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７）で対数変換したｃＡＭＰ濃度を適用した後、ダネット事後分析を適用する。結果を、平均±標準誤差として表７に記載する。

実施例８．インビボでの三叉神経節刺激誘導性硬膜血漿タンパク質の血管外漏出の中和
本発明の抗ＰＡＣＡＰ抗体が、三叉神経節の刺激後にＰＡＣＡＰの放出によって誘導される血漿タンパク質の血管外漏出をインビボで遮断する能力を、ラットモデルを使用して調査する。簡潔には、スプラーグドーリーラット（Ｅｎｖｉｇｏ、雄、２５０〜３５０ｇ）に、１〜１０ｍｇ／ｋｇの例示される抗体Ａ、３〜３０ｍｇ／ｋｇの例示される抗体Ｂ、または３もしくは１０ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ４抗体のうちの１つを皮下投与する。７２時間後、ラットをネンブタール（６５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、切歯バーを−２．５ｍｍに設定した定位固定枠（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内に置く。正中線矢状頭皮切開を行った後、頭蓋骨に二対の両側の穴をドリルで開ける（後側３．２ｍｍ、外側１．８および３．８ｍｍ、全ての座標は十字縫合を基準とする）。一対のステンレス鋼刺激電極（Ｒｈｏｄｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を、硬膜から両半球の穴を通して９．２ｍｍの深さまで下げる。三叉神経節刺激の２分前に、タンパク質の血管外漏出のマーカーであるフルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）（２０ｍｇ／ｋｇ、静脈内）を、大腿静脈に注射する。左三叉神経節を、ＰＳＩＵ６光電式分離ユニット（Ｇｒａｓｓ−Ｔｅｌｅｆａｃｔｏｒ）を備えたＭｏｄｅｌ Ｓ４８Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒを用いて、１．０ｍＡ（５Ｈｚ、５ミリ秒のパルス持続時間）の電流強度で５分間刺激する。刺激の５分後、４０ｍｌの食塩水で失血させることによってラットを屠殺する。

ラットの屠殺後、頭蓋骨の上部を除去し、硬膜を収集する。両半球から膜試料を除去し、水で濯ぎ、顕微鏡スライド上に平らに広げる。スライドをスライドウォーマーで１５分間乾燥させ、組織を７０％のグリセロール／水の溶液とともにカバーガラスをかける。回折格子モノクロメータおよび分光光度計を備えた蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、各硬膜試料のＦＩＴＣ−ＢＳＡ色素を定量化する。三叉神経節の電気刺激によって誘導される血管外漏出は、同側効果であり（すなわち、三叉神経節が刺激される硬膜の側でのみ生じる）、したがって、硬膜の刺激されていない半分が対照として機能することが可能となる。刺激した側からの硬膜と刺激されていない側からの硬膜との血管外漏出の比率を計算する。結果を、表８に提供する（平均±標準誤差）。

実施例９．例示される抗ＰＡＣＡＰ抗体の薬物動態
本発明の例示される抗体の血清薬物動態を、総ＩｇＧアッセイによって、単回皮下投与後の雄のカニクイザル（ｎ＝２）において特性評価する。動物に例示される抗体Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、注射の１、３、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２４０、３３６、５０４、および６７２時間後に血清試料を収集する。総ＩｇＧアッセイを、一般に本明細書に記載のように実行する。簡潔には、１００ｕＬ／ウェルの１ｕｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１０９−００６−０９７）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＨＢＸプレートにコーティングする。ウェルを、標準物質（例示される抗体Ｂの標準曲線は、１５．６３〜１，０００ｎｇ／ｍＬから用意する）、対照、または血清試料のうちの１つとともにインキュベートした後、検出のために１００ｕｌ／ウェルの１：１０，０００に希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号９０４０−０５）とともにインキュベートする。未結合の検出試薬を、洗い流す。その後、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍを、ウェルに添加する。１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの添加によって発色を停止させ、波長補正を６３０ｎｍに設定して４５０ｎｍで光学濃度を測定する。免疫反応性を、１００％のカニクイザル血清中、既知量の例示される抗体Ｂから決定した後、５パラメータのアルゴリズム（ＳｔａｔＬｉａ、バージョン３．２）を使用して、ＰＢＳ中、Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインで最低限必要な１：１０に希釈する。本質的に上記の手順に従って、０．４９ｍＬ／時／ｋｇの見かけ上のクリアランス（ＣＬ／Ｆ）、１１４．０ｍＬ／ｋｇの見かけ上の分布体積（Ｖ／Ｆ）、および非コンパートメント分析によって計算される１７１時間の最終半減期を、例示される抗体Ｂについて計算する。得られた薬物動態結果は、延長した時間にわたって作用することができる治療抗体と一致している。

