CN111164105B

CN111164105B - 抗pacap抗体

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Publication number: CN111164105B
Application number: CN201880063106.2A
Authority: CN
Inventors: C·B·贝德勒; M·P·约翰逊; C·N·帕特尔
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: JP6952888B2; US20190100579A1; AU2018341959B2; US20200131256A1; US10519225B2; CA3077304A1; IL273529A; JOP20200069A1; EA202090563A1; KR102453573B1; CO2020002170A2; WO2019067293A1; NZ762312A; US10954292B2; SG11202002572YA; CR20200127A; AU2018341959A1; JP2022000049A; CA3077304C; DOP2020000060A

Abstract

抗垂体腺苷酸环化酶激活肽的抗体，包含这类抗PACAP抗体的组合物，及用这类抗体治疗包括头痛和/或偏头痛在内的疼痛的方法。

Description

抗PACAP抗体

本发明属于医药领域。具体而言，本发明涉及抗垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的抗体，包含这类抗PACAP抗体的组合物，及用这类抗体治疗包括原发性头痛(包括三叉神经自主头痛)，继发性头痛和偏头痛(包括慢性偏头痛)在内的疼痛的方法。

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是一种神经肽，遍布在神经系统中，所述神经系统包括三叉神经血管系统，三叉神经节，脊髓，下丘脑和垂体。PACAP以至少两种α-酰胺化的活性形式存在：PACAP38(SEQ ID NO:13)，其包含38个氨基酸并且是更普遍的活性形式，在哺乳动物组织中通常代表高达90％的PACAP；和PACAP27(SEQ ID NO:14)，其包含与PACAP38相同的27个N-末端氨基酸。PACAP被认为在神经保护，神经调节，神经源性炎症和伤害感受，以及在引起包括头痛和偏头痛的疼痛中发挥作用。

头痛和偏头痛估计每年影响3700万患者，其中三分之二以上未经治疗。原发性头痛被界定为不是由不同的或不相关的疾病或病症引起的头痛，而继发性头痛被界定为由不同的或不相关的的潜在原因(例如，创伤，疾病或其他病症)导致的头痛。三叉神经自主头痛(“TACs”)被界定为原发性头痛，包括发作性和慢性丛集性头痛，阵发性偏侧头痛，连续性偏侧头痛和单侧神经痛样头痛发作。偏头痛是指“无先兆”的偏头痛(以前称为“普通偏头痛”)和“有先兆”的偏头痛(以前称为“经典偏头痛”)。慢性偏头痛被界定为每月头痛15天或以上，并其中至少有8天为偏头痛。当偏头痛的发作率为每月两次或以上，或者当偏头痛显著干扰患者的日常生活工作和/或急性药物治疗无效时，鼓励医生考虑采取预防性治疗选项。然而，迄今为止，用于偏头痛预防的治疗选项经常是无效的，并且当前的预防和急性治疗选项(例如，抗高血压药，抗惊厥药，抗抑郁药)有效率低并且具有相关的致残副作用。

PACAP的结构是本领域公知的(例如参见A.Miyata,A.等,Biochem Biophys ResCommun 170:643-648(1990))，抗PACAP抗体也是这样。例如，美国专利号5,486,472A，国际专利申请公开号WO/2012/106407A3和美国专利申请公开号2016-304604均公开了各种抗PACAP抗体及其潜在用途。然而，迄今为止，尚无靶向PACAP的抗体被批准用于治疗。因此，仍然存在对可选择的抗PACAP抗体的需要。具体而言，仍然存在对可选择的，能高效中和PACAP，提供持续的作用并且能够治疗包括原发性和继发性头痛以及包括慢性偏头痛在内的偏头痛的疼痛的抗PACAP抗体的需要。如同所有的治疗方法一样，安全性和毒性仍然是限制并且可选择的抗PACAP抗体不得伴随不可接受的免疫原性。因此，仍然存在对展示降低的人体内免疫原性的风险的可选择的抗PACAP抗体的需要。这类抗PACAP抗体还将优选地具有良好的物理化学性质以便于开发，制造和配制。

本发明提供了结合人PACAP的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含互补决定区(CDRs)HCDR1，HCDR2和HCDR3并且LCVR包含互补决定区LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，HCDR2的氨基酸序列为SEQID NO.4，HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.7，LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。在一个具体实施方案中，HCDR2在残基13处包含天冬氨酸，HCDR3在残基8处包含天冬酰胺，LCDR1在残基7处包含丝氨酸，并且LCDR2在残基7处包含亮氨酸。在另一个具体实施方案中，HCDR2在残基13处包含丙氨酸，HCDR3在残基8处包含苏氨酸。LCDR1在残基7处包含色氨酸，并且LCDR2在残基7处包含苯丙氨酸。在另一具体实施方案中，HCDR2在残基13处包含谷氨酸，HCDR3在残基8处包含苏氨酸，LCDR1在残基7处包含色氨酸，LCDR2在残基7处包含苯丙氨酸。在另一个甚至更具体的实施方案中，HCDR2在残基13处包含谷氨酰胺，HCDR3在残基8处包含苏氨酸，LCDR1在残基7处包含色氨酸，并且LCDR2在残基7处包含苯丙氨酸。

