TW201920280A - 抗pacap抗體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於針對人類腦下垂體腺苷酸環化酶活化肽之抗體、包含該等抗體之組合物及使用該等抗體治療包括頭痛及/或偏頭痛之疼痛的方法。

Description

抗PACAP抗體

本發明屬於醫藥領域。特定而言，本發明係關於腦下垂體腺苷酸環化酶活化肽(PACAP)之抗體、包含該等抗PACAP抗體之組合物及使用該等抗體治療疼痛之方法，疼痛包括原發性頭痛(包括三叉自主神經頭痛)、次發性頭痛及偏頭痛(包括慢性偏頭痛)。

腦下垂體腺苷酸環化酶活化肽(PACAP)係分佈於整個神經系統中之神經肽，神經系統包括三叉血管系統、三叉神經節、脊髓、下視丘及腦下垂體。PACAP以至少兩種α-醯胺化活化形式存在：PACAP38 (SEQ ID NO: 13)，其包含38個胺基酸且係較普遍之活化形式，通常表示哺乳動物組織中至多90%之PACAP；及PACAP27 (SEQ ID NO: 14)，其包含與PACAP38相同之27個N端胺基酸。咸信PACAP在神經保護、神經調節、神經性炎症及痛感中發揮作用且在造成包括頭痛及偏頭痛之疼痛中發揮作用。

估計每年3700萬患者受頭痛及偏頭痛影響，其中超過2/3未接受治療。原發性頭痛歸類為非因不同或單獨疾病或病症所造成之頭痛，而次發性頭痛歸類成因不同或單獨潛在原因(例如，創傷、疾病或其他病症)造成之頭痛。三叉自主神經頭痛(「TAC」)歸類為原發性頭痛，其包括復發性及慢性叢集性頭痛、陣發性偏頭痛、持續性偏頭痛及單側神經痛樣頭痛發作。偏頭痛係指「無先兆」偏頭痛(先前稱為「普通偏頭痛」)及「先兆性」偏頭痛(先前稱為「典型偏頭痛」)。慢性偏頭痛歸類為每月15天或更多天之頭痛，其中至少八天係偏頭痛。當偏頭痛患病率係每月兩次或更多次時，或當偏頭痛嚴重干預患者之日常生活且/或急性用藥無效時，鼓勵醫師考慮預防性治療選擇。然而，目前用於偏頭痛預防之治療選擇經常無效且現行預防性及急性治療選擇(例如，降壓藥、抗驚厥藥、抗抑鬱劑)功效較低且具有相關致殘副作用。

如作為抗PACAP抗體，PACAP之結構在本領域中為人熟知(參見例如，A. Miyata, A.等人, Biochem Biophys Res Commun 170: 643-648 (1990))。舉例而言，美國專利第5,486,472A號、國際專利申請公開案第WO/2012/106407 A3號及美國專利申請公開案第2016-304604號均揭示各種抗PACAP抗體及其潛在用途。然而，迄今為止，未證明存在靶向PACAP之抗體用於治療用途。因此，仍需要替代性抗PACAP抗體。特定而言，仍需要以高效中和PACAP、提供持久作用時間且能夠治療疼痛之替代性抗PACAP抗體，疼痛包括原發性及次發性頭痛及包括慢性偏頭痛之偏頭痛。如使用所有治療性療法，安全性及毒性仍係限制因素，且替代性抗PACAP抗體必不可伴隨不可接受之免疫原性。因此，仍需要在人體中呈現較低免疫原性風險之替代性抗PACAP抗體。較佳地，該等抗PACAP抗體亦將具有良好物理-化學特性以促進研發、生產及調配。

本發明提供一種結合人類PACAP之抗體，且其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中HCVR包含互補決定區(CDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且LCVR包含CDR LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中HCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO.3，HCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO.4，HCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO.5，LCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO.6，LCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO.7且LCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO.8。在一特定實施例中，HCDR2包含殘基13處之天冬胺酸，HCDR3包含殘基8處之天冬醯胺，LCDR1包含殘基7處之絲胺酸且LCDR2包含殘基7處之白胺酸。在另一特定實施例中，HCDR2包含殘基13處之丙胺酸，HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸，LCDR1包含殘基7處之色胺酸且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。在另一特定實施例中，HCDR2包含殘基13處之麩胺酸，HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸，LCDR1包含殘基7處之色胺酸且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。在甚至另一特定實施例中，HCDR2包含殘基13處之麩醯胺酸，HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸，LCDR1包含殘基7處之色胺酸且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。

本發明之實施例提供一種結合人類PACAP之抗體，其包含HCVR及LCVR，其中HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO.9，且LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO. 10。在特定實施例中，HCVR包含殘基62處之天冬胺酸及殘基104處之天冬醯胺，且LCVR包含殘基30處之絲胺酸及殘基55處之白胺酸。在其他特定實施例中，HCVR包含殘基62處之丙胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。在一些實施例中，HCVR包含殘基62處之麩胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。在一些實施例中，HCVR包含殘基62處之麩醯胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。

