DE68920898T2

DE68920898T2 - Aglykone von A/16686-Antibiotika.

Info

Publication number: DE68920898T2
Application number: DE68920898T
Authority: DE
Inventors: Bruno Cavalleri; Romeo Ciabatti
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1988-04-13
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2009-03-31
Also published as: DE68920898D1; EP0337203B1; ES2067493T3; ATE118017T1; DK170189D0; CA1337838C; GB8808658D0; JPH0228196A; EP0337203A2; KR900016263A; US5491128A; EP0337203A3; DK170189A; JP2647490B2

Description

Die Erfindung betrifft depsipeptidische Verbindungen der folgenden Strukturformel I:
worin
R -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,
-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)2,
-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; und die entsprechenden tetrahydrierten Gruppen bedeutet, und die Säureadditionssalze davon einschließlich ihrer Gemische in irgendeinem Verhältnis, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Antibiotika.
Die oben erwähnten Substanzen stehen mit dem Antibiotikum A/16686 in Beziehung, und sie werden durch selektive hydrolytische Behandlung der Verbindungen, die als Antibiotikum-A/16686-Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2 und A'3 bezeichnet werden, ihren entsprechenden tetrahydrierten Derivaten und den Gemischen davon hergestellt.
Das Antibiotikum A/16686 ist eine Substanz, die gegenüber grampositiven Bakterien aktiv ist, und es wird in der US-PS 4 303 646 zusammen mit seinem Herstellungsverfahren und es enthaltenden pharmazeutischen Präparaten beschrieben.
Das Antibiotikum A/16686, sein Herstellungsverfahren und seine vorläufigen physikalisch-chemischen Eigenschaften werden ebenfalls von B. Cavalleri et al. in "J Antibiotics, Bd. 37: 309-317 (1984)" beschrieben.
Es wurde dann gefunden, daß drei eng verwandte Komponenten aus dem Antibiotikum A/16686 isoliert werden konnten, welche als Faktoren A1, A2 und A3 bezeichnet wurden. Diese Substanzen wie auch ihre Herstellung und ihre Verwendungen werden in der US-PS 4 427 656 beschrieben. Der Faktor A2 ist die Komponente, die in überwiegender Menge erhalten wird, und er ist wegen seiner biologischen Aktivität am bedeutungsvollsten, während die Faktoren A1 und A3 in einer geringen Menge erhalten werden.
Ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Bildung der Faktoren A2 und/oder A3 des Antibiotikums A/16686 durch Zugabe geeigneter Vorstufen zu einer A/16686-erzeugenen Kultur wird in der europäischen Patentveröffentlichung 259 780 beschrieben.
In der europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 116 947.8 werden die Antibiotikum-A/16686-Faktoren A'1, A'2 und A'3 und ihre Herstellung beschrieben.
In der europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 119 001.1 werden die tetrahydrierten Derivate der Antibiotikum-A/16686- Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2 und A'3 und Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden ebenfalls als A/16686- Faktor-A1-Aglycon, A/16686-Faktor-A2-Aglycon, A/16686-Faktor-A3-Aglycon, A/16686-tetrahydrierter Faktor-A1-Aglycon (Formel I, R = -CO(CH&sub2;)&sub6;-CH&sub3;), A/16686-tetrahydrierter Faktor-A2-Aglycon (Formel I, R = -CO(CH&sub2;)&sub5;CH(CH&sub3;)2), A/16686-tetrahydrierter Faktor-A3-Aglycon (Formel I, R = -CO(CH&sub2;)&sub6;CH(CH&sub3;)&sub2;) bezeichnet.
Die hydrolytische Behandlung von Teicoplanin, einem Glykopeptid-Antibiotikum, in biphasischem hydroalkoholischem Medium wird von B. Cavalleri et al. in J. Antibiotics, Bd. 40: 49-59 (1987), beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch selektive Hydrolyse eines Ausgangsmaterials, ausgewählt aus den Antibiotikum-A/16686-Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2, A'3, einem Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen, ihren entsprechenden Tetrahydroderivaten und einem Gemisch aus zwei oder mehreren von diesen hergestellt werden. Dementsprechend kann die selektive Hydrolyse entweder mit den einzelnen Faktoren oder mit irgendeinem Gemisch aus zwei oder mehreren davon, wie beispielsweise dem A/16686-Antibiotikum-Komplex, der durch Fermentation von Actinoplanes sp. ATCC 33076 (ein Stamm, der in der permanenten Kultursammlung ATCC hinterlegt ist und jetzt frei verfügbar ist und gemäß dem Budapester-Vertrag am 31. Januar 1981 angenommen ist), wie es in der US-PS 4 303 646 beschrieben wird, hergestellt werden. Weitere Beispiele für Gemische der A/16686-Faktoren sind solche, die nach dem Verfahren der europäischen Patentveröffentlichung 259 780 gebildet werden, wobei das Verhältnis des Faktors A2 und/oder A3 selektiv während des Fermentationsverfahrens erhöht wird, und die Gemische, die die Faktoren sowohl der A- als auch der A'-Gruppen enthalten, die durch Fermentation des oben erwähnten Actinoolanes sp. ATCC 33076 unter geeigneten Bedingungen oder durch Behandlung irgendeines der Faktoren der Gruppe A oder eines Gemisches davon mit dem Mycel des gleichen Stamms während einer geeigneten Zeitdauer bei geeigneten Bedingungen gemäß den Verfahren, die in der oben erwähnten europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 116 947.8 beschrieben werden, erhalten werden.
Gemische aus tetrahydrierten Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2, A'3 werden ebenfalls beispielsweise durch Hydrierung des Antibiotikum-A/16686- Komplexes, wie in der europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 119 001.1 beschrieben, hergestellt.
In allen oben erwähnten Fällen können die Ausgangsmaterialien entweder in Form einer freien Base oder in Form eines Säureadditionssalzes vorliegen, wie solche, die in den US-PSen 4 303 646, 4 427 656 und in der schwebenden europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 116 947.8 beschrieben werden.
Wenn das Ausgangsmaterial aus einem Gemisch aus zwei oder mehreren A/16686-Faktoren besteht, kann das Produktgemisch, das bei der selektiven Hydrolyse erhalten wird, in die reinen Komponenten entsprechend den erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I getrennt werden.