本发明的实施方案提供了结合人PACAP的抗体，其包含HCVR和LCVR，其中HCVR的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，而LCVR的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。在具体实施方案中，HCVR在残基62处包含天冬氨酸，在残基104处包含天冬酰胺，并且LCVR在残基30处包含丝氨酸，在残基55处包含亮氨酸。在另外的具体实施方案中，HCVR在残基62处包含丙氨酸，在残基104处包含苏氨酸，并且LCVR在残基30处包含色氨酸，在残基55处包含苯丙氨酸。在某些实施方案中，HCVR在残基62处包含谷氨酸，在残基104处包含苏氨酸，并且LCVR在残基30处包含色氨酸和在残基55处包含苯丙氨酸。在某些实施方案中，HCVR在残基62处包含谷氨酰胺，在残基104处包含苏氨酸，并且LCVR在残基30处包含色氨酸，在残基55包含苯丙氨酸。

在另外的实施方案中，本发明提供了结合人PACAP的抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC的氨基酸序列为SEQ ID NO.1且LC的氨基酸序列为LC为SEQ ID NO.2。在具体实施方案中，HC在残基62处包含天冬氨酸，在残基104处包含天冬酰胺，在残基231处包含脯氨酸，在残基237处包含丙氨酸，以及在残基238处包含丙氨酸，并且LC在残基30处包含丝氨酸以及在残基55处包含亮氨酸。在另外的具体实施方案中，HC在残基62处包含丙氨酸，在残基104处包含苏氨酸，在残基231处包含脯氨酸，在残基237处包含丙氨酸，以及在残基238处包含丙氨酸，并且LC在残基30处包含色氨酸以及在残基55处包含苯丙氨酸。在另外的具体实施方案中，HC在残基62处包含谷氨酸，在残基104处包含苏氨酸，在残基231处包含脯氨酸，在残基237处包含丙氨酸，以及在残基238处包含丙氨酸，并且LC在残基30处包含色氨酸以及在残基55处包含苯丙氨酸。在某些具体实施方案中，HC在残基62处包含谷氨酰胺，在残基104处包含苏氨酸，在残基231处包含脯氨酸，在残基237处包含丙氨酸，以及在残基238处包含丙氨酸，并且LC在残基30处上包含色氨酸以及在残基55处上包含苯丙氨酸。

本发明还提供了包含本发明的抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。另外，本发明提供治疗诸如包括原发性和继发性头痛在内的头痛之类的疼痛的方法，其包括对有需要的患者施用本发明的药物组合物。在甚至另一个实施方案中，原发性头痛是TAC。在甚至另一个实施方案中，本发明提供了治疗偏头痛的方法，其包括对有需要的患者施用本发明的药物组合物。在某些这样的实施方案中，偏头痛是慢性偏头痛。本发明还提供了治疗与肥大细胞脱颗粒相关疼痛的方法，其包括对有需要的患者施用本发明的抗体或药物组合物。根据某些这样的实施方案，肥大细胞脱颗粒相关疼痛是原发性或继发性头痛和偏头痛中之一。

此外，本发明提供了治疗疼痛例如原发性头痛，继发性头痛和/或偏头痛的方法，其包括对有需要的患者施用有效量的本发明的抗体。根据某些实施方案，原发性头痛是TAC。根据某些实施方案，偏头痛是慢性偏头痛。

本发明还提供用于治疗的本发明的抗体。更具体地，本发明提供用于治疗疼痛的本发明的抗体。在具体实施方案中，本发明提供用于治疗原发性头痛，继发性头痛和/或偏头痛的本发明的抗体。

另外，本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗疼痛例如原发性头痛、继发性头痛和/或偏头痛的药物中的用途。在甚至更具体的实施方案中，原发性头痛是TAC。在某些具体实施方案中，偏头痛是慢性偏头痛。

本发明还涉及编码本发明抗体的核酸分子和表达载体。在一个实施方案中，本发明提供了DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基62是天冬氨酸，残基104是天冬酰胺，残基231是脯氨酸。残基237是丙氨酸，以及残基238是丙氨酸。在某些实施方案中，残基62是丙氨酸，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸。在某些实施方案中，残基62是谷氨酸，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸。在另一些实施方案中，残基62是谷氨酰胺，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸并且残基238是丙氨酸。

本发明的实施方案还提供了一种DNA分子，其包含编码具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基30是丝氨酸以及残基55是亮氨酸。在某些实施方案中，残基30是色氨酸，以及残基55是苯丙氨酸。

在某些实施方案中，本分子的DNA分子包含编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基62是天冬氨酸，残基104是天冬酰胺，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸，并包含编码具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基30是丝氨酸以及残基55是亮氨酸。在一个具体实施方案中，本分子的DNA分子包含编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基62是丙氨酸，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸，并包含编码具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基30是色氨酸以及残基55是苯丙氨酸。在一个具体实施方案中，本分子的DNA分子包含编码具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基62是谷氨酸，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸，并包含编码具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基30是色氨酸以及残基55是苯丙氨酸。在另一个具体实施方案中，本分子的DNA分子包含编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基62是谷氨酰胺，残基104是苏氨酸，残基231是脯氨酸，残基237是丙氨酸以及残基238是丙氨酸，并包含编码具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中残基30是色氨酸以及残基55是苯丙氨酸。本发明还提供根据方法制备的抗体，其中所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养包含本发明的多核苷酸序列的宿主细胞，并从所述宿主细胞中回收本发明的抗体。

