CN1046938A - Ws7622a、b、c和d物质及其衍生物、制备方法及应用 - Google Patents

Ws7622a、b、c和d物质及其衍生物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有抑制人类白细胞弹性蛋白酶活性的新的WS7622A、B、C和D物质、其衍生物及其可药用盐，涉及其制备方法和含有它们的药物组合物及其使用方法。

Description

本发明涉及新的WS7622A、B、C和D物质及其衍生物。
更具体地说，本发明涉及具有抑制人类白细胞弹性蛋白酶活性的新的WS7622A、B、C和D物质、其衍生物及其可药用的盐，它们的制备方法和含有它们的药物组合物及其使用方法。
在营养培养基中培养产生WS7622A、B、C和D物质的链霉菌属（Streptomyces）菌株，即可生产WS7622A、B、C和D物质。
微生物
可用来生产WS7622A、B、C和D物质的微生物是一种产生WS7622A、B、C和D物质的菌株，它属于链霉菌属，其中拒霉素链霉菌（Streptomyces        resistomycificus）7622已新近从采自日本福岛县广野区的土样中分离出来。
新近分离的拒霉素链霉菌7622的冻干样品按照《布达佩斯条约》首次保藏在国际性保藏机构工业科技署发酵研究所（日本305，茨城县筑波市东1区1-3号），其登记号为FERM        BP-2306（保藏日：1989年2月23日），称为链霉菌第7622号种，因此此菌株被称为拒霉素链霉菌7622。
应该理解，新的WS7622A、B、C和D物质的生产并不仅限于使用此处所述的特定微生物，该微生物仅仅用于举例说明。本发明还包括使用能够产生WS7622A、B、C和D物质的任何突变株，包括天然突变株和人工突变株，人工突变株可以由所述菌株通过常规手段得到，这些手段有例如X光照射、紫外辐射、用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和2-氨基嘌呤处理等。
拒霉素链霉菌7622具有下列形态学、培养、生物学和生理学特征。
（1）形态特征：
应用Shirling和Gottlieb1）所述的方法进行这项分类研究。
用光学显微镜和电子显微镜对在燕麦粉琼脂、酵母膏-麦芽汁琼脂和无机盐-淀粉琼脂上于30℃下培养14天的培养物进行形态观察。
营养菌丝体发育良好，没有断裂现象。气生菌丝体总状分枝而形成螺旋状孢子链和易曲竖直孢子链，每链有30多个孢子。孢子表面光滑且为卵形，大小为0.7-0.9×0.8-1.1μm。未观察到硬颗粒、孢子囊和游动孢子。
（2）培养特征：
在Shirling和Gottlieb（前面已提到）及Waksman2）所述的10种培养基上观察培养特征。
培养过程在30℃下进行21天。本研究中所用的颜色名称取自Methuen颜色手册（Handbook of Colour3））。结果示于表1。
表1        7622号菌株的培养特征
培养基        培养特征
酵母膏-麦芽汁琼脂        G：良好
A：中等，蓝灰色（22E2）
R：褐色（6F4）
S：无
燕麦粉琼脂        G：良好
A：中等，蓝灰色（22D2）
R：褐色（6F6）
S：无
无机盐-淀粉琼脂        G：良好
A：丰富，褐灰色（7E2）
R：紫褐色（11F6）
S：无
甘油-天冬酰胺琼脂        G：良好
A：丰富，褐灰色（6E2）
R：灰橙色（5B5）
S：无
蛋白胨-酵母膏-铁琼脂        G：中等
A：无
R：褐色（6F6）
S：深褐色
酪氨酸琼脂        G：良好
A：差，青绿灰色（24E2）
R：深褐色（7F8）
S：无
葡萄糖-天冬酰胺琼脂        G：中等
A：无
R：黄白色（4A2）
S：无
营养琼脂        G：差
A：无
R：黄白色（4A2）
S：无
本奈特琼脂        G：良好
A：差，蓝灰色（22E3）
R：褐橙色（5C5）
S：无
蔗糖-硝酸盐琼脂        G：良好
A：无
R：灰洋红色（13D4）
S：无
缩写：G＝生长;A＝气生菌丝体;
R＝反面颜色;S＝可溶性色素。
气生菌丝体为蓝灰色至褐灰色。培养物的反面在酵母膏-麦芽汁琼脂和燕麦粉琼脂上为褐色，在无机盐-淀粉琼脂上为紫褐色，在蔗糖-硝酸盐琼脂上为灰洋红色。产生类黑色素，但不产生其他可溶性色素。
（3）细胞壁类型：
用Becker等人4）和Yamaguchi5）的方法进行细胞壁分析。
7622号菌株的全细胞水解液分析表明有LL-二氨基庚二酸存在。因此该菌株的细胞壁被分类为Ⅰ型。
（4）生物学和生理性质：
生理性质和碳源的利用分别示于表2和表3。
利用温度梯度培养箱TN-3（Advantec        Toyo        Co.，Ltd制造）在酵母膏-麦芽汁琼脂上测定生长的温度范围。
按Pridham和Gottlieb6）的方法检查碳源的利用。
表2        7622号菌株的生理性质
条件        特征
生长的温度范围        12°-34℃
最适生长温度        27℃
明胶液化        阳性
牛奶凝固作用        阴性
牛奶胨化作用        阳性
淀粉水解        阳性
类黑色素产生        阳性
纤维素分解        阴性
NaCl耐量        ＞3%而＜4%
表3        7622号菌株的碳利用
化合物        生长
D-葡萄糖        +
蔗糖        +
D-木糖        ±
D-果糖        +
L-鼠李糖        +
棉子糖        -
L-阿拉伯糖        +
肌醇        +
甘露醇        +
+：利用
±：可疑利用
-：不利用
基于上述形态和生理特征，7622号菌株被认为是属于链霉菌属7）。
这样，便将7622号菌株与文献8-12）中所述的链霉菌物种作比较。结果发现，该菌株与拒霉素链霉菌IF012814在细节上十分相象。还发现这两个菌株的性质除几点差异外几乎完全相同。
表4给出了这两个菌株间的差异。
表4        7622号菌株与拒霉素
链霉素IFO12814间的差异
条件        特征
IFO12814        7622号菌株
在蔗糖-硝酸盐琼脂上生长        差        良好
蔗糖利用        不利用        利用
生长的温度范围        14-37℃        12-34℃
NaCl耐量        ＞4%而＜6%        ＞3%而＜4%
可恰当地认为这些差异很小，不能认为7622号菌株是不同的种。
因此，我们将该菌株鉴定为拒霉素链霉菌并将其命名为拒霉素链霉菌7622。
1）Shirling，E.B.and        D.Gottlieb：Methods        for        characterization        of        Streptomyces        species.