Der Ausdruck "selektive Hydrolyse", wie er hier in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet ein Hydrolyseverfahren, das bei kontrollierten Bedingungen durchgeführt wird und welches die Spaltung der Semi-Acetalbindung zwischen der Zuckergruppierung und dem Rest des A/16686-Moleküls erlaubt, ohne daß andere Teile der Grundstruktur der A/16686-Antibiotika, die Peptid-, Amid- und Lactonbindungen enthalten, betroffen sind.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein selektives Hydrolyseverfahren zur Herstellung der Verbindungen der obigen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Ausgangsmaterial, ausgewählt aus Antibiotikum-A/16686-Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2, A'3, einem Gemisch aus zwei oder mehreren davon, ihren entsprechenden Tetrahydroderivaten oder einem Gemisch aus zwei oder mehreren davon, mit entweder
a) Trimethylsilyliodid oder Trimethylsilylchlorid in Anwesenheit von Natriumiodid, gefolgt von der Hydrolyse bei milden Bedingungen des so erhaltenen Trimethylsilylderivats,
oder
b) einer starken Säure in Anwesenheit eines niedrigen Alkanols oder eines Gemisches von niedrigen Alkanolen bei wasserfreien Bedingungen
in Kontakt gebracht wird.
Das selektive Hydrolyseverfahren gemäß Absatz a) umfaßt die Umwandlung der glycosidischen Acetale der A/16686-Antibiotika in die entsprechenden Trimethylsilylether gemäß dem Verfahren, das von T. Morita et al. in J.C.S., Chem. Comm. 1978, S. 874, und in den in dieser Literaturstelle angegebenen Literaturstellen beschrieben wird.
Die Bildung der Trimethylsilylether erfolgt im allgemeinen in Anwesenheit eines aprotischen organischen Lösungsmittels durch Behandlung des A/16686-Ausgangsmaterials mit einem molaren Überschuß an Trimethylsilyliodod oder Trimethylsilylchlorid, beispielsweise 1 bis 3 ml Trimethylsilylhalogenid für jedes Gramm Ausgangsmaterial. Wenn Trimethylsilylchlorid verwendet wird, wird Natriumiodid zu dem Reaktionsgemisch in einem Verhältnis im Bereich von 0,01 bis 1 mol Natriumiodid für jedes mol Trimethylsilylchlorid zugegeben. Das aprotische organische Lösungsmittel wird im allgemeinen ausgewählt aus chlorierten niedrigen Kohlenwasserstoffen (beispielsweise Dichlormethan, Tetrachlorkohlenstoff), Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Acetonitril und ihren Gemischen. Die Temperatur der Reaktion liegt im allgemeinen im Bereich zwischen 10ºC und 100ºC, bevorzugt zwischen 20ºC und 80ºC.
Wie es dem Fachmann geläufig ist, kann die Reaktionszeit, abhängig von der Art und Reinheit des Ausgangsmaterials und den spezifischen Reaktionsbedingungen und -verfahren, variieren. Im allgemeinen ist die Reaktion in 0,5 bis 5 Stunden beendet. In jedem Fall kann der Verlauf der Reaktion durch TLC- oder HPLC-Verfahren, die gut bekannt sind, verfolgt werden. Beispielsweise können Proben in Intervallen entnommen und analysiert weden, um festzustellen, wann die Reaktion beendet ist. Die Reaktion kann dann beendet werden, um die negativen Folgen einer verlängerten Behandlung des Endprodukts bzw. der Endprodukte mit der Reaktionsmasse zu vermeiden.
Die Trimethylsilylether-Bindungen werden dann leicht bei milden Bedingungen hydrolysiert. Der Ausdruck "milde Bedingungen" bedeutet in diesem Fall, daß die Reaktionsbedingungen geeignet sein müssen, um die Trimethylsilylether-Bindung(en) zu spalten, ohne die anderen Teile des Antibiotikum-Moleküls zu beeinflussen. Gemäß einem allgemeinen Verfahren wird die Reaktionslösung, die das bzw. die Trimethylsilylderivat(e) enthält, mit Wasser oder einem niedrigen Alkanol oder einem Gemisch davon bei einer Temperatur, die von 0ºC bis Raumtemperatur variiert, behandelt, wobei der pH-Wert zwischen 3 bis 5 gehalten wird, und während einer Zeitdauer, die in Abhängigkeit von dem pH-Wert und der Temperatur variieren kann und im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 24 Stunden liegt.
Wenn die Silylierungsreaktion beendet ist, wird das Reaktionsgemisch in einen Überschuß an Wasser oder einem niedrigen Alkanol oder einem Gemisch davon in Anwesenheit einer geeigneten Menge einer milden Base, um den pH-Wert zwischen 3 und 5 zu halten, gegossen. Die Reaktionsprodukte der Formel I werden dann aus diesem Gemisch nach an sich bekannten Verfahren gewonnen und gereinigt, wie durch Verdampfen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Präzipitation durch Zugabe von nicht-Lösungsmitteln, Säulenchromatographie und ähnlichen. Manchmal kann es zweckdienlich sein, die organische Lösung auf ein geringes Volumen einzuengen, um das rohe Hydrolyseprodukt auszufällen.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen aus dem rohen Hydrolyseprodukt, ihre Trennung und Reinigung erfolgt nach per se bekannten Verfahren, die die Extraktion mit Lösungsmitteln, die Präzipitation aus der so erhaltenen Lösung durch Zugabe von nicht-Lösungsmitteln oder durch Änderung des pH-Werts der Lösung, die Verteilungschromatographie, die Umkehrphasen-Verteilungschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie, HPLC-Verfahren und ähnliche umfassen.
Wenn die selektive Hydrolyse nach den Verfahren von Absatz b) oben durchgeführt wird, ist die starke Säure im allgemeinen eine starke Mineralsäure, beispielsweise Chlorwasserstoff- oder Bromwasserstoffsäure, oder eine starke Aryl- oder Alkylsulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, ihre halogenierten Derivate, wie Trifluormethansulfonsäure, Trichlormethansulfonsäure und ähnliche.
Die starke Säure kann ebenfalls ein getrocknetes starkes Kationenaustauschharz in Säureform sein. Sowohl gelartige als auch makroporöse getrocknete Harze dieses Typs sind im Handel erhältlich, beispielsweise Dowex DR-2020, DR-2030, DR-2090 oder Dowex M15-DR, M18-DR, M31-DR und M32-DR. Gegebenenfalls können die im Handel erhältlichen getrockneten Harze weiter durch wiederholtes Waschen mit wasserfreiem Methanol, durch azeotrope Destillationsverfahren oder durch Erwärmen bei 100 bis 115ºC bei verringertem Druck in wasserfreie Form überführt werden. Die Reaktion erfolgt im allgemeinen in Anwesenheit eines Lösungsmittels, das ausgewählt wird aus organischen polaren Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, oder in einem Überschuß des gleichen niedrigen Alkanols (d.h. eines C&sub1;-C&sub6;-Alkanols) oder einem Gemisch davon. Die Säure wird im allgemeinen in einem großen Überschuß des Lösungsmittels in einer Konzentration von 1 bis 5% (Gew./Vol.), bevorzugt von 2 bis 3,5% (Gew./Vol.), gelöst.