本文所用的“抗体”是包含通过二硫键互相连接的2HC和2LC的免疫球蛋白分子。每条LC和HC的氨基末端部分包括约100-120个氨基酸的主要通过其中所含的CDR负责抗原识别的可变区。CDR之间散布更保守的区域，称为构架区(“FR”)。每个LCVR和HCVR由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。LC的3个CDR被称为“LCDR1，LCDR2和LCDR3”，以及HC的3个CDR被称为“HCDR1，HCDR2和HCDR3”。CDR包含了大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。抗体结合特定抗原功能的能力在很大程度上受这六个CDR的影响。根据公知的Kabat编号惯例(Kabat等,Ann.NY Acad.Sci.190:382-93(1971)；Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(1991))和North编号惯例(North等,A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011))将氨基酸分配至本发明的抗体的LCVR和HCVR区内的CDR结构域。

LC分类为kappa(κ)或lambda(λ)，它们各自以本领域已知的特定恒定区为特征。本发明的抗体包括kappa(κ)LC。HC分为gamma(γ)，mu(μ)，alpha(α)，delta(δ)或epsilon(ε)，并将抗体的同种型分别定义为IgG，IgM，IgA，IgD或IgE。本发明的抗体包括IgG HC。IgG抗体可以进一步分为亚类，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。在一个具体实施方案中，本发明的抗体是IgG4。每条HC的羧基末端部分确定了主要负责效应子功能的恒定区。在一个具体实施方案中，本发明的抗体在每条HC的恒定区有一个或多个降低效应子功能的修饰。在一个更具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG4，并且在两条HC的恒定区中具有降低了效应子功能的修饰，包括在残基237和238处的氨基酸丙氨酸(残基编号是线性的并且基于示例性SEQID NO.1的HC)。在一个甚至更具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG4，并且在两条HC的恒定区中都具有降低效应子功能的修饰，包括在残基237和238处的氨基酸丙氨酸，并且在两条HC的恒定区中都具有另外的提高稳定性的修饰，包括残基231处的氨基酸脯氨酸(残基编号是线性的并且基于示例性SEQ ID NO.1的HC)。

本发明的抗体是单克隆抗体(“mAb”)。mAb可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如CDR移植)或这类或其他的本领域已知的技术的组合来产生。本文所指的mAb是衍生自单个拷贝或克隆的抗体，所述克隆包括例如任何真核，原核或噬菌体克隆，而不是其产生方法。

产生和纯化抗体的方法是本领域公知的。例如，可以筛选噬菌体文库，从而筛选数千个Fab片段与重组人PACAP的相互作用。所得到的相互作用可以回收，纯化，并使用本领域公知的常规方法确定氨基酸序列，从而可以构建起始的前导抗体。本发明的抗体是经工程化以包含一个或多个人构架区的。可以通过其网站http://imgt.cines.fr从ImMunoGeneTics(INGT)，或从Immunoglobulin FactsBook，Marie-Paule Lefranc和GerardLefranc，Academic Press,2001,ISBN 012441351获得人类构架胚系序列。根据具体的实施方案，用于本发明的抗体的种系HC和LC构架区分别包括3-23和O18。

在本发明的具体实施方案中，以分离的形式提供抗体或编码其的核酸。本文所用的术语“分离的”指这样的蛋白质、肽或核酸，其不含或基本不含其他见于细胞环境中的该大分子种类。

可以使用已知方法制备和纯化本发明的抗体。例如，可以将编码HC(例如，SEQ IDNO.1给出的氨基酸序列)和LC(例如，SEQ ID NO.2给出的氨基酸序列)的cDNA序列克隆并工程化到GS(谷氨酰胺合成酶)表达载体中。然后可以将工程化的免疫球蛋白表达载体稳定转染到CHO细胞中。如本领域技术人员将会理解的，抗体哺乳动物表达会引起糖基化，通常位于Fc区域中高度保守的N-糖基化位点处。可以针对特异性结合人PACAP的抗体的表达验证稳定克隆。阳性克隆可以扩增到无血清培养基中，以在生物反应器中生产抗体。可以通过常规技术纯化已经分泌了抗体的培养基。例如，可将培养基方便地加至用相容的缓冲液例如磷酸盐缓冲盐溶液平衡的Protein A或G Sepharose FF柱。洗柱以去除非特异性结合组分。例如通过pH梯度洗脱结合的抗体，并诸如通过SDS-PAGE检测抗体级分，然后合并。抗体可以用常用技术浓缩和/或除菌过滤。可溶性聚集体和多聚体可通过常用技术有效去除，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。产物可以立即冷冻，例如在-70℃，或可以冻干。

本发明的抗体可用于治疗患者。更具体地，期望本发明的抗体可治疗一类疼痛，其特别地包括原发性和继发性头痛，以及包括慢性偏头痛在内的偏头痛。尽管期望本发明的抗体用于治疗疼痛，包括原发性和继发性头痛以及偏头痛，但这类抗体还可用于其他疼痛的治疗。如同在本文中可互换地使用的，“治疗”以及其各个词性形式“treatment and/ortreating and/or treat”意指其中可能存在减慢，中断，阻滞，控制，阻止或逆转本文所描述病症进展的所有过程，但未必表明所有病症症状的完全消除。治疗包括施用本发明的抗体以治疗人的疾病或病况，其将从PACAP活性的降低中受益，并且包括：(a)抑制疾病的进一步进展，即，阻止其发展；(b)减轻疾病，即引起疾病或病症的消退或缓解其症状或并发症；(c)预防具有症状的疾病的发作。