International        Journal        of        Systematic        Bacteriology，16，313-340，1966
2）Waksman，S.A.：The        actinomycetes        Vol.2：Classification，identification        and        description        of        genera        and        species：The        Williams        and        Wilkins        Co.，Baltimore，1961
3）Kornerup，A.and        J.H.Wanscher：Methuen        Handbook        of        Colour，Methuen，London，1978
4）Becker，B.，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon        and        H.A.Lechevalier：Rapid        differentiation        between        Nocardia        and        Streptomyces        by        paper        chromatography        of        whole-cell        hydrolysates：Appl.Microbiol.12，421-423，1964
5）Yamaguchi，T.：Comparison        of        the        cell        wall        composition        of        morphologically        distinct        actinomycetes：J.Bacteriol.89，444-453，1965
6）Pridham，T.G.and        D.Gottlieb：The        utilization        of        carbon        compounds        by        some        Actinomycetales        as        an        aid        for        species        determination：J.Bacteriol.56：107-114，1948
7）Buchanan，R.E.and        N.E.Gibbons：Bergey′s        Manual        of        Determinative        Bacteriology，8th        edition：The        Williams        and        Wilkins        Co.，Baltimore，1974
8）Shirling，E.B.and        D.Gottlieb：Cooperative        description        of        type        culture        of        Streptomyces.2.Species        descriptions        from        first        study.Intern.J.Syst.Bacteriol.18：69-189，1968
9）Shirling，E.B.and        D.Gottlieb：Cooperative        description        of        type        culture        of        Streptomyces.3.Additional        species        descriptions        from        first        and        second        studies.Intern.J.Syst.Bacteriol.18：279-392，1968
10）Shirling，E.B.and        D.Gottlieb：Cooperative        description        of        type        culture        of        Streptomyces.4.Species        descriptions        from        the        second，third        and        forth        studies.Intern.J.Syst.Bacteriol.19：391-512，1969
11）Skelman，V.B.D.;V.McGowan        &        P.H.A.Sneath：Approved        list        of        bacterial        names.Intern.J.Syst.Bacteriol.30：225-420，1980
12）Moore，W.E.C.，E.P.Cato        &        L.V.H.Moore：Index        of        Bacterial        and        Yeast        Nomenclatural        Changes        Published        in        the        I.J.S.B.Since        the        1980        Approved        Lists        of        Bacterial        Names.Intern.J.Syst.Bacteriol.35：382-407，1985
WS7622A、B、C和D物质
如果在有氧条件（如振荡培养、深层培养等）下，在含有可同化的碳源和氮源的营养培养基中，培养属于链霉菌属的产生WS7622A、B、C和D物质的菌株，即产生WS7622A、B、C和D物质。培养基可以是合成的、半合成的或天然的。
优选的碳源可以是葡萄糖、甘露糖、甘油、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等;优选的氮源可以是肉膏、酪蛋白水解物、胨、谷蛋白粉、玉米粉、棉子粉、大豆粉、玉米浸液、干酵母、磷酸铵、硫酸铵、尿素等。还可以掺入无机盐如金属的磷酸盐、盐酸盐和其他盐，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锌、氯化锰、氯化镁等。如果在发酵过程中遇到大量发泡，则可加入适当量的消泡剂，例如植物油（如豆油、亚麻子油等）、高级醇类（如十八烷醇）。
发酵过程最好在30℃左右进行50至200小时。
最适的一组发酵条件根据所用微生物菌株的特征从上述发酵条件中选择。
由于在培养液中产生的大部分WS7622A、B、C和D物质存在于细胞内，所以首先将培养液过滤。在所得的菌丝体饼中加入适当的溶剂如丙酮，然后利用通常在抗生素生产中常用的方法从所得混合物中分离纯化出所要的化合物。例如，可以使用这样一些方法如减压浓缩、冰冻干燥、溶剂萃取、pH调节、用阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、非离子型吸附树脂等处理、用吸附剂如活性碳、硅酸、硅胶或氧化铝等处理、结晶、重结晶，它们可被单独使用或视需要结合起来使用。
可以从培养液中分离出WS7622的各成分即A、B、C和D，例如采用下列高效液相色谱数据：
柱：Yamamura        Chemical        Institute，Kyoto，
A-302（ODS        6ψ×150mm）
流动相：CH3OH-CH2CN-0.3%磷酸水溶液（10∶1∶10）
检测：210nm
流速：1ml/分钟
保留时间（分）：WS7622A：6.93
WS7622B：10.08
WS7622C：5.30
WS7622D：4.38
在培养液中产生的WS7622A、B、C和D物质可以以其游离形式分离出来，如果需要，也可以以可药用盐的形式分离出来。如果以可药用盐的形式分离这些物质，则用碱或酸处理从菌丝体萃取液中得到的所需化合物，从而可得到WS7622A、B、C和D各自的相应盐。可用的碱有无机碱如碱金属化合物（如氢氧化钠、氢氧化钾等）、碱土金属化合物（如氢氧化钙、氢氧化镁等）;无机碱如氨等;有机碱如三乙胺、二环己胺等。可用的酸有无机酸如盐酸、硫酸、磷酸等;或有机酸如甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、草酸等。
所得到的WS7622A、B、C和D物质各自的盐都可以以常规方式重新转化成游离的WS7622A、B、C和D物质。
（1）WS7622A物质：
WS7622A物质是一种新物质，具有下列物化性质。
WS7622A物质的物化性质：
外观：无色棱柱体
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气
阴性：茚三酮、莫里斯氏反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、正丁醇
微溶：氯仿、丙酮、乙酸乙酯
不溶：水、正己烷
薄层色谱（TLC）：
氯仿-甲醇（5∶1，v/v） Rf0.51
丙酮-甲醇（10∶1）        0.62
（Kiesel        Gel        60        F254硅胶板，Merck）
熔点：250-252℃（分解）
旋光率：[α]23 D+36°（c＝1.0，MeOH）
紫外光谱：λMeOH max287nm（ε＝3600）
λMeOH-HCl max287nm
λMeOH-NaOH max298nm
分子式：C47H63N9O13
元素分析：
计算值（C47H63N9O13·2H2O）;C 56.56，H 6.77，N 12.63%
实测值;C        56.65，H        6.62，N        12.27%
分子量：FAB-MS m/z 984（M+Na）+
红外吸收光谱（附图1）：
νKBr max3400，3300，3060，2980，2940，1735，1710，
1690，1670，1660，1640，1540，1520，1470，
1380，1330，1300，1260，1220，1200，1160，
1130，1090，1000，980，940，920cm-1
1H核磁共振谱（附图2）：
（400MHz，CD3OD）δ
7.22-7.09        （3H，m）
6.88-6.77        （3H，m）
6.74        （1H，s）
6.46        （1H，s）
5.46        （1H，m）
5.18        （1H，s）
4.85        （1H，s）
4.77        （1H，m）
4.65        （1H，m）
4.50        （1H，m）
3.96        （1H，m）
3.91        （1H，d，J＝9Hz）
3.60-3.47        （2H，m）
3.03        （1H，m）
2.90        （3H，s）
2.86        （1H，m）
2.59-2.49        （2H，m）
2.39        （1H，m）
2.29-2.16        （2H，m）
2.00        （1H，m）
1.84        （1H，m）
1.74        （3H，d，J＝6Hz）
1.72-1.53（4H，m）
1.44        （3H，d，J＝6Hz）
1.12        （1H，m）
1.10        （6H，d，J＝6Hz）
0.99        （3H，d，J＝6Hz）
0.94        （3H，d，J＝6Hz）.
