CN1037617C - 酸性脲酶及其生产 - Google Patents

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Abstract

用属于乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus)微生物生产活性最优pH在酸性区的新的脲酶。该脲酶在pH，温度和对乙醇稳定性均优于通常的脲酶。

Description

酸性脲酶及其生产
本发明系一种新的脲酶，它可用于提高酒精性饮料的质量或用于临床实验室检验或食品中的脲的测定。
脲酶(E，C，3，5，1，5)是一种分解脲为氨气和二氧化碳的酶，广泛布于自然界的植物，动物和微生物体内。除了来自刀豆素A(Cananal ia  Adans(Jack豆))和鼠疫杆菌(Bacillus pastenri)的脲酶已被商品化生产和提供使用以外，已知还有由某些微生物合成的分子量440,000的脲酶，包括：百合棒状杆菌(Corynebactiriumlilium)，产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)，石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)，普通变形杆菌(proteus vulgaris)，嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)或支气管败血杆菌(Bordetella bronchiseptica)(日本专利公布№60-55119)，还有由芽胞杆菌UR-155(Bacillus SP，UR-155)合成的分子量440,000的脲酶(日本未审查专利公布(KOKAI)59-17987)以及由绿脓假单孢杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和红色奴卡氏菌(Nocardia erythrropolis)(日本未审查专利申请(KOKAl)61-257183)合成的分子量280,000的脲酶。
上述全部脲酶最适反应PH值均于中性到碱性区，在酸性区不但不稳定和易于失活，而且难以进行反应。特别是当反应温度高于室温或反应系统中含有有机溶剂，如酒精时，这些脲酶显示出大量失活的缺点。
本发明者作了大量的筛选性研究以发现能产生最适PH为酸性区并且高度稳定的脲酶的微生物，发现属于乳杆菌属(Lactobac-illus)和链球菌属(Streprotoccus)的一个菌株，其细胞内积累所需要的脲酶。随后，发明者对该酶进行分离和纯化，及进一步研究，并完成本发明。
因此，本发明目的标是提供一种具有下列理化特征和最适PH于酸性区的新的脲酶(简称酸性脲酶)：
(1)作用
它使1摩尔脲和1摩尔水产生2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
它主要是有效地作用于脲。
(3)最适PH和PH稳定性
它的最适PH是1.5-5.5，在PH6-8.37℃下稳
定30分钟。
(4)最适温度和温度稳定性
在最适PH下，它是最适温度是55-75℃，在PH6，
50℃下保持稳定30分钟。
(5)抑制剂
它可被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。
(6)分子量
经凝胶过滤确定其分子量为100,000到250,000。
(7)比活性
在最适PH和37℃下，它的比活性不低于20单位/毫克蛋白质。
本发明的另一个目标是提出一种通过在培养基中培养乳菌属或链球菌属的一种细菌来生产酸性脲酶的方法。在生产本发明的酸性脲酶中使用的乳杆菌属或链球菌属产脲酶菌株，包括发酵乳杆菌(Laotobac-illusfe rmentum)JCM5867(IFO14511，FERMP-8990)，发酵乳杆菌JCM5868(IFO14512，FERM P-8991)，发酵乳杆菌JCM5869(IFO14513，FERM P-8992)，reuteri乳杆菌(Lactobacillusreuteri)UM-12(IFO14629，FERM P-9456)，reuteri乳杆菌UM-18(IFO14630，FERM P-9457)，reuteri乳杆菌Rt-5(IFO 14631，FERMP-9458)，ruminis乳杆菌(Lactobacillusruminis)PG-98(IFO14632，FERM P-9459)，轻型链球菌(Streptococ us mitior)PG-154(IFO14633，FEM P-9460)，牛链球菌(Streptococcus boyis)PG-186(IFO14634，FERM P-9461)和唾液腺链球菌(Streptococcus sulivarius)PG-186(IFO 14746)可以作为例子来说明．上述的IFO编号系日本大阪发酵研究所保藏菌种编号(地址Juso-honmachi
2-Chome，Yodogawa-ku，osa ka532，Japan)，FEMP编号系日本国际贸易和工业部，工业科技分部，发酵研究所)FRI(的保藏编号)地址1-3，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，1baraki-ken305，Japan)。
发酵乳杆菌JCM5867(IFO14511)，JCM5868(IFO14512)和JCM5869(IFO14513)株列于IFO发行的研究通讯(No 13，Page94，1987)上。
本发明中所涉及的菌株也在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了相应的保藏，其保藏日和保藏号见下表：菌株                     保藏日           保藏号发酵乳杆菌JC M5867     1987，9.14.     CCTCC M87078reuteri乳杆菌Rt-5      1987.9.14.      CCTCC N87081牛链球菌PG-186         1987.9.14.      CCTCC M87084轻型链球菌PG-154       1987.9.14       CCTCC M87083ruminis乳杆菌PG-98     1988.8.8        CCTCC M88059reuteri乳杆菌um-12     1988.8.8        CCTCC M88057reuteri乳杆菌um-18     1988.8.8        CCTCC M88058唾液链球菌PG-303W      1988.8.8        CCTCC M88060
rellteri乳杆菌UM1-12，UM-18，Rt-5和ruminis乳杆菌PG-98细菌学特性介绍于下：
菌株来源细胞形态活动力芽胞形成革兰氏染色对氧需要有氧酵解试验酵解类型过氧化氢酶氧化酶硝酸盐还原明胶液化   UM-12小鼠粪便短杆状(0.6-0.8×1.0-1.5)--+微需氧酵解异型发酵DL-乳酸----   UM-18小鼠粪便短杆状(0.6-0.8×1.0-1.5)--+微需氧酵解异型发酵DL-乳酸----   Rt-5大鼠粪便短杆状(0.6-0.8×1.0-1.5)--+专性厌氧酵解异型发酵DL-乳酸----