如同在本文中可互换地使用的，术语“患者”，“受试者”和“个体”是指人。在某些实施方案中，所述患者的特征还在于疾病，病症或病况(例如疼痛，例如原发性或继发性头痛和/或偏头痛，包括慢性偏头痛)，其将受益于PACAP活性的降低。在另一个实施方案中，所述患者的特征还在于处于发生如上描述的病况或将从PACAP活性降低中受益的病况的风险中。

如本文所用，术语“结合(或结合到)”是指抗体与人PACAP的表位的相互作用。术语“表位”如本文所用指的是被本发明的抗体识别的抗原的分散的三维位点。

可以将本发明的抗体并入药物组合物中，该药物组合物可以通过本领域公知的方法制备，并且包含本发明的抗体和一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂(例如，Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Loyd V.,Ed.,Pharmaceutical Press，2012年，其提供了从业人员通常已知的配制技术汇编。适用于药物组合物的载体包括任何与本发明的抗体结合后可保留分子活性且对患者免疫系统无反应性的物质。

包含本发明的抗体的药物组合物可以通过胃肠外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌内或透皮)对处于本文所述疾病或病症风险或显示本文所述疾病或病症的患者施用。本发明的药物组合物包含在本文中可互换使用的“有效量”或“治疗有效量”的本发明的抗体。有效量指达到所希望得到的治疗结果所必需的量(在剂量、持续时期和施用方式上)。抗体的有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及抗体在个体中引起所希望得到的反应的能力等因素而变。有效量也是在其中本发明抗体的治疗性有益效果超出了任何毒性或有害作用的量。

实施例

实施例1.示例性抗PACAP抗体的工程化和表达

当构建本发明的抗PACAP抗体时，遇到了与化学和物理稳定性有关的重大问题。例如，最初的人源化构建体遇到的问题包括低结合亲和力，不可接受的免疫原性，可变区脱酰胺，氧化，异构化和低功效。

因此，对本发明的抗体，进行了对化学和物理的工程化改造以改善结合亲和力，消除或减少HC二聚化，降低免疫原性以及改善化学和物理稳定性。在整个重链和轻链上都进行了氨基酸修饰的工程化。还施行了广泛的蛋白质稳定性研究，并针对表达和热稳定性特性以及其他特性(包括结合亲和力)筛选了构建的抗体。以下抗体，包含来自原始构建体的许多修饰，被鉴定为具有高结合亲和力，化学和物理稳定，具有低免疫原性及具有与每月施用相一致的药代动力学特性。在最初的人源化构建体中没有鉴定出包含本发明抗体的修饰。

表1中列出了本发明的示例性抗PACAP抗体。示例性抗体包括SEQ ID NO:1的重链和SEQ ID NO:2的轻链，以及人HC构架3-23和带有构架O18的人κLC。此外，表1中还提供了改善了抗体化学和物理稳定性及功能特性的轻链和重链内的工程化修饰。示例性抗PACAP抗体的各个区域之间的关系如下(氨基酸编号采用线性编号；将氨基酸分配至可变区结构域是基于在www.imgt.org可获得的International Immunogenetics

将氨基酸分配至CDR结构域是基于公知的North编号惯例，其中基于公知的Kabat编号惯例的HCDR2除外)：

表1：本发明的示例性抗PACAP抗体的氨基酸区域。

以下实施例和测定法证明本发明的抗体可用于治疗疼痛，包括原发性和继发性头痛以及偏头痛。但是，应理解，以下实施例以说明而非限制的方式给出，本领域普通技术人员可进行多种修改。

本发明的示例性抗PACAP抗体基本可以按照如下方法进行表达和纯化。用包含编码根据表1的HC氨基酸序列的DNA序列(例如，编码表1中所示的示例性抗体B的HC的SEQ IDNO:11的DNA序列)和编码根据表1的LC氨基酸序列的DNA序列(例如，编码表1中所示的示例性抗体B的LC的SEQ ID NO:12的DNA序列)的谷氨酰胺合成酶(GS)表达载体通过电穿孔转染中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)。该表达载体编码SV早期(猿猴病毒40E)启动子和GS基因。表达GS允许了CHO细胞需要的氨基酸谷氨酰胺的生物化学合成。转染后，用50μM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(L-methionine sulfoximine；MSX)对细胞进行混合选择(bulk selection)。利用MSX对GS的抑制作用提高选择的严格性。相对于表达内源性GS水平的CHO野生型细胞，表达载体cDNA整合到宿主细胞基因组的转录活性区域中的细胞可以被选择出来。将转染汇集物以低密度铺板以允许稳定表达细胞接近克隆生长。筛选主孔中的抗体表达，然后在无血清悬浮培养中放大以用于生产。将抗体已分泌进入其中的澄清培养基加至用相容的缓冲液如磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)平衡的蛋白A亲和柱。用1M NaCl洗柱以去除非特异性结合组分。例如用pH(约)3.5的柠檬酸钠洗脱结合的抗体，并用1M Tris缓冲液中和级分。如通过SDS-PAGE或分析型尺寸排阻检测抗体级分，然后合并。可溶性聚集体和多聚体可通过常用技术有效去除，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。本发明的示例性抗PACAP抗体可以用常用技术浓缩和/或除菌过滤。在这些色谱步骤之后，示例性抗体的纯度大于95％。本发明的示例性抗PACAP抗体可以立即冷冻于-70℃或在4℃保存几个月。