在其他實施例中，本發明提供一種結合人類PACAP之抗體，其包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中HC之胺基酸序列係SEQ ID NO.1，且LC之胺基酸序列係SEQ ID NO.2。在特定實施例中，HC包含殘基62處之天冬胺酸、殘基104處之天冬醯胺、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且LC包含殘基30處之絲胺酸及殘基55處之白胺酸。在其他特定實施例中，HC包含殘基62處之丙胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。在其他特定實施例中，HC包含殘基62處之麩胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。在一些特定實施例中，HC包含殘基62處之麩醯胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。

本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，本發明提供一種治療諸如頭痛之疼痛的方法，頭痛包括原發性及次發性頭痛，方法包含向有需要之患者投與本發明之醫藥組合物。在甚至另一實施例中，原發性頭痛係TAC。在甚至另一實施例中，本發明提供一種治療偏頭痛之方法，其包含向有需要之患者投與本發明之醫藥組合物。在一些該等實施例中，偏頭痛係慢性偏頭痛。此外，本發明提供一種治療肥胖細胞去顆粒相關之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與本發明之抗體或醫藥組合物。根據一些該等實施例，肥胖細胞去顆粒相關疼痛係原發性或次發性頭痛及偏頭痛之一者。

此外，本發明提供一種治療諸如原發性頭痛、次發性頭痛及/或偏頭痛之疼痛的方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明的抗體。根據一些實施例，原發性頭痛係TAC。根據一些實施例，偏頭痛係慢性偏頭痛。

本發明亦提供本發明之抗體在療法中之用途。更特定而言，本發明提供本發明之抗體在治療疼痛中之用途。在特定實施例中，本發明提供本發明之抗體在治療原發性頭痛、次發性頭痛及/或偏頭痛中之用途。

此外，本發明提供本發明之抗體在製造用於治療諸如原發性頭痛、次發性頭痛及/或偏頭痛之疼痛的藥物中之用途。在甚至更特定之實施例中，原發性頭痛係TAC。在一些特定實施例中，偏頭痛係慢性偏頭痛。

本發明亦關於編碼本發明之抗體的核酸分子及表現載體。在一實施例中，本發明提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO.1胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基62係天冬胺酸，殘基104係天冬醯胺，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸。在一些實施例中，殘基62係丙胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸。在一些實施例中，殘基62係麩胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸。在其他實施例中，殘基62係麩醯胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸。

本發明之實施例亦提供一種DNA分子，其包含編碼具有SEQ ID NO.2胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基30係絲胺酸且殘基55係白胺酸。在一些實施例中，殘基30係色胺酸且殘基55係苯丙胺酸。

在一些實施例中，本分子之DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO.1胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基62係天冬胺酸，殘基104係天冬醯胺，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸，且DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO. 2胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基30係絲胺酸且殘基55係白胺酸。在一特定實施例中，本分子之DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO.1胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基62係丙胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸，且DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO. 2胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基30係色胺酸且殘基55係苯丙胺酸。在一特定實施例中，本分子之DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO.1胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基62係麩胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸，且DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO. 2胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基30係色胺酸且殘基55係苯丙胺酸。在另一特定實施例中，本分子之DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO.1胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基62係麩醯胺酸，殘基104係蘇胺酸，殘基231係脯胺酸，殘基237係丙胺酸且殘基238係丙胺酸，且DNA分子包含編碼具有SEQ ID NO. 2胺基酸序列之多肽的多核苷酸序列，其中殘基30係色胺酸且殘基55係苯丙胺酸。此外，本發明提供一種根據一種製程製備之抗體，其中該製程包含在使抗體得以表現之條件下培養包含本發明之多核苷酸序列的寄主細胞，且自該寄主細胞恢復本發明之抗體。

如本文所用，「抗體」係免疫球蛋白分子，其包含由雙硫鍵連接之2個HC及2個LC。各LC及HC之胺基端部包括約100-120個胺基酸之可變區，其主要負責經由其中所含之CDR識別抗原。CDR散佈有更保守之區域，稱為框架區(「FR」)。各LCVR及HCVR由3個CDR及4個FR構成，自胺基末端至羧基末端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。LC之3個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」，且HC之3個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」。CDR含有多數與抗原形成特定相互作用之殘基。抗體結合特定抗原之功能性深受六個CDR影響。本發明之抗體的LCVR及HCVR區內之胺基酸的分配係基於熟知的卡巴特編號慣例(Kabat numbering convention；Kabat等人,Ann. NY Acad. Sci . 190:382-93 (1971)；Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版物第91-3242號(1991))及諾斯編號慣例(North numbering convention；North等人,A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations , Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011))。

LC歸類為κ (kappa)或λ (lambda)，其各自之特點在於如本領域中已知的特定恆定區。本發明之抗體包括κ LC。HC歸類為γ (gamma)、μ (mu)、α (alpha)、δ (delta)或ε (epsilon)，且分別將抗體之同型界定為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。本發明之抗體包括IgG HC。IgG抗體可進一步歸類為子類，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。在一特定實施例中，本發明之抗體係IgG4。各HC之羧基端部界定主要負責效應物功能之恆定區。在一特定實施例中，本發明之抗體在降低效應物功能之各HC的恆定區中具有一或多個修飾。在一更特定實施例中，本發明之抗體係IgG4且在降低效應物功能之兩個HC的恆定區中具有修飾，包括胺基酸丙胺酸於殘基237及238處(殘基編號係線性的且基於SEQ ID NO.1之例示性HC)。在一甚至更特定之實施例中，本發明之抗體係IgG4且在降低效應物功能之兩個HC的恆定區中具有修飾，包括胺基酸丙胺酸於殘基237及238處，且在提昇穩定性之兩個HC的恆定區中具有進一步修飾，包括胺基酸脯胺酸於殘基231處(殘基編號係線性的且基於SEQ ID NO.1之例示性HC)。

