DE69633234T2

DE69633234T2 - Reinigung von dalbeheptide-antibiotika mittels isoelektrofokussierung

Info

Publication number: DE69633234T2
Application number: DE69633234T
Authority: DE
Inventors: Maria Alessandra BOSSI; Giorgio Pier RIGHETTI; Ernesto Riva; Franco Luigi ZERILLI
Original assignee: Aventis Bulk SpA
Current assignee: Sanofi Aventis SpA
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2016-06-26
Also published as: EP0836619B1; DE69633234D1; KR100430202B1; US5939523A; PT836619E; JPH11508572A; AU701463B2; EP0836619A1; ES2224173T3; IL122151A0; AU6416196A; ATE274524T1; CA2226142A1; IL122151A; DK0836619T3; CA2226142C; WO1997002288A1; KR19990028712A; JP4051421B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von antibiotischen Verbindungen der Dalbaheptid-Familie mit Hilfe einer elektrophoretischen Technik, die als isoelektrische Fokussierung bekannt ist.
Genauer gesagt bezieht sich das vorliegende Reinigungsverfahren auf die isoelektrische Fokussierung (IEF) der Dalbaheptid-Antibiotika in einem Mehrzellen-Elektrolysegerät mit Immobiline^®-Membranen, insbesondere zwitterionischen Membraner.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind reine antibiotische Verbindungen, die erhältlich sind nach dem vorliegenden Verfahren, insbesondere das reine 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-N⁶³-3-(dimethylamino)-propylamidderivat des Antibiotikums A40926.
Eine eingehende Beschreibung der Grundsätze und Methoden der IEF in Mehrzellen-Elektrolysegeräten mit Immobiline^®-Membranen findet sich in Ref. 5.
Entsprechend dieser Technik ist die zu reinigende Verbindung eine amphotere Substanz, gekennzeichnet dadurch, dass sie einen festgelegten isoelektrischen Punkt (pI) und gute Pufferungseigenschaften bei dem pI-Wert besitzt (siehe Ref. 102). Die zu reinigende Mischung ist in einer Flüssigkeitsader enthalten und ist in einem Set von Kammern eingeschlossen, wobei eine derartige Kammer durch zwei Immobiline-Kammern mit isoelektrischen Punkten, die den pI der gewünschten Verbindung umfassen, abgegrenzt ist. So werden durch Fortführung des elektrophoretischen Titrationsverfahrens sämtliche anderen Verunreinigungen entweder nicht-isoelektrisch oder mit verschiedenen pI-Werten gezwungen, die Kammer in Richtung anodischere oder kathodischere Kammern zu verlassen, während die gereinigte Verbindung in der ursprünglichen Kammer verbleibt.
Diese Reinigungstechnik wurde auf eine Vielzahl von Proteinen angewandt, wie eglin C (Ref. 5), monoklonale Antikörper gegen den gp-41 des AIDS-Virus (Ref. 103), rekombi nantes humanes Wachstumshormon (Ref. 104), der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (Refs. 105 und 106), rekombinante Superoxid-Dismutase (Ref. 107), Interleukin (Ref. 108) und Glucoamylase (Ref. 109).
Die vorliegende Erfindung offenbart erstmals eine geeignete Methodik für die Anwendung einer derartigen IEF-Reinigungstechnik auf ziemlich kleine Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 1800 Dalton, und speziell auf antibiotische Verbindungen der Dalbaheptid-Familie.
Unter dem Begriff Dalbaheptide werden gewöhnlich sämtliche antiobiotischen Substanzen definiert, die als gemeinsames Merkmale eine hoch-modifizierte, lineare Heptapeptidstruktur aus sieben Aminosäuren besitzen, von denen fünf konstant Aryl- und Arylmethylaminosäuren sind, wobei diese Struktur für einen gemeinsamen Wirkmechanismus bestimmend ist, d. h. die spezifische Komplexierung des D-Alanyl-D-alanin-Endes von einem oder mehreren Zwischenprodukten der Zellwandsynthese, die zur Zellzerstörung führt. Die Bezeichnung Dalbaheptid leitet sich somit von dem Ausdruck D-al{anyl-D-alanine}-b{inding}-a{antiobiotics}-{having}-hept-{apept}ide-{structure}.
Die Dalbaheptid-Antibiotika können üblicherweise durch die folgende allgemeine Formel I
wiedergegeben werden, worin:
W, Z, X₁, X₂ und T die jeweiligen Anteile eines Antibiotikums der Dalbaheptidgruppe darstellen;
und Y eine Carboxysäuregruppe oder ein funktionelles Derivat hiervon bedeutet.
Die Formel I umfasst die Salze der Dalbaheptid-Antibiotika mit Säuren und Basen sowie ihre inneren Salze.
In der allgemeinen durch die Formel I wiedergegebene Struktur sind die vorstehend genannten fünf grundlegenden Aryl- und Arylmethylaminosäuren diejenigen, die mit den Einheiten Z und W verbunden sind. Abgesehen von geringfügigen Unterschieden hinsichtlich der Substitutionen an dem jeweiligen Arylteil, sind die fünf Aryl- und Arylmethylaminosäuren im wesentlichen sämtlichen Gliedern der Gruppe der Dalbaheptid-Antibiotika gemeinsam, während der unterschiedliche Typ und die unterschiedliche Struktur der zwei verbliebenen Aminosäureteile, die die Substituenten X₁ und X₂ tragen, eine weitere Klassifizierung der Dalbaheptide, soweit bekannt, in vier verschiedene Untergruppen erlauben, von denen sich eine jede aus Gründen der Zweckmäßigkeit auf ein gut bekanntes Antibiotikum der Gruppe bezieht, die in der früheren wissenschaftlichen Literatur allgemein als Glycopeptid-Antibiotika identifiziert worden ist.
Diese vier Untergruppen können jeweils als Antibiotika vom Ristocetin-Typ, Vancomycin-Typ, Avoparcin-Typ und Synmonicin-Typ definiert werden.
Für eine detailliertere Klassifizierung der Dalbaheptid-Antibiotika siehe Refs. 1 und 2.
Entsprechend den Begriffen und Definitionen dieser Beschreibung umfassen die Dalbaheptid-Antibiotika ebenso wie die vier Untergruppen, in die sie gegenwärtig klassifiziert sind, sowohl Produkte, die als Metabolite von mikrobiellen Stämmen produziert werden wie auch semisynthetische Derivate hiervon.
Die Fermentationsprodukte tragen im allgemeinen Zuckereinheiten, die mit den Hydroxygruppen konjugiert sind, welche an den Aryl- oder Arylmethylteilen der fünf grundlegenden Aminosäuren oder an den X₁- und/oder X₂-Einheiten positioniert sind, wenn sie hydroxylierte aromatische Ringeinheiten enthalten. In einigen wenigen Fällen kann eine phenolische Hydroxyfunktion mit einer Schwefelsäureeinheit verestert sein. In den Fermentationsprodukten ist die durch das Symbol Y wiedergegebene Funktion im allgemeinen eine Carboxysäure oder ein Niedrigalkylcarboxyester, während das Symbol T im allgemeinen eine Amino- oder eine Niedrigalkylamino(z. B. Methylamino)-Einheit wiedergibt.
Die in den Patenten und in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen semisynthetischen Derivate sind zum Beispiel Produkt, die sich ableiten von der vollständigen oder partiellen Hydrolyse von Zuckerteilen und somit freie Hydroxygruppen an den Aryl- oder den Arylmethylteilen aufweisen, Produkte, die sich von der Eliminierung der benzylischen Hydroxygruppe an den Arylmethylteilen ableiten, Produkte, die sich von der Einführung spezifischer Zuckereinheiten oder aliphatischer oder alicyclischer Einheiten an der phenolischen Hydroxyfunktion ableiten, Produkte, die sich von den Modifizierungen der carboxylischen Einheit Y unter Bildung von deren funktionellen Derivaten ableiten, z. B. Ester, Amid- oder Hydrazidderivate, oder Produkte, die sich von der Modifizierung des Teils T unter Erzielung von unterschiedlich substituierten Aminogruppen (z. B. durch Alkylierung oder Acylierung) ableiten, oder der Einführung von Schutzgruppen dieser aminischen Funktion entstammen, oder Produkte, die sich von der Acylierung der aminischen Einheiten der Aminozuckereinheiten ableiten, oder Produkte, die der Dehalogenierung von Aryleinheiten, welche ursprünglich Halosubstituenten enthalten, entstammen, oder Produkte, die sich von der Einführung von Halo(vorzugsweise Chlor, Brom und Iod)-Substituenten an den Aryleinheiten ableiten. Diese semisynthetischen Derivate können mehr als eine der vorstehend genannten Modifikationen der Grundstruktur der natürlichen Produkte enthalten.