淀粉水解七叶苷分解(6-β-d葡萄糖苷)MR试验(甲基红)VP试验吲哚生成试验硫化氢生成试验精氨酸产氨试验石芯指示葡萄糖产气最适生长温度45℃生长15℃生长PH4.0下生长PH9.6下生长     --+---+产酸+25-45℃+-+-     --+---+产酸+30-45℃+-+-     --+---+产酸+25-45℃+-+-
含3％NaCl含6.5％NaCl酸性产物核糖醇阿拉伯糖阿拉伯醇熊果苷(对苯二酚葡糖苷)纤维二糖菌株半乳糖醇果糖半乳糖葡萄糖酸盐葡萄糖甘油肌醇菊粉乳糖麦芽糖甘露醇     +--+---UM-12--+++---++-     -------UM-18--+++---++-     -------Rt-5--+++---++-
甘露糖松三糖蜜二糖α-甲基葡萄糖苷棉子糖鼠李糖核糖水杨苷山梨醇山梨糖淀粉蔗糖海藻糖木糖木糖醇营养缺陷型烟酸硫胺(维生素B)氯化胆硷核黄素泛酸钙     --+-+-+----+-+-++-++     --+-+------+----+++-+   --+-+-(微)+----+---++-+
吡哆醛叶酸DNA中GC含量肽聚糖链类型     --39.8LysAspAlaGlu     +-40.7LysAspAlaGlu     --40.3LysAspAlaGlu
               乳杆菌PG-98的细菌学特性如下列来源                              猪盲肠细胞形态                          短杆状(0.6-0.8×1.0-1.5)活动力                            -孢子形成                          -革兰氏染色                        +氧需要                            微需氧有氧发酵试验                      酵解酵解类型                          同质L-乳酸过氧化氢酶                        -氧化酶                            -硝酸盐还原                        -明胶液化                               -淀粉水解                               (微弱)+七叶苷分解                             +MR试验                                 (微弱)+VP试验                                 -吲哚产生                               -硫化氢产生                             -精氨酸产氨                             -石芯指示                               无变化葡萄糖产气                             -最适生长温度                           30-37℃45℃下生长                             -15℃下生长                             -PH4.0下生长                            -PH9.6下生长                            -含3％NaCl                              -培基中生长含6.5％NaCl                            -培基中生长α-溶血                                -β-溶血                                -酸性产物核糖醇                                 -阿拉伯糖                               -阿拉伯醇                               -熊果苷                                 -纤维二糖                               +半乳糖醇                               -果糖                                   +半乳糖                                 +(Gluconate)                            -葡萄糖酸盐葡萄糖                                 +甘油                                   -肌醇                                   -菊粉                                   -乳糖                                   -麦芽糖                                 +甘露醇                                 -甘露糖                                 +松三糖                                 -蜜二糖                                 -α-甲基葡萄糖苷                        -棉子糖                                 +鼠李糖                                 -核糖                                   -唾液酸                                 +山梨醇                                 -山梨糖                             -淀粉                               +蔗糖                               +海藻糖                             -木糖                               -木糖醇                             -DNA中GC含量(％)                    45.6肽聚糖链类型                       m-DAP
                               Ala
                               Glu
PG-154，PG-186，和PG303W株的细菌学特性描述于下。
菌株特性来源细胞形态 PG154猪空肠球菌 PG186猪结肠球菌 PG-303W猪十二指肠球菌