本發明之抗體係單株抗體(「mAb」)。mAb可例如藉由融合瘤技術、重組技術、噬菌體顯示技術、例如CDR接枝的合成技術或本領域中已知的該等或其他技術的組合而製成。如本文提及，mAb係抗體，該等抗體衍生自包括例如任何真核、原核或噬菌體選殖體之單一拷貝體或選殖體，且並非製造其之方法。

製造且純化抗體之方法係本領域中所熟知的。舉例而言，可篩選噬菌體庫，由此篩選成千上萬個Fab片段以與重組人類PACAP相互作用。所得相互作用之片段可經回收、純化，且使用本領域中熟知之習知方法確定胺基酸序列，藉此可建構初始引導抗體。本發明之抗體經過工程改造而含有一或多個人類框架區。人類框架生殖系列序列可經由該等序列之網址http://imgt.cines.fr獲自ImMunoGeneTics (INGT)，或從由Marie-Paule Lefranc及Gerard Lefranc所著之The Immunoglobulin FactsBook (學術出版社, 2001, ISBN 012441351)獲得。根據特定實施例，本發明之抗體中所用之生殖系列HC及LC框架區分別包括3-23及O18。

在本發明之特定實施例中，抗體或編碼抗體之核酸以經分離形提供。如本文所用，術語「經分離」係指蛋白質、肽或核酸不受或基本不受細胞環境中所發現之其他巨分子種類影響。

本發明之抗體可使用已知方法製備且純化。舉例而言，編碼HC (例如，由SEQ ID NO.1給出之胺基酸序列)及LC (例如，由SEQ ID NO.2給出之胺基酸序列)的cDNA序列可經選殖並進行基因改造至GS (麩醯胺酸合成酶)表現載體中。隨後可將基因改造之免疫球蛋白表現載體穩定轉染至CHO細胞中。如本領域中之技術者之一應理解，哺乳動物抗體表現會導致糖基化，通常位於Fc區中之高度保守的N-糖基化位點。驗證可用於表現特異性結合至人類PACAP之抗體的穩定選殖體。陽性選殖體可擴張至無血清培養基中以使抗體在生物回應器中生產。可藉由習知技術純化抗體分泌於其中之培養基。舉例而言，培養基可順利施用於蛋白質A或蛋白質G瓊脂糖凝膠FF管柱，該管柱已使用諸如磷酸鹽緩衝鹽水之相容緩衝劑平衡。洗滌管柱以移除非特異性結合組分。例如藉由pH梯度溶離結合抗體，且諸如藉由SDS-PAGE偵測到抗體部分，且隨後匯集在一起。可使用一般技術使抗體濃縮及/或除菌過濾。可藉由一般技術有效移除可溶性凝集物及集合體，技術包括粒徑篩析、疏水作用、離子交換或羥磷石灰層析法。產物可在例如-70℃下立即冷凍，或可進行凍乾。

本發明之抗體可用於治療患者。更特定而言，預期本發明之抗體治療一類疼痛，其具體包括原發性及次發性頭痛及包括慢性偏頭痛之偏頭痛。儘管本發明之抗體預期用於治療包括原發性及次發性頭痛及偏頭痛之疼痛，但該等抗體亦可用於治療其他疼痛。如本文中互換使用，「治療(treatment/treating/treat)」意欲係指本文所述之病症進程可能存在減緩、中斷、中止、控制、停止或逆轉之所有過程，但未必意指所有疾病症狀完全消失。治療包括投與本發明之抗體用於治療人體中可能得益於PACAP活性降低之疾病或病況，且包括：(a)抑制疾病之進一步進程，亦即，中止其發展；(b)緩解疾病，亦即，使疾病或病症退化或緩解其症狀或併發症；及(c)防止症候之疾病發作。

本申請案在35 U.S.C. §119(e)下要求2017年9月29日發表之美國臨時申請案系列第62/565,278號之權益；該申請案之揭示內容以引用方式併入本文中。

如本文互換使用，術語「患者」、「受試者」及「個體」係指人類。在某些實施例中，患者之特徵進一步在於患有將得益於PACAP活性降低之疾病、病症或病況(例如，疼痛，例如原發性或次發性頭痛及/或包括慢性偏頭痛之偏頭痛)。在另一實施例中，患者之特徵進一步在於存在發展上文所述病況或將得益於PACAP活性降低之病況的風險。

如本文所用，術語「結合(或結合至)」係指抗體與人類PACAP之表位的相互作用。如本文所用之術語「表位」係指由本發明之抗體識別之抗原的離散、三維位點。

本發明之抗體可併入醫藥組合物中，該組合物可藉由本領域中熟知的方法製備且包含本發明之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑(例如，Remington ,The Science and Practice of Pharmacy ，第22版，Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012，其提供如從業者普遍知曉之調配技術概要)。醫藥組合物之合適載劑包括任何材料，其在與本發明之抗體組合時保留分子活性且不與患者之免疫系統反應。