Entsprechend einer spezielleren Darstellung können die meisten der Dalbaheptid-Antibiotika, deren Struktur bislang bestimmt wurde durch die Formel I. wiedergegeben werden, worin das Symbol W die partielle Struktur:
wiedergibt, worin R₁ Wasserstoff, eine Zuckereinheit, eine aliphatische oder alicyclische Kohlenwasserstoffeinheit ist. R₂, R₃ und R₄ sind jeweils unabhängig Wasserstoff oder Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom, und befinden sich meist bevorzugt in der ortho-Position im Hinblick auf die Etherbindung. R₅ und R₆ sind jeweils unabhängig Wasserstoff oder eine Gruppe OR₇, worin R₇ Wasserstoff oder eine Zuckereinheit ist. Wie in der vorstehenden Formel I gezeigt, ist die Gruppe W gleichzeitig an die zweite, vierte und sechste Aminosäureeinheit (ausgehend von rechts) der Heptapeptidkette der Dalbaheptide gebunden; und das Symbol Z bedeutet die partielle Struktur:
worin die Gruppen OR₈ und OR₉ vorzugsweise sich in para- bzw. ortho-Position im Hinblick auf die Bindung, die die zwei Phenylringe verknüpft, befinden und der Rest R₈ und R₉ jeweils unabhängig Wasserstoff oder eine Zuckereinheit darstellt. Meist bevorzugt ist R₈ Wasserstoff. Die Gruppe OR₁₀ befindet sich bevorzugt in der ortho-Position im Hinblick auf die die zwei Phenylringe verknüpfende Bindung und der Rest R₁₀ bedeutet Wasserstoff oder eine Zuckereinheit. Die Gruppe R₁₁ befindet sich vorzugsweise in der meta-Position im Hinblick auf die die zwei Phenylringe verbindende Bindung und bedeutet Wasserstoff oder Halogen, meist bevorzugt Wasserstoff oder Chlor. Wie in Formel I gezeigt, ist die Gruppe Z mit der fünften und siebten Aminosäureeinheit (ausgehend von rechts) der Heptapeptidkette der Dalbaheptide verknüpft.
Die Bedeutungen der Symbole X₁ und X₂, die die Unterscheidung der bislang bekannten Dalbaheptid-Antibiotika in Form von vier Untergruppen erlauben, sind jeweils wie folgt:
X₁ bedeutet eine Phenyl- oder eine Benzylgruppe, worin der Phenylring gegebenenfalls einen oder zwei Substituenten enthalten kann, ausgewählt unter Halogen, vorzugsweise Chlor, Niedrigalkyl, vorzugsweise Methyl, und Hydroxy, worin die Hydroxygruppe gegebenenfalls mit einer Zuckereinheit über eine acetalische Bindung konjugiert oder mit einem Schwefelsäurerest verestert sein kann, oder es kann auch eine (C₁-C₂-)-aliphatische Einheit, die substituiert ist mit einer Carboxyl- oder Carboxamidfunktion, eine Thiomethyl- oder eine Methylsulfinylgruppe wiedergeben.
X₂ bedeutet eine Phenylgruppe, die gegebenenfalls einen oder zwei Substituenten, ausgewählt unter Halogen, vorzugsweise Chlor, Niedrigalkyl, vorzugsweise Methyl, und Hydroxy tragen kann, wobei die Hydroxygruppe gegebenenfalls mit einer Zuckereinheit durch eine acetalische Bindung konjugiert sein kann oder es kann eine (C₁-C₄)-aliphatische Einheit, vorzugsweise Methyl oder Isobutyl, wiedergeben;
oder X₁ und X₂ können gemeinsam eine Oxybis-(phenylen)-einheit bedeuten, worin ein oder beide Phenylringe gegebenenfalls wie vorstehend angegeben substituiert sein können.
Entsprechend einer spezielleren Darstellung der meisten der Dalbaheptid-Antibiotika der Formel I, soweit bekannt, (einschließlich von deren semisynthetischen Derivaten) identifiziert das Symbol T vorzugsweise eine aminische Gruppe, worin ein oder beide Wasserstoffatome gegebenenfalls substituiert sein können durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, die ihrerseits einen oder mehrere Substituenten tragen können, durch eine (C₄-C₇)-Cycloalkylgruppe, durch einen Acylrest oder durch eine geeignete Schutzgruppe der aminischen Funktion oder T kann auch einen Tri-(niedrigalkyl)-ammoniorest wiedergeben, dessen positive Ladung durch ein Anion neutralisiert wird, das sich entweder von einer starken Säure oder einer inneren Säurefunktion ableitet, z. B. ein Carboxylatanion, das sich von der Carboxysäureeinheit, die durch das Symbol Y wiedergegeben wird, ableitet. In einigen Fällen kann T auch Wasserstoff (z. B. teicoplanin-semisynthetische Derivate) oder eine Hydroxy-, Oxo- oder Oximinoeinheit (z. B. Ristocetin-Derivate) sein. Dem zufolge bedeutet, wenn T ein zweiwertiger Rest der gestrichelten Linie in Formel I ist, eine zusätzliche Bindung.
Das Symbol Y bedeutet eine Carboxygruppe, ein funktionelles Derivat hiervon wie ein Carboxyester, ein Carboxamid, eine Carbohydrazidgruppe oder eine Hydroxymethyleinheit. Diese Definition umfasst die natürlich auftretenden Niedrigalkylester ebenso wie die Ester, die durch Umsetzung der Carboxylfunktion mit Alkoholen, z. B. aliphatischen Alkoholen, gebildet werden, welche Substituenten in der aliphatischen Kette enthalten, und umfasst auch einen breiten Bereich von substituierten Amiden, die durch Umsetzung der Carboxygruppe mit aliphatischen, cycloaliphatischen und heterocyclischen Aminen gebil det werden. Insbesondere kann das aliphatische Amin Substituenten an der aliphatischen Kette enthalten, wie Amino, Niedrigalkylamino, Diniedrigalkylamino, Hydroxy, Niedrigalkoxy, Carboxy, Carbamyl, substituiertes Carbamyl und ähnliche.
Die Salze der Endverbindungen der Formel I können solche sein, die sich ableiten von der Salzbildung mit einer Säure der basischen Funktionen des Moleküls, z. B. der durch das Symbol T identifizierten aminischen Funktion oder einer aminischen Funktion, die als Substituent in dem Carboxyester enthalten ist, Carboxamid- oder Carbohydrazideinheit, dargestellt durch das Symbol Y, oder in einer Zuckereinheit (z. B. Vancomycin, Avoparcin). Alternativ können die Salze durch Salzbildung der carboxylischen Säurefunktion, dargestellt durch das Symbol Y, oder einer sauren Funktion, die als Substituent in dem Carboxyester- oder Carboxamidteil enthalten ist oder irgendeiner sauren Funktion, die in einem anderen Teil des Moleküls enthalten sein kann, mit einer geeigneten Base gebildet werden. Die inneren Salze sind solche, die durch innere Salzbildung im Fall der gleichzeitigen Anwesenheit von basischen (z. B. aminischen) und sauren (z. B. carboxylischen) Funktionen mit ausreichender Stärke in dem Dalbaheptidvorläufer und/oder den Pentapeptid-Endverbindungen gebildet werden.
In dem Dalbaheptid-Antibiotika sind die Zuckereinheiten, die an die Hydroxygruppen geknüpft sein können, entweder Mono- oder Polysaccharide, die in einer der Hydroxylgruppen acetyliert oder methyliert oder in einer oder zwei Positionen deoxygeniert sein können und carboxylische oder aminische Substituenten, die zum Beispiel durch aliphatische saure Reste acyliert sein können, tragen können. Spezielle Zuckereinheiten können durch chemische oder mikrobiologische Reaktionen an den Dalbaheptid-Substraten mit freien Hydroxygruppen an den aromatischen Ringen eingeführt werden.
Typische Beispiele für unsubstituierte Monosaccharideinheiten, die an Hydroxygruppen der basischen Dalbaheptid-Struktur gebunden sind, umfassen sowohl Hexosen als auch Pentosen wie zum Beispiel Glukose (z. B. Actaplanin B₂), Galactose (z. B. Antibiotikum A41030C), Mannose (z. B. Teicoplanin A₂), Fucose (z. B. Antibiotikum A35512 B), Rhamnose (z. B. Avoparcin) und Acetylmannose (z. B. Parvodicin C₃).
Typische Beispiele für Carboxy- oder Amino-substituierte Monosaccharideinheiten, die an Hydroxygruppen geknüpft sind, umfassen N-Acetylglucosamin (z. B. Teicoplanin A₂-Komplex), N-(C₉-C₁₂)-aliphatisches Acylglucosamin (z. B. Teicoplanin A₂-Komplex), Ristosamin (z. B. Ristocetin A), Actinosamin (z. B. Actinoidin A), N-(C₉-C₁₂)-aliphatische Acyl-2-amino-2-desoxyglucuronsäure (z. B. Ardacine).