Gemäß einer typischen Ausführungsform des oben in Absatz b) beschriebenen Verfahrens wird das A/16686-Ausgangsmaterial zu einer Lösung (oder einer Suspension) der Säure in dem ausgewählten Lösungsmittel in Anwesenheit eines überschusses an niedrigem Alkanol, bevorzugt Butanol, gegeben, und das Gemisch wird bei einer Temperatur zwischen 15 und 80ºC gehalten, bis die Spaltung der glycosidischen Acetalbindung beendet ist. Ebenfalls variiert in diesem Fall die Reaktionszeit, abhängig von der Art und Reinheit der Ausgangsmaterialien und den spezifischen Reaktionsbedingungen. Der Reaktionsverlauf kann durch TLC- oder HPLC-Verfahren, wie für das Verfahren gemäß Absatz a) oben erläutert, verfolgt werden. Im allgemeinen liegt die Reaktionszeit im Bereich von 0,1 bis 10 Stunden. Auch in diesem Fall werden die Reaktionsprodukte aus dem Reaktionsgemisch nach an sich bekannten Verfahren gewonnen und gereinigt, wie mit den Verfahren, wie sie oben für das Verfahren gemäß Absatz a) beschrieben wurden.
Wenn die selektive Hydrolyse mit einem Substrat durchgeführt wird, das aus einem Gemisch aus zwei oder mehreren der Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2 und A'3 oder ihren Tetrahydroderivaten besteht und die Herstellung eines einzelnen Aglyconderivats gewünscht wird, erfolgt die Irennung und Reinigung des Hydrolyseprodukts bevorzugt unter Verwendung von Säulenchromatographie- oder präparativen HPLC-Verfahren. Die präparativen HPLC-Verfahren werden im allgemeinen bei solchen Bedingungen durchgeführt, die für die Trennung und Reinigung der A/16686-Antibiotikum-Faktoren üblich sind. Beispiele für die Trennungs- und Reinigungsverfahren finden sich beispielsweise in der US-PS 4 427 656, wo eine C-18-Alkyl-silanisierte Silicagelsäule und als Eluierungsmittel ein Gemisch aus wäßrigem Ammoniumformiat und Acetonitril verwendet werden.
Während der präparativen HPLC werden die eluierten Flüssigkeiten aus jeder Injektion durch analytische HPLC geprüft, und die Fraktionen, die mit jedem A/16686-Faktor-Aglycon angereichert sind, werden getrennt.
Die Fraktionen, die mit jeder der obigen Verbindungen angereichert sind, werden vereinigt und zur Trockene im Vakuum konzentriert. Der bzw. die Feststoff(e), der bzw. die bei der Konzentrierung der eluierten Lösung(en) erhalten wird bzw. werden, wird bzw. werden von Restsalzen befreit, dann in wäßrigen Mineralsäuren gelöst, und die entstehenden Lösungen werden gefriergetrocknet, wobei das bzw. die entsprechenden reinen Produkt(e) in Form des Mineralsäure-Additionssalzes bzw. der Mineralsäure-Additionssalze [beispielsweise als Dihydrochlorid(e)] erhalten wird bzw. werden. Das obige Verfahren kann einmal oder mehrere Male wiederholt werden, wenn die Reinheit der entstehenden Produkte nicht ausreicht. Die Säulenchromatographie-Verfahren können beispielsweise an silanisiertem Silicagel unter Verwendung von Wasser/Acetonitril-Gemischen als Lösungsmittel und verdünnter Chlorwasserstoffsäure/Acetonitril-Gemischen als Eluierungsmittel durchgeführt werden. Gegebenenfalls können die durch Säulenchromatographie-Verfahren getrennten Produkte weiter durch präparative HPLC gereinigt werden. In diesem Fall ist es ebenfalls im allgemeinen bevorzugt, das End-Aglyconprodukt in Form eines Mineralsäureadditionssalzes zu isolieren, indem das gleiche Verfahren, wie oben beschrieben, verwendet wird. Gegebenenfalls können die festen Rückstände, die bei der Säulenchromatographie oder HPLC erhalten werden, durch Chromatographie durch ein makroporöses Harz (beispielsweise XAD-2) und Eluierung mt einer sauren Lösung entsalzt werden.
Die Antibiotikum-A/16686-Faktor-A1-, -A2- und -A3-Aglycone und ihre Tetryhydroderivate werden der Säure/Base-Titration, der Aminosäureanalyse (für die Menge und die Sequenz), der IR-, UV-, NMR-Spektrometrie und der Fast Atom Bombardment-Massenspektrometrie (FAB-MS) unterworfen. Die Werte, die bei diesen analytischen Tests erhalten werden, bestätigen die zugeordneten Strukturen.
Wie in der Formel I gezeigt, besitzen die erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen zwei basische Funktionen, die nach an sich bekannten Verfahren Säureadditionssalze bilden können.
Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel I umfassen solche Salze, die durch Standardreaktionen mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet wurden, wie beispielsweise Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Trifluoressig-, Trichloressig-, Bernstein-, Zitronen-, Ascorbin-, Milch-, Malein-, Fumar-, Palmitin-, Cholin-, Pamoa-, Mucin-, Glutamin-, Campher-, Glutar-, Glykol-, Phthal-, Wein-, Laurin-, Stearin-, Salicyl-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, Sorbin-, Picrin-, Benzoe-, Zimtsäure und ähnlichen.
Die Umwandung der erfindungsgemäßen freien Amino- oder nicht-Salzverbindungen in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h. die Umwandlung eines Säureadditionssalzes einer erfindungsgemäßen Verbindung in nicht-Salzform, sind dem Fachmann geläufig und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße Verbindung in das entsprechende Säureadditionssalz durch Auflösen der nicht-Salzform in einem wäßrigen Lösungsmittel und dann Zugabe eines geringen Überschusses der ausgewählten Säure umgewandelt werden. Die entstehende Lösung oder Suspension wird dann zur Gewinnung des gewünschten Salzes lyophilisiert.
Wenn das End-Salz in einem Lösungsmittel, in dem die nicht-Salzform löslich ist, unlöslich ist, kann das Salz durch Filtration aus der organischen Lösung der nlcht-Salzform nach der Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen Überschusses der ausgewählten Säure gewonnen werden.
Gegebenenfalls kann die nicht-Salzform aus dem entsprechenden Säuresalz, gelöst in einem wäßrigen Lösungsmittel, durch Neutralisation unter Freisetzung der nicht-Salzform erhalten werden.
Wenn nach der Neutralisation eine Entsalzung erforderlich ist, kann ein übliches Entsalzungsverfahren verwendet werden.
Beispielsweise kann die Säulenchromatographie an silanisiertem Silicagel, nichtfunktionalisiertem Polystyrol, Acrylharzen und Polydextranharzen mit kontrollierten Poren (wie Sephadex LH 20) oder an Aktivkohle zweckdienlich verwendet werden. Nach Eluierung der unerwünschten Salze mit einer wäßrigen Lösung wird das gewünschte Produkt mittels eines linearen Gradienten oder mittels eines Stufengradienten eines Gemisches aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittel, wie Wasser/Acetonitril-Gemische von 50:50 bis etwa 100% Acetonitrii, eluiert.