13C核磁共振谱（附图3）：
（100MHz，CD3OD）δ
179.7        （s）
176.3        （s）
174.7        （s）
173.3        （s）
172.4        （s）
171.4        （s）
170.3        （s）
165.8        （s）
160.2        （s）
145.7        （s）
145.6        （s）
137.5        （s）
134.0        （d）
131.4        （s）
130.6        （d）        x        2
129.8        （s）
129.1        （d）        x        2
129.1        （s）
127.6        （d）
119.1        （d）
118.0        （d）
76.0        （d）
73.4        （d）
63.1        （d）
61.4        （d）
57.1        （d）
53.6        （d）
52.7        （d）
50.5        （d）
39.9        （t）
36.1        （t）
35.8        （d）
31.8        （q）
31.0        （t）
30.8        （d）
29.9        （t）
29.7        （t）
25.2        （t）
22.3        （t）
20.2        （q）
20.0        （q）        x        2
19.7        （q）
19.5        （q）
13.3        （q）
（2）WS7622B物质：
WS7622B物质是一种新物质，具有下列物化性质。
WS7622B物质的物化性质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气、氯化铁
阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、正丁醇
微溶：氯仿、丙酮
不溶：水、正己烷
薄层色谱（TLC）：
氯仿-甲醇（5∶1，v/v） Rf0.55
（Kiesel        Gel        60        F254硅胶板，Merck）
熔点：248-250℃（分解）
旋光率：[α]23 D+39°（C＝1.0，MeOH）
紫外光谱：λMeOH max287nm（ε＝3800）
λMeOH-HCl max287nm
λMeOH-NaOH max299nm
分子式：C48H65N9O13
元素分析：
计算值（C48H65N9O13·3H2O）;C 55.96，H 6.95，N 12.24%
实测值;C        55.84，H        7.05，N        12.12%
分子量：FAB-MS m/z 998（M+Na）+
红外吸收光谱（附图4）：
νKBr max3400，3300，2960，1735，1680，1660，1640，
1540，1520，1460，1400，1380，1330，1290，
1250，1200，1180，1150，1130，1080，1050，
1000，980，940，920cm-1
1H核磁共振谱（附图5）：
（400MHz，DMSO-d6）δ
9.48        （1H，宽        s）
9.03        （1H，宽        s）
8.76        （1H，宽        s）
8.30        （1H，宽        d，J＝6Hz）
7.77        （1H，d，J＝7Hz）
7.21        （1H，d，J＝8Hz）
7.20-7.11        （3H，m）
6.97        （1H，宽        d，J＝7Hz）
6.80        （2H，d，J＝8Hz）
6.72        （1H，宽        s）
6.67        （1H，s）
6.63        （1H，q，J＝7Hz）
6.37        （1H，s）
5.48        （1H，m）
5.40        （1H，m）
5.09        （1H，m）
4.77        （1H，m）
4.64        （1H，m）
4.38        （1H，m）
4.31        （1H，m）
3.87-3.80        （2H，m）
3.40-3.30        （2H，m）
2.95        （1H，m）
2.79        （3H，s）
2.65        （1H，m）
2.40-2.20        （4H，m）
2.00        （1H，m）
1.87        （1H，m）
1.73        （1H，m）
1.65        （3H，d，J＝7Hz）
1.65-1.40        （5H，m）
1.32        （3H，d，J＝6Hz）
1.27        （1H，m）
0.97        （3H，d，J＝6Hz）
0.97        （1H，m）
0.91        （3H，d，J＝6Hz）
0.88        （3H，d，J＝6Hz）
0.81        （3H，t，J＝7Hz）
13C核磁共振谱（附图6）：
（100MHz，DMSO-d6）δ
175.6        （s）
174.8        （s）
172.0        （s）
170.9        （s）
170.6        （s）
170.3        （s）
168.7        （s）
162.5        （s）
157.4        （s）
144.2        （s）
144.2        （s）
136.5        （s）
131.1        （d）
130.7        （s）
129.6        （d）        x        2
128.4        （s）
127.9        （d）        x        2
127.8        （s）
126.4        （d）
118.9        （d）
116.8        （d）
74.2        （d）
72.1        （d）
61.0        （d）
59.8        （d）
55.2        （d）
51.6        （d）
50.8        （d）
48.6        （d）
40.9        （d）
38.2        （t）
35.0        （t）
30.8        （q）
29.8        （t）
28.8        （d）
28.4        （t）
28.1        （t）
27.1        （t）
23.3        （t）
21.2        （t）
19.6        （q）
19.1        （q）
19.0        （q）
17.7        （q）
12.9        （q）
11.9        （q）
（3）WS7622C物质：
WS7622C物质是一种新物质，具有下列物化性质。
WS7622C物质的物化性质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气、氯化铁
阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇
微溶：氯仿、丙酮、乙酸乙酯
不溶：水、正己烷
薄层色谱（TLC）：
氯仿-甲醇（4∶1，v/v） Rf0.56
（Kiesel        Gel        60        F254硅胶板，Merck）
熔点：250-252℃（分解）
旋光率：[α]23 D+36°（C＝0.5，MeOH）
紫外光谱：λMeOH max287nm（ε＝3500）
λMeOH-HCl max287nm
λMeOH-NaOH max298nm
分子式：C46H61N9O13
元素分析：
计算值（C46H61N9O13·6H2O）;C 52.31，H 6.97，N 11.94%
实测值;C        51.95，H        6.66，N        11.77%
分子量：FAB-MS m/z 970（M+Na）+
红外吸收光谱（附图7）：
νKBr max3400，3300，2980，1740，1700，1660，1640，
1540，1470，1450，1410，1335，1260，1230，
1200，1160，1140，1070，1010，980，940，
920，880cm-1
1H核磁共振谱（附图8）：
（400MHz，CD3OD）δ
7.21-7.10        （3H，m）
6.86-6.77        （3H，m）
6.75        （1H，s）
6.47        （1H，s）
5.46        （1H，m）
5.18        （1H，m）
4.85        （1H，s）
4.74        （1H，m）
4.65        （1H，m）
4.51        （1H，m）
3.94        （1H，m）
3.90        （1H，d，J＝10Hz）
3.58-3.46        （2H，m）
3.02        （1H，m）
2.90        （3H，s）
2.86        （1H，m）
2.55        （1H，m）
2.38        （1H，dd，J＝14和11Hz）
2.28        （2H，q，J＝7Hz）
2.30-2.16        （2H，m）
1.99        （1H，m）
1.84        （1H，m）
1.75        （3H，d，J＝7Hz）
1.78-1.54        （4H，m）
1.44        （3H，d，J＝6.5Hz）
1.13        （3H，t，J＝7Hz）
1.12        （1H，m）
1.01        （3H，d，J＝6.5Hz）
0.97        （3H，d，J＝6.5Hz）
13C核磁共振谱（附图9）：
（100MHz，CD3OD）δ
176.7        （s）
176.4        （s）
174.7        （s）
173.4        （s）
172.5        （s）
171.4        （s）
170.4        （s）
165.8        （s）
160.4        （s）
145.8        （s）
145.7        （s）
137.5        （s）
134.0        （d）
131.4        （s）
130.6        （d）        x        2
129.8        （s）
129.1        （d）        x        2
129.1        （s）
127.7        （d）
119.1        （d）
118.0        （d）
76.0        （d）
73.5        （d）
63.1        （d）
61.4        （d）
57.1        （d）
53.7        （d）
52.7        （d）
50.5        （d）
39.9        （t）
36.1        （t）
31.8        （q）
31.0        （t）
30.8        （d）
29.9        （t）
29.7        （t）
29.7        （t）
25.3        （t）
22.3        （t）
20.2        （q）
19.4        （q）