Typische Beispiele für Polysaccharideinheiten können sowohl unsubstituierte als auch Carboxy- oder Amino-substituierte Zuckereinheiten enthalten wie Glukose (z. B. Actaplanin A), Mannose (z. B. Ristocetin A), Rhamnose (z. B. Ristocetin B), Olivose (z. B. Orienticin B), Vancosamin (z. B. Vancomycin), Epivancosamin (z. B. Orienticin A, C und D), Acosamin (z. B. Octinoidin), und Ristosamin (z. B. Avoparcin), die mit zumindest einer weiteren Zuckereinheit verknüpft sind. In den Dalbaheptiden wurden, soweit sie bekannt sind und ihre Strukturen ermittelt worden sind, die bis zu vier Zuckereinheiten enthaltenden Polysaccharide identifiziert.
Die Merkmale, die eine weitere Klassifizierung der bislang bekannten Dalbaheptide in die vier Untergruppen erlauben, sind in keiner Weise für den Bereich der Erfindung einschränkend insoweit, als neue natürliche Produkte und deren Derivate, welche unter die allgemeine Klassifikation der Dalbaheptid-Antibiotika fallen, erhalten und identifizirt werden können und entsprechend dem erfindungsgemäßen IEF-Verfahren gereinigt werden können. Im folgenden wird jedoch für eine präzisere Identifikation der repräsentativen Verbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden können, eine detailliertere Beschreibung der vorstehend genannten vier Untergruppen und der entsprechenden repräsentativen Verbindungen angegeben.
Unter Bezugnahme auf die vorstehende Formel I ist die als Dalbaheptide vom Ristocetin-Typ identifizierte Untergruppe dadurch gekennzeichnet, dass die Symbole X₁ und X₂ zusammen genommen eine Oxybis-(phenylen)-einheit wiedergeben, worin ein oder beide Phenylringe gegebenenfalls ein oder zwei Substituenten tragen können, ausgewählt unter Halogen, vorzugsweise Chlor, Niedrigalkyl, vorzugsweise Methyl, und Hydroxy, worin die Hydroxygruppe gegebenenfalls mit einer Zuckereinheit über eine acetalische Bindung konjugiert oder mit einem Schwefelsäurerest verestert sein kann.
Dalbaheptid-Antibiotika, die dieser Untergruppe zugeordnet werden können, umfassen die folgenden:
Ristocetin (Ref. 6), Actaplanin (Ref. 7, 8), Teicoplanin (Ref. 9, 10, 11), Antibiotikum A35512 (Ref. 12, 13), Antibiotikum A41030 (Ref. 14, 15), Antibiotikum A47934 (Ref. 16, 17), Ardacin A, B, C (Ref. 18, 19, 20), Antibiotikum A40926 (Ref. 21, 22, 23), Kibdelin (Ref. 24), Parvodicin (Ref. 25), und Antibiotikum UK 68597 (Ref. 26).
Die semisynthetischen Derivate der vorstehend genannten natürlichen Produkte sind ebenfalls in dieser Untergruppe eingeschlossen. Siehe zum Beispiel das Aglycon und Pseudoaglycone der Aracine (Ref. 27) und deren Derivate, worin Y eine Carboxamid- oder Carbohydrazideinheit (Ref. 28) darstellt; das Aglycon und Pseudoaglycon von Parvodicin (Ref. 29); die Hydrolyseprodukte von Actaplaninen (Ref. 30); die Umwandlungsprodukte der ersten Aminosäureeinheit von Ristocetin A, Antibiotikum A35512, A41030 und A47934 bis zu den entsprechenden Ketoanalogen (Ref. 31 und 32); die Acylierungsderivate von Ristocetin, Actaplanin und deren Pseudoaglycone (Ref. 33), die Bromanaloga von Actaplanin (Ref. 34); die aromatischen Aldehydderivate von Ristocetin (Ref. 35); die Derivate von Teicoplanin und Antibiotikum A40926, die im folgenden spezielle Erwähnung finden.
Die als Dalbaheptide vom Vancomycin-Typ identifizierte Untergruppe der Dalbaheptid-Antibiotika ist gekennzeichnet dadurch, dass in Formel I das Symbol X₁ einen (C₁-C₂)-aliphatischen Rest, der mit einer carboxylischen oder Carboxamidfunktion substituiert ist, bedeutet und das Symbol X₂ einen (C₁-C₄)-aliphatischen Rest bedeutet. Insbesondere ist bei den häufigsten Beispielen der Antibiotischen Substanzen, die unter diese Untergruppe fallen, X₁ ein Rest, der sich von Asparaginsäure, Asparagin oder Glutamin ableitet, während X₂ ein Rest ist, der sich von Alanin oder Leucin ableitet.
Einige Dalbaheptide vom Vancomycin-Typ (z. B. M43A, B und C, Ref. 55) sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass T eine Trimethylammoniogruppe darstellt, deren positive Ladung neutralisiert wird durch das Carboxylatanion, welches gebildet wird durch die, durch das Symbol Y dargestellte, carboxylische Gruppe.
Andere Dalbaheptid-Antibiotika, die dieser Untergruppe zugeordnet werden können, umfassen die folgenden:
OA-7653 (Ref. 51, 52), A51568 A und B (Ref. 53, 54), Orienticine (Ref. 56, 57), Eremomycin (Ref. 58, 59, 60, 61), A42867 (Ref. 50, 62), A82846 (Ref. 63, 64), Chloroorienticine (Ref. 65), MM 47761 und MM 49721 (Ref. 94), Decaplanin (Ref. 95), MM 45289 und MM 47756 (Ref. 96).
Die semisynthetischen Derivate der vorstehend genannten natürlichen Produkte sind von dieser Untergruppe umfasst. Siehe zum Beispiel: die verschieden glycosylierten Derivate der Hydrolyseprodukte von Vancomycin, A51568 A und B und M 43D (Ref. 66); die Desvancosaminyl- und Des-(vanocsaminyl)-O-glucosyl)-derivate von Vancomycin, A51568 A; A51568 B, M 43A und M 43B (Ref. 67), die Derivate von A82846 (Ref. 93); die Reaktionsprodukte der aminischen Reste einiger Dalbaheptide vom Vancomycin-Typ mit Aldehyden und Ketonen und den entsprechenden Hydrierungsprodukten (Ref. 68, 69), die N-Acylderivate der Antibiotika vom Vancomycin-Typ (Ref. 70, 71), Mono- und Didechlorvancomycin (Ref. 72) und die Hydrolyseprodukte von Eremomycin (Ref. 60).
Die Dalbaheptid-Untergruppe vom Avoparcin-Typ ist dadurch gekennzeichnet, dass das Symbol X₁ in Formel I eine Phenyl- oder Benzylgruppe darstellt, worin der Phenylring gegebenenfalls ein oder zwei Substituenten tragen kann, ausgewählt unter Hydroxy und Halogen, vorzugsweise Chlor, das Symbol X₂ eine Phenylgruppe bedeutet, die gegebenenfalls ein oder zwei Substituenten tragen kann, ausgewählt unter Halogen, vorzugsweise Chlor und Hydroxy, das gegebenenfalls mit einer Zuckereinheit (z. B. Rhamnose) konjugiert sein kann.
Andere Dalbaheptid-Antibiotika, die dieser Gruppe zugeordnet werden können, umfassen die folgenden:
Actinopidin A, B (Ref. 3, 75, 76), Chloropolysporin A, B, C (Ref. 77, 78, 79), Actinoidin A₂ (Ref. 80, 76) und Helvecardin A, B (Ref. 26), MM 47767, MM 55256 (Ref. 92).
Semisynthetische Derivate der Untergruppe vom Avoparcin-Typ der Dalbaheptid-Antibiotika sind zum Beispiel die Demannosyl-chloropolysporin B-Derivate, das Chloropolysporin-pseudoaglycon, das Derhamnosyl-alpha- und -beta-avoparcin (Ref. 81), die Mannosylaglycone von Avoparcin (LL-AV290) und andere Derivate, worin ein oder mehrere Zuckereinheiten hydrolysiert sind (Ref. 84).
Die als Antibiotika vom Synmonicin-Typ identifizierte Untergruppe der Dalbaheptid-Antibiotika ist dadurch gekennzeichnet, dass in Formel I das Symbol X₁ einen C₂-Alkylrest darstellt, der substituiert ist an dem Kohlenstoffende mit einer Thiomethyl- oder Methylsulfinylgruppe, und das Symbol X₂ eine Phenylgruppe darstellt, die einen Hydroxysubstituenten trägt, der mit einer Zuckereinheit konjugiertsein kann. Synmonicin(CWI-785)-Komplex, dessen Komponenten und einige seiner Hydrolyseprodukte (Ref. 86, 87, 88) scheinen gegenwärtig die einzigen Glieder dieser Untergruppe zu sein.