             (0.8-1.0×0.8-1.0)μ(0.8-1.0×0.8-1.0)μ(0.8-1.0×0.8-1.0)μ
活动力芽胞形成革兰氏染色氧需要有氧酵解试验酵解类型   --+专性厌氧发酵同质L-乳酸   --+专性厌氧发酵同质L-乳酸 --+专性厌氧发酵同质L-乳酸
过氧化氢酶氧化酶氮还原反应明胶液化淀粉水解七叶苷分解MR试验VP试验吲哚产生精氨酸产氨石芯试剂葡萄糖分解产气最适生长温度45℃下生长15℃下生长PH4.0下生长PH9.6下生长在4.0％NaCl中生长在6.5％NaCl中生长在40％胆汁-琼脂中粘液生长   ------+(微弱)+--产酸(微弱)-30-37℃------+(微弱)     ----微弱++(微弱)+--产酸(微弱)-25-37℃------+(微弱)     ----+-++ND-NDND30-37℃--ND---+
(蔗糖培养基)α-溶血β-溶血产酸核糖醇阿拉伯糖熊果苷纤维二糖果糖半乳糖(Grluconate)葡萄糖酸盐葡萄糖甘油肌醇菊粉乳糖麦芽糖甘露醇甘露糖松三糖蜜二糖棉子糖     ---ND-+(微弱)+++-+---++----+     -+(微弱)-ND-++++-+---++-+---     -+(微弱)---++++-+-ND-++-+--+
鼠李糖核糖唾液酸山梨醇蔗糖海藻糖木糖木糖醇DNA中GC含量(％)     --+-+--ND40.3     --+-+--ND40.1     --+-++--ND
上表中的符号Lys，Asp，Glu，Orn，Ser，和m-DAP分别代表赖氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，谷氨酸，鸟氨酸，丝氨酸和对二氨基庚二酸。“ND”表示该项试验未进行。为按上述细菌学特性对各菌株于以归类，查阅Bergey鉴定细菌学手册第2卷(1986)提示，UM-12，UM-18，和Rt-5株足以归类于reuteri乳杆菌，虽然它们与文献所述特性稍有不同：UM-18和Rt-5株对分解阿拉伯糖，果糖，核糖产酸反应阴性(Rt-5核糖产酸微弱阳性)。由于UM-12和Rt-5在生长温度和营养缺陷型方面有所差异，故认为它们是突变菌株。PG-98株的特性与rumines乳杆菌特性相当一致。PG-154株，虽然α-溶血阴性，但属轻型乳杆菌；PG-186株虽然对七叶苷的水解阴性，也属牛链球菌，PG-303株为唾液链球菌。
为积累酸性脲酶而培养这些菌株可以通过常规操作的静置培养，振荡培养，浸没的需氧培养或固体培养，或持续性或在间歇性基础培养基上来进行。特别理想的是静置培养。培养基可以是一种常用的微生物生长培养基。作为碳源，菌株生长时可被同化的一种以上的底物能从各种碳水化合物，油，脂肪，脂肪酸，有机酸，乙醇及其它物质中选择。作为氮源，可被应用为有机氮源物质有：胨，大豆粉，棉籽粉，玉米浸液，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，乳清，等，以及无机氮化合物如：硫酸铵，氯化铵，亚硝酸铵，磷酸铵等。这些原料可按需要单独使用或结合应用。除了这些碳源和氮源外，培养基最好还含有一些必需的因子和促生长剂，如无机离子，氨基酸，维生素等，以利生长和酶的产生。此外，在某些情况下加入脲和硫脲来诱生酸性脲酶。培养期间为控制PH和泡沫，加入苛性硷溶液，碳酸钠溶液或一种钙盐被证明是有利的。
作为温育温度，适于所用菌株生长的温度能被选择。通常，培养在15-55℃成功地进行，最好是在25-45℃。温育时间应足够该菌生长和酸生脲酶的产生，一般维持5-120小时。
于上述条件下培养后，一般可见该酸性脲酶出现于微生物细胞之中。因此，用离心收集，沉降，结絮或在多孔的聚合材料或陶瓷材料滤膜上过滤的活细胞先经以下处理，即冷冻干燥，匀浆器处理，超声波破碎，渗透压处理，细胞壁膜溶解，表面活性剂处理等。由此而溶解出的酶再经过适当的常用酶纯化方法处理，如：精蛋白处理，分级沉淀，有机溶剂处理，等电聚焦，电泳，离子交换层析，凝胶过滤，亲和层析，结晶等，得到一种同质蛋白质的酶制品。
检测酶活性的方法
已讲过的该脲酶活性值在PH4.0，37℃下经下列步骤测定。2ml适度稀释的酶溶液在37℃下温育5分钟。向该酶溶液中加入预温于37℃的底物溶液2ml。振荡后，37℃下反应30分钟。反应后立即向混合液中加入10％三氯乙酸4ml，并离心(8,000转/分，5分钟)。上清液2ml并加水至20ml，向4ml一份的该溶液中加入呈色试剂A2ml，轻柔地混合。再加呈色试剂B2ml，再轻柔混合，37℃下反应进行30分钟。然后，以水为对照测定波长640nm下的吸光值。
另一方面，上述酶稀释液2ml与作为底物替代物的柠檬酸盐缓冲液0.2M 2ml混合，37℃下反应30分钟。所获反应混合液作为酶的本底，(空白)试验按上述方法同样步骤处理。
此外，为取得标准液可取标准硫酸铵溶液(50μg/ml)2ml，10％三氯乙酸1ml和0.2M的柠檬酸盐缓冲液0.5ml混合并用水稀释至20ml，所得溶液按上述步骤同样呈色反应进行。另一方面，取10％三氯乙酸1ml和0.2M柠檬酸盐缓冲液0.5ml混合并用水稀释至20ml，稀释液按上述同样呈色反应处理以作为标准品的本底试验。
酶反应活性按下列公式计算。
酶活性(单位/毫克)＝
OD值(酶溶液)-OD值(酶本底)          稀释系数
-------------------                -----
OD值(标准品液)-OD值(标准品本底)    酶数量(mg)×1/30
每分钟作用于1μM NH3的酶量推定为1个单位(Iu)。上述测定过程所用试剂和稀释液的制备如下。底物液系将脲1.0g溶于0.2M柠檬酸盐缓冲液中制成100ml。10g三氯乙酸溶于水900ml中制成10％三氯乙酸液。呈色试剂A(苯酚-硝普钠溶液)系用酚5g和硝普钠25mg溶于水成500ml而制成。呈色试剂B液(硷性次氯酸钠液)用氢氧化钠5.0g和次氯酸钠液(有效氯浓度5％)7.5ml溶于水至500ml制成。0.2M柠檬酸盐缓冲液用柠檬酸(含1分子水)25.18g和柠檬酸钠(2分子水)23.59g加水至1000ml(PH4.0)制成。标准硫酸铵溶液(50μ/ml)用精确称量硫酸铵250.0mg溶于水中至250ml，取该液5ml再用水稀释至100ml而成。
与既往的脲酶不同，该新脲酶活性最适PH在酸性区间。而且，在PH稳定性方面优于以往的脲酶。因此，本发明的脲酶更适于商品化使用。特别是本脲酶有超过20单位/毫克蛋白质的比活性，因此，在一个低剂量下，它足以有效地从强酒精饮料中降解和排除脲(日本专专利申请N.179738/1987)，从而可用以提高这些产品的质量。另一方面，在血和尿标本的临床试验室检验和测定酒精饮料中的脲实验，该酶是一种很有效的试剂(日本专利申请N.171751/1987)。例如，日本米酒中脲的测定可用该酶分解脲为氨气和应用吲哚酚的方法而高精度地完成。
图注
图1，2，3，4显示例1脲酶活性与PH和温度间的关系。
在图1可显示37℃下的PH-活性曲线，O，和X分别表示0.1M柠檬酸盐缓冲液，0.1M醋酸盐缓冲液，和0.1M佛罗纳-醋酸-盐酸缓冲液中测定的结果。
图2显示该酶的PH稳定性，说明37℃下放置30分钟后的残留酶活性。