配列
例示されるＨＣ（配列番号１）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＬＳＧＧＳＴＹＹＡＸＳＨＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＥＶＧＡＳＸＨＮＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＸＣＰＡＰＥＸＸＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
式中、残基６２のＸは、Ｄ、Ａ、Ｅ、およびＱのうちの１つであり、残基１０４のＸは、ＮおよびＴのうちの１つであり、残基２３１のＸは、ＰおよびＳのうちの１つであり、残基２３７のＸは、ＡおよびＦのうちの１つであり、残基２３８のＸは、ＡおよびＬのうちの１つである。

例示されるＬＣ（配列番号２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＸＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＤＡＳＱＬＸＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＦＤＬＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
式中、残基３０のＸは、ＳおよびＷのうちの１つであり、残基５５のＸは、ＬおよびＦのうちの１つである。

例示されるＨＣＤＲ１（配列番号３）
ＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳ

例示されるＨＣＤＲ２（配列番号４）
ＡＩＳＬＳＧＧＳＴＹＹＡＸＳＨＫＧ
式中、残基１３のＸは、Ｄ、Ａ、Ｅ、およびＱのうちの１つである。

例示されるＨＣＤＲ３（配列番号５）
ＶＲＥＶＧＡＳＸＨＮＹＹＧＭＤＶ
式中、残基８のＸは、ＮおよびＴのうちの１つである。

例示されるＬＣＤＲ１（配列番号６）
ＲＡＳＱＳＩＸＲＷＬＡ
式中、残基７のＸは、ＳおよびＷのうちの１つである。

例示されるＬＣＤＲ２（配列番号７）
ＨＤＡＳＱＬＸＥ
式中、残基７のＸは、ＬおよびＦのうちの１つである。

例示されるＬＣＤＲ３（配列番号８）
ＱＱＦＤＬＬＰＬＴ

例示されるＨＣＶＲ（配列番号９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＬＳＧＧＳＴＹＹＡＸＳＨＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＥＶＧＡＳＸＨＮＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
式中、残基６２のＸは、Ｄ、Ａ、Ｅ、およびＱのうちの１つであり、残基１０４のＸは、ＮおよびＴのうちの１つである。

例示されるＬＣＶＲ（配列番号１０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＸＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＤＡＳＱＬＸＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＦＤＬＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
式中、残基３０のＸは、ＳおよびＷのうちの１つであり、残基５５のＸは、ＬおよびＦのうちの１つである。

例示される抗体ＢのＨＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）
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例示される抗体ＢのＬＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）
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組み換えヒトＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配列（配列番号１３）
ＨＳＤＧＩＦＴＤＳＹＳＲＹＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＡＡＶＬＧＫＲＹＫＱＲＶＫＮＫ
式中、残基３８のＫは、Ｃ末端アミド化によって翻訳後修飾されている

組み換えヒトＰＡＣＡＰ２７のアミノ酸配列（配列番号１４）
ＨＳＤＧＩＦＴＤＳＹＳＲＹＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＡＡＶＬ
式中、残基２７のＬは、Ｃ末端アミド化によって翻訳後修飾されている

Claims (29)