实施例2.结合亲和力

使用基于动力学排阻的96孔板的测定方法(改编自Estep等人,mAbs,2013,5:270-278)确定每种抗体-抗原复合物的结合亲和力(K_D)。简而言之，制备每种示例性抗体(表1所列)的3倍稀释系列，从7290pM的起始浓度至41fM；每个系列均包含抗体空白对照。样品制备于3％(w/v)Blocker A溶液(MSD,#R93AA-1)中，并将固定的最终抗原浓度为30pM的N端生物素化PACAP27(定制合成,CPC Scientific)或N端生物素化PACAP38(Anaspec,#23590)添加到每个样品中。将100μl体积的每种抗原-抗体样品添加到96孔微量滴定板(Greiner,EK-20101)的各个孔中，一式两份。用光学粘性膜(Thermo Fisher Scientific,#4311971)封板，并在37℃下孵育3至4天使样品平衡。在分析前一天用30μl以3μg/ml浓度在磷酸盐缓冲液(PBS)中的相应抗体(如用于滴定系列的)包被96孔MSD标准板(MSD,#L15XA)的每一行。在实验当天，将MSD标准板用150μl PBS洗一次后，在30℃置于MaxQ 4450台式摇床(ThermoFisher Scientific)，以300rpm的摇动用150μl 3％Blocker A溶液封闭45分钟。用PBS洗涤3次后，将50μl的每种抗原抗体样品(如上所描述制备和孵育的)添加到MSD标准板中，并在30℃以300rpm摇动孵育150秒。用PBS进行单次洗涤后，加入50μl在1％(w/v)Blocker A溶液中制备的1μg/ml SULFO-TAG标记的链霉亲和素(MSD,#R32AD-5)到MSD标准板中，并将板在30℃以300rpm摇动孵育3分钟。用PBS再洗板3次，然后每孔加入150μl 1×Read缓冲液(MSD,#R92TC-2)。使用MESO Quickplex SQ 120/1300仪器(Meso Scale Discovery)读取MSD标准板。使用SigmaPlot(Version 12.5,Systat Software)完成数据分析，并用SigmaPlot的集成四参数逻辑曲线模型(Four Parameter Logistic Curve Model)确定结合亲和力(K_D)。结果在表2中提供。

表2：在37℃时抗体-抗原复合物的结合亲和力(K_D)

实施例3.体内(Invivo)PACAP降解

在大鼠中评估体内循环PACAP38的降解。将一种对照IgG4抗体(10mg/kg)或示例性抗体A(10mg/kg)静脉注射给大鼠。评估每只大鼠血浆中的PACAP38基线，然后通过静脉内向大鼠注射6μg/kg的PACAP38。注射PACAP38后，在120分钟内收集血浆样品，并通过改进的ELISA形式确定PACAP38的总水平(与抗体结合或未结合的)。简而言之，用在PBS中的1μg/ml抗PACAP38抗体(US Biological目录号P1775-03C)以30μl/孔包被96孔MSD板(MSD，目录号：L15xA-1)，并在40℃孵育过夜。用200μl/孔的PBST洗板3次，然后用150μl/孔的于PBS中的3％Blocker A(MSD目录号R93BA-2)在室温下以650rpm旋转封闭1小时。之后，用200μl/孔PBST洗板3次。用含有1份稀释剂2(MSD目录号R51-BB-3)和39份稀释剂3(MSD目录号R51BA-3)的测定缓冲液稀释PACAP38的校准物(Bachem目录号H430-0500)到1000pg/mL，并补充200μg/ml的HBR1(Scantibodies Inc,目录号3KC533)和10μg/ml的生物素-示例性抗体A。通过用测定缓冲液对1000pg/mL的校准物进行三倍系列稀释来制备校准物标准曲线。将血浆样品用补充了200μg/mL HBR1和10μg/mL生物素-示例性抗体A的稀释剂3稀释40倍。将25μl不同浓度的校准物和稀释的血浆样品加入测定板的各个孔中并以650rpm的转速在室温下旋转孵育2小时。用200μl/孔PBST洗板3次后，向每个孔中加入25μl在稀释剂3中的0.5μg/ml磺基标签标记的山羊抗人IgG(MSD目录号R32AJ-1)，并将平板在室温下孵育1小时。随后，将板用200μl/孔PBST洗涤3次，并向每个孔中添加150μl 2X读取缓冲液T(MSD,目录号R92TC-3)，用MSD读板器读取信号(结果显示为可检测的PACAP38水平，平均值±SEM(n＝2-3))。结果列于表3。