19.4        （q）
13.3        （q）
10.3        （q）
（4）WS7622D物质：
WS7622D物质是一种新物质，具有下列物化性质。
WS7622D物质的物化性质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气、氯化铁
阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇
微溶：水、氯仿
不溶：正己烷
薄层色谱（TLC）：
氯仿-甲醇（4∶1，v/v） Rf0.45
（Kiesel        gel        60        F254硅胶板，Merck）
熔点：250-252℃（分解）
旋光率：[α]24 D+35.8°（C＝0.5，MeOH）
紫外光谱：λMeOH max287nm（ε＝3640）
λMeOH-HCl max287nm
λMeOH-NaOH max298nm
分子式：C45H59N9O13
元素分析：
计算值（C45H59N9O13·6H2O）;C 51.86，H 6.87，N 12.10%
实测值;C        51.90，H        6.26，N        12.08%
分子量：FAB-MS m/z 956（M+Na）+
红外吸收光谱（附图10）：
νKBr max3360，2950，1730，1700，1680，1660，1640，
1530，1460，1380，1330，1290，1250，1200，
1170，1160，1140，1080，980，940，920，
880cm-1
1H核磁共振谱（附图11）：
（400MHz，CD3OD）δ
7.20-7.10        （3H，m）
6.85-6.77        （3H，m）
6.73        （1H，s）
6.46        （1H，s）
5.46        （1H，m）
5.18        （1H，m）
4.84        （1H，s）
4.73        （1H，m）
4.64        （1H，m）
4.50        （1H，m）
3.99-3.87        （2H，m）
3.58-3.46        （2H，m）
3.01        （1H，m）
2.90        （3H，s）
2.87        （1H，m）
2.53        （1H，m）
2.38        （1H，dd，J＝14和11Hz）
2.30-2.16        （2H，m）
2.00        （1H，m）
1.99        （3H，s）
1.84        （1H，m）
1.75        （3H，d，J＝7Hz）
1.76-1.55        （4H，m）
1.43        （3H，d，J＝6.5Hz）
1.15        （1H，m）
1.00        （3H，d，J＝6.5Hz）
0.95        （3H，d，J＝6.5Hz）
13C核磁共振谱（附图12）：
（100MHz，CD3OD）δ
176.4        （s）
174.6        （s）
173.4        （s）
173.0        （s）
172.4        （s）
171.4        （s）
170.4        （s）
165.8        （s）
160.3        （s）
145.9        （s）
145.9        （s）
137.5        （s）
134.0        （d）
131.4        （s）
130.6        （d）        x        2
129.8        （s）
129.1        （d）        x        2
129.1        （s）
127.6        （d）
119.0        （d）
118.0        （d）
76.0        （d）
73.5        （d）
63.1        （d）
61.3        （d）
57.1        （d）
53.9        （d）
52.7        （d）
50.5        （d）
39.9        （t）
36.1        （t）
31.8        （q）
31.0        （t）
30.7        （d）
29.9        （t）
29.6        （t）
25.3        （t）
22.4        （q）
22.3        （t）
20.2        （q）
19.5        （q）
19.4        （q）
13.3        （q）
WS7622A物质的衍生物
本发明的WS7622A物质的衍生物可由下式（1）表示：
其中R1和R2各为低级烷基或低级链烷酰基。
低级烷基指含有1至6个碳原子的烷基，低级烷基的优选实例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。
低级链烷酰基指含有1至6个碳原子的链烷酰基，低级链烷酰基的优选实例为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基等。
WS7622A物质（1）的衍生物可用下列方法制备：
（1）方法1（WS7622A物质的烷基化）：
Figure 901013099_IMG4
二烷基化的WS7622A物质（Ⅰa）或其盐可以通过使WS7622A物质（Ⅱ）或其盐与烷化剂反应来制备。
化合物（Ⅰa）和（Ⅱ）的盐的优选实例可包括作为WS7622A、B、C和D物质的可药用盐列举的那些化合物及其衍生物。
烷化剂的优选实例可包括重氮烷（如重氮甲烷、重氮乙烷等）、烷基卤（如甲基碘、乙基碘等）、硫酸二烷基酯（如硫酸二甲酯等）等。
该反应最好在室温下在对该反应为惰性的溶剂如醇类（如甲醇、乙醇、丙醇等）、氯仿或其混合物中进行。
在一些情况下，该反应最好在常规的碱存在下进行。
（2）方法2（WS7622A物质的酰化）：
Figure 901013099_IMG5
二酰基化的WS7622A物质（Ⅰb）或其盐可以通过使WS7622A物质（Ⅱ）或其盐与下式的化合物或其活性衍生物反应来制备：
R-OH
其中R为低级链烷酰基。
化合物（Ⅰb）和（Ⅱ）的盐的优选实例可包括作为WS7622A、B、C和D物质的可药用盐所列举的那些化合物及其衍生物。
所述活性衍生物可包括酰卤、酰基叠氮、酸酐、活性酰胺、活性酯等。
当使用游离羧酸（即式R-OH化合物）时，该反应最好在常规缩合剂存在下进行。
该反应最好在冰冷或室温下在常规溶剂如醇（如甲醇、乙醇、丙醇等）中进行，如果该反应在碱如吡啶存在下进行，则多数情况下都能得到良好的结果。这样一种液态的碱还可以作为溶剂。
WS7622A、B、C和D各物质的可药用盐及其衍生物可包括与无机碱或有机碱形成的盐，如碱金属盐（如钠盐、钾盐等）、碱土金属盐（如钙盐等）、铵盐、乙醇胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐等;以及与有机酸或无机酸形成的酸加成盐，如甲磺酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等。
WS7622A、B、C和D物质，其衍生物和其可药用盐具有抑制人类白细胞弹性蛋白酶的活性，因而可用作人类白细胞弹性蛋白酶抑制剂治疗变性疾病，例如肺气肿、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症等。
为了说明WS7622A、B、C和D物质，其衍生物及其可药用盐的有用性，以下给出它们的药理试验数据。
蛋白酶抑制试验：
（1）粗制人类白细胞弹性蛋白酶的制备：
从健康志愿者体内取50毫升血。用Mono-Poly分离介质（FLOW Laboratories，Australia）从血中分离白细胞并离心收集。在沉淀物中加入蒸馏水使留下的红细胞溶解，并以3000rpm离心30分钟。向所得的沉淀物中加入10ml 2M NaClO4提取弹性蛋白酶。于0℃下提取120分钟后，通过离心得到含有弹性蛋白酶活性的上清液。于此上清液中加入等体积的氯仿并剧烈振荡，然后分离出含有弹性蛋白酶活性的清澈上清液。于上清液中加入10ml HEPES缓冲液，供进行酶测定。
（2）方法
整个试验中所用的缓冲液为含0.5M NaCl的0.1M HEPES（N-（2-羟乙基）哌嗪-N′-2-乙磺酸）（pH7.5）。在96孔微量滴定板的各小孔中混合25微升2mM甲氧基琥珀酰-（Ala）2-Pro-Val-对硝基苯胺（用缓冲液稀释100mM二甲亚砜溶液）和50微升样品（有机溶剂中的样品10微升用缓冲液稀释5倍）。用微板测量仪（microplate reader，Corona Electric Co.，Ibaraki，Japan）测量混合物在415nm波长下的吸光度。测量后，加入25微升6μg/ml人痰弹性蛋白酶（HSE）或25微升人白细胞弹性蛋白酶制剂，于室温下放置30分钟。然后测量415nm处的吸光度。药物抑制的百分率由下式确定：100×（1-存在抑制剂时的“r”/不存在抑制剂时的“r”），其中“r”为保温30分钟后的吸光度减去加入酶前的吸光度。类似地测定抑制剂对其他蛋白酶的作用，测定猪胰腺弹性蛋白酶（Ⅳ型，终浓度为5μg/ml）时用N-琥珀酰-（Ala）3-对硝基苯胺;测定牛胰胰蛋白酶（Ⅰ型，终浓度为16μg/ml）时用N-α-苯甲酰-Arg-对硝基苯胺;测定牛胰腺胰凝乳蛋白酶（Ⅱ型，终浓度为1.5μg/ml和人痰组织蛋白酶G（终浓度为10单位/ml）时用甲氧基琥珀酰-（Ala）2-Pro-Met-对硝基苯胺。HSE和组织蛋白酶G得自Elastin Products Company Inc.，MO，U.S.A.。其他底物和蛋白酶都购自Sigma化学品公司。
（3）结果：
1）WS7622A、B、C和D物质对几种丝氨酸蛋白酶活性的抑制作用
物质（μg/ml) 人痰弹性蛋白酶 猪胰腺弹性蛋白酶 胰蛋白酶（牛） 胰凝乳蛋白酶（牛） 人白细胞弹性蛋白酶 组织蛋白酶G
WS7622A 0.0071 <0.005 >250 0.031 0.017 1.1
WS7622B 0.038 0.013 >250 0.13 0.029 1.85
WS7622C 0.12 0.036 >5 0.21
WS7622D 0.15 0.12 >5 0.38
2）WS7622A物质的衍生物对人白细胞弹性蛋白酶的抑制作用
μg/ml
实例2化合物 0.0103
实例3化合物 0.0103
每个数值都表示为50%抑制浓度。
本发明的药物组合物可以常规药物剂型如粉剂、细粒剂、粒剂、片剂、糖锭剂、微囊剂、胶囊剂、栓剂、溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂等使用。如果需要，可在所述组合物中配入稀释剂或崩解剂（如蔗糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、合成硅酸铝等）、粘合剂（如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯树胶、聚乙二醇等）、着色剂、增甜剂、润滑剂（如硬脂酸镁等）等。
所述本发明组合物的剂量取决于患者的年令、体重、身体状况等，口服日剂量通常为100mg至10g目的化合物或其可药用盐，最好为1g至5g，每日1至3次。典型的单位剂量可为50mg、100mg、200mg、500mg、1g等，当然这些都是举例，并不是限制性的。
为说明本发明，给出下列实例。
实例1（WS7622A物质的生产）
在12个500ml锥形瓶中各倒入200ml种子培养液，并于120℃下灭菌30分钟，培养液中含有1%可溶性淀粉、1%蔗糖、1%葡萄糖、1%Pharma media（商品名，即棉子粉）、0.5%多胨、0.5%大豆粉和0.1%CaCO3。从成熟的斜面培养上取一环拒霉素链霉菌7622接种在每个种子培养基上。将锥形瓶置于旋转摇床上于30℃振荡3天。将所得的种子培养物接种到装在200升不锈钢发酵罐中的160升无菌发酵培养基中，该培养基的组成为4%Pine-Dex（商品名，即淀粉酸水解液）、1%谷蛋白粉、0.5%麦胚、0.5%马铃薯蛋白、0.2%CaCO3。发酵反应在25℃下进行5天，通气速度为160升/分，搅拌速度为200转/分。