Wie vorstehend gesagt, ist eine spezielle Verbindung, die den Dalbaheptiden vom Ristocetin-Typ zugeordnet werden kann, der Teicoplanin A₂-Komplex der allgemeinen Formel
worin A, B und M die an den Molekülkern in den natürlichen Produkten geknüpften Zuckereinheiten bedeuten.
Unter den Begriff "Teicoplanin" sind die einzelnen Komponenten des Fermentationskomplexes (Ref. 9) und verwandte Substanzen (Ref. 36, 37) sowie das Aglycon, die Pseudoaglycone (Ref. 4, 38, 39, 40) und die semisynthetischen Derivate hiervon umfasst.
Die chemischen Strukturen der semisynthetischen Derivate von Teicoplanin, die von speziellem Interesse wegen ihrer biologischen Aktivität sind, besitzen die gleiche Basisstruktur der Teicoplanin-Hauptkomponenten, der verwandten Substanzen, Aglycon und Pseudoaglycon mit den Modifikationen von einer/beiden der C⁶³-Carboxygruppe oder/und des aminischen Restes am C¹⁵. Insbesondere wurde der C⁶³-Carboxyrest, der dem Symbol Y in der vorstehenden Formel I entspricht, modifiziert zu den entsprechenden Estern gemäß Ref. 41 und Carboxamidgruppe CONR₁₄R₁₅ entsprechend den in Ref. 73, 74, 82 bzw. 83 angegebenen Bedeutungen.
Bei den semisynthetischen Derivaten identifiziert der aminische Rest an dem C¹⁵ einen aminischen Rest modifiziert durch Umsetzung mit Schutzgruppen oder durch Umwandlung in die entsprechende Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe, worin der bzw. die Alkylteil(e) weitere Substituenten tragen können gemäß Ref. 85, 89, 90 und 91. Teicoplaninderivate, die Modifikationen sowohl im Hinblick auf die C⁶³-carboxylische Gruppe als auch den aminischen Rest am C¹⁵ beinhalten und Verfahren zu deren Herstellung wurden in Ref. 83 und 98 beschrieben.
Andere semisynthetische Teicoplaninderivate, die im Stand der Technik beschrieben werden, umfassen die Ester und Hydrazide der C⁶³-Carboxygruppe (Ref. 41 und 42), die Deacetylglucsaminyl-deoxyteicoplanine (Ref. 43) und die entsprechenden C⁶³-Carboxyamide (Ref. 44), die Mono- und Didechlorderivate von Teicoplanin (Ref. 45), die O⁵⁶-Alkyl- und -Cycloalkylderivate von Teicoplaninaglycon und -pseudoaglyconen (Ref. 46 und 97) und die 38-Decarboxy-38-hydroxymethylderivate (Ref. 99).
Eine weitere unter die Untergruppe der Dalbaheptide vom Ristocetin-Typ fallende Verbindung ist der Antibiotikum A40926-Komplex und dessen Hauptfaktoren (Ref. 21, 22, 23), definiert durch die folgende allgemeine Formel
worin A und M die an den Molekülkern in den natürlichen Produkten gebundenen Zuckereinheiten darstellen.
Ebenso wie für Teicoplanin wurde eine Vielzahl von Derivaten des Antibiotikums A40926 offenbart; unter diesen sind dessen Aglycon (Ref. 48), das Mannoxylaglycon (Ref. 47), die N-Acylamino-deoxy-glucuronylaglycone (Ref. 48), die Deacylderivate (Ref. 49), die C⁶³-Esterderivate (Ref. 100) und die C⁶³-Amidderivate (Ref. 101).
Ref. 101 offenbart unter anderem die Herstellung des 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-N⁶³-3-(dimethylamino)-propylamidderivats des Antibiotikums A40926. Diese Verbindung wird hergestellt, indem man 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-Antibiotikum A40926 mit Dimethylpropylamin in Anwesenheit des Kondensationsmittels Benzotriazolyloxy-tris-(pyrrolidin)-phosphonium-hexafluorphosphat (PyBOP) umsetzt. Das so erhaltene Produkt enthält jedoch einige unerwünschte Verunreinigungen, die nicht mit Hilfe herkömmlicher chromatographischer Verfahren entfernt werden können.
Wie vorstehend angegeben, besteht ein Gegenstand der Erfindung in der Bereitstellung eines Reinigungsverfahrens, das auf der isoelektrischen Fokussierung für die Reinigung der vorstehenden Dalbaheptid-Antibiotika von unerwünschten Verunreinigungen basiert.
Diese abzutrennenden Verunreinigungen können entweder geringere Komponenten einer Antibiotikum-Komplexmischung sein, erhalten aus einem Fermentationsverfahren oder Nebenprodukte von chemischen Reaktionen, denen die Antibiotische Verbindung zur Erzielung von dessen semisynthetischen Derivaten unterzogen worden ist.
Zum Beispiel ist es bekannt, dass ein Dalbaheptid-Antibiotikumkomplex (entweder natürlich oder semisynthetisch) einige Verunreinigungen enthalten kann, die bei Verabreichung an Patienten eine Histaminfreisetzung auslösen können; in Abhängigkeit von dem speziellen Dalbaheptid-Antibiotikum kann diese Histaminfreisetzung mehr oder weniger ausgeprägt sein (siehe Ref. 114). Solch eine Histaminfreisetzung wurde zum Beispiel auch im Fall des 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-N⁶³-3-(dimethylamino)-propylamidderivates des Antibiotikums A40926-Komplexes beobachtet.
Da diese Verunreinigungen im allgemeinen schwer nachweisbar sind und somit individuell kaum entfernbar sind, ist ein Verfahren, das die Abtrennung sämtlicher der Verunreinigungen aus den aktiven Substanzen erlaubt, in hohem Grade erwünscht.
Die vorliegende IEF-Reinigung ist somit ein effizientes Mittel zur Eliminierung von Verunreinigungen, die mit Hilfe einer Reihe herkömmlicher chromatographischer Verfahren, einschließlich RP-HPLC, nicht hätten eliminiert werden können. Sie stellt weiterhin eine Methode dar, die zur Reinigung von Dalbaheptid-Antibiotika im Industriemaßstab angewandt werden kann.
Das Haupthindernis bei der Anwendung der IEF-Technik zur Reinigung von Dalbaheptid-Antibiotika beruht allgemein bei sämtlichen Fokussierungsmethodiken darin, dass die zu reinigende Verbindung bei deren pI-Wert eine sehr beschränkte Löslichkeit besitzt. Die Herstellung einer geeigneten Trägerlösung des Analyten bei deren pI-Wert, die imstande ist, die Löslichkeit der zu reinigenden Verbindung auch bei relativ hohen Konzentrationen beizubehalten, ist somit eines der zu lösenden Hauptprobleme. In der Tat würden nach der Ausfällung auch die Verunreinigungen mit der Hauptfraktion co-präzipitieren.
Es wurde nun gefunden, dass eine wässrige Lösung von Harnstoff und einem zwitterionischen Detergens geeignet ist für die Solubilisierung der Dalbaheptid-Antibiotika-Verbindungen. Als besonders geeignet erwiesen sich Mischungen von Harnstoff mit Detergenzien der CHAPS-Familie, d. h. den Sufobetain-zwitterionischen Derivaten der Cholsäure, z. B. {3-[3-(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]}-1-propansulfonat oder {3-[3-(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]}-2-hydroxy-1-propansulfonat; unter diesen ist {3-[3-(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]}-1-propansulfonat bevorzugt.
Das Harnstoff/CHAPS-Verhältnis in den Mischungen und deren Konzentration werden von der speziellen zu reinigenden Dalbaheptid-Verbindung abhängen. Im allgemeinen wurde gefunden, dass die Konzentration des Harnstoffs in der Lösung im Bereich von etwa 4 M bis 8 M variieren kann; zum Beispiel beträgt, wenn Mischungen, die 63-Amid-Derivate des Antibiotikums A40926 enthalten, bei der IEF-Reinigung der Erfindung involviert sind, eine bevorzugte Konzentration des Harnstoffs etwa 8 M. Eine geeignete Konzentration der CHAPS-Detergenzien in der IEF-Trägerlösung kann von etwa 1% bis 5% (Gew./Vol.) betragen; vorzugsweise beträgt die Konzentration von 2% bis 4,5%. Besonders bevorzugt beträgt bei der Reinigung von Mischungen, die bei der Amidierung des Antibiotikums A40926 erhalten werden, die Konzentration etwa 3,5%.
Die pI-Werte einer jeden Dalbaheptid-Antibiotikum-Substanz können einfach entsprechend herkömmlichen analytischen Verfahren ermittelt werden, wie durch Elektrophorese an analytischen immobilisierten pH-Gradientengelen (IPG-Gelen). Eine geeignete Methodik zur Bestimmung der pI-Werte unter Verwendung von IPG-Gelen wird in Ref. 112 beschrieben.