包含本發明之抗體的醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如，皮下、靜脈、腹膜內、肌內或透皮)投與至有風險患有或呈現如本文所述之疾病或病症的患者。如本文互換使用，本發明之醫藥組合物含有「有效」或「治療有效」量之本發明的抗體。有效量係指實現所要治療結果所必需之量(以劑量形式且持續一段時間且針對投與方式)。抗體之有效量可根據如下因素而改變：諸如疾病狀態、年齡、性別及個體之重量及抗體在個體中誘發所要反應之能力。有效量亦係治療有益效應超過本發明之抗體的任何毒性或有害效應之量。

實例 實例 1. 例示性抗 PACAP 抗體之工程改造及表現 當構建本發明之抗PACAP抗體時，遭遇與化學及物理穩定性相關之顯著問題。舉例而言，初始人性化構建物所遭遇之問題包括低結合親和力、不可接受之免疫原性、可變區脫醯胺、氧化、異構化及低效能。

因此，對化學及物理修飾進行工程改造以改良結合親和力，消除或減少HC二聚合，降低免疫原性且改善本發明之抗體的化學及物理穩定性。在重鏈及輕鏈中對胺基酸修飾進行工程改造。亦進行延伸蛋白質穩定性研究，且針對表現及熱穩定特性以及包括結合親和力之其他特性篩選構建之抗體。包括來自初始構建物之許多修飾的以下抗體視作具有高結合親和力，具有化學及物理穩定性，具有低免疫原性且在持續投與一月後具有藥物動力特性。在初始人性化之構建物中未識別出包含本發明之抗體的修飾。

本發明之例示性抗PACAP抗體顯示於表1中。例示性抗體包括SEQ ID NO: 1之重鏈及SEQ ID NO: 2之輕鏈以及人類HC框架3-23及具有框架O18之人類κ LC。此外，改善抗體化學及物理穩定性以及功能特性之輕鏈及重鏈內的工程改造之修飾提供於表1中。例示性抗PACAP抗體之各種區的關係如下(胺基酸之編號適用線性編號；胺基酸至可變域之分配係基於獲自www.imgt.org之國際免疫遺傳學資訊系統^® (International Immunogenetics Information System^® )；胺基酸至CDR域之分配係基於熟知的諾斯編號慣例(North numbering convention)，而HCDR2係基於熟知的卡巴特編號慣例(Kabat numbering convention))：表 1 ：本發明之例示性抗 PACAP 抗體之胺基酸區

以下實例及分析顯示，本發明之抗體適用於治療包括原發性及次發性頭痛及偏頭痛之疼痛。然而，應理解，以下實例係以闡釋及非限制的方式例舉，且本領域中之普通技術者之一可作出各種修改。

本發明之例示性抗PACAP抗體基本上可如下表現及純化。麩醯胺酸合成酶(GS)表現載體用於以電穿孔轉染中國倉鼠卵巢細胞株(CHO)，該載體含有編碼根據表1之HC胺基酸序列的DNA序列(例如，編碼表1中顯示之例示性抗體B之HC的SEQ ID NO:11 DNA序列)及編碼根據表1之LC胺基酸序列的DNA序列(例如，編碼表1中顯示之例示性抗體B之LC的SEQ ID NO:12 DNA序列)。表現載體編碼SV早期(猴病毒40E)啟動子及GS之基因。GS之表現允許麩醯胺酸之生化合成，麩醯胺酸係CHO細胞所需之胺基酸。轉染後，使用50µM L-甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)對細胞進行大批量選擇。藉由MSX抑制GS係用於提高選擇之嚴格度。以CHO野生型細胞(該等細胞表現內源含量之GS)為背景，選擇出將表現載體cDNA併入至宿主細胞基因體之轉錄性活性區的細胞。以低密度塗覆培養經轉染之細胞集合體，使得穩定表現細胞以接近純系方式生長。篩選用於抗體表現之主要細胞槽，且隨後以無血清、懸浮培養物方式擴增以用於生產。將其中已分泌有抗體之澄清培養基施用於蛋白質A親和力管柱，該管柱已使用諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)之相容緩衝劑平衡。用1M NaCl洗滌管柱以移除非特異性結合組分。使用pH (大約) 3.5之檸檬酸鈉溶離結合抗體，且使用1M Tris緩衝劑中和分液。諸如藉由SDS-PAGE或分析性粒徑篩析偵測抗體部分，且隨後匯集在一起。藉由一般技術有效移除可溶性凝集物及集合體，技術包括粒徑篩析、疏水作用、離子交換或羥磷石灰層析法。使用一般技術使本發明之例示性抗PACAP抗體濃縮及/或除菌過濾。在此等層析步驟之後，例示性抗體之純度大於95%。本發明之例示性抗PACAP抗體可在-70℃下立即冷凍，或儲存於4℃下持續數月。