1. 重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドに結合する抗体であって、前記ＨＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＶＲが、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号３であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号４であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号５であり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号８である、抗体。
2. ＨＣＤＲ２が、残基１３にアスパラギン酸を含み、ＨＣＤＲ３が、残基８にアスパラギンを含み、ＬＣＤＲ１が、残基７にセリンを含み、ＬＣＤＲ２が、残基７にロイシンを含む、請求項１に記載の抗体。
3. ＨＣＤＲ２が、残基１３にアラニンを含み、ＨＣＤＲ３が、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１が、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２が、残基７にフェニルアラニンを含む、請求項１に記載の抗体。
4. ＨＣＤＲ２が、残基１３にグルタミン酸を含み、ＨＣＤＲ３が、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１が、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２が、残基７にフェニルアラニンを含む、請求項１に記載の抗体。
5. ＨＣＤＲ２が、残基１３にグルタミンを含み、ＨＣＤＲ３が、残基８にスレオニンを含み、ＬＣＤＲ１が、残基７にトリプトファンを含み、ＬＣＤＲ２が、残基７にフェニルアラニンを含む、請求項１に記載の抗体。
6. 重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号９であり、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号１０である、請求項１に記載の抗体。
7. ＨＣＶＲが、残基６２にアスパラギン酸、および残基１０４にアスパラギンを含み、ＬＣＶＲが、残基３０にセリンおよび、残基５５にロイシンを含む、請求項６に記載の抗体。
8. ＨＣＶＲが、残基６２にアラニン、および残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲが、残基３０にトリプトファンおよび、残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項６に記載の抗体。
9. ＨＣＶＲが、残基６２にグルタミン酸、および残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲが、残基３０にトリプトファン、および残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項６に記載の抗体。
10. ＨＣＶＲが、残基６２にグルタミン、および残基１０４にスレオニンを含み、ＬＣＶＲが、残基３０にトリプトファン、および残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項６に記載の抗体。
11. 重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含むヒト下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドに結合する抗体であって、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号１であり、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号２である、抗体。
12. ＨＣが、残基６２にアスパラギン酸、残基１０４にアスパラギン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣが、残基３０にセリン、および残基５５にロイシンを含む、請求項１１に記載の抗体。
13. ＨＣが、残基６２にアラニン、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣが、残基３０にトリプトファン、および残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項１１に記載の抗体。
14. ＨＣが、残基６２にグルタミン酸、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣが、残基３０にトリプトファン、および残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項１１に記載の抗体。
15. ＨＣが、残基６２にグルタミン、残基１０４にスレオニン、残基２３１にプロリン、残基２３７にアラニン、および残基２３８にアラニンを含み、ＬＣが、残基３０にトリプトファン、および残基５５にフェニルアラニンを含む、請求項１１に記載の抗体。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
17. 原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つを治療する方法であって、原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つの治療を必要とする患者に、有効量の請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
18. 前記原発性頭痛が、三叉神経・自律神経性頭痛である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記三叉神経・自律神経性頭痛が、反復性群発頭痛、慢性群発頭痛、発作性片側頭痛、および片側神経痛様頭痛発作のうちの１つである、請求項１８に記載の方法。
20. 原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つを治療する方法であって、原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つの治療を必要とする患者に、請求項１６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
21. 前記原発性頭痛が、三叉神経・自律神経性頭痛である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記三叉神経・自律神経性頭痛が、反復性群発頭痛、慢性群発頭痛、発作性片側頭痛、および片側神経痛様頭痛発作のうちの１つである、請求項２１に記載の方法。
23. 療法における使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
24. 原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つの治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
25. 三叉神経・自律神経性頭痛の治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
26. 前記三叉神経・自律神経性頭痛が、反復性群発頭痛、慢性群発頭痛、発作性片側頭痛、および片側神経痛様頭痛発作のうちの１つである、請求項２５に記載の抗体。
27. 原発性頭痛、二次性頭痛、および片頭痛のうちの１つの治療のための薬物の製造に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
28. 三叉神経・自律神経性頭痛の治療のための薬物の製造に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
29. 前記三叉神経・自律神経性頭痛が、反復性群発頭痛、慢性群発頭痛、発作性片側頭痛、および片側神経痛様頭痛発作のうちの１つである、請求項２８に記載の抗体。