Die theoretische Berechnung der pI-Werte basieren auf den pK-Werten der sauren und/oder basischen Gruppen des Antibiotikummoleküls, kann zu unkorrekten Ergebnissen führen, wegen möglicher Wechselwirkungen der sauren und basischen Einheiten, die die effektiven pK-Werte der einzelnen Einheiten modifizieren können.
Sobald die geeignete Trägerlösung des Dalbaheptid-Antibiotikums hergestellt worden ist, kann die IEF-Reinigung entsprechend Methodiken analog den aus dem Stand der Technik bekannten durchgeführt werden.
Demzufolge wird ein Set von Zellen bzw. Kammern hergestellt, wobei diese Zellen durch die Zahl der isoelektrischen Membranen mit zunehmenden pI-Werten bestimmt werden. Der Bereich der pI-Werte der Membranen wird entsprechend dem bestimmten pI-Wert der zu reinigenden Verbindung und den pI-Werten der abzutrennenden Verunreinigungen festgelegt. In Abhängigkeit von dem zu reinigenden speziellen Dalbaheptid kann der pI-Wert der Membranen von etwa 3 bis etwa 9 variieren. Im allgemeinen wird der Bereich der pI-Werte etwa ±2 des pI-Werts der zu reinigenden Verbindung betragen. Eine geeignete Methode für die Herstellung der Membranen wird in Ref. 5 und 113 offenbart.
Die Komponenten der zu reinigenden Mischung werden so über den isoelektrischen Gradienten entsprechend ihren spezifischen pI-Werten getrennt; am Ende des Verfahrens wird jede Zelle die Substanz (Verunreinigung oder Hauptverbindung) mit einem pI-Wert enthalten, der zwischen den pI-Werten der zwei isoelektrischen Membranen, die die Zelle abgrenzen, liegt. Zur Erzielung von guten Reinigungsergebnissen sollte sich der pI-Wert der zu reinigenden Verbindung natürlich zumindest in einem minimalen Ausmaß von den pI-Werten der Verunreinigungen unterscheiden; jedoch können die eine einzelne Zelle abgrenzenden pI-Werte sehr nahe beieinander liegen, was sehr hohe Reinigungsgrade erlaubt.
Es sollte erwähnt werden, dass es, wenn die einzelnen Antibiotischen Faktoren eines Komplexes (oder zumindest dessen Hauptfaktoren) ähnliche pI-Werte besitzen, möglich ist, all diese Faktoren in einer einzigen Zelle zu sammeln, vorausgesetzt, dass die unerwünschten Verunreinigungen pI-Werte außerhalb des pI-Bereichs der Antibiotischen Faktoren liegen. Auf diese Weise können die aktiven Antibiotischen Verbindungen als Ganzes von den unerwünschten Verunreinigungen ohne die Notwendigkeit einer Abtrennung eines jeden einzelnen Faktors abgetrennt werden. So bezieht sich im folgenden in dieser Beschreibung der Ausdruck "Hauptkomponente" auf einen einzelnen Faktor eines Antibiotischen Komplexes ebenso wie auf eine Mischung von Faktoren mit ähnlichen pI-Werten.
Eine geeignete Vorrichtung zur Durchführung der vorliegenden IEF-Reinigung wird in Ref. 113 beschrieben.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die zu reinigende Verbindung kontinuierlich in die Zelle zugeführt werden, wo die Hauptkomponente isoelektrisch ist. Auf diese Weise verbleibt unter den elektrophoretischen Titrationsverfahrensbedingungen die gewünschte Verbindungen) in der Zelle eingeschlossen, während Verunreinigungen mit verschiedenen pI-Werten oder solche, die nicht isoelektrisch sind, gezwungen sind, die Zelle in Richtung der anodischeren oder kathodischeren Zellen zu verlassen. Gewünschtenfalls kann jede Zelle mit einem Flüssigkeits-Reservoir verbunden sein, um eine geeignete Recyclisierung der Zelle zur Vermeidung einer unerwünschten Ausfällung des Produkts zu schaffen. Diese Option ist besonders geeignet, wenn sie auf die Zelle der Hauptkomponente angewandt wird. In der Tat kann, wenn das IEF-Verfahren stattfindet, die Konzentration des Produkts in der Zelle (die ein relativ geringes Volumen hat) bis zu dem Ausfällungswert gesteigert werden. Wie vorstehend erwähnt, sollte ein derartiges Vorkommnis unbedingt vermieden werden, da mit der Hauptkomponente auch Verunreinigungen co-präzipitieren würden. Andererseits kann eine Konzentrierung der Verunreinigungen in die anderen Zellen erwünscht sein und die vorstehende Recyclisierung würde somit nicht erforderlich sein.
Bei einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens kann die zu reinigende Verbindung kontinuierlich in eine Zelle zugeführt werden, in der die Hauptkomponente nicht isoelektrisch ist, so dass sie gezwungen ist, sich auf eine isoelektrische Zelle hin zu bewegen. Dieses alternative Verfahren ist besonders geeignet zur Abtrennung von Verunreinigungen mit einem pI-Wert, der demjenigen der Hauptkomponente sehr nahe kommt. Es könnte passieren, dass wenn die zu reinigende Mischung in ihre isoelektrische Zelle zugeführt wird, eine Verunreinigung mit einem pI-Wert nahe demjenigen oder ähnlich demjenigen der Hauptkomponente in dieser Zelle verbleiben würde, anstatt dass sie sich in Richtung der jeweiligen benachbarten anodischen oder kathodischen Zelle bewegt, wo die Verunreinigung isoelektrisch ist. Somit bewegt sich, indem man die zu reinigende Komponente in eine Zelle zuführt, wo die Hauptkomponente nicht iso elektrisch ist, zum Beispiel in die benachbarte anodische Zelle, die Hauptkomponente auf ihre isoelektrische Zelle zu, während die Verunreinigungen mit anodischeren pI-Werten in der anfänglichen Zelle zurückbleiben.
Wie vorstehend kann ein Flüssigkeits-Reservoir mit jeder Zelle verbunden sein. Natürlich sollte zur Vermeidung einer Ausfällung der Hauptkomponente das Flüssigkeits-Reservoir auch in dem Fall mit der Zelle verbunden sein, bei dem die Hauptkomponente isoelektrisch ist.
Die angelegte Spannung wird von einer Reihe Faktoren abhängen, wie vom Typ der zu reinigenden Substanz, der Menge der vorhandenen Verunreinigungen, der Menge der zugeführten Substanz, der Zusammensetzung der Trägerlösung sowie der Zusammensetzung des Anolyten und des Katholyten, und der Geometrie der IEF-Apparatur (z. B. Dimension, Anzahl der isoelektrischen Membranen, Abstand der Elektroden, etc.); zum Beispiel wird im allgemeinen eine niedrige Spannung für die Eliminierung von überschüssigem Salz in der Probe angelegt, bevor man mit dem Reinigungsprozess bei einer höheren Spannung beginnt. Zum Beispiel kann bei einem Elektrodenabstand von 12 cm eine anfängliche Spannung von 400 V bis 600 V angelegt werden, und danach das Verfahren bei einer Spannung von 1000 V bis 5000 V, vorzugsweise etwa 1500 V, durchgeführt werden.
Die Wärme, die sich während des elektrophoretischen Verfahrens bildet, kann entsprechend per se bekannten Techniken abgeführt werden. Für reduziertes Erhitzen ist eine Ableitung in Luft bei Raumtemperatur ausreichend, während bei intensiverem Erhitzen eine Zirkulationskühle, wie Wasser, bevorzugt sein kann.
Die Verfahrensdauer hängt vorwiegend von der Menge der zugeführten Substanz und der angelegten Spannung ab.
Nach Durchführung der IEF-Reinigung wird die gewünschte Verbindung aus der Trägerlösung entsprechend per se bekannten Techniken gewonnen. Zum Beispiel kann die Abtrennung der gereinigten Verbindung aus der Harnstoff/CHAPS-Mischung an einer Säule mit silaniertem Silicagel durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung eingehender.
Diese Beispiele beziehen sich auf die Reinigung des 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-N⁶³-3-(dimethylamino)-propylamidderivats (nachstehend bezeichnet als "Amidderivat") des Antibiotikums A40926, das erhalten wurde entsprechend dem Amidierungsverfahren, welches offenbart wird in Ref. 101 durch Umsetzung des 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-Antibiotikums A40926 mit Dimethylpropylamin in Gegenwart des Kondensationsmittels PyBOP. Während der pharmakologischen Untersuchungen wurde gefunden, dass ein solcher Amidderivatkomplex unerwünschte Verunreinigungen enthält, die den Effekt einer Histaminfreisetzung auslösen können. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, diese unerwünschten Verunreinigungen zu entfernen und so ein gereinigtes Produkt zu erhalten, das keinen Effekt einer Histaminfreisetzung zeigt.