图3显示在PH4，0.1M柠檬酸盐缓冲液中的温度-酶活性曲线。
图4显示该酶的温度稳定性，指出在各种温度下作用30分钟后的残留酶活性；O表示PH4，为PH6(0.1M柠檬酸缓冲液)。
图5到8，9到12，13到16，17到20，21到24，25到29，29到32分别显示按例2，3，4，5，6，7和8中脲酶活性与PH和温度间的关系。图5-32的试验，除PH稳定性试验以外均使用0.1M柠檬酸盐缓冲液进行。
下列例子希望能更详细地说明本发明，但决不应视为是对本发明范围的限制。
例1
将生长于一种商品GAM半液体培养基(NissuiSeyyaku公司出品，日本)的reuteri乳杆菌Rt-5(IFO14631，FERM BP-1447，M87081)接种于10个锥形瓶(容量200ml)内，每瓶内含50ml无菌种子培养基，其成分为3％葡萄糖，1.5％胨，1％肉浸膏，0.8％酵母浸膏0.5％氧化钠，0.2％无水醋酸钠，0.005％硫酸镁(约含4分子水)和0.001％硫酸镍(6HO)(用30％NaOH调PH至7.0)。34℃下静置培养24小时。由此制备的种子培养物再转移至10个锥形瓶内(容量2升)。每瓶内含上述同样成分的无菌培养基11，32℃下静置培养2天，上述步骤得到显示21.6单位/ml酸性脲酶活性的培养物101。
上述培养物离心获得细胞，以0.05M PH7.2磷酸盐缓冲液冲洗两次，以含0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)，1mMEDTA和1mM二硫苏糖醇的溶液41悬浮细胞。加入直径0.1-0.2mm的玻璃球2升后，细胞悬液在4,500转/分下机械破碎20分钟。破碎细胞悬液被离心，再向上清液中加入终浓度达80％的乙醇。经离心收集沉积团块，复溶于PH7.0是0.05MTris-HCl缓冲液(含1mM EDTA和2-ME(二巯基乙醇)中，溶液过葡萄聚糖(Sephodex)G-100柱(直径7.5cm，长度90cm)为吸附和洗脱使用同一缓冲液。收集酶活性部分，再过以同一缓冲液平衡后的SephadexG-200柱(4.5cm×150cm)，使用同一缓冲液进行吸附和洗脱。收集酶活性部分，再过DEAE-SepharoseCL-6B柱，使用含0-0.7M氯化钠的上述同一缓冲液经梯度提取法进行吸附和洗脱。收集酶活性部分。在带有一个Amicon8200UK-50薄膜的超滤器中(排除分子量界限50,000)对该溶液于以浓缩，缓冲液改用含1mM 2ME的0.005M磷酸盐缓冲液(PH 7.0)。然后，溶液再过亲和层析柱(4cm×50cm)该柱以Bio-Rad公司出品的Affiprep10和羟基脲为吸附剂，用0.005M-0.044M磷酸缓冲液为梯度洗脱液进行。收集酶活性部分，使用上述同样超滤器进行浓缩，随后分级沉淀和冻于而获得纯酶制品104mg。该制品比活性为336.5u/mg蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一的蛋白区带。纯化过程见表1。
                       表1------------------------------------------------------------纯化步骤          总蛋白     总活性      比活性         产率
                         (X10U)    (U/mg蛋白)       (％)无细胞提取物       14.1      183.3        13.0          100.0乙醇               5.2       157.6        30.3          86.0Sephadex G-100     3.0       140.1        46.7          76.4Sephadex G-200     1.0       78.7         78.7          42.9DEAE-Sepharose     0.37      60.7         164.0         33.1CL-6B亲和层析凝胶       0.10      35.4         354.0         19.3冻干               0.10      35.0         336.5         19.1------------------------------------------------------------
上述过程所获冻干酸性脲酶的酶化学和理化特性如下。
酸性脲酶A
(1)活性
该酶使1分子脲和1分子水产生2分子氨气和1分子二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶最有效地作用于脲，并在一定程度上作用于乙脲，二脲，甲脲，尿囊酸和尿囊素(表2)
              表2
---------------------------------------
底物                         比活性(％)
脲                             100.0
尿囊素                         1.2
尿囊酸                         8.8
联二脲                         64.1
甲脲                           4.9
乙脲                           41.1
---------------------------------------
(3)最适PH和PH稳定值
如图1所示，该酶最适PH为2-4.5。图2显示了该酶在37℃和各种PH下静置30分钟后的残留活性。图2可见该酶在PH6-8下很稳定，在2-10区间尚稳定。
(4)最适温度和温度稳定性
如图3所示，该酶最适温度为60-70℃。图4显示了该酶在PH4和6下和变温条件下静置30分钟后的残留酶活性，从图4可见该酶在PH660℃下稳定，PH4，60℃下尚稳定。
(5)抑制剂
如表3所示，该酶被氯化汞，硝酸银，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制。
                     表3
--------------------------------------------
抑制剂            浓度            比活性(％)
无                                 100.0
AgNO3            0.05mM           0.7
HgCl2            0.05mM           0.6
碘乙酸            1mM              15.4
乙酰氧肟酸        10mM             10.0
--------------------------------------------
(6)分子量
经Sephadex G-200凝胶过滤测定为220,000。
(7)等电点
经聚丙烯酰胺凝胶上的等电聚焦测定，该酶的等电点为4.7。