實例 2. 結合親和力 使用以96孔盤為基礎之動力排除分析(改編自Estep等人, mAbs, 2013, 5:270-278)測定各抗體-抗原複合物之結合親和力(K_D )。簡言之，自初始濃度7290pM至41fM製備各例示性Ab (例舉於表1中)之3倍稀釋系列；各系列包括無抗體對照物。以3% (w/v)阻斷劑A溶液(MSD，#R93AA-1)製備樣品，且將30pM固定最終抗原濃度之N端生物素化PACAP27 (定製合成，CPC Scientific)或N端生物素化PACAP38 (Anaspec，#23590)添加至各樣品中。將100µl體積之各抗原-抗體樣品重複添加至96孔微量滴定盤(Greiner，EK-20101)之個別孔中。使用光學黏合膜(Thermo Fisher Scientific，#4311971)使盤密封，且在37℃下培養3至4天以使樣品平衡。在分析前一日，96孔MSD標準盤(MSD，#L15XA)之各列塗覆有30µl相應抗體(如滴定系列中所用)，其濃度係3µg/ml於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。在實驗日，使用150µl PBS洗滌MSD標準盤一次，且在30℃下使用150µl 3%阻斷劑A溶液阻斷45分鐘，同時在MaxQ 4450台式搖晃器(Thermo Fisher Scientific)上以300 rpm搖晃。使用PBS洗滌三次後，將50µl各抗原-抗體樣品(如上文所述製備且培養)添加至MSD標準盤中，且在30℃下培養150秒，同時以300 rpm搖晃。使用PBS單次洗滌後，將50µl製備於1% (w/v)阻斷劑A溶液中之1µg/ml SULFO-TAG標記鏈親和素(MSD，#R32AD-5)添加至MSD標準盤中，且在30℃下培養該盤3分鐘，同時以300 rpm搖晃。再次使用PBS洗滌該盤三次，隨後添加150微升/孔之1X讀緩衝劑(MSD，#R92TC-2)。使用MESO Quickplex SQ 120/1300儀器(Meso Scale Discovery)讀取MSD標準盤。使用SigmaPlot (12.5版本，Systat Software)完成資料分析，且使用SigmaPlot之一體化四參數邏輯曲線模型(Four Parameter Logistic Curve Model)測定結合親和力(K_D )。結果提供於表2中。表 2 ： 37 ℃下抗體 - 抗原複合物之結合親和力 (K_D )

實例 3. 活體內 PACAP 分解 在大鼠中分析循環PACAP38之活體內分解。將對照IgG4抗體(10 mg/kg)或例示性抗體A (10 mg/kg)之一者靜脈注射至大鼠中。分析各大鼠之血漿內基線PACAP38，且隨後將6 µg/kg PACAP38靜脈注射至大鼠中。在PACAP38注射後，在120分鐘時段內收集血漿樣品，且經由改良ELISA形式測定PACAP38之總含量(與抗體結合或未與抗體結合)。簡言之，96孔MSD盤(MSD，目錄#: L15xA-1)塗覆有30微升/孔之1ug/ml抗PACAP38抗體(US Biological Cat# P1775-03C)於PBS中，且在40℃下培養隔夜。用200微升/孔PBST洗滌該盤三次，隨後在室溫下用150微升/孔3%阻斷劑A於PBS中(MSD Cat# R93BA-2)阻斷1小時，同時以650 rpm旋轉。之後，用200微升/孔PBST洗滌該盤三次。使用分析緩衝劑以1000 pg/mL稀釋PACAP38之校準物(Bachem Cat# H430-0500)，緩衝劑含有一份稀釋劑2 (MSD Cat# R51-BB-3)及39份稀釋劑3 (MSD Cat# R51BA-3)，補充有200 µg/ml HBR1 (Scantibodies Inc，Cat# 3KC533)及10 µg/ml之生物素例示性抗體A。藉由用分析緩衝劑對1000 pg/mL校準物進行三倍連續稀釋而製備校準物標準曲線。在補充有200 µg/mL HBR1及10 µg/mL生物素例示性抗體A之稀釋劑3中使血漿樣品稀釋40倍。將25 µl不同濃度之校準物及稀釋之血漿樣品添加至分析盤之個別孔中，且在室溫下培養2小時，同時以650 rpm旋轉。在用200微升/孔PBST洗滌該盤3次後，將25 µl 0.5 µg/ml Sulfo-tag標記山羊抗人類IgG (MSD Cat# R32AJ-1)於稀釋劑3中添加至各孔中，且在室溫下培養該盤1小時。隨後用200微升/孔PBST洗滌該等盤三次，且將150 µl 2X讀緩衝劑T (MSD，Cat# R92TC-3)添加至各孔中，且用MSD盤讀取器讀取信號(結果，呈現為可偵測之PACAP38含量，平均值 ± SEM (n=2-3))。結果呈現於表3中。表 3 ： PACAP38 血漿含量

表3中呈現之結果表明，在靜脈注射時，例示性抗體A阻止PACAP38分散，但不阻止PACAP38活體內分解。

實例 4. 抑制 PACAP27 、 PACAP38 或 VIP 誘導之 cAMP 在用表現人類PAC 1 (NP_001186564.1)或人類VPAC2 (NP_003373.2)之載體轉染的CHO-K1細胞(ATCC，catalog # CCL-61)中分析由本發明之抗體造成的PACAP27、PACAP38及VIP誘導之cAMP刺激的中和作用。用非酵素細胞解離緩衝劑(Gibco #313131-014)收集CHO-K1細胞，計數，離心且再懸浮於分析緩衝劑中達10,000個細胞/25微升。將濃縮細胞(10,000個於25 µl中)添加至96孔盤之孔中。