Bekanntermaßen ist das aus dem Fermentationsverfahren erhaltene Antibiotikum A40926 (siehe Ref. 21) eine Mischung einzelner verwandter Faktoren, worin die Hauptfaktoren Faktor B₀ und Faktor B₁ sind. Das Verhältnis der einzelnen Faktoren kann variiert werden, indem man die Fermentationsbedingungen modifiziert (siehe z. B. Ref. 115). Weiterhin können gewünschtenfalls die einzelnen Faktoren von A40926 zuerst getrennt werden und dann die Mischungen der einzelnen Faktoren in dem gewünschten Verhältnis hergestellt werden.
Ersichtlicherweise werden die betreffenden Amidderivate eines A40926-Komplexes so eine entsprechende Mischung der Amidderivate der einzelnen Faktoren in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des speziellen Antibiotikum A40926-Ausgangsmaterials sein.
Im folgenden ist in dieser Beschreibung, wenn es sich um Mischungen von Amidderivaten von Faktor B₀ und B₁ handelt, eine Mischung der zwei Faktoren in beliebigem Verhältnis beabsichtigt.
Das vorstehende Amidderivat von A40926 Faktor B₀ und Faktor B₁ kann durch die folgende Formel wiedergegeben werden:
worin M eine Mannosyleinheit bedeutet und R₁ eine Gruppe -CH(CH₃)₂ für Faktor B₀ oder eine Gruppe -(CH₂)₂CH₃ für Faktor B₁ wiedergibt.
Somit können erfindungsgemäß die vorstehenden Amidderivate von A40926 im wesentlichen frei von unerwünschten Verunreinigungen als eine Mischung von Amiden der Faktoren B₀ und B₁ erhalten werden. Es ist beabsichtigt, dass eine im wesentlichen reine Mischung von Amiden der Faktoren B₀ und B₁ eine Mischung dieser zwei Verbindungen in beliebigem Verhältnis ist, wobei diese Mischung von unerwünschten Verunreinigungen mit einem pI-Wert innerhalb des Bereichs von etwa 8,40 bis 8,65, bestimmt in einer Lösung von 8 M Harnstoff und 3,5% (Gew./Vol.) CHAPS, ist. Um diese gereinigte Mischung zu erhalten, können die zwei begrenzenden Membranen der Sammelzelle bei einem pI-Wert von 8,41 bzw. 8,65 festgelegt sein, wobei man die zu reinigende Mischung in diese Elektrolysezelle zuführt.
Gewünschtenfalls kann der geringere Faktor B₁ vom Hauptfaktor B₀ abgetrennt werden, wobei man so ein im wesentlichen reines Amidderivat des Faktors B₀ erhält. Es ist beabsichtigt, dass ein im wesentlichen reines Amidderivat von Faktor B₀ eine Verbindung ist, die frei ist von unerwünschten Verunreinigungen mit einem pI-Wert innerhalb des Bereichs von etwa 8,45 bis etwa 8,65, bestimmt in einer Lösung von 8 M Harnstoff und 3,5% (Gew./Vol.) CHAPS. Um die vorstehende reine Verbindung zu erhalten, können die zwei begrenzenden Membranen der Sammelzelle bei einem pI-Wert von 8,45 bzw. 8,65 eingestellt sein. In diesem Fall wird die zu reinigende Mischung vorzugsweise in die nächstliegende Anodenkammer zugeführt.
Die Figuren zeigen:
1: Analytische RP-HPLC der nicht-fraktionierten Probe; der Haupt-Peak betrifft die Amidderivate der Faktoren B₀ und B₁.
2: Analytisches IPG der nicht-fraktionierten Probe gemäß Beispiel 1; Probenbeschickung reicht von 80 (rechte Seite) bis 600 (linke Seite) μg je Bahn.
3: Analytische RP-HPLC des Inhalts der Zelle 3 (pI 8,41 + 8,65, Zelle, in der die gereinigte Hauptfraktion gesammelt wird) nach dem IEF-Reinigungsverfahren gemäß Beispiel 2. Der Haupt-Peak entspricht dem Amidderivat von Faktor B₀; der kleinere Peak, der diesen Peak überlappt, entspricht dem Amidderivat von Faktor B₀.
4–6: Analytische RP-HPLC des Inhalts der Zellen 1, 2 und 4 (Zellen, in denen die Verunreinigungen gesammelt werden) nach dem IEF-Reinigungsverfahren entsprechend Beispiel 2.
7: Analytische RP-HPLC des Inhalts der Zelle 3 (pI 8,46 + 8,65, Kammer, in der das gereinigte Amidderivat von Faktor B₀ gesammelt wird) nach dem IEF-Reinigungsverfahren gemäß Beispiel 3. Der Haupt-Peak entspricht dem reinen Amidderivat von Faktor B₀.
ANALYTISCHES RP-HPLC-SYSTEM

– Apparatur: zwei Mod. 305 Pumpen, ein Mod. 232 Autosammler, ein Mod. 805 Manometer, ein Mod. 811B dynamischer Mischer (sämtlich von Gilson Medical Electronic, Middletown, WI, USA);
– Säule: YMC-Pack C4-AMP 5 μm, 20 nm, 250 × 4,6 mm (YMC Co., Ltd., Shin-Arami Tai Kumijama-cho, Kuse-gun, Kyoto, Japan);
– Elution: Phase A: Wasser/Acetonitril/Phosphorsäure (95/5/0,05), Phase B: Wasser/Acetonitril/Phosphorsäure (5/95/0,05), Gradientenprofil: Zeit (min): 2 25 35 55 60 64 65 %B: 5 20 20 40 95 95 5 Volumeninjektion: 100 μl, Fließgeschwindigkeit: 1,8 ml/min, Ofentemperatur: 30°C;
– Nachweis: UV-Absorption bei 254 nm auf einem Mod. 116 UV-Detektor (Gilson Medical Electronic, Middletown, WI, USA).

BEISPIEL 1
Herstellung von analytischen immobilisierten pH-Gradienten(IPG)-Gelen zur Bestimmung der pI-Werte der Hauptkomponente und der Verunreinigungen

Geldimension: 25 × 10 cm, 0,5 mm dick; pH-Intervall: 7,0 bis 10,0.

Die IPG-Bereiche werden in einer 5% T, 4% C Polyacrylamidmatrix entsprechend der in Ref. 110 offenbarten Herstellungsrezeptur festgelegt. Nach Herstellung der zwei begrenzenden sauren und basischen Mischungen werden sie titriert (mit einer schwachen Säure und einer schwachen Base) auf pH-Werte nahe der Neutralität. Dies ist wichtig, um eine gleichmäßige Polymerisation und wirksame Monomerenumwandlung durch den vorgebildeten pH-Gradienten hindurch sicherzustellen. Nach dem Waschen des Gels in destilliertem Wasser (3 × 30 ml) werden sämtliche zugesetzten Titranten (sowie die Katalysatoren als auch nicht-gepfropften Monomeren) wirksam entfernt. Die Gele werden dann 30 Minuten in einer 2% Glyzerinlösung equilibriert, an Luft getrocknet und in einer Mischung von 8 M Harnstoff und 3,5% CHAPS über Nacht erneut gequollen. Die Probe wird in Oberflächenvertiefungen an der anodischen Gelseite in Konzentrationen von 80 bis 600 μg/Bahn aufgebracht. Nach einer anfänglichen 1 h-Periode bei 500 V wird die Fokussierung bei 2500 V während 6 h bei 20°C fortgeführt.
Zur Gelanfärbung wurde eine kolloidale Dispersion von Coomassie-Brilliant-Blue G.250 in 12,5% TCA in einer Leuco-Form (siehe Ref. 111) über Nacht aufgebracht. Die Farbverstärkung wird durch Spülen in normalem destillierten Wasser erzielt.
2 zeigt die Ergebnisse des analytischen IPG.
Zur exakten Bestimmung des pI-Werts des Amidderivats von Faktor B₀ und Faktor B₁ wird das vorstehende Verfahren unter den gleichen Bedingungen bei einem pH-Intervall von 8,0 bis 9,0 unter Verwendung einer Mischung von 8 M Harnstoff und 1% CHAPS wiederholt. Der so bestimmte pI-Wert des Amidderivats von Faktor B₀ beträgt 8,56, während der pI-Wert des Amidderivats von Faktor B₁ 8,40 beträgt.
BEISPIEL 2
IEF-Reinigung der Probe (Amide der Antibiotikum A40926-Faktoren B₀ und B₁)
Die IEF-Reinigung wird mit der Iso-PrIME-Apparatur (Hoefer Sco., San Francisco), bestehend aus einer Mehrzellen-Elektrolysiervorrichtung, die mit isoelektrischen, puffernden Membranen zu versehen ist, besteht.