(8)晶体结构
该酶不易结晶
(9)元素分析
由于难以结晶而未能测定。
(10)米氏常数(km)
该酶km值为1.7mM(PH4，0.1M柠檬酸缓冲液)。
例2
以例1同样的方式得到发酵乳杆菌JCM5867(lFO是14511，FERM BP-1454，M87078)的种子培养物。将其接种到含1升无菌培养基的锥形瓶(2升容积)中。培养基含4％葡萄糖，1.5％，1％肉提取物，0.8％酵母膏，0.5％氯化钠，0.2％无水醋酸钠，0.5％尿素，0.05％硫酸锰(约含4分子水)，0.002％硫酸镍(带6个水)，0.002％硫酸钴(带7个水)，0.005％硫酸锡和0.001％硫酸锶(用氢氧化钠将PH调至7.0。在32℃静置培养2天。得到10升的培养液，显示出5.6单位/毫升的酸性脲酶活性。
离心上述培养液，收集细胞，用0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)洗两次，再悬浮在含0.05M磷酸缓冲液(PH7.2)，1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇的4升溶液中。加入2升直径为0.1到0.2毫米的玻璃珠，然后以4.500转/分机械破碎细胞20分钟，再离心该破碎细胞悬液，向上清液中加乙醇使乙醇终浓度为80％。离心收集沉淀，复溶在含1mM EDTA和2-巯基乙醇的0.05M Tris-HCl缓冲液(PH7.0)中。将所得溶液进Sephadex G-100柱(直径7.5cm，长90cm)，用与吸附同样的缓冲液洗脱。将有活性组分合在一起再进Sephadex G-200柱(直径4.5cm，150cm)，用同样缓冲液洗脱。将所得活性级分再汇集，进DEAT-SephadexA-50柱，用同样缓冲液平衡及用含0-0.7M氯化钠的同样缓冲液梯度洗脱。汇集活性级分。该溶液的比活性为35.2单位/毫克，活性收率为43.7％。这个产物的酶化学性质如下：
酸性脲酶B
(1)作用
该酶使1摩尔的脲和1摩尔的水产生2摩尔的氨气和1摩尔的二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶对脲作用最有效，也在一定程度上作用于乙脲，联二脲，甲脲和尿囊酸(见表4)
             表4-----------------------------------------底物                         相对活性(％)脲                             100.0脲囊素                         0.0尿囊酸                         3.7联二脲                         72.0甲脲                           14.0乙脲                           46.0-----------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图5所示一最优PH约为3。图6表示该酶置于37℃不同PH下30分钟后残留的活性。从图6似乎看出酶PH6-8时是稳定的。
(4)最优温度和温度稳定性
如图7所示，该酶最优温度为60-70℃，图8表示该酶置于PH4和6下30分钟后残留的活性。从图8看出似乎该酶在PH6时达80℃仍是稳定的，在PH4时，到60℃仍是稳定的。
(5)抑制剂
如表5所示，该酶被氯化汞，硝酸银，硫酸铜，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制
                      表5
--------------------------------------------------
抑制剂                  浓度          相对活性(％)
无                                       100.0
AgNO3                  0.05mM           0.4
CuSO4.5H2O            0.4mM            0.8
HgCl2                  0.005mM          0.8
碘乙酸                  1mM              14.9
乙酰氧肟酸              10mM             16.0
--------------------------------------------------
(6)分子量
根据Sephadex G-200凝胶过滤测定，该酶分子量为210,000到220,000。
(7)等电点
用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦测定，该酶等电点为4.8。
(8)晶体结构
该酶不易结晶
(9)元素分析
由于不易结晶，没有测定
(10)米氏常数(km)
该酶米氏常数为1.0mM(在PH2，0.1M柠檬酸缓冲液中)。
例3
将生长在商品GAM半液体培养基(Nissui seiyaku公司产品，日本)上的牛链球菌PG-186(IFO14634，FERM BP-1449，M87084)接种到10个锥形瓶(200ml容量)中，每瓶内装50ml无菌的种子培养基，内含4％葡萄糖，1.5％胨。1％肉浸膏，0.8％酵母浸膏，0.5％氯化钠，0.2％无水醋酸钠，0.5％脲(尿素)，0.005％硫酸锰(约含4H2O，和0.001％硫酸镍(6分子H2O)(用30％氢氧化钠调PH至7.0)。将其在34℃下静置温育24小时。将如此制备的种子培养液转入10入锥形瓶中(容积2升)，每瓶含1升上述同样成分的无菌培养基，在32℃静置温育2天。得到10升培养液，显示7.6U/ml的酸性脲酶活性。
离心上述培养液回收细胞，用0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)洗两次，将其悬浮于4升含0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇的溶液中。加入2升直径为0.1-0.2毫米的玻璃球，以4,500转/分机械破碎细胞20分钟。离心破碎细胞悬液，向上清液加乙醇，使乙醇终浓度为80％。再离心收集沉淀，将其复溶于含1mM EDTA和2-巯基乙醇的0.05M Tris-HCI缓冲液(PH7.0)中。然后将该液过Sephadex G-100柱(直径7.5cm，长90cm)吸附，用同样缓冲液洗脱。汇集活性级分，再将其过Sephadex G-200柱(直径4.5cm，长150cm)用同样缓冲液平衡和洗脱。将汇集的活性级分再进入DEAE-Sephadex CL-6B柱，用含0-0.7M氯化钠的同样缓冲液梯度洗脱。汇集活性级分后，将其在带Amicon8200 UK-50膜(排除分子量为50,000的分子)的超滤器中浓缩。缓冲液改为含1mM 2-巯基乙醇的0.005M磷酸盐缓冲液(PH 7.0)。然后将溶液进亲和凝胶层析柱(直径4cm，长50cm)，该柱是用Affiprepl0(Bro-Rad产品)和羟基脲作吸附材料制备的，然后用0.005M-0.044M磷酸盐缓冲液梯度洗脱。汇集活性级分，用上述超滤法浓缩，再分级沉淀，冷冻干燥，得到104毫克纯酶粉。该酶比活性为124u/mg蛋白。