Wie es auf diesem Gebiet üblich ist, kann die Salzbildung entweder mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder mit nicht pharmazeutisch annehmbaren Säuren als zweckdiendliches Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Nach der Bildung und Isolierung kann die Salzform des Antibiotikums der Formel I oben in das entsprechende nicht-Salz oder in ein pharmazeutisch annehmbares Salz überführt werden.
Die Aglycone der A/16686-Antibiotika sind besonders gegenüber grampositiven Mikroorganismen aktiv. Das mikrobiologische Aktivitätsspektrum der Aglycone der Antibiotikum-A/16686-Faktoren A1, A2 und A3 wird in der folgenden Tabelle I angegeben: TABELLE I In-vitro-Aktivität von A/16686-Antibiotikum-Aglyconen (Dihydrochloriden) MIC (mcg/ml) Stamm Faktor-A1-Aglycon A/16686-Faktor-A2 Staphylococcus aureus Tour Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Staphylococcus haemolyticus L602 c) Streptococcus pyogenes C203 SKF 13400 Streptococcus pneumoniae UC41 Streptococcus faecalis ATCC 7080 Streptococcus mitis L 796 c) Propionibacterium acnes ATCC 6922 a) Inokulum 10&sup6; (KBE/ml) b) 30%iges Rinderserum wurde zugegeben c) Klinische Isolate
Die minimale Inhibitorkonzentration (MIC) wird entweder nach dem Kulturbrühen- (Rohr) oder dem zweifachen Agarreihen-Verdünnungsverfahren bestimmt. Kulturmedien und Wachstumsbedingungen sind die folgenden: Iso-Sensitest-Brühe (Oxoid) für Staphylokokken und Streptococcus faecalis; Todd-Hewitt-Brühe (Difco) für andere Streptokokkenarten; Wilkins-Chalgren- Agar für P. acnes [T.D. Wilkins, S. Chalgren: Antimicrob. Agents Chemother. 1976, 10, 926 ]; sofern nicht anders angegeben, beträgt das End- Inokulum etwa 10&sup4; koloniebildende Einheiten/ml oder Fleck. MIC wird als die niedrigste Konzentration abgelesen, die kein sichtbares Wachstum nach einer 18- bis 24stündigen Inkubation bei 37ºC zeigt; für Anaerobier erfolgt die Inkubation bei 37ºC während 48 Stunden in anaerober Atmosphäre (N&sub2;:CO&sub2;:H&sub2;; 80:10:10).
Die Aktivität der Tetrahydroderivate der Aglycone liegt bei den gleichen Versuchen bei den gleichen Werten wie jene für die oben beschriebenen Aglycone. Da das A/16686-Faktor-A2-Aglycon eine gute Aktivität gegenüber S.epidermidis zeigt, wurde er gegenüber einer Reihe von klinisch isolierten S. epidermidis-Pathogenen von relevantem klinischen Interesse (Tabelle II) geprüft: TABELLE II In-vitro-Aktivität des A/16686-Faktor-A2-Aglycons (Dihydrochlorid) gegenüber ausgewählten Staphvlococcus epidermidis-Stämmen (klinische Isolate) Organismus MIC (mcg/ml) Faktor-A2-Aglycon Antibiotikum-A/16686-Faktor-A2 Staphylococcus epidermidis L a) Methicillin-resistent
Die A/16686-Aglycone sind ebenfalls bei Mäusen, die mit Streptococcus pyogenes infiziert sind, aktiv. In einem repräsentativen Versuch wurden Gruppen von fünf Mäusen (Charles River) intraperitoneal mit S. pyogenes C 203 SKF 13400 infiziert. Die Inokula wurden so eingestellt, daß die nicht behandelten Tiere an Septikämie innerhalb von 48 Stunden starben. Unmittelbar nach der Infektion wurden die Tiere subkutan einmal mit dem A/16686-Faktor-A2-Aglycon behandelt. Am zehnten Tag wurde der Wert für ED&sub5;&sub0; in mg/kg gemäß dem Verfahren von Spearman und Karber (D.J. Finney, Statistical Methods in Biological Assay, S. 524; C. Griffin and Co., London, 1952) auf der Basis des Prozentgehalts der überlebenden Tiere bei jeder Dosis bestimmt.
Der ED&sub5;&sub0;-Wert des A/16686-Faktor-A2-Aglycons beträgt 0,11 mg/kg (im Vergleich mit 0,14 für den Antibiotikum-A/16686-Faktor-A2).
Die erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen sind nützlich zur Herstellung von Arzneimitteln gegen Infektionen, die primär auf grampositive, stark diffundierte Bakterien zurückzuführen sind. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen nützlich für die topische Behandlung von Haut- und Wundinfektionen und Akne.
Für die Verwendung als Arzneimittel können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf verschiedenen Wegen, entweder in Form der freien Verbindungen oder in Form ihrer Additionssalze, mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren verabreicht werden, wobei die letztere Verabreichung bevorzugt ist. Für medizinische Verwendungen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in pharmazeutische Dosisformen, die für die orale, topische oder parenterale Verabreichung geeignet sind, eingearbeitet, wie in Tabletten, Kapseln, Pastillen, gelartige Zubereitungen, Granulate, Pulver, Salben, Gele, flüssige Lösungen, Cremes, Lösungen für die Injektion, Suspensionen und ähnliche. Beispielsweise können die Zubereitungen der Dosisformen nach den allgemeinen Lehren von Remingston's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, hergestellt werden. Zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist der topische Weg im allgemeinen der geeignetste.
Die Dosiseinheit kann von 0,01 bis 99%, bevorzugt von 0,5 bis 80%, an aktivem Bestandteil enthalten. Die tägliche Dosis kann von verschiedenen Faktoren, wie von dem Körpergewicht, dem infizierenden Mikroorganismus, der Stärke der Infektion, dem Alter des Patienten, der Dauer und dem Weg der Verabreichung, abhängen. Im allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer täglichen Dosis im Bereich von etwa 2 mg bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht wirksam, gegebenenfalls unterteilt in eine oder mehrere Verabreichungen pro Tag. Insbesondere können die Salben, Cremes, Lösungen, Gele und Lotionen für die topische Verabreichung entweder einen hydrophilen oder hydrophoben Grundstoff enthalten, und bevorzugt enthalten sie von 0,1 bis 15 Gew.-% an aktivem Bestandteil. Die topischen Dosisformen können ebenfalls Sorptionsaktivatoren (vgl. beispielsweise: W.A. Ritschel und O.L. Sprockel, Drugs of Today, Bd. 24, S. 613-628, 1988) und Konservierungsmittel enthalten.
Offensichtlich sind die obigen Dosismengen nur beispielhaft, und die geeignetste Dosis kann in den speziellen Fällen und Anwendungen eingestellt werden, indem man sich auf biologische Prüfungen, die für die Bestimmung der Menge an aktiver Verbindung, die den gewünschten Effekt ergeben soll, nützlich ist, anlehnt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1 - A/16686-Faktor-A2-Aglycon