A) Herstellung der isoelektrisch immobilisierten Membranen
Nach Bestimmung in den vorstehenden analytischen Gelen der exakten pI-Werte der Hauptfraktion und der Verunreinigungen werden sechs isoelektrische Membranen hergestellt mit den folgenden pI-Werten: 7,00, 8,31, 8,41, 8,46, 8,65 und 9,50. Sämtliche Membranen werden als eine 10% T, 4% C Matrix in Form von Scheiben mit 4,7 cm Durchmesser und einer Dicke von ca. 1 mm gegossen; die Membranen werden durch Glasfaserfilter gestützt (siehe Ref. 5 und 113 hinsichtlich einer detaillierten Beschreibung ihrer Eigenschaften und Herstellung).
B) Experimentelle Bedingungen

– Anolyt: 5 mM Essigsäure in 8 M Harnstoff und 0,1% CHAPS (pH 4,84, Leitfähigkeit: 85,5 μmhos);
– Trägerlösung in den Zellen: Mischung von 8 M Harnstoff und 3,5% CHAPS;
– Trägerlösung in den Elektroden-Reservoirs: 8 M Harnstoff und 0,1% CHAPS.

Nach einem anfänglichen Betrieb bei niedriger Spannung (500 V) zur Eliminierung von überschüssigem Salz in der Probe wird die Reinigung bei 1500 V (über einem Elektrodenabstand von 12 cm) innerhalb 30 Stunden erreicht. Es wird keine Zirkulationskühlung angewandt und die Joule-Wärme wurde in Luft bei Raumtemperatur (22°C) abgeführt. Unter den vorstehenden Bedingungen betrug der Temperaturanstieg in der Flüssigkeit in dem Elektrolysegerät unter Gleichgewichtsbedingungen lediglich 3°C.
C) Reinigungsverfahren
Ein präparativer Ansatz wird durchgeführt, indem man 500 mg der Probe (gelöst in 100 ml 8 M Harnstoff und 3,5% CHAPS) in die Zelle 3 des Mehrzellen-Elektrolysegeräts zuführt (zwischen die pI 8,41- und pI 8,65-Membranen, wo die Hauptkomponente isoelektrisch festgehalten würde). Der Inhalt dieser Zelle wird aus einem Reservoir recyclisiert, während sämtliche benachbarte Zellen nicht mit einem Reservoir verbunden waren. Da der Flüssigkeitsinhalt einer jeden Zelle der Elektrolysevorrichtung 5 ml beträgt, wohingegen in Zelle 3 (Zelle plus Reservoir) dieser 100 ml beträgt, führt dies zu einer Ansammlung in den benachbarten Zellen von 20-fach konzentrierten Verunreinigungen.
Die Ergebnisse des präparativen Ansatzes werden in den 3 bis 6 wiedergegeben, wo die RP-HPLC-Analyse einer jeden Zelle gezeigt ist.
1 gibt das Gesamtspektrum der Komponenten wieder aus der Sicht unter starker Überbeladung der Hauptkomponenten. Während es nicht möglich ist, die Elutionsreihenfolge bei RP-HPLC mit dem pI-Spektrum vollständig zu vergleichen, ist die Komponente B₁ klar mit der Verbindung identifizierbar, die den nächstliegenden anodischen pI-Wert in Bezug auf die Komponente B₀ besitzt.
Das Spektrum der in Zelle 1 des Elektrolysegeräts sich ansammelnden Komponenten (zwischen den pI 7,0- und pI 8,31-Membranen) wird in 4 gezeigt; solche in Zelle 2 konzentrierten Verunreinigungen (pI 8,31- bis pI-8,41-Membranen) werden in 5 gezeigt; die in der letzten Zelle konzentrierten Verunreinigungen (Nr. 4, zwischen den pI 8,65- und pI 9,5-Membranen) werden in 6 gezeigt.
Die Hauptkomponente (die sich in Zelle 3 zwischen den pI 8,41- und pI 8,65-Membranen ansammelt) wird in 3 gezeigt; der dem Haupt-Peak benachbarte kleinere Peak entspricht dem Amidderivat von Faktor B₁.
BEISPIEL 3
Reines Amidderivat von A40926 Faktor B₀
Man wiederholt Beispiel 2 unter den gleichen experimentellen Bedingungen mit dem einzigen Unterschied, dass der pI-Bereich von Zelle 3 nun 8,46 + 8,65 beträgt und dass die Probe (500 mg) in die nächstliegende anodische Zelle (Zelle 2) anstatt in Zelle 3 zugeführt wird; der Inhalt von Zelle 3 (wo die Hauptkomponente gezwungen wird, sich zu bewegen und isoelektrisch festgehalten wird) wird aus einem Reservoir recyclisiert.
7 zeigt die Ergebnisse dieser Reinigung; der kleinere Peak nahe dem Haupt-Peak des Amidderivats von A40926 Faktor B₀ ist abwesend, was somit die Abwesenheit der B₁-Amidderivate von A40926 anzeigt.
BEISPIEL 4
Abtrennung des Amidderivats von A40926 Faktor B₀ aus der Harnstoff/CHAPS-Trägermischung
Die endgültige in Zelle 3 enthaltene Lösung (200 mg in 50 ml), die entsprechend Beispiel 3 erhalten wurde, wird mit 0,5 M TRIS (450 ml, pH 9) verdünnt und oben auf die Säule mit silaniertem Silicagel (16 × 250 mm) gegeben, wobei man eine Miniplus 3-peristaltische Pumpe (Gilson) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min verwendet; als Elutionsmittel wird Methanol eingesetzt.
Vor dem Aufbringen der Lösung wird die Säule mit TRIS-Puffer (0,5 M, pH 9) gewaschen.
Nach dem Aufbringen der Lösung wird die Säule zuerst mit TRIS-Puffer (0,5 M, pH 9) herab bis auf eine optische Dichte von Null und dann mit destilliertem Wasser zur Entfernung der Salze gewaschen.
Die Überwachung der Lösung der Eluate erfolgt mit einem UV-Detektor Mod. 2138 Unicords (LKB, Uppsala, Schweden) bei 280 nm.
Die eine von Null verschiedene optische Dichte aufweisenden Fraktionen werden gesammelt und durch RP-HPLC (siehe die vorstehende Methodik) und TPC auf Silicagel F254 (Merck, Darmstadt, Deutschland), mobile Phase CHCl₃/CH₃OH/NH₄OH (50/47/3) oder CH₃CN/H₂O/CH₃COOH/CH₃OH (50/20/15/5), Sichtbarmachung mit UV-Lampe oder Ioddämpfe analysiert.
Die das reine Amidderivat von A40926 Faktor B₀ enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter Vakuum konzentriert und lyophilisiert.