上述所得冻干酸性酶的酶化学及物理化学性质如下：
酸性脲酶C
(1)作用
该酶将1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶有效地作用于脲(见表6)
                       表6
--------------------------------------------------
底物                                  相对活性(％)
脲                                      100.0
尿囊酸                                  0.0
联二脲                                  0.0
乙脲                                    0.0
--------------------------------------------------
(3)最适PH和PH稳定性
如图9所示，该酶最优PH为5。图10表示该酶在37℃和不同PH水平静置30分钟残留活性。从图10看出该酶象在PH6-10间都是稳定的。
(4)最适温度和温度稳定性
如图11所示，该酶最优温度为60-70℃，图12表示在PH6及不同温度下放置30分钟该酶的残留活性。从图12看在PH6时，达50℃时该酶还是稳定的。
(5)抑制剂
如表7所示，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制该酶。
                       表7
---------------------------------------------------
抑制剂              浓度                相对活性(％)
无                                        100.0
HgCl2              1mM                   0.0
碘乙酸              10mM                  89.8
乙酰氧肟酸          10mM                  9.8
---------------------------------------------------
(6)分子量
经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定(见H，Eng等人；Can，J，Microbial，32，487(1986)，该酶分子量约为190,000。
Sephadex G-200凝胶过滤测定其分子量约为170,000。
(7)等电点
根据聚丙烯酰胺上的等电聚焦测定，该酶等电点约为4.7。
(8)结晶结构
该酶难以结晶。
(9)元素分析
由于难结晶，没有测定：
(10)米氏常数(km)
该酶米氏常数为0.2mM(PH5.0，0.1M柠檬酸缓冲液中)。
例4
以例3同样方式培养轻型链球菌PG-154(IFO 14633，FERMBP-1448，M87083)。所得10升培养液显示5.4单位/毫升蛋白质。
离心上述培养液，回收细胞，用0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)洗两次，再悬入4升含0.05M磷酸盐缓冲液(PH7.2)，1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇的溶液中。加2升直径为0.1-0.2毫米的玻璃球后，以4,500转/分的转速机械破碎细胞20分钟。离心破碎的细胞悬液，向上清液加乙醇，使其终浓度为80％。离心收集沉淀，将其复溶于含1mMEDTA和2-巯基乙醇的0.05M Tris-HCl缓冲液(PH7.0)。将所得溶液过Sephadex G-100柱(直径7.5cm，长90cm)，用同样缓冲液洗脱。汇集活性级分，将其过Sephadex G-200柱(直径4.5cm，长150cm)用与吸附一样的缓冲液平衡和洗脱。再汇集所得活性级分，进DEAE-Sephadex CL-6B柱，用含0.7M氯化钠的同样缓冲液梯度洗脱。汇集活性级分，该溶液比活性为76.3单位/毫克蛋白，活性收率为38.7％，该产物酶化学性质如下：
酶性脲酶D
(1)作用
该酶使1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶有地作用于脲，也一定程度上作用于联二脲和乙脲(见表8)。
                 表8
-----------------------------------------------
底物                               相对活性(％)
脲                                   100.0
尿囊酸                               0.0
联二脲                               22.0
乙脲                                 18.0
-----------------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图13所示，该酶最优PH为4-5，图14表示将该酶放置37℃不同PH水平30分钟后残留的活性。从图14看出似乎该酶在PH4-8时仍然稳定。
(4)最优温度和温度稳定性
如图15所示，该酶最优温度给为60℃，图16表示将该酶放置PH6下30分钟后残留的活性。从图16看出似乎该酶在PH6高达60℃时仍是稳定的。
(5)抑制剂
如表9所示，氯化汞，碘乙酸和乙酰氧肟酸是该酶抑制剂。
                        表9
---------------------------------------------------
抑制剂                浓度              相对活性(％)
无                                        100.0
HgCl                  1mM                 0.0
碘乙酸                10mM                0.6
乙酰氧肟酸            10mM                19.2
---------------------------------------------------
(6)分子量
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量约为160,000，而用Sephadex G-200凝胶过滤测定，该酶分子量约为170,000。
(7)等电点
在聚丙烯酰胺凝胶上等电聚焦测定该酶等电点约4.6。
(8)结晶结构
本酶不易结晶。