Zu einem Gemisch aus 10 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril werden Natriumiodid (50 mg) und A/16686-Faktor A2 (erhalten gemäß der US-PS 4 427 556) (1 g) zugegeben. Anschließend werden 2 ml Trimethylsilylchlorid zugegeben. Die Suspension wird klar. Nach dem Erwärmen bei 75ºC während 2 Stunden werden 90 mg Natriumiodid zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine weitere Stunde bei 75ºC erhitzt.
Nach dem Abkühlen wird Wasser zugegeben, der pH wird auf 4 mit NaHCO&sub3; eingestellt, und das Reaktionsgemisch wird mit Butanol dreimal extrahiert. Die Butanolschicht wird abgetrennt und im Vakuum eingedampft, während Toluol wiederholt zu der Lösung zugegeben wird. Der feste Rückstand (1,25 g) wird der präparativen HPLC unter Verwendung der folgenden Vorrichtung für jeden Teil aus 250 mg, gelöst in 5 ml eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (1:1, Vol./Vol.), unterworfen. Instrument: die Vorrichtung wird zusammengebaut, indem eine Waters-Pumpe, Mod. 590, ein Waters-Lambda-Max-Detektor, Mod. 481LC, eingestellt auf 254 nm, und ein Rheodyne-Injektor, ausgerüstet mit einer 5-ml-Schlaufe, verwendet werden.
Säule: LiChrosorb RP-18, 10 Mikron, 250 mm x 50 mm (Merck)
Mobile Phase: 0,05M HCOONH&sub4;/CH&sub3;CN (60:40)
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
Die Verfahren werden durch analytische HPLC verfolgt (vgl. Beispiel 4.1). Die Gruppen von Fraktionen, die an Antiotikum A/16686-Faktor- A2-Aglycon angereichert ist, wird abgetrennt und vereinigt.
Butanol wird zur Schaumverhinderung zugegeben, und die Lösungsmittel werden im Vakuum eingedampft. Der Rückstand (500 mg, 75% Titer) wird erneut durch präparate HPLC mit der gleichen Vorrichtung, wie oben beschrieben, gereinigt. Fünf Teile von 100 mg werden in 5 ml (jeder Teil) eines Gemiches aus Wasser und Acetonitril (1:1, Vol./Vol.) gelöst und unter Eluierung mit einem Gmeisch aus 0,05M HCOONH4/CH&sub3;CN, 62:38 (Vol./ Vol.), chromatographiert. Die Fraktionen, die die reine Komponente enthalten, werden vereinigt; die Lösungsmittel werden im Vakuum abgedampft, während wiederholt Butanol zugegeben wird, um einen Rest Butanollösung (100 ml) zu erhalten. Die Lösung wird mit einer gesättigten Wasserlösung aus NaCl (7 x 50 ml), bis kein restliches HCOONH&sub4; vorhanden ist, gewaschen. Die organische Phase wird im Vakuum auf ein Volumen von 20 ml konzentriert, und der Niederschlag wird abfiltriert und mit wenig Butanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden zur Trockene eingedampft. Zu dem festen Rückstand, gelöst in 4 ml Wasser, wird 10%ige HCl bis pH 3,5 zugegeben, und der gebildete Niederschlag wird mit einem Millipore -Filter abfiltriert. Die Lösung wird lyophilisiert, wobei 120 mg reines A/16686-Faktor-A2-Aglycon-Dihydrochlorid erhalten werden.