表3:PACAP38血浆水平

示于表3中的结果表明静脉注射示例性抗体A阻止了PACAP38的分布，但没有阻止PACAP38的体内降解。

实施例4.抑制PACAP27，PACAP38或VIP诱导的cAMP

在转染了表达人PAC 1(NP_001186564.1)或人VPAC2(NP_003373.2)的载体的CHO-K1细胞(ATCC,目录号CCL-61)中评估了本发明的抗体对PACAP27，PACAP38和VIP诱导的cAMP刺激的中和作用。用非酶细胞解离液(Cell Dissociation Buffer,Gibco#313131-014)收获CHO-K1细胞，计数，离心并重悬于测定缓冲液中至10,000个细胞/25μl。将浓缩的细胞(25μl中10,000个)加至96孔板的孔中。

在100μl测定缓冲液(含钙和镁的HBSS(Hyclone,ThermoScientific,SH30268)，0.1％BSA(Sigma-Aldrich,#A7888)，500μM IBMX(Sigma-Aldrich,I5879))中连续稀释示例性抗体(表1中所列)至所需最终浓度的4倍。将稀释的示例性抗体与激动剂(2倍终浓度)在室温下孵育15分钟。激动剂的终浓度是：人PAC1中PACAP27和PACAP38为100pM，人VPAC2中PACAP27和PACAP38为800pM，人VPAC2测定中VIP为800pM。此后，将25μl的示例性抗体-激动剂溶液添加到96孔板的各个孔中(包含细胞)，并在室温下孵育1小时。使用cAMP femto 2(Cisbio,62AM5PEC)确定每个孔中的cAMP形成。将25μl cAMP-d2工作溶液(Cisbio,62AM5PEC)添加到每个孔中，然后添加25μl抗cAMP-穴状配合物(Anti-cAMP-Cryptate)工作溶液，并将板于室温黑暗孵育1小时。使用Envision 12(Perkin Elmer,激发光330nm)仪器在665和620nm处测量产生的HTRF信号，并绘制665/620的比例以量化cAMP(数据使用Graphpad Prism 7绘制，IC50值使用集成的四参数逻辑曲线模型拟合例行程序)。结果在表4中提供为平均值±SEM。

表4：体外中和PACAP27和PACAP38诱导的cAMP升高

实施例5.免疫原性分析

使用包括Tregitope-adjusted Epimatrix得分的EpiMatrix T细胞表位预测软件(在Interactive Screening and Protein Reengineering Interface(ISPRI)的在线门户(Epivax,Inc.)中)进行计算机模拟免疫原性评估。与每种抗体相关的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)蛋白序列分别进行了分析。根据Epivax,Tregitope-adjustedEpimatrix得分大于零的蛋白质序列具有更高的总体免疫原性潜力。还对每个LCVR和HCVR进行EpiMatrix簇免疫原性评估，以鉴定每种抗体的CDR内的T细胞表位簇。由2个或多个相邻EpiBars的存在所定义的T细胞表位簇的存在与更高的总体免疫原性潜力相关。使用North CDR定义，在示例性抗体A，B或C中未鉴定到CDR相关的T细胞表位簇。在比较抗体ALD1.H(在美国专利公开号US 2016/0304604中描述为“抗体1.H”)的LCVR的CDR2中鉴定到有4个相邻EpiBar的T细胞表位簇，表明比较抗体具有更高的免疫原性潜力。结果提供在表5A，5B和5C中。

表5A：通过EpiMatrix T细胞表位预测进行的计算机模拟免疫原性风险评估

表5B:Tregitope-Adjusted Epimatrix评估

表5C:通过EpiMatrix簇免疫原性评估进行的计算机模拟免疫原性风险评估

抗体	CDR相关的Epibar簇
		示例性抗体A	0
示例性抗体B	0
		示例性抗体C	0
示例性抗体D	0
		ALD 1.H	1

实施例6.中和肥大细胞脱颗粒诱导的PACAP释放

使用StemSpan培养基(StemCell)和SCF/IL-6使得培养中人类脐带血干细胞分化为人肥大细胞。在测定当天，将肥大细胞以悬于Tyrode's缓冲液(130mM NaCl,5mM KCl,1.4mM CaCl2,1mM MgCl2,5.6mM葡萄糖,10mM HEPES和0.1％BSA,pH 7.4)中每50μl 100,000个细胞铺板到96孔组织培养板的孔中。如下所述，在存在或不存在示例性抗体的情况下，用PACAP38或PACAP27处理细胞。

通过添加每孔25μl 4X浓缩的示例性抗体(最终浓度为153μM示例性抗体)进行单点测试。通过添加每孔25μl 4X浓缩抗体至最终剂量范围为0至153μM(三倍稀释)进行剂量曲线测试。每个孔中添加25μl 4X浓缩的PACAP38或PACAP27，至最终浓度为1μM PACAP(38或27)。仅测定培养基用作无处理对照，而IgG4单抗用作阴性对照。一式三份进行测试。将96孔板置于培养箱(37℃)中30分钟。孵育后，收集30μl/孔的上清液，并通过商品化测定法(Millipore)测量类胰蛋白酶的活性。通过以下公式计算上清液中类胰蛋白酶的释放百分比(％)：((实验组类胰蛋白酶的释放–载体对照组类胰蛋白酶的释放)/(类胰蛋白酶的总释放量–载体对照组类胰蛋白酶的释放)×100，其中通过冷冻/解冻肥大细胞获得类胰蛋白酶的总释放量)。结果提供在表6A，6B和6C中。