(9)元素分析
由于难于结晶，故未测定。
(10)米氏常数；
该酶米氏常数为0.3mM(PH4.0，0.1M柠檬酸缓冲液中)。
例5
以例3同样方式培养唾液链球菌PG-303W(IFO14746，FERM BP-1856)。所得10升培养液显示活性为4.3单位/毫升。将该培养液根据例4步骤纯化，得到酶溶液比活性为68.2单位/毫克蛋白。活性收率为41.2％，本产品酶化学性质如下：
酸性脲酶E
(1)作用
该酶使1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶主要有效作用于脲，一定程度上也作用于联二脲和尿囊酸(见表10)
                      表10
--------------------------------------------
底物                            相对活性(％)
脲                                100.0
尿囊酸                            12.0
联二脲                            60.0
乙脲                              50.0
--------------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图17所示，该酶最优PH是4。图18表示将该酶放置37℃，不同PH水平30分钟后残留的活性。从图18看出似乎在PH6-11时该酶仍是稳定的。
(4)最优温度和温度稳定性
如图19所示，该酶最优温度为60-70℃。图20表示该酶被放置PH为6和不同温度下30分钟残留的活性。从图20看出好象在PH6高达60℃时该酶仍是稳定的。
(5)抑制剂
从表11看出，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制该酶。
                   表11
------------------------------------------------
抑制剂                浓度          相对活性(％)
无                                     100.0
HgCl2                0.05mM           2.0
碘乙酸                10mM             100.0
乙酰氧肟酸            10mM             15.2
------------------------------------------------
(6)分子量
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶分子量约为110,000。用Sephadex G-200凝胶过滤测定，该酶分子量约为140,000。
(7)等电点
在聚丙烯酰胺凝胶上等电聚焦测定，该酶等电点约为4.7
(8)结晶结构
该酶难以结晶
(9)元素分析
由于难结晶，未测定。
(10)米氏常数
该酶的米氏常数为0.2mM(PH4，0.1M柠檬酸缓冲液)。
例6
用例1同样方式培养ruminis乳杆菌PG-98(IFO14632，FERM BP-1906)。所得10升培养液显示5.2单位/毫升的酸性脲酶活性。如例2所述将该培养液纯化，所得酶比活性为36.7单位/毫克蛋白，活性收率为42.8％。该产品酶化学性质如下：
酸性脲酶F
(1)作用
该酶将1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲和联二脲(见表12)。
                       表12
------------------------------------------------------
底物                                      相对活性(％)
脲                                           100.0
尿囊酸                                       0.0
联二脲                                       26.0
乙脲                                         5.0
------------------------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图21所示，该酶最优PH为5。图22表示将该酶置于37℃，不同PH下30分钟残留的酶活性。从图22可看出该酶在PH4-8时是稳定的。
(4)最优温度和温度稳定性
如图23所示，该酶的最优温度为55-60℃，图24表示将该酶放置PH6下30分钟后残留的活性，从图24看出该酶在PH6，温度高达55℃及PH4，温度达30℃时都是稳定的。
(5)抑制剂
如表3所示，氯化汞，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制该酶。
                  表13
-----------------------------------------------
抑制剂                浓度         相对活性(％)
无                                   100.0
HgCl2                0.05mM         0.0
碘乙酸                10mM           50.0
乙酰氧肟酸            10mM           0.0
-----------------------------------------------
(6)分子量
用Sephadex G-200凝胶过滤测定，该酶分子量约为150,000。
(7)等电点
在聚丙烯酰胺凝胶上等电聚焦测定该酶等电点约为4.7。
(8)结晶结构
本酶难于结晶
(9)元素分析
由于其难于结晶，故未测定。
(10)米氏常数
该酶米氏常数为1.2mM(PH5，0.1M柠檬酸缓冲液)
例7
如例1同样方式培养reuteri乳杆菌M-12(IFO14629，FERM BP-1904)。得到10升显示3.6单位/毫升的酸性脲酶活性的培养液。用例2步骤将上述培养液纯化，使酶的比活性达33.4单位/毫升蛋白。活性收率为45.3％，该产品的酶化学性质如下：
酸性脲酶G
(1)作用
该酶使1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
本酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲和联二脲(见表14)。
                   表14
-----------------------------------------
底物                         相对活性(％)