Beispiel 2 - A/16686-Faktor-A1-, -A2-, -A3-Aglycone

Eine Lösung aus 10 g A/16686-Komplex (erhalten gemäß der US-PS 4 303 646) in einem Geisch aus 180 ml wasserfreiem Dimethylformamid und 60 ml Butanol, enthaltend 2,3% (Gew./Vol.) HCl, wird bei 70 bis 75ºC (Badtemperatur) während 2 Stunden unter Rühren erhitzt. Nach dem Kühlen auf 0ºC wird der pH des Reaktionsgemisches mit festem NaHCO&sub3; auf 4 eingestellt. Dann wird filtriert, und das Butanol wird im Vakuum in einer Rotationsvorrichtung verdampft. Bei der Zugabe von Ethylether bildet sich ein Niederschlag. Nach dem Stehenlassen bei -15ºC über Nacht wird der Überstand entnommen, und die restlichen Lösungsmittel werden im Vakuum abgedampft. Der ölige Rückstand (6 g) wird mit 100 ml eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril, 1:1 (Vol./Vol.), gelöst und auf eine Chromatographie-Säule (600 mm x 65 mm), welche 800 g silanisiertes Silicagel (70 bis 230 mesh) (Merck) enthält und durch Aufschlämmung mit Methanol, Waschen mit 2 l Wasser, Konditionieren mit 2 l 2%igem wäßrigen HCOONH&sub4; und schließlich Waschen mit Wasser hergestellt worden ist, gegeben.
Wasser (1 l) wird durch die Säule geleitet. Danach wird 1%ige HCl (Gew./Vol.) (2 l) durchgeleitet. Schließlich wird die Säule nacheinander mit einem Gemisch aus 1%iger HCl/CH&sub3;CN, 90:10 (2 l); 1%iger HCl/CH&sub3;CN, 85:15 (2 l); und 1%iger HCl/CH&sub3;CN, 75:25 (2 l), eluiert. Fraktionen von je 30 ml werden gesammelt und durch analytische HPLC (vgl. Beispiel 4.1) geprüft. Die Gruppen von Fraktionen, welche die entsprechenden Aglycone von A/16686-Faktoren A1, -A2 und -A3 enthalten, werden vereinigt. Butanol wird zugegeben, und die Lösungsmittel werden im Vakuum zur Trockene abgedampft.
Der Teil, der das Faktor-A2-Aglycon enthält, wird in wenig Millilitern verdünnter HCl gelöst und lyophilisiert, wobei 1,05 g reines A/16686-Faktor-A2-Aglycon-Dihydrochlorid erhalten werden.
Der Teil, welcher das Faktor-A1-Aglycon (0,9g) enthält, wird in 30ml Wasser/Acetonitril-Gemisch (1:1) gelöst, und die Lösung wird auf eine Chromatographie-Säule, welche 800 g silanisiertes Silicagel 60 (Merck) enthält und wie oben hergestellt wurde, gegeben. Die Säule wird mit 1 l Wasser, dann mit 2 l 1%iger HCl und schließlich mit Gemischen aus 1%iger HCl/CH&sub3;CN der folgenden Verhältnisse: 90:10 (2 l ), 85:15 (1 l); 80:20 (1 l); 75:25 (1 l) eluiert.
Fraktionen von 30 ml werden gesammelt und durch analytische HPLC (vgl. Beispiel 4.1) geprüft. Die Fraktionen 250 bis 280, welche das Faktor- A1-Aglycon enthalten, werden vereinigt und nach der Zugabe von Butanol zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand (300 mg) wird durch semipräparative HPLC unter Verwendung der folgenden Vorrichtung für jeden Teil von 20 mg, gelöst in 2 ml eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (1:1), gereinigt. Instrument: Hewlett-Packard Flüssigkeits-Chromatograph, Mod. 1080, ausgerüstet mit einem UV-Detektor, der auf 254 nm eingestellt ist, und einem Rheodyne-Injektor mit einer 200-ul-Schleife.
Säule: Hibar LiChrosorb RP 8, 7 Mikron, 250 mm x 10 mm (Merck)
Mobile Phase: 0,05 M HCOONH&sub4;/CH&sub3;CN (55:45), pH 4
Strömungsgeschwindigkeit: 5,5 ml/min
Fraktionen, welche reines Faktor-A1-Aglycon enthalten) werden gesammelt, vereinigt und nach der Zugabe von Butanol im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert, bis kein HCOONH&sub4; mehr zurückbleibt. Der Rückstand wird in einigen Millilitern verdünnter HCl erneut gelöst und lyophilisiert, wobei 140 mg reines A/16686-Faktor-A1-Aglycon-Dihydrochlorid erhalten werden.
Die Fraktionen, welche Faktor-A3-Agiycon (0,08 g) enthalten, werden in 30 ml Wasser gelöst, und die Lösung wird auf eine Chromatographie-Säule gegeben, welche 800 g silanisiertes Silicagel 60 (Merck), hergestellt wie oben beschrieben, enthält. Die Lösung wird mit 1 l Wasser gewaschen und mit einem Gemisch aus 1%iger HCl/CH&sub3;CN, 75:25 (10 l), eluiert.
Fraktionen von 30 ml werden gesammelt und mittels HPLC geprüft. Die Fraktionen 191-230 werden vereinigt, und Butanol wird zugegeben. Die Lösungsmittel werden im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird entsalzt, in verdünnter HCl erneut gelöst und dann, wie für den Faktor A1 beschrieben, lyophillsiert, wobei 300 mg reines A/16686-Faktor-A3-Aglycon- Dihydrochlorid erhalten werden.

Beispiel 3 - A/16686-Tetrahydro-Faktor-A1-, -A2-, -A3-Aglycone

Eine Probe aus 10 g eines Gemisches aus A/16686-tetrahydrierten Faktoren A1, A2, A3, A'1,A'2 und A'3, erhalten gemäß der europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 119 001.1, wird 3 Stunden unter den Bedingungen von Beispiel 2 hydrolysiert. Das Reaktionsgemisch wird wie in Beispiel 2 aufgearbeitet, und die tetrahydrlerten Aglycone werden als Dihydrochloride gewonnen.

Beispiel 4 - Analytische Assays und physikalisch-chemische Charakterisierung

4.1. Analytische HPLC

Vorrichtung: Hewlett-Packard-Flüssigkeits-Chromatograph, Modell 1084 B, ausgerüstet mit einem UV-Detektor, der bei 254 nm eingestellt ist. Säule: Erbasil C-18, 10 Mikron, 250 mm x 4,6 mm (Carlo Erba).
Mobile Phase: A) 0,05M HCOONH&sub4;
B) CH&sub3;CN
Strömungsgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
Gradientenprofil: min 0 15 16 28 30
% B 38 38 55 55 38
Unter diesen Bedingungen sind die Retentionszeiten (tR) wie folgt:
tR (Minuten)
Antibiot ikum-A/16686-Faktor-A1-Aglycon 14,40 ( 6,82)
Antibiotikum-A/16686-Faktor-A2-Aglycon 19,33 ( 9,69)
Antibiotikum-A/16686-Faktor-A3-Aglycon 20,96 (12,85)
Die Werte für die entsprechenden di-mannosylierten Verbindungen sind in Klammern angegeben.
Antibiotikum-A/16686-Tetrahydro-Faktor-A1-Aglycon 17,40 ( 8,97; 10,66)
Antibiotikum-A/16686-Tetrahydro-Faktor-A2-Aglycon 20,38 (12,24; 15,33)
Antibiotikum-A/16686-Tetrahydro-Faktor-A3-Aglycon 20,65 (19,03; 20,55)
Die Werte für die entsprechenden di- und mono-mannosylierten Verbindungen sind in Klammern angegeben.