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39 Malabarba, A., Strazzolini, P., DePaoli, A., Landi, M., Berti, M. und Cavalleri, B., Teicoplanin, Antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. Sp. VI., Chemical degradation: physico-chemical and biological properties of acid hydrolysis products. J. Antibiot 1984; 37: 988–999
40 US-Patent Nr. 5 064 811
41 US-Patent Nr. 4 954 483
42 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 326 873
43 Europäisches Patent Nr. 290 922
44 US-Patent Nr. 5 194 424
45 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 316 712
46 US-Patent Nr. 5 185 320
47 US-Patent Nr. 4 782 042
48 US-Patent Nr. 4 868 171
49 Internationale Patentanmeldung, Publikations-Nr. WO 88/02755 (USA benannt)
50 US-Patent Nr. 4 804 534
51 Kamogashira, T., Nishida, T und Sugawara, M., A new glycopeptide Antibiotic, OA-7653, produced by Streptomyces hygroscopicus subsp. Hiwasaensis. Agric Biol Chem 1983; 47: 499–506
52 Jeffs, P. W., Yellin, B., Mueller, L. und Heald, S. L., Structure of the Antibiotic OA-7653. J Org Chem 1988; 53: 471–477
53 Boeck, L. D., Mertz, F. P., Wolter, R. K. und Higgens, C. E., N-Demethyl vancomycin, a novel Antibiotic produced by a strain of Nocardia orientalis. Taxonomy and fermentation. J. Antibiot 1984; 37: 446–453
54 Hunt, A. H., Marconi, G. G., Elzey, T. K. und Hoehn, M. M., A 51568A: N-Demethyl vancomycin, J. Antibiot 1984; 37: 917–919
55 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 159 180
56 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 231 111
57 Tsuji, N., Kobayashi, M., Kamigauchi, T., Yoshimura, Y. und Terui, Y., New glycopeptide Antibiotics. I. The structures of orienticins. J. Antibiot 1988; 41: 819–822
58 Gauze, G. F., Brazhnikova, M. G., Laiko, A. V., Sveshnikova, M. A., Preobrazhenskaya, T. P., Fedorova, G. B., Borisova, V. N., Tolstykh, I. V., Yurina, M. S., Pokras, L. S., Goldberg, L. E., Malkova, I. V. und Stepanova, E. S., Eremomycin, a novel cyclic glycopeptide Antibiotic. Antibiot Med Biotecknol 1987; 32: 571–576
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64 Hunt, A. H., Occolowitz, J. L., Debono, M., Molloy, R. M. A 82846, a new glycopeptide complex, produced by Amycolatopsis orientalis, 3. Structure determination, 28. Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother (23.–26. Oktober, Los Angeles) 1988; Abst 976
65 Tsuji, N., Kamigauchi, T., Kobayashi, M. und Terui, Y., New glyco peptide antibiotics: II. The Isolation and structures of chloro orienticins: J. Antibiot 1988; 41: 1506–1510
66 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 273 727 (unter Beanspruchung der Priorität der US-Patentanmeldung Nr. 948175, eingereicht am 30. Dezember 1986)
67 US-Patent Nr. 4 552 701
68 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 201 251 (unter Beanspruchung der Priorität der US-Patentanmeldung Nr. 726731, eingereicht am 25. April 1985, und der US-Patentanmeldung Nr. 853583, eingereicht am 18. April 1986)
69 US-Patent Nr. 4 698 327
70 US-Patent Nr. 4 639 433
71 US-Patent Nr. 4 643 987
72 Harns C. M., Kannan R., Kopecka, H., und Harris T. M., The role of the chlorine substituents in the antibiotic vancomycin: preparation and characterization of mono- und didechlorovancomycin. J. Am. Chem. Soc. 1985; 107: 6652–6658
73 Europäisches Patent Nr. 218 099
74 US-Patent Nr. 5 198 418
75 Batta, G., Sztaricskai, F., Csanadi, J., Kamaromi, I. und Bognar, R. 13C NMR study of actinoidins: carbohydrate moieties and their glycosidic linkages. J. Antibiot 1986; 39: 910–913
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77 Okazaki, T., Enokita, R., Miyaoka, H., Takatsu, T. und Torkiata, A., Chloropolysporins A, B and C, novel glycopeptide antibiotics from Faenia interjecta sp. Nov. I. Taxonomy of producing organism. J. Antibiot 1987; 40: 917–923
78 Takatsu, T., Nakajima, M., Oyajima, S., Itoh, Y., Sakaida, Y., Takahashi, S. und Haneishi, T., Chloropolysporins A, B and C, novel glycopeptide antibiotics from Faenia interjecta sp. Nov. II. Fermentation, isolation and physico-chemical characterization, J. Antibiot 1987; 40: 924–932
79 Takatsu, T., Takahashi, S., Nakajima, M., Haneishi, T., Nakamura, T., Kuwano, H. und Hinoshita, T., Chloropolysporins A, B and C, novel glycopeptide antibiotics from Faenia interjecta sp. Nov. III. Structure elucidation of chloropolysporins. J. Antibiot 1987; 40: 933–940
80 Dingerdissen, J. J., Sitrin, R. D., DePhillips, P. A., Giovenella, A. J., Grappel, S. F., Mehta, R. J., Oh, Y. K., Pan, C. H., Roberts, G. D., Shearer, M. C. und Nisbet, L. J., Actinoidin A2 a novel glyco peptide: production, preparative HPLC separation and characterization. J. Antibiot 1987; 40: 165–172
81 Japanische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 63017897 (Farmdoc Abstract 88-061310)
82 Internationale Patentanmeldung, Publikations-Nr. WO 90/11300 (USA benannt)
83 Europäisches Patent Nr. 370 283
84 McGahren, W. J., Leese, R. A., Barbatschi, F., Morton, G. O., Kuck, N. A., und Ellestad, G. A., Components and degradation compounds of the avoparcin complex. J. Antibiot 1983; 36: 1671–1682
85 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 276 740
86 US-Patent Nr. 4 742 045
87 Arjuna Rao, V., Ravishankar, D., Sadhukhan, A. K., Ahmed, S. M., Goel, A. K., Prabhu, N. S., Verman, A. K., Venkateswarlu, A., Allaudeen, H. S., Hedde, R. H. und Nisbet, L. J., Synmonicins: a novel antibiotic complex produced by Synnemomyces mamnoorii gen. et. sp. nov. I. Taxonomy of the producing organism, fermentation and biological properties, 26. Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother (28. September–1. Oktober, New Orleans) 1986; Abst 939
88 Verma, A. K., Prakash, R., Carr, S. A., Roberts, G. D., und Sitrin, R. D., Synmonicins: a novel antibiotic complex: II. Isolation and preliminary characterization, 26. Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother (28. September–1. Oktober, Las Vegas) 1986; Abst 940
89 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 351 597
90 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 351 684
91 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 351 685
92 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 339 982
93 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 365 319
94 Internationale Patentanmeldung, Publikations-Nr. WO 89/07612 (USA benannt)
95 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 356 894
96 Internationale Patentanmeldung, Publikations-Nr. WO 89/02441 (USA benannt)
97 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 448 940
98 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 352 538
99 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 560 795
100 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 578 644
101 Europäische Patentanmeldung, Publikations-Nr. 596 929
102 Rilbe, H., (1973), Ann. N.Y. Acad. Sci. 209, 11–22
103 Righetti, P. G., Wenisch, E., Jungbauer, A., Katinger, H., und Faupel, M., (1990), 7. Chromatogr. 500, 681–696
104 Ettori, C., Righetti, P. G., Chiesa, C., Frigerio, F., Galli, G., and Grandi, G. (1992), J. Biotechnol. 25, 307–318
105 Wenisch, E., Righetti, P. G., und Weber, W. (1992) Electrophoresis 13, 668–673
106 Weber W., Wenisch, E., Gunther, N., Marnitz, U., Betzels, C., und Righetti, P. G. (1994), J. Chromatogr. A 679, 181–189
107 Wenisch, E., Vorauer, K., Jungbauer, A., Katinger, H. und Righetti, P. G. (1994), Electrophoresis 15, 647–653
108 Breton, J., Avanzi, N., Valsasina, B., Sgarella, L., La Fiura, A., Breme, U., Orsini, G., Wenisch, E., und Righetti, P. G. (1995), J. Chromatogr. A, in Druck
109 Wenisch, E., Schneider, P., Hansen, S. A., Rezzonico, R., und Righetti, P. G. (1993), J. Biochem. Biophys. Methods 27, 199–213
110 Righetti, P. G. (1990) Immobilized pH Gradients; Theory and Metodology, Seiten 64–68, Elsevier, Amsterdam
111 Righetti, P. G., und Chillemi, F. (1978), J. Chromatogr. 157, 243–251
112 Henner, J., Sitrin, R. D. (1984), J. Antib., 11, 1475–1478
113 US-Patent Nr. 4 971 670
114 Sahai et al., Antimicrob. Agents Chemother (1990), 34(5), 765–9
115 Europäisches Patent Nr. 259 781

Claims

Verfahren zur Reinigung einer antibiotischen Verbindung der Dalbaheptid-Familie mit Hilfe isoelektrischer Fokussierung in einem Mehrzellen-Elektrolysegerät mit Immobilin^®-zwitterionischen Membranen, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerlösung eine wässrige Mischung von Harnstoff und einem Detergens ist, welches ein Sulfobetain-zwitterionisches Derivat der Cholsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Detergens {3-[3-(Cholamidopropyl)-dimethylammonio]}-1-propansulfonat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Harnstoffkonzentration von 4 M bis 8 M beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Harnstoffkonzentration 8 M beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Detergenskonzentration von 1% bis 5% (Gew./Vol.) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Detergenskonzentration von 2% bis 4,5% (Gew./Vol.) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Detergenskonzentration 3,5% (Gew./Vol.) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Dalbaheptid-Antibiotikum der Sub-Gruppe vom Ristocetin-Typ angehört.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das zu reinigende Dalbaheptid-Antibiotikum Ristocetin, Actaplanin, Teicoplanin, Antibiotikum A35512, Antibiotikum A41030, Antibio tikum A47934, Ardacin A, B, C, Antibiotikum A40926, Kibdelin, Parvodicin, Antibiotikum UK 68597 oder ein natürliches oder semisynthetisches Derivat dieser Antibiotika ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das zu reinigende Dalbaheptid-Antibiotikum Antibiotikum A40926-Komplex oder ein natürliches oder semisynthetisches Derivat hiervon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das zu reinigende Dalbaheptid-Antibiotikum das 6^B-Decarboxy-6^B-(hydroxymethyl)-N⁶³-3-(dimethylamino)-propylamid-Derivat des Antibiotikum A40926-Komplexes ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die zwei Ausschluß-Membranen der Kammer, worin das gereinigte Produkt gesammelt wird, auf einen pI-Wert von 8,41 bzw. 8,65 eingestellt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die zwei Ausschluß-Membranen der Kammer, worin das gereinigte Produkt gesammelt wird, auf einen pI-Wert von 8,45 bzw. 8,65 eingestellt sind.