用体外弹性蛋白酶抑制试验对发酵液中的WS7622A物质进行定量。供试验的样品如下制备：剧烈搅拌下将等体积的丙酮加到发酵液中。将混合物于室温下放置1小时，然后过滤。将滤液减压浓缩至适当的体积。弹性蛋白酶抑制试验如前所述。
借助于硅藻土过滤培养液（160升）。搅拌下向菌丝体饼中加入50升丙酮。将混合物于室温下放置过夜，然后过滤。减压浓缩滤液除去丙酮。将前面从培养液中得到的滤液（140升）与菌丝体提取液合并，然后通过聚合吸附剂Diaion        HP-20柱（商品名，三菱化学工业株式会社制造，17升）。用50升水和50升50%甲醇水溶液洗柱，用40升甲醇洗脱出吸附物。减压浓缩洗脱液得油状残余物。将残余物加到硅胶（Kiesel        gel        60，70-230目，Merck，1.3升）上进行柱层析。用2升正己烷-乙酸乙酯（1∶1，v/v）和4升乙酸乙酯洗柱，用丙酮（3升）和丙酮-甲醇（10∶1，6升）从柱中洗脱出活性物质。合并活性级分（6升）并浓缩至干，将其加到硅胶柱上进行柱层析，用氯仿-甲醇混合溶剂进行分步洗脱。活性物质被洗脱在氯仿-甲醇（10∶1，v/v）溶液中。减压浓缩并干燥这些级分得到3g黄色粉末。通过高效液相色谱（HPLC）分离出WS7622A物质。使用装填有S-15反相硅胶的YMC-D-ODS-15B        30×250mm不锈钢柱（Yamamura        Chemical        Laboratories，Japan）。将50毫克黄色粉末溶解于50微升甲醇中，并进行高效液相层析，用60%甲醇水溶液作流动相，流速为20毫升/分。WS7622A物质的保留时间为17.6分。层析操作进行60次，合并含WS7622A物质的级分并浓缩至干。将残留物溶于少量甲醇中并放置过夜，得600mg无色棱状的WS7622A物质。
实例2（二甲基化的WS7622A物质（R1、R2为甲基）的生产）：
向WS7622A物质（1克）在氯仿（20毫升）和甲醇（20毫升）混合物中的溶液中加入三甲硅基重氮甲烷（4毫升，10%（重量）己烷溶液，购自Petrarch        Systems公司），并将该溶液于室温下放置过夜。将溶液蒸发至干得油状物，将该油状物加到硅胶上进行柱层析纯化，用氯仿和甲醇（95∶5）混合液洗脱。收集产品级分并蒸发至干。所得白色残留物加乙醚研制，得0.62克二甲基化的WS7622A物质，为白色粉末。
外观：白色粉末
分子式：C49H67N9O13
FAB-MS m/z：990（M+H）+
薄层色谱（TLC）
硅胶板
（Merck        Art        5715）        氯仿-甲醇        Rf
（5∶1，V/V）        0.72
Rf
（9∶1，V/V）        0.40
旋光率：[α]23 D+37°（C＝1.6，CHCl3-MeOH
（1∶1））
红外吸收光谱
ν液体石蜡 max3400，3250，1730，1660，1640，1540，
1520，1330，1260，1210，1180，1160，
1100，1080，1000，980，920cm-1
1H核磁共振谱：
（400MHz，CD3OD）δ
7.20-7.11        （3H，m）
6.93        （1H，s）
6.83        （1H，q，J＝7Hz）
6.77        （2H，d，J＝8Hz）
6.59        （1H，s）
5.48        （1H，m）
5.15        （1H，m）
4.85        （1H，s）
4.76        （1H，m）
4.67        （1H，m）
4.42        （1H，m）
3.99-3.89        （2H，m）
3.82        （3H，s）
3.81        （3H，s）
3.66        （1H，m）
3.55        （1H，m）
3.02        （1H，m）
2.95        （3H，s）
2.90        （1H，m）
2.60-1.94        （6H，m）
1.82        （1H，m）
1.77        （3H，d，J＝7Hz）
1.68-1.58        （4H，m）
1.46        （3H，d，J＝7Hz）
1.13        （3H，d，J＝6Hz）
1.12        （3H，d，J＝6Hz）
1.01        （3H，d，J＝6Hz）
0.96        （3H，d，J＝6Hz）
1.00        （1H，m）
实例3（二乙酰化的WS7622A物质（R1、R2为乙酰基）的生产）
向WS7622A物质（1克）在吡啶（5毫升）中的溶液中加入乙酸酐（0.24毫升），将该混合物于室温下放置过夜。将混合物蒸发至干，得一油状物，将其加到硅胶柱上进行柱层析纯化，用氯仿和甲醇（95∶5）混合液洗脱。用热甲醇-异丙醚结晶得0.73克二乙酰化的WS7622A物质，为白色粉末。
外观：无色棱状体
分子式：C51H67N9O15
FAB-MS m/z ：1046（M+H）+
薄层色谱：
硅胶板
（Merck        Art        5715）        氯仿-甲醇        Rf
（5∶1，V/V）        0.73
Rf
（9∶1，V/V）        0.40
旋光率：[α]23 D+29°（C＝1.0，CHCl3-MeOH
（1∶1））
红外吸收光谱
ν液体石蜡 max3400，1770，1730，1660，1640，1540，
1420，1340，1260，1210，1080，1010，
980，920cm-1
1H核磁共振谱：
（400MHz，DMSO-d6）δ
9.48        （1H，宽峰）
8.37        （1H，d，J＝8Hz）
7.76        （1H，d，J＝7Hz）
7.23-7.10        （4H，m）
7.18        （1H，s）
7.03        （1H，d，J＝9Hz）
6.93        （1H，s）
6.76        （2H，d，J＝8Hz）
6.74        （1H，br        s）
6.65        （1H，q，J＝7Hz）
5.74        （1H，m）
5.42        （1H，m）
5.08        （1H，m）
4.77        （1H，d，J＝10Hz）
4.64        （1H，m）
4.57        （1H，m）
4.42        （1H，m）
3.92-3.78        （2H，m）
3.49        （1H，m）
3.34        （1H，m）
2.90        （1H，dd，J＝13和12Hz）
2.80        （3H，s）
2.70        （1H，m）
2.60        （1H，dd，J＝13和11Hz）
2.54        （1H，七重峰，J＝6Hz）
2.42-2.27        （2H，m）
2.27        （3H，s）
2.25        （3H，s）
2.17        （1H，m）
1.88        （1H，m）
1.70        （1H，m）
1.66        （3H，d，J＝7Hz）
1.60-1.46        （4H，m）
1.34        （3H，d，J＝6Hz）
0.99        （6H，d，J＝6Hz）
0.91        （3H，d，J＝6Hz）
0.88        （3H，d，J＝6Hz）
0.90        （1H，m）
实例4（WS7622B物质的生产）
在12个500ml锥形瓶中各倒入200ml种子培养液，并于120℃下灭菌30分钟，培养液中含有1%可溶性淀粉、1%蔗糖、1%葡萄糖、1%Pharma media（商品名，即棉子粉）、0.5%多胨、0.5%大豆粉和0.1%CaCO3。从成熟的斜面培养上取一环拒霉素链霉菌7622接种在每个种子培养基上。将锥形瓶置于旋转摇床上于30℃振荡3天。将所得的种子培养物接种到装在200升不锈钢发酵罐中的160升无菌发酵培养基中，该培养基的组成为4%Pine-Dex（商品名，即淀粉酸水解液）、1%谷蛋白粉、0.5%麦胚、0.5%马铃薯蛋白、0.2%CaCO3。发酵反应在25℃下进行5天，通气速度为160升/分，搅拌速度为200转/分。
用体外弹性蛋白酶抑制试验对发酵液中的WS7622B物质进行定量。供试验的样品如下制备：剧烈搅拌下将等体积的丙酮加到发酵液中。将混合物于室温下放置1小时，然后过滤。将滤液减压浓缩至适当的体积。弹性蛋白酶抑制试验如前所述。
借助于硅藻土过滤培养液（160升）。搅拌下向菌丝体饼中加入50升丙酮，将混合物于室温下放置过夜，然后过滤。减压浓缩滤液除去丙酮。将前面从培养液中得到的滤液（140升）与菌丝体提取液合并，然后通过聚合吸附剂Diaion        HP-20柱（商品名，三菱化学工业株式会社制造，17升）。用50升水和50升50%甲醇水溶液洗柱，用40升甲醇洗脱出吸附物。减压浓缩洗脱液得油状残余物。将残余物加到硅胶（Kiesel        gel        60，70-230目，Merck，1.3升）上进行柱层析。用2升正己烷-乙酸乙酯（1∶1，v/v）和4升乙酸乙酯洗柱，用丙酮（3升）和丙酮-甲醇（10∶1，6升）从柱中洗脱出活性物质。合并活性级分（6升）并浓缩至干，将其加到硅胶柱上进行柱层析，用氯仿-甲醇混合溶剂进行分步洗脱。活性物质用氯仿-甲醇（10∶1）洗脱出来。减压浓缩并干燥这些部分得到3g黄色粉末。通过高效液相色谱（HPLC）分离出WS7622B物质。使用装填有S-15反相硅胶的YMC-D-ODS-15B        30×250mm不锈钢柱（Yamamura        Chemical        Laboratories，Japan）。将50毫克黄色粉末溶解于50微升甲醇中，进行高效液相层析，用60%甲醇水溶液作流动相，流速为20毫升/分、WS7622B物质的保留时间为23.0分。层析操作进行60次，合并含WS7622B物质的级分并浓缩，然后用甲醇结晶得180毫克无色针状的WS7622B物质。
实例5（WS7622C和D物质的生产）
以与实例1相同的方式进行发酵。
搅拌下向所得到的培养液（70升）中加入70升甲醇。将混合物于室温下放置1小时，然后过滤。在滤液中加入140升水，制得280升25%甲醇水溶液。使该溶液通过聚合吸附剂Diaion        HP-20（商品名，三菱化学工业株式会社制造，5升）柱。用10升50%甲醇水溶液洗柱并用10升甲醇洗脱。减压浓缩洗脱液得油状残余物。将残余物加到硅胶（Kiesel        gel        60，70-230目，Merck，2.2升）上进行柱层析。用10升丙酮洗柱，用丙酮-甲醇（5∶1）从柱中洗脱出活性物质。洗脱液各级分的收集如下：级分1∶1升;级分2∶5.4升;级分3∶3.8升;级分4∶3.2升。WS7622C和D物质分别被洗脱在级分3和级分4中。
WS7622C物质的分离
减压浓缩并干燥级分3得1.2克黄色粉末。取1克含有WS7622C物质的粉末重新溶解于6毫升氯仿-甲醇（10∶1）中，并加到预填有氯仿-甲醇（10∶1）的100毫升硅胶柱上。用300毫升氯仿-甲醇（10∶1）洗柱，用氯仿-甲醇（5∶1）洗脱WS7622C物质。弃去头180毫升洗脱液，收集随后80毫升，减压浓缩并干燥得372毫克粉末。将粉末重新溶解于6毫升乙醇中，于4℃下放置1小时，得170毫克无色针状的WS7622C物质。
WS7622D物质的分离
将级分4浓缩至干，得3.3克黄色粉末。取1克含WS7622D物质的粉末溶于6毫升氯仿-甲醇（20∶1）中，并加到预填有氯仿的100毫升硅胶柱上。用300毫升氯仿-甲醇（20∶1）和300毫升氯仿-甲醇（10∶1）洗柱，用氯仿-甲醇（5∶1）洗脱WS7622D物质。弃去头200毫升洗脱液，收集随后90毫升并浓缩至干，得127毫克粉末。将粉末溶于少量乙醇中并于4℃下放置过夜，得90毫克无色针状的WS7622D物质。