4.2 - Aminosäureanalyse und ¹H-NMR-Spektren

Die Säurehydrolyse wird mit den A/16686-Aglyconen mit 6N HCl bei 105 ºC während 20 Stunden durchgeführt. Das Gemisch der Aminosäuren wird durch Säulenchromatographie an einem stark sauren Sulfonsäuredivinylbenzol-Harz (Dowex 50 W) durch Eluierung mit wäßriger HCl mit steigenden Konzentrationen von 0,05N bis 2N getrennt.
Die Aminosäuren werden durch Vergleich mit authentischen Proben auf der Basis von ¹H-NMR und GC-MS identifiziert. Das Aminosäureverhältnis und ihre Sequenz in den intakten Molekülen werden durch NMR-Experimente bestimmt.
Alle Verbindungen zeigen die gleiche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz.
In der folgenden Tabelle III sind der Typ und die Zahl der Aminosäurereste in jedem der Aglycone aufgeführt. Tabelle III Aminosäure Zahl der Einheiten Threo-β-hydroxyasparaginsäure Asparaginsäure Allo-threonin Glycin Alanin 4-Hydroxyphenylglycin Leucin Phenylalanin 3-Chlor-4-hydroxyphenylglycin Ornithin
Zwei Äquivalente Ammoniak pro mol von jedem Aglycon werden in den entsprechenden Säurehydrolysegemischen mittels eines automatischen Aminosäureanalysators titriert, wodurch die Anzeichen für zwei primäre Amidgruppen gegeben sind. Außerdem übersteigt die Gesamtzahl der Stickstoffatome (19), die aus den ¹&sup5;N NMR-Versuchen folgt, um zwei die Zahl der Stickstoffatome, die an Peptidbindungen entsprechend der Zahl der Aminosäuren in dem Molekül (Tabelle III) beteiligt sind, und die Titration der Aglycone zeigt keine Anwesenheit von freien Carbonsäuregruppen. Diese Ueberlegungen beweisen, daß die zwei primären Amidgruppen an den Asparaginbzw. Threo-β-hydroxyasparaginsäure-Einheiten vorhanden sind.
Die ¹H-NMR-Spektren werden auf einem Bruker-AM-500-Spektrometer, der mit einem Aspect-3000-Computer ausgerüstet ist, bei 500 MHz aufgenommen. In der folgenden Tabelle IV sind die chemischen Verschiebungen (delta, ppm) des Antibiotikum-A/16686-Faktor-A2-Aglycons in D&sub2;O/DMSO, 4:1, bei pH 4,6, Temperatur: 40ºC, interner Standard: TMS (delta = 0,00 ppm) angegeben.
Figur 1 ist das ¹H-NMR-Spektrum des Faktor-A2-Aglycons. Die ¹H- NMR-Spektren der anderen Aglycone sind im wesentlichen identisch mit dem des Aglycons des Faktors A2, ausgenommen der Signale, die den Fettsäureketten zuzordnen sind, welche an die Asparagingruppierung gebunden sind. In allen Spektren fehlen die Signale, die den Zuckergruppierungen zuzuordnen sind. Die Spektren der Tetrahydro-Aglycone zeigen keine Resonanzsignale der vinylischen Protonen der Fettsäure-Seitenketten. TABELLE IV Aminosäure Andere Asparaginsäure β-Hydroxyasparaginsäure 4-Hydroxyphenylglycin Ornithin Threonin Phenylalanin Phenyl TABELLE IV (Fortsetzung) Aminosäure Andere Ornithin 4-Hydroxyphenylglycin Threonin Glycin Leucin Alanin 3-Chlor-4-hydroxyphenylglycin Fettsäure-Seitenkette: Phenyl

4.3 - Lactonring

Die Anwesenheit eines Lactonrings wird durch die Absorption bei 1760 cm&supmin;¹ in dem IR-Spektrum (vgl. bei Beispiel 4.4) belegt. Die Stellung der Lactonbindung wird sichergestellt durch:
a) Identifizierung der Aminosäure, die zu der Lactonbindung mit ihrer Carbonsäuregruppe bei trägt,
b) Identifizierung der Hydroxyaminosäure, die zu der Lactonbindung mit ihrer Hydroxylgruppe beiträgt.
Gemäß Stufe a) wird das Faktor-A2-Aglycon mit Ca(BH&sub4;)&sub2; reduziert, und dann wird mit konzentrierter HCl, wie in der schwebenden europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 119 001.1 beschrieben, hydrolysiert. Die Anwesenheit von 2-Amino-2-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)ethanol in dem Hydrolysat bestätigt die Stellung der Carbonsäuregruppierung, die die Lactonbindung in der Strukturformel I der Aglycone bildet.
Gemäß Stufe b) wird das Faktor-A2-Aglycon mit Phenylisocyanat umgesetzt, und dann wird, wie in der europäischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 88 119 001.1 beschrieben, hydrolysiert. Die konstante Menge an Hydroxyasparaginsäure gegenüber der Abnahme der anderen hydroxylierten Aminosäuren bestätigt die Stellung der Hydroxygruppe, die an der Lactonbindung in den Aglyconen der Strukturformel I teilnimmt.

4.4 - IR-Spektren

Das IR-Spektrum des faktor-A2-Aglycons, aufgenommen als Nujol- Mull mit einem Perkin-Elmer-Spektrophotometer, Modell 580, ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Es werden die folgenden Absorptionsmaxima beobachtet: 3700-3100 (ny NH und ny OH); 3020-2800 (Nujol); 1760 (ny C=O, Lacton); 1640 (ny C=0, Amid I); 1510 (delta NH, Amid II); 1460 und 1375 (Nujol); 1230 (ny C-O, Lacton); 840 und 815 cm&supmin;¹ (gamma, CH, aromatische Protonen).
Die Spektren der anderen Aglycone zeigen keine wesentlichen Untersch iede.

4.5 - UV-Spektren

Das Ultraviolettspektrum des Faktor-A2-Aglycons, aufgenommen in 0,IN HCl mit einem Perkin-Elmer-Spektrophotometer, Modell 320, ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Das Spektrum zeigt die folgenden Absorptionsmaxima: 233 nm (E 1%, 1 cm 206,7) und 271 nm (E 1%, 1 cm 109,3).
Die UV-Spektren der anderen ungesättigten Aglycone zeigen keine wesentlichen Unterschiede. Die Tetrahydro-Aglycone zeigen Absorptionsmaxima bei 232 und 275 nm.

4.6 - FAB-MS-Spektren

Die Fast Atom Bombardment-Massenspektren (FAB-MS) werden mit einem MS-50-TC-Instrument unter Verwendung von Glycerin als Matrix aufgenommen. Bombardiergas Xe; kinetische Energie 6 keV; Beschleunigungsspannung 8 kV. Das Isotop mit niedriger Masse der protonierten Molekularionen (MH&spplus;) zeigt Molekulargewichte von 2214,9 (Faktor-A1-Aglycon), 2228,9 (faktor-A2-Aglycon) und 2242,9 (faktor-A3-Aglycon). Die protonierten Molekularionen der Tetrahydro-Aglycone (MH&spplus;) zeigen Molekulargewichte von 2218,9, 2232,9 bzw. 2246,9. Diese Werte entsprechen innerhalb von 0,3 Dalton den theoretischen Werten und sind mit den zugeordneten Strukturen in Übereinstimmung.

4.7 - Elementaranalyse

Die Elementaranalyse ergibt die folgenden ungefähren Zusammensetzungen in Prozentgehalten: Faktor-A1-Aglycon Aschen % ** Gewichtsverlust % Tetrahydro-Faktor-A1-Aglycon * Die Probe wurde zuvor bei etwa 140ºC in inerter Atmosphäre getrocknet. ** Thermogravimetrische Analyse
Die Werte sind in Übereinstimung mit denen, die aus den entsprechenden Dihydrochloridsalzen berechnet wurden.