例示性抗體(例舉於表1中)係連續稀釋於100 µl分析緩衝劑(具有鈣及鎂之HBSS (Hyclone，ThermoScientific，SH30268)、0.1 % BSA (Sigma-Aldrich, #A7888)、500 µM IBMX (Sigma-Aldrich, I5879))中至4倍所要最終濃度。用促效劑(以2X最終濃度)在室溫下培養稀釋之例示性抗體持續15分鐘。促效劑之最終濃度：100 pM PACAP27及PACAP38於人類PAC1中、800 pM PACAP27及PACAP38於人類VPAC2中、800 pM VIP於人類VPAC2分析中。其後，將25 µl例示性抗體-促效劑溶液添加至96孔盤之個別孔(含有細胞)中，且在室溫下培養1小時。使用cAMP femto 2 (Cisbio, 62AM5PEC)確定各孔中之cAMP形成。在添加25 µl抗cAMP-穴狀化合物使用溶液後，將25 µl cAMP-d2使用溶液(Cisbio，62AM5PEC)添加至各孔，且在黑暗中於室溫下培養該盤1小時。使用Envision 12 (Perkin Elmer，激發330 nm)儀器在665及620 nm處量測所得HTRF信號，且繪製665/620之比率以量化cAMP (使用Graphpad Prism 7繪製資料，且使用一體化四參數邏輯曲線模型合適慣例測定IC50值)。結果作為平均值 ± SEM提供於表4中。表 4 ： PACAP27 及 PACAP38 誘導之 cAMP 提高的體外中和作用

實例 5. 免疫原性分析 用後生基質T細胞表位預測軟體(交互篩選及蛋白質再工程改造界面(ISPRI)基於網頁之入口網站(Epivax, Inc.)中)進行電腦模擬免疫原性分析，包括Tregitope調節之後生基質評分。分別分析與各抗體相關之輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)蛋白質序列。根據Epivax，具有大於零之Tregitope調整後生基質評分的蛋白質序列具有更高總體免疫潛能。後生基質群免疫原性分析亦針對各LCVR及HCVR進行以識別各抗體之CDR內的T細胞表位群。如藉由存在2個或更多個相鄰EpiBar而界定之T細胞表位群的存在係與更高總體免疫性潛能有關。使用諾斯CDR定義，在例示性抗體A、B或C中未識別CDR相關之T細胞表位群。4個相鄰EpiBar之T細胞表位群經識別於比較物抗體ALD 1.H (在美國專利公開案第US 2016/0304604號中描述為「Ab 1.H」)之LCVR的CDR2中，表明比較物抗體具有更高免疫性潛能。結果提供於表5A、5B及5C中。表 5A ：經由後生基質 T 細胞表位預測之電腦模擬免疫原性風險分析 表 5B ： Tregitope 調整之後生基質分析 表 5C ：經由後生基質群免疫原性分析之電腦模擬免疫原性風險分析

實例 6. 肥胖細胞去顆粒誘導之 PACAP 釋放的中和作用 使用StemSpan培養基(StemCell)及SCF/IL-6在培養物中區分人類肥胖細胞與人類臍帶血幹細胞。在分析日，以每50 µl 100,000個細胞將肥胖細胞電鍍於96孔組織培養板之孔中的台氏緩衝劑(Tyrode's buffer，130 mM NaCl，5 mM KCl，1.4 mM CaCl2，1 mM MgCl2，5.6 mM葡萄糖，10 mM HEPES及0.1% BSA，pH 7.4)中。如下文描述在存在或不存在例示性抗體之情況下用PACAP38或PACAP27處理細胞。

藉由向每個孔添加25 µl之4X濃縮例示性抗體(153 µM例示性抗體之最終濃度)進行單點測試。針對0至153 µM之最終劑量範圍(三倍稀釋)，藉由每孔添加25 µl 4X濃縮抗體進行劑量曲線測試。將25µl之4X濃縮PACAP38或PACAP27添加至每孔中，達至1 µM PACAP之最終濃度(38或27)。分析培養基僅用作非處理對照組且IgG4 mAb用作陰性對照組。進行三次測試。將96孔盤置於培養箱(37℃)中持續30分鐘。培養後，收集30微升/孔之上清液，且藉由商業分析(Millipore)量測類胰蛋白酶活性。上清液中類胰蛋白酶釋放百分比(%)係藉由以下方程計算：((實驗類胰蛋白酶釋放 - 載體對照組類胰蛋白酶釋放) / (總類胰蛋白酶釋放 - 載體對照組類胰蛋白酶釋放) × 100，其中總類胰蛋白酶釋放係藉由冷凍/融化肥胖細胞獲得)。結果提供於表6A、6B及6C中。表 6A ：人類肥胖細胞中 PACAP (27 及 38) 誘導之類胰蛋白酶釋放的單點抑制 表 6B ：人類肥胖細胞中 PACAP27 誘導之類胰蛋白酶釋放的劑量曲線抑制 表 6C ：人類肥胖細胞中 PACAP38 誘導之類胰蛋白酶釋放的劑量曲線抑制