Claims (16)

1、WS7622的各成分及其可药用盐，选自WS7622A物质、WS7622B物质、WS7622C物质和WS7622D物质，其物化性质如下：
WS7622A物质：
外观：无色棱状体
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气
                                        阴性：茚三酮、莫里斯氏反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、正丁醇
                                微溶：氯仿、丙酮、乙酸乙酯
                                不溶：水、正己烷
薄层色谱(TLC)：
氯仿-甲醇(5∶1，V/V) Rf0.51
丙酮-甲醇(10∶1)                                        0.62
(Kiesel    gel    60    F254    硅胶板，Merck)
熔点：250-252℃(分解)
旋光率：[α]23 D+36°(c=1.0，MeOH)
紫外光谱：λMeOH max287nm (ε=3600)
λMeOH-HCl max287nm
λMeOH-NaOH max298nm
分子式：C47H63N9O13
元素分析：
计算值(C47H63N9O13·2H2O)；C56.56，H6.77，N12.63%
实测值                                                                ；C56.65，H6.62，N12.27%
分子量 ：FAB-MS m/z 984 (M+Na)+
红外吸收光谱        ：
νKBr max3400，3300，3060，2980，2940，1735，1710，
                                                1690，1670，1660，1640，1540，1520，1470，
                                                1380，1330，1300，1260，1220，1200，1160，
1130，1090，1000，980，940，920 cm-1
1H核磁共振谱：
(400MHz， CD3OD) δ
7.22-7.09        (3H，m)
6.88-6.77        (3H，m)
6.74                            (1H，s)
6.46                            (1H，s)
5.46                            (1H，m)
5.18                            (1H，s)
4.85                            (1H，s)
4.77                            (1H，m)
4.65                            (1H，m)
4.50                            (1H，m)
3.96                            (1H，m)
3.91                            (1H，d，J=9Hz)
3.60-3.47        (2H，m)
3.03                            (1H，m)
2.90                            (3H，s)
2.86                            (1H，m)
2.59-2.49        (2H，m)
2.39                            (1H，m)
2.29-2.16        (2H，m)
2.00                            (1H，m)
1.84                            (1H，m)
1.74                            (3H，d，J=6Hz)
1.72-1.53        (4H，m)
1.44                            (3H，d，J=6Hz)
1.12                            (1H，m)
1.10                            (6H，d，J=6Hz)
0.99                            (3H，d，J=6Hz)
0.94                            (3H，d，J=6Hz)。
13C核磁共振谱：
(100MHz，CD3OD) δ
179.7                        (s)
176.3                        (s)
174.7                        (s)
173.3                        (s)
172.4                        (s)
171.4                        (s)
170.3                        (s)
165.8                        (s)
160.2                        (s)
145.7                        (s)
145.6                        (s)
137.5                        (s)
134.0                        (d)
131.4                        (s)
130.6                        (d)        x        2
129.8                        (s)
129.1                        (d)        x        2
129.1                        (s)
127.6                        (d)
119.1                        (d)
118.0                        (d)
76.0                            (d)
73.4                            (d)
63.1                            (d)
61.4                            (d)
57.1                            (d)
53.6                            (d)
52.7                            (d)
50.5                            (d)
39.9                            (t)
36.1                            (t)
35.8                            (d)
31.8                            (q)
31.0                            (t)
30.8                            (d)
29.9                            (t)
29.7                            (t)
25.2                            (t)
22.3                            (t)
20.2                            (q)
20.0                            (q)        x        2
19.7                            (q)
19.5                            (q)
13.3                            (q)
WS7622B物质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反性：阳性：硫酸铈、磺蒸气、氯化铁
                                        阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、正丁醇
                                微溶：氯仿、丙酮
                                不溶：水、正己烷
薄层色谱(TLC)：
氯仿-甲醇(5∶1，V/V) Rf0.55
(Kiesel    gel    60    F254    硅胶板，Merck)
熔点：248-250℃(分解)
旋光率：[α]23 D+39°(c=1.0，MeOH)
紫外光谱：λMeOH max287 nm (ε=3800)
λMeOH-HCl max287 nm
λMeOH-NaOH max299 nm
分子式：C48H65N9O13
元素分析：
计算值(C48H65N9O13·3H2O)；C55.96，H6.95，N12.24%
实测值                                                                ；C55.84，H7.05，N12.12%
分子量 ：FAB-MS m/z 998 (M+Na)+
红外吸收光谱        ：
νKBr max3400，3300，26960，1735，1680，1660，1640，
                                                1540，1520，1460，1400，1380，1330，1290，
                                                1250，1200，1180，1150，1130，1080，1050，
1000，980，940，920 cm-1
1H核磁共振谱：
(400MHz，DMSO-D6) δ
9.48                            (1H，宽        S)
9.03                            (1H，宽        S)
8.76                            (1H，宽        S)
8.30                            (1H，宽        d，J=6Hz)
7.77                            (1H，d，J=7Hz)
7.21                            (1H，d，J=8Hz)
7.20-7.11        (3H，m)
6.97                            (1H，宽        d，J=7Hz)
6.80                            (2H，d，J=8Hz)
6.72                            (1H，宽        S)
6.67                            (1H，s)
6.63                            (1H，q，J=7Hz)
6.37                            (1H，s)
5.48                            (1H，m)
5.40                            (1H，m)