Beispiel 5 - Repräsentative Beispiele für Lotion, Lösung und Gel

5.1 - Lotion

Eine 2%ige (Gew./Gew.) hydroalkoholische Lotion wird mit den folgenden Bestandteilen (für 100 g der Lotion) zubereitet:
Faktor-A2-Aglycon 2,00 g
90%ige Milchsäurelösung (Gew./Gew.) 0,107 g
10%ige Natriumhydroxidlösung (Gew./Gew.)
bis pH 4
96% Ethanol
gleiche Anteile zu 100 g
gereinigtes Wasser BP

5.2 - Lösung

Ampullen, welche gefriergetrocknetes Pulver für die Rekonstitution in normaler Salzlösung unter Bildung einer Lösung für Wundinfektionen oder in einem hydroalkoholischen Träger unter Bildung von Lotionen für die topische Verwendung enthalten, werden hergestellt, indem 10 mg, 25 mg, 50 mg bzw. 100 mg aktives Aglycon in 1 bis 2 ml gereinigtem Wasser BP gelöst werden, die Ampullen gefüllt und auf einen Rest-Feuchtigkeitsgehalt von etwa 2% gefriergetrocknet werden.

5.3 - Gel

Ein Gel für die topische form wird mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Aktives Aglycon 2,00 g
90%ige Milchsäurelösung (Gew./Gew.) 0,55 g
Methocel 3,00 g
Ethanol 96%
bis zu 100 g
gereinigtes Wasser BP
10%ige Natriumhydroxidlösung (Gew./Gew.) bis pH 4,0
Das aktive Aglycon wird in gereinigtem Wasser gelöst, dann wird filtriert, und dann werden die Lösung und die Milchsäure bei 25ºC zu einer Methoceldispersion in dem verbleibenden Wasser zugegeben. Nach der Zugabe des Ethanols und dem Mischen für die vollständige Disperson wird der pH- Wert auf 4,0 durch Zugabe von 10%igem Natriumhydroxid eingestellt.

Claims

1. Verbindungen der Formel I:

worin

R -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; und die entsprechenden tetrahydrierten Gruppen bedeutet, und die Säureadditionssalze davon und ihre Gemische in irgendeinem Verhältnis.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin

R -CO-CH=CH-CH--CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; bedeutet, und die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze davon.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R eine tetrahydrierte Gruppe der Formel:

-CO(CH&sub2;)&sub6;-CH&sub3;, -CO(CH&sub2;)&sub5;CH(CH&sub3;)&sub2; oder -CO(CH&sub2;)&sub6;CH(CH&sub3;)&sub2;

bedeutet, und die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze davon.

4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I:

worin

R -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;,

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; und die entsprechenden tetrahydrierten Gruppen bedeutet, und der Säureadditionssalze davon und ihrer Gemische in irgendeinem Verhältnis, dadurch gekennzeichnet, daß ein Ausgangsmaterial, ausgewählt aus Antibiotikum A/16686-Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2, A'3, einem Gemisch aus zwei oder mehreren davon, ihren entsprechenden Tetrahydroderivaten oder einem Gemisch aus zwei oder mehreren davon in Form der freien Verbindungen, oder ein Säureadditionssalz davon der selektiven Hydrolyse unterworfen wird und, wenn ein Gemisch aus zwei oder mehreren Verbindungen als Ausgangsmaterial verwendet wird und eine reine Komponente der Formel I gewünscht wird, das entstehende Reaktionsprodukt in die einzelnen Komponenten nach an sich bekannten Verfahren getrennt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die selektive Hydrolyse durchgeführt wird, indem das Ausgangsmaterial entweder mit

a) Trimethylsilyliodid oder Trimethylsilylchlorid in Anwesenheit von Natriumiodid, gefolgt von der Hydrolyse bei milden Bedingungen des so erhaltenen Trimethylsilylderivats,

oder

b) einer starken Säure in Anwesenheit eines niedrigen Alkanols oder eines Gemisches von niedrigen Alkanolen bei wasserfreien Bedingungen in Kontakt gebracht wird.

6. Verfahren gemäß Stufe a) von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Anwesenheit eines aprotischen organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen 10ºC und 100ºC, bevorzugt zwischen 20ºC und 80ºC, durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Überschuß aus Trimethylsilylchlorid in Anwesenheit von 0,01 bis 1 mol Natriumiodid für jedes mol Trimethylsilylchlorid verwendet wird und daß das aprotische organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus chlorierten niedrigen Kohlenwasserstoffen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril und ihren Gemischen.

8. Verfahren nach Ansprch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an verwendetem Trimethylsilylchlorid 1 bis 3 ml für jedes Gramm des Ausgangsmaterials beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse bei milden Bedingungen des so erhaltenen Trimethylsilylderivats durchgeführt wird, indem mit Wasser, einem niedrigen Alkanol oder einem Gemisch davon bei einer Temperatur von 0ºC bis Raumtemperatur bei einem pH zwischen 3 und 5 behandelt wird.

10. Verfahren gemäß Stufe b) von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Anwesenheit eines organischen polaren Lösungsmittels durchgeführt wird, die starke Mineralsäure ausgewählt wird aus starken Mineralsäuren, starken Arylsulfonsäuren, starken Alkylsulfonsäuren, ihren halogenierten Derivaten und einem getrockneten Kationenaustauschharz in Säureform, und daß als niedriges Alkanol C&sub1;-C&sub6;-Alkanol, bevorzugt Butanol, verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als starke Säure Chlorwasserstoffsäure verwendet wird, das Reaktions-Lösungsmittel ausgewählt wird aus Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder einem Überschuß des gleichen niedrigen Alkanols oder einem Gemisch davon, und daß die Reaktionstemperatur zwischen 15ºC und 80ºC gehalten wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial ein Gemisch aus zwei oder mehreren Faktoren A1, A2, A3, A'1, A'2, A'3 oder ihren Tetrahydroderivaten ist und daß die Trennung des entstehenden Hydrolyseprodukts bevorzugt unter Verwendung von Säulenchromatographie- oder präparativen HPLC-Verfahren erfolgt

13. Verbindung nach Anspruch 1 für die Verwendung als Arzneimittel.

14. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines antibakteriellen Arzneimittels.

15. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines antibakteriellen Arzneimittels für die topische Behandlung von Wundinfektionen oder Akne.

16. Topische pharmazeutische Zubereitung für die Behandlung von Wundinfektionen oder Akne, die eine antibakteriell wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 enthält.