表6A：人肥大细胞中PACAP(27和38)诱导的类胰蛋白酶释放的单点抑制

表6B：人肥大细胞中PACAP27诱导的类胰蛋白酶释放的剂量曲线抑制

表6C：人肥大细胞中PACAP38诱导的类胰蛋白酶释放的剂量曲线抑制

实施例7.体内PACAP诱导的cAMP中和

在CD-1鼠模型(Envigo)中评估体内PACAP诱导的血浆cAMP升高的中和作用。简而言之，雄性CD-1小鼠以10mg/kg通过皮下施用以下之一：对照IgG4抗体(N＝6)；对照IgG4抗体仅加PBS/咯利普兰(N＝5)；示例性抗体B(N＝5)；示例性抗体C(N＝5)；或示例性抗体D(N＝6)。抗体处理后三天，给小鼠静脉内施用PACAP38(13nmols/kg)加咯利普兰(100μg/mL)；某些先前接受IgG4对照抗体处理的小鼠仅静脉内施用PBS(含0.2％乙醇,1％BSA,5ml/kg)和咯利普兰(100μg/ml)。在PACAP38处理十分钟后，将血液收集在含有EDTA的试管中，并离心分离血浆。使用可商购的cAMP ELISA(Cell Bios,Inc.)，根据制造商的说明测定血浆中cAMP的水平，统计分析将对数转换cAMP浓度应用于单向方差分析(one-way ANOVA，Graphpad Prism 7)，然后进行Dunnett事后比较分析(Dunnett’s post hoc analysis)，结果列于表7中，为均值±SE。

表7：PACAP诱导的血浆cAMP水平

*p<0.0001vs.IgG4对照抗体(PACAP38)

实施例8.体内(InVivo)中和三叉神经节刺激诱导的硬膜血浆蛋白外渗

使用大鼠模型检测了本发明的抗PACAP抗体在体内(in vivo)阻断三叉神经节刺激后释放PACAP诱导的血浆蛋白外渗的能力。简而言之，Sprague-Dawley大鼠(Envigo,雄性,250-350g)通过皮下施用以下之一：1-10mg/kg示例性抗体A；3-30mg/kg例示抗体B；或3或10mg/kg的对照IgG4抗体。72小时后，用戊巴比妥钠(65mg/kg,腹膜内)麻醉大鼠，并将其置于门齿杆设置在–2.5mm的立体定位架(David Kopf Instruments)中。行中线矢状头皮切口，然后钻两对双侧孔穿过颅骨(后部3.2毫米，侧部1.8毫米和3.8毫米，所有坐标均参照前囟)。成对的不锈钢刺激电极(Rhodes Medical Systems,Inc.)向下经过这些孔从硬膜进入双侧半球，降至9.2毫米深度。在三叉神经节刺激前两分钟，将荧光素异硫氰酸酯标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)(20mg/kg,静脉注射)，蛋白质外渗的标记物，注入股静脉。使用带有PSIU6光电隔离单元的Model S48 Grass Instrument Stimulator(Grass-Telefactor)，以1.0mA(5Hz,5毫秒脉冲持续时间)的电流强度刺激左三叉神经节5分钟。刺激后五分钟，通过40ml盐水驱血处死大鼠。

处死大鼠后，除去颅骨顶部并收集硬膜。从双侧半球取膜样品，用水冲洗，然后在显微镜载玻片上平展。将载玻片在载玻片加热器上干燥15分钟，然后组织用70％甘油/水溶液加盖盖玻片。使用配备有光栅单色光镜和分光光度计的荧光显微镜(Zeiss)对每个硬膜样品中的FITC-BSA染料进行定量。对三叉神经节电刺激引起的外渗是同侧效应(即仅发生在三叉神经节被刺激的一侧硬膜)，因此允许未受刺激的一半硬膜作为对照。计算刺激侧与未刺激侧硬膜外渗的比率。结果提供在表8中(平均值±SE)。

表8：三叉神经节刺激诱导的硬膜血浆蛋白外渗

实施例9.示例性抗PACAP抗体的药代动力学

在雄性食蟹猴(n＝2)中，单次皮下施用后通过总IgG测定表征了本发明的示例性抗体的血清药代动力学。给动物皮下注射示例性抗体B(10mg/kg)，并在注射后1、3、6、24、48、72、96、120、144、168、240、336、504和672小时收集血清样品。总IgG测定大体上如本文所述实施。简而言之，1μg/mL山羊抗人IgG F(ab')2抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratoriesk,Inc.，目录号109-006-097)以100μL/孔包被Immulon 4HBX板。将孔与标准品(制备示例性抗体B15.63-1000ng/mL的标准曲线)，对照或血清样品之一进行孵育，然后用100μl/孔的1:10,000稀释的小鼠抗人IgG Fc-辣根过氧化物酶(HRP；SouthernBiotech，目录号9040-05)进行检测。洗掉未结合的检测试剂。之后，向孔中加入100μl/孔TMB微孔过氧化物酶底物系统。通过添加100μl/孔的TMB终止液停止显色，并在450nm波长处测量光密度，并将波长校正设置为630nm。通过在100％食蟹猴血清中的已知量示例性抗体B，然后以最小所需稀释度1:10稀释于在PBS中的Blocker^TMCasein中，使用5参数算法(StatLia；Version 3.2)，确定免疫反应性。后续过程基本按照以上描述，就示例性抗体B计算表观清除率(CL/F)为0.49mL/hr/kg，表观分布容积(V/F)为114.0mL/kg，通过非房室分析计算的终末半衰期为171小时。获得的药代动力学结果与能够延长作用时间的治疗性抗体一致。