5.09                            (1H，m)
4.77                            (1H，m)
4.64                            (1H，m)
4.38                            (1H，m)
4.31                            (1H，m)
3.87-3.80        (2H，m)
3.40-3.30        (2H，m)
2.95                            (1H，m)
2.79                            (3H，s)
2.65                            (1H，m)
2.40-2.20        (4H，m)
2.00                            (1H，m)
1.87                            (1H，m)
1.73                            (1H，m)
1.65                            (3H，d，J=7Hz)
1.65-1.40        (5H，m)
1.32                            (3H，d，J=6Hz)
1.27                            (1H，m)
0.97                            (3H，d，J=6Hz)
0.97                            (1H，m)
0.91                            (3H，d，J=6Hz)
0.88                            (3H，d，J=6Hz)
0.81                            (3H，t，J=7Hz)
13C核磁共振谱：
(100MHz，DMSO-d6) δ
175.6        (s)
174.8        (s)
172.0        (s)
170.9        (s)
170.6        (s)
170.3        (s)
168.7        (s)
162.5        (s)
157.4        (s)
144.2        (s)
144.2        (s)
136.5        (s)
131.1        (d)
130.7        (s)
129.6        (d)        x        2
128.4        (s)
127.9        (d)        x        2
127.8        (s)
126.4        (d)
118.9        (d)
116.8        (d)
74.2            (d)
72.1            (d)
61.0            (d)
59.8            (d)
55.2            (d)
51.6            (d)
50.8            (d)
48.6            (d)
40.9            (d)
38.2            (t)
35.0            (t)
30.8            (q)
29.8            (t)
28.8            (d)
28.4            (t)
28.1            (t)
27.1            (t)
23.3            (t)
21.2            (t)
19.6            (q)
19.1            (q)
19.0            (q)
17.7            (q)
12.9            (q)
11.9            (q)
WS7622    C物质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气、氯化铁
                                        阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、
                                微溶：氯仿、丙酮、乙酸乙酯
                                不溶：水、正己烷
薄层色谱(TLC)：
氯仿-甲醇(4∶1，V/V) Rf0.56
(Kiesel    gel    60    F254    硅胶板，Merck)
熔点：250-252℃(分解)
旋光率：[α]23 D+36°(c=0.5，MeOH)
紫外光谱：λMeOH max287 nm (ε=3500)
λMeOH-HCl max287 nm
λMeOH-NaOH max298 nm
分子式：C46H61N9O13
元素分析：
计算值(C46H61N9O13·6H2O)；C52.31，H6.97，N11.94%
实测值                                                                ；C51.95，H6.66，N11.77%
分子量 ：FAB-MS m/z 970 (M+Na)+
红外吸收光谱        ：
νKBr max3400，3300，2980，1740，1700，1660，1640，
                                                1540，1470，1450，1410，1335，1260，1230，
                                                1200，1160，1140，1070，1010，980，940，
920，880 cm-1
1H核磁共振谱：
(400MHz，CD3OD) δ
7.21-7.10        (3H，m)
6.86-6.77        (3H，m)
6.75                            (1H，s)
6.47                            (1H，s)
5.46                            (1H，m)
5.18                            (1H，m)
4.85                            (1H，s)
4.74                            (1H，m)
4.65                            (1H，m)
4.51                            (1H，m)
3.94                            (1H，m)
3.90                            (1H，d，J=10Hz)
3.58-3.46        (2H，m)
3.02                            (1H，m)
2.90                            (3H，s)
2.86                            (1H，m)
2.55                            (1H，m)
2.38                            (1H，dd，J=14和11Hz)
2.28                            (2H，q，J=7Hz)
2.30-2.16        (2H，m)
1.99                            (1H，m)
1.84                            (1H，m)
1.75                            (3H，d，J=7Hz)
1.78-1.54        (4H，m)
1.44                            (3H，d，J=6.5Hz)
1.13                            (3H，t，J=7Hz)
1.12                            (1H，m)
1.01                            (3H，d，J=6.5Hz)
0.97                            (3H，d，J=6.5Hz)
13C核磁共振谱：
(100MHz，CD3OD) δ
176.7        (s)
176.4        (s)
174.7        (s)
173.4        (s)
172.5        (s)
171.4        (s)
170.4        (s)
165.8        (s)
160.4        (s)
145.8        (s)
145.7        (s)
137.5        (s)
134.0        (d)
131.4        (s)
130.6        (d)        x        2
129.8        (s)
129.1        (d)        x        2
129.1        (s)
127.7        (d)
119.1        (d)
118.0        (d)
76.0            (d)
73.5            (d)
63.1            (d)
61.4            (d)
57.1            (d)
53.7            (d)
52.7            (d)
50.5            (d)
39.9            (t)
36.1            (t)
31.8            (q)
31.0            (t)
30.8            (d)
29.9            (t)
29.7            (t)
29.7            (t)
25.3            (t)
22.3            (t)
20.2            (q)
19.4            (q)
19.4            (q)
13.3            (q)
10.3            (q)
WS7622C物质：
外观：无色针状物
物质性质：酸性
颜色反应：阳性：硫酸铈、碘蒸气、氯化铁
                                        阴性：茚三酮、莫里斯氏反应、德腊根道夫反应
溶解性：可溶：甲醇、乙醇、
                                微溶：氯仿、
                                不溶：正己烷
薄层色谱(TLC)：
氯仿-甲醇(4∶1，V/V) Rf0.45
(Kiesel    gel    60    F254    硅胶板，Merck)
熔点：250-252℃(分解)
旋光率：[α]24 D+35.8°(c=0.5，MeOH)
紫外光谱：λMeOH max287 nm (ε=3640)
λMeOH-HCl max287 nm
λMeOH-NaOH max298 nm
分子式：C45H61N9O13
元素分析：
计算值(C45H59N9O13·6H2O)；C51.86，H6.87，N12.10%
实测值                                                                ；C51.90，H6.26，N12.08%
分子量 ：FAB-MS m/z 956 (M+Na)+
红外吸收光谱                                                ：