實例 7. 體內 PACAP 誘導之 cAMP 中和作用 在CD-1小鼠模型(Envigo)中分析PACAP誘導之血漿cAMP提高的體內中和作用。簡言之，向雄性CD-1小鼠皮下投與10 mg/kg之以下中的一者：對照IgG4抗體(N= 6)；對照IgG4抗體加PBS/僅咯利普蘭(rolipram) (N= 5)；例示性抗體B (N=5)；例示性抗體C (N=5)；或例示性抗體D (N=6)。抗體處理三日後，向小鼠靜脈投與PACAP38 (13 nmols/kg)加咯利普蘭(100ug/mL)；一些先前用IgG4對照抗體處理之小鼠僅靜脈注射PBS (含有0.2%乙醇、1% BSA、5 ml/kg及咯利普蘭(100 µg/ml))。PACAP38處理十分鐘後，將血液收集於含EDTA之管中，且藉由離心分離血漿。根據製造商指示，使用市售cAMP ELISA (Cell Bios, Inc.)測定cAMP之血漿含量。統計分析以單向ANOVA (Graphpad Prism 7)運用對數轉換cAMP濃度，隨後進行鄧奈特事後分析(Dunnett's post hoc analysis)。結果作為平均值 ± SE例舉於表7中。表 7 ： PACAP 誘導之血漿 cAMP 含量 *p＜0.0001對比IgG4對照Ab (PACAP38)

實例 8. 體內三叉神經節刺激誘導之硬膜血漿蛋白質外滲的中和作用 使用大鼠模型檢驗本發明之抗PACAP抗體在體內阻斷血漿蛋白質外滲之能力，該外滲係由刺激三叉神經節後釋放PACAP而誘發。簡言之，向史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat，Envigo，雄性，250-350 g)皮下投與以下之一者：1-10 mg/kg例示性抗體A；3-30 mg/kg例示性抗體B；或3或10 mg/kg對照IgG4 Ab。七十二小時後，用寧必妥(Nembutal，65 mg/kg, ip.)麻醉大鼠，且將其置於立體定位框架(David Kopf Instruments)中，門齒桿設於-2.5 mm處。製造中線矢狀切口，隨後在頭骨上刺穿兩對雙邊洞(3.2 mm於後部，1.8及3.8 mm橫向，所有座標參考前囪)。將不鏽鋼刺激電極對(Rhodes Medical Systems, Inc.)降入兩個半球中之孔中，達至距硬膜9.2 mm之深度。在三叉神經節刺激兩分鐘前，將螢光素異硫氰酸鹽標記之牛血清白蛋白(FITC-BSA) (20 mg/kg, iv.)注射至股靜脈中，該螢光素異硫氰酸鹽標記之牛血清白蛋白係蛋白質外滲之標記。使用具有PSIU6光電獨立單元之Model S48 Grass Instrument刺激器(Grass-Telefactor)以1.0 mA之電流強度刺激左側三叉神經節持續5分鐘(5 Hz，5 msec脈衝持續時間)。刺激五分鐘後，用40 ml鹽水換血使大鼠致死。

大鼠死後，移除頭骨之頂部且收集硬膜。自兩個半球移除膜樣品，用水洗滌，且在載玻片上鋪平。在載玻片加溫器上乾燥載玻片15分鐘，且用70%甘油/水溶液覆蓋滑動組織。配備有光柵單色儀及分光光度計之螢光載玻片(Zeiss)用於量化各硬膜樣品中之FITC-BSA染料。由三叉神經節之電刺激誘導之外滲係同側效應(亦即，僅發生於三叉神經節受到刺激之硬膜的一側)，因此允許未受刺激之一半硬膜作為對照物。計算硬膜中刺激側與未受刺激側之外滲的比率。結果提供於表8中(平均值 ± SE)。表 8 ：三叉神經節刺激誘導之硬膜血漿蛋白質外滲

實例 9. 例示性抗 PACAP 抗體之藥物動力學 在雄性石蟹獼猴(n=2)中使本發明之例示性抗體的血清藥物動力學特徵化，隨後藉由總IgG分析進行單次SC投與。將例示性抗體B (10mg/kg)皮下注射至動物，且在注射後1、3、6、24、48、72、96、120、144、168、240、336、504及672小時收集血清樣品。大致如本文中描述進行總IgG分析。簡言之，將100微升/孔之1 ug/mL山羊抗人類IgG F(ab')2抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.，目錄號109-006-097)塗覆於Immulon 4HBX盤上。用標準物(例示性抗體B之標準曲線係製備自15.63-1,000 ng/mL)、對照物或血清樣品之一者培養該等孔，隨後100微升/孔之1:10,000稀釋小鼠抗人類IgG Fc-辣根過氧化酶(HRP；SouthernBiotech，目錄號9040-05)用於偵測。洗淨未結合之偵測試劑。其後，將100微升/孔TMB微孔過氧化酶基質系統添加至孔中。藉由添加100微升/孔TMB終止溶液終止色彩發展，且使用設於630 nm之波長校正於450 nm處量測光學密度。在100%石蟹獼猴血清中自已知量之例示性抗體B測定免疫反應性，隨後使用5-參數算法(StatLia；3.2版本)在Blocker™ Casein於PBS中進行最小所需稀釋。以下程序基本如上文所述，計算例示性抗體B之明顯0.49 mL/hr/kg之間距(CL/F)、114.0 mL/kg之明顯體積分佈(V/F)及藉由非分割分析計算的171小時最終半衰期。所獲得之藥物動力學結果與能夠延長作用時間的治療抗體一致。