序列

示例性重链(SEQ ID NO.1)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISLSGGSTYYAXSHKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVREVGASXHNYYGMDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPXCPAPEXXGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

其中，X在残基62处是D、A、E和Q之一；X在残基104处是N和T之一；X在残基231处是P和X之一；X在残基237处是A和F之一；以及X在残基238处是A和L之一。

示例性轻链(SEQ ID NO.2)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIXRWLAWYQQKPGKAPKLLIHDASQLXEGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

其中X在残基30处是S和W之一；以及X在残基55处是L和F之一。

示例性HCDR1(SEQ ID NO.3)

AASGFTFSSYYMS

示例性HCDR2(SEQ ID NO.4)

AISLSGGSTYYAXSHKG

其中X在残基13处是D、A、E和Q之一。

示例性HCDR3(SEQ ID NO.5)

VREVGASXHNYYGMDV

其中X在残基8处是N和T之一。

示例性LCDR1(SEQ ID NO.6)

RASQSIXRWLA

其中X在残基7处是S和W之一。

示例性LCDR2(SEQ ID NO.7)

HDASQLXE

其中X在残基7处是L和F之一。

示例性LCDR3(SEQ ID NO.8)

QQFDLLPLT

示例性HCVR(SEQ ID NO.9)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSAISLSGGSTYYAXSHKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVREVGASXHNYYGMDVWGQGTMVTVSS

其中，X在残基62处是D、A、E和Q之一；以及X在残基104处是N和T之一。

示例性LCVR(SEQ ID NO.10)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIXRWLAWYQQKPGKAPKLLIHDASQLXEGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQFDLLPLTFGGGTKVEIK

其中X在残基30处是S和W之一；以及X在残基55处是L和F之一。

编码示例性抗体B的HC的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggc ttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagc agctattacatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagct attagtctgagtggtggtagcacatactacgcagcgtcccacaagggccggttcaccatc tccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggac acggccgtatattactgtgtccgggaggtgggagctagcactcacaactactacggtatg gacgtctggggccaagggaccatggtcaccgtctcttcagcttctaccaagggcccatcg gtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgc ctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacc agcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagc gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcac aagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgccca ccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaaccc aaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagc caggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgcc aagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc gtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggc ctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacag gtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgc ctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccg gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctac agcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtg atgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt

编码示例性抗体B的LC的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)

gacatccagatgacccagtctccatcctcc ctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagagtatttgg aggtggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatccacgat gcatcccaattgttcgaaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagat tttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacag tttgatttgctccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggaccgtg gctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcc tctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtg gataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggac agcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaa gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc

重组人PACAP38的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK

其中残基38处的K通过C端酰胺化被翻译后修饰。

重组人PACAP27的氨基酸序列(SEQ ID NO.14)

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL

其中残基27处的L通过C端酰胺化被翻译后修饰。

Claims

1.结合人垂体腺苷酸环化酶激活肽的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCVR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO.3，HCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO.4，HCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO.5，LCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO.6，LCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO.7，且LCDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO.8，

其中HCDR2在残基13处的氨基酸是丙氨酸，HCDR3在残基8处的氨基酸是苏氨酸，LCDR1在残基7处的氨基酸是色氨酸，并且LCDR2在残基7处的氨基酸是苯丙氨酸。

2.权利要求1的抗体，其包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO.9以及LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO.10。

3.权利要求2的抗体，其中HCVR在残基62处的氨基酸是丙氨酸以及在残基104处的氨基酸是苏氨酸，并且其中LCVR在残基30处的氨基酸是色氨酸以及在残基55处的氨基酸是苯丙氨酸。

4.结合人垂体腺苷酸环化酶激活肽的抗体，其包含重链(HC)和轻链(LC)，其中HC的氨基酸序列是SEQ ID NO.1以及LC的氨基酸序列是SEQ ID NO.2，其中HC在残基62处的氨基酸是丙氨酸以及在残基104处的氨基酸是苏氨酸，并且其中LC在残基30处的氨基酸是色氨酸以及在残基55处的氨基酸是苯丙氨酸。

5.权利要求4的抗体，其中HC在残基62处的氨基酸是丙氨酸，在残基104处的氨基酸是苏氨酸，在残基231处的氨基酸是脯氨酸，在残基237处的氨基酸是丙氨酸，以及在残基238处的氨基酸是丙氨酸，并且其中LC在残基30处的氨基酸是色氨酸以及在残基55处的氨基酸是苯丙氨酸。

6.权利要求1至5中任一项的抗体用于制备治疗原发性头痛或继发性头痛的药物的用途。

7.权利要求1至5中任一项的抗体用于制备治疗偏头痛的药物的用途。

8.权利要求1至5中任一项的抗体用于制备治疗三叉神经自主头痛的药物的用途。

9.权利要求8的用途，其中三叉神经自主头痛是发作性丛集性头痛、慢性丛集性头痛、阵发性偏侧头痛和单侧神经痛样头痛发作之一。