νKBr max3360，2950，1730，1700，1680，1660，1640，
                        1530，1460，1380，1330，1290，1250，1200，
                        1170，1160，1140，1080，980，940，920，
880 cm-1
1H核磁共振谱：
(400MHz，CD3OD) δ
7.20-7.10        (3H，m)
6.85-6.77        (3H，m)
6.73                            (1H，s)
6.46                            (1H，s)
5.46                            (1H，m)
5.18                            (1H，m)
4.84                            (1H，s)
4.73                            (1H，m)
4.64                            (1H，m)
4.50                            (1H，m)
3.99-3.87        (2H，m)
3.58-3.46        (2H，m)
3.01                            (1H，m)
2.90                            (1H，s)
2.87                            (1H，m)
2.53                            (1H，m)
2.38                            (1H，dd，J=14和11Hz)
2.30-2.16        (2H，m)
2.00                            (1H，m)
1.99                            (3H，s)
1.84                            (1H，m)
1.75                            (3H，d，J=7Hz)
1.76-1.55        (4H，m)
1.43                            (3H，d，J=6.5Hz)
1.15                            (1H，m)
1.00                            (3H，d，J=6.5Hz)
0.95                            (3H，d，J=6.5Hz)
13C核磁共振谱：
(100MHz，CD3OD) δ
176.4        (s)
174.6        (s)
173.4        (s)
173.0        (s)
172.4        (s)
171.4        (s)
170.4        (s)
165.8        (s)
160.3        (s)
145.9        (s)
145.9        (s)
137.5        (s)
134.0        (d)
131.4        (s)
130.6        (d)        x        2
129.8        (s)
129.1        (d)        x        2
129.1        (s)
127.6        (d)
119.0        (d)
118.0        (d)
76.0            (d)
73.5            (d)
63.1            (d)
61.3            (d)
57.1            (d)
53.9            (d)
52.7            (d)
50.5            (d)
39.9            (t)
36.1            (t)
31.8            (q)
31.0            (t)
30.7            (d)
29.9            (t)
29.6            (t)
25.3            (t)
22.4            (q)
22.3            (t)
20.2            (q)
19.5            (q)
19.4            (q)
13.3            (q)
2、具有下式的WS7622A物质的衍生物及其可药用盐：
其中R1和R2各为低级烷基或低级链烷酰基。
3、WS7622A物质的二低级烷基衍生物及其可药用盐。
4、WS7622A物质的二低级链烷酰基衍生物及其可药用盐。
5、WS7622A物质的二甲基衍生物及其可药用盐，该衍生物的物化性质如下：
外观：白色粉末
分子式：C49H67N9O13
FAB-MS m/z：990（M+H）+
薄层色谱（TLC）
硅胶板
（Merck        Art        5715）        氯仿-甲醇        Rf
（5∶1，V/V）        0.72
Rf
（9∶1，V/V）        0.40
旋光率：[α]23 D+37°（C＝1.6，CHCl3-MeOH
（1∶1））
红外吸收光谱
ν液体石蜡 max3400，3250，1730，1660，1640，1540，
1520，1330，1260，1210，1180，1160，
1100，1080，1000，980，920cm-1
1H核磁共振谱：
（400MHz，CD3OD）δ
7.20-7.11        （3H，m）
6.93        （1H，s）
6.83        （1H，q，J＝7Hz）
6.77        （2H，d，J＝8Hz）
6.59        （1H，s）
5.48        （1H，m）
5.15        （1H，m）
4.85        （1H，s）
4.76        （1H，m）
4.67        （1H，m）
4.42        （1H，m）
3.99-3.89        （2H，m）
3.82        （3H，s）
3.81        （3H，s）
3.66        （1H，m）
3.55        （1H，m）
3.02        （1H，m）
2.95        （3H，s）
2.90        （1H，m）
2.60-1.94        （6H，m）
1.82        （1H，m）
1.77        （3H，d，J＝7Hz）
1.68-1.58        （4H，m）
1.46        （3H，d，J＝7Hz）
1.13        （3H，d，J＝6Hz）
1.12        （3H，d，J＝6Hz）
1.01        （3H，d，J＝6Hz）
0.96        （3H，d，J＝6Hz）
1.00        （1H，m）
6、WS7622A物质的二乙酰基衍生物及其可药用盐，该衍生物的物化性质如下：
外观：白色粉末
分子式：C51H67N9O15
FAB-MS m/z：1046（M+H）+
薄层色谱：
硅胶板
（Merck        Art        5715）        氯仿-甲醇        Rf
（5∶1，V/V）        0.73
Rf
（9∶1，V/V）        0.40
旋光率：[α]23 D+29°（C＝1.0，CHCl3-MeOH
（1∶1））
红外吸收光谱
ν液体石蜡 max3400，1770，1730，1660，1640，1540，
1420，1340，1260，1210，1080，1010，
980，920cm-1
1H核磁共振谱：
（400MHz，DMSO-d6）δ
9.48        （1H，
8.37        （1H，d，J＝8Hz）
7.76        （1H，d，J＝7Hz）
7.23-7.10        （4H，m）
7.18        （1H，s）
7.03        （1H，d，J＝9Hz）
6.93        （1H，s）
6.76        （2H，d，J＝8Hz）
6.74        （1H，br        s）
6.65        （1H，q，J＝7Hz）
5.74        （1H，m）
5.42        （1H，m）
5.08        （1H，m）
4.77        （1H，d，J＝10Hz）
4.64        （1H，m）
4.57        （1H，m）
4.42        （1H，m）
3.92-3.78        （2H，m）
3.49        （1H，m）
3.34        （1H，m）
2.90        （1H，dd，J＝13和12Hz）
2.80        （3H，s）
2.70        （1H，m）
2.60        （1H，dd，J＝13和11Hz）
2.54        （1H，七重峰，J＝6Hz）
2.42-2.27        （2H，m）
2.27        （3H，s）
2.25        （3H，s）
2.17        （1H，m）
1.88        （1H，m）
1.70        （1H，m）
1.66        （3H，d，J＝7Hz）
1.60-1.46        （4H，m）
1.34        （3H，d，J＝6Hz）
0.99        （6H，d，J＝6Hz）
0.91        （3H，d，J＝6Hz）
0.88        （3H，d，J＝6Hz）
0.90        （1H，m）
7、一种制备WS7622A、B、C和/或D物质或其可药用盐的方法，该方法包括：在营养培养基中培养属于链霉菌属的产生WS7622A、B、C和D物质的菌株，并从培养液中分离WS7622A、B、C和/或D物质或其可药用盐。
8、根据权利要求7的方法，其特征在于，产生WS7622A、B、C和D物质的菌株为拒霉素链霉菌7622（FERM        BP-2306）。
9、一种制备具有下式的WS7622A物质的衍生物及其可药用盐的方法，该方法包括：使WS7622A或其盐与烷化剂反应，或使WS7622A或其盐与式R-OH（其中R为低级链烷酰基）化合物或其活性衍生物反应。
Figure 901013099_IMG2
其中R1和R2各为低级烷基或低级链烷酰基。
10、一种制备WS7622A物质的二低级烷基衍生物或其可药用盐的方法，该方法包括：使WS7622A物质或其盐与烷化剂反应。
11、一种制备WS7622A物质的二低级链烷酰基衍生物或其可药用盐的方法，该方法包括：使WS7622A或其盐与式R-OH（其中R为低级链烷酰基）化合物或其活性衍生物反应。
12、根据权利要求10的方法，其特征在于，目的化合物为WS7622A物质的二甲基衍生物。
13、根据权利要求11的方法，其特征在于，目的化合物为WS7622A物质的二乙酰基衍生物。
14、一种药物组合物，其中所含的活性成分为WS7622A、B、C和/或D物质、或WS7622A物质的二低级烷基衍生物、或WS7622A物质的二低级链烷酰基衍生物、或它们的可药用盐。
15、一种治疗有关患者的变性疾病的方法，这些疾病有肺气肿、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症等;该方法包括给患者服用有效量的WS7622A、B、C和/或D、或WS7622A物质的二低级烷基衍生物或WS7622A物质的二低级链烷酰基衍生物、或它们的可药用盐。
16、一种生物纯的拒霉素链霉菌7622（FERM        BP-2306）培养物。
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