序列表 例示性 HC (SEQ ID NO.1) 其中，殘基62處之X係D、A、E及Q中之一者；殘基104處之X係N及T中之一者；殘基231處之X係P及S中之一者；殘基237處之X係A及F中之一者；且殘基238處之X係A及L中之一者。例示性 LC (SEQ ID NO.2) 其中殘基30處之X係S及W中之一者；且殘基55處之X係L及F中之一者。例示性 HCDR1 (SEQ ID NO.3) AASGFTFSSYYMS例示性 HCDR2 (SEQ ID NO.4) AISLSGGSTYYAXSHKG 其中殘基13處之X係D、A、E及Q中之一者。例示性 HCDR3 (SEQ ID NO.5) VREVGASXHNYYGMDV 其中殘基8處之X係N及T中之一者。例示性 LCDR1 (SEQ ID NO.6) RASQSIXRWLA 其中殘基7處之X係S及W中之一者。例示性 LCDR2 (SEQ ID NO.7) HDASQLXE 其中殘基7處之X係L及F中之一者。例示性 LCDR3 (SEQ ID NO.8) QQFDLLPLT例示性 HCVR (SEQ ID NO.9) 其中，殘基62處之X係D、A、E及Q中之一者；且殘基104處之X係N及T中之一者。例示性 LCVR (SEQ ID NO.10) 其中殘基30處之X係S及W中之一者；且殘基55處之X係L及F中之一者。編碼例示性 Ab B 之 HC 的 核苷酸序列 (SEQ ID NO.11) 編碼例示性 Ab B 之 LC 的核苷酸序列 (SEQ ID NO.12) 重組人類 PACAP 38 之胺基酸序列 (SEQ ID NO.13) HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK 其中殘基38處之K係藉由C端醯胺化進行轉譯後修飾。重組人類 PACAP 27 之胺基酸序列 (SEQ ID NO.14) HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL 其中殘基27處之L係藉由C端醯胺化進行轉譯後修飾。

Claims (19)

1. 一種結合人類腦下垂體腺苷酸環化酶活化肽之抗體，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR包含互補決定區(CDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該LCVR包含CDR LCDR1、LCDR1及LCDR3，其中HCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO.3，HCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO.4，HCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO.5，LCDR1之胺基酸序列係SEQ ID NO.6，LCDR2之胺基酸序列係SEQ ID NO.7且LCDR3之胺基酸序列係SEQ ID NO.8。
2. 如請求項1之抗體，其中HCDR2包含殘基13處之天冬胺酸；HCDR3包含殘基8處之天冬醯胺；LCDR1包含殘基7處之絲胺酸；且LCDR2包含殘基7處之白胺酸。
3. 如請求項1之抗體，其中HCDR2包含殘基13處之丙胺酸；HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸；LCDR1包含殘基7處之色胺酸；且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。
4. 如請求項1之抗體，其中HCDR2包含殘基13處之麩胺酸；HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸；LCDR1包含殘基7處之色胺酸；且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。
5. 如請求項1之抗體，其中HCDR2包含殘基13處之麩醯胺酸；HCDR3包含殘基8處之蘇胺酸；LCDR1包含殘基7處之色胺酸；且LCDR2包含殘基7處之苯丙胺酸。
6. 如請求項1之抗體，其包含重鏈可變區(HCVR)及輕鏈可變區(LCVR)，其中該HCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO.9，且該LCVR之胺基酸序列係SEQ ID NO. 10。
7. 如請求項6之抗體，其中HCVR包含殘基62處之天冬胺酸及殘基104處之天冬醯胺，且其中LCVR包含殘基30處之絲胺酸及殘基55處之白胺酸。
8. 如請求項6之抗體，其中HCVR包含殘基62處之丙胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且其中LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
9. 如請求項6之抗體，其中HCVR包含殘基62處之麩胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且其中LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
10. 如請求項6之抗體，其中HCVR包含殘基62處之麩醯胺酸及殘基104處之蘇胺酸，且其中LCVR包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
11. 一種結合人類腦下垂體腺苷酸環化酶活化肽之抗體，其包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC之胺基酸序列係SEQ ID NO.1，且該LC之胺基酸序列係SEQ ID NO.2。
12. 如請求項11之抗體，其中HC包含殘基62處之天冬胺酸、殘基104處之天冬醯胺、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且其中LC包含殘基30處之絲胺酸及殘基55處之白胺酸。
13. 如請求項11之抗體，其中HC包含殘基62處之丙胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且其中LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
14. 如請求項11之抗體，其中HC包含殘基62處之麩胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且其中LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
15. 如請求項11之抗體，其中HC包含殘基62處之麩醯胺酸、殘基104處之蘇胺酸、殘基231處之脯胺酸、殘基237處之丙胺酸及殘基238處之丙胺酸，且其中LC包含殘基30處之色胺酸及殘基55處之苯丙胺酸。
16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
17. 一種如請求項1至15中任一項之抗體或如請求項16之醫藥組合物的用途，其用於製造治療原發性頭痛、次發性頭痛及偏頭痛中之一者的藥物。
18. 如請求項17之用途，其中該原發性頭痛係三叉自主神經頭痛。
19. 如請求項18之用途，其中該三叉自主神經頭痛係以下之一者：復發性叢集性頭痛、慢性叢集性頭痛、陣發性偏頭痛及單側神經痛樣頭痛發作。