脲                              100.0
尿囊酸                          0.0
联二脲                          7.9
乙脲                            25.5
-----------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图25所示，该酶的最优PH是4。图26表示将酶置于37℃和不同PH下30分钟后残留的活性。从图26可看出该酶在PH4-8时是稳定的。
(4)最优温度和温度稳定性
如图27所示，该酶最优温度为70-75℃。图28表示将酶放置PH4和PH6下30分钟后的残留活性。从图28可看出该酶在PH6温度达75℃及PH为6温度为65℃时都是稳定的。
(5)抑制剂
如表15所示，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制该酶。
                    表15
----------------------------------------------
抑制剂             浓度           相对活性(％)
无                                   100.0
HgCl               0.05mM            0.0
碘乙酸             10mM              100.0
乙酰氧肟酸         10mM              17.1
----------------------------------------------
(6)分子量
用Sephadex G-200凝胶过滤测得该酶分子量约为210,000。
(7)等电点
在聚丙烯酰胺凝胶上的等电聚焦测定其等电点约为4.8。
(8)结晶结构
该酶难于结晶。
(9)元素分析
由于难以结晶，而未测定。
(10)米氏常数
该酶米氏常数为1.3mM(PH4，0.1M柠檬酸缓冲液中)。
例8
用例1同样方式培养reuteri乳杆菌M-18(IFO14630，FERM BP-1905)。得到10升显示4.5单位/毫升的酸性脲酶活性的培养液。将上述培养液用例2步骤纯化至酶比活性为39.8单位/毫克蛋白，活性收率41.7％。该产品酶化学性质如下：
酸性脲酶H
(1)作用
该酶可使1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳。
(2)底物特异性
该酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲，联二脲和尿囊酸(见表16)。
                   表16
-------------------------------------------
底物                           相对活性(％)
脲                                100.0
尿囊酸                            12.3
联二脲                            82.4
乙脲                              66.2
-------------------------------------------
(3)最优PH和PH稳定性
如图29所示，本酶最优PH为3。图30表示该酶置于37℃和不同PH下30分钟后残留的活性。从图30可看出该酶在PH5-8时是稳定的。
(4)最优温度和温度稳定性如图31所示，本酶最优温度为70-75℃。图32表示将该酶放置PH4和PH6下30分钟后的残留活性，从图32可以看出，该酶在PH6，温度达70℃及PH4温度达65℃都是稳定的。
(5)抑制剂
如表17所示，该酶被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。
                      表17
--------------------------------------------------
抑制剂            浓度                相对活性(％)
无                                      100.0
HgCl              0.05mM                0.0
碘乙酸            10mM                  99.0
乙酰氧肟酸        10mM                  7.9
--------------------------------------------------
(6)分子量
用Sephadex G-200凝胶过滤测定本酶分子量约为230,000。
(7)等电点
在聚丙烯酰胺凝胶上进行等电聚焦测定其等电点为约4.5。
(8)结晶结构
本酶很难结晶。
(9)元素分析
由于难于结晶，故未测定。
(10)米氏常数
该酶米氏常数为4.8mM(PH3，0.1M柠檬酸缓冲液中)。
试验例1
用含不同乙醇浓度的反应液测定，例3-5所得酸性脲酶C、D和E的酶活性。如表18所示，这些脲酶既便在20或50％乙醇浓度下都能对脲作用。
                表18-----------------------------------------------酸性脲酶                  乙醇浓度(％)
            0          20              50-----------------------------------------------酸性脲酶C       100        84.2            51.6酸性脲酶D       100        85.0            50.4酸性脲酶E       100        82.6            47.6-----------------------------------------------
                                (相对活性％)
试验例2
将例1、2、6、7和8所得酸性脲酶A、B、F、G和H及Jack豆脲酶调至浓度为10单位/毫升，然后在20℃有20％乙醇存在时测定这些酶活性。结果见表19。
                          表19
-----------------------------------------------
酸性脲酶                           相对活性(％)
酸性脲酶A                             100.0
酸性脲酶B                             95.0
酸性脲酶F                             107.0
酸性脲酶G                             119.7
酸性脲酶H                             121.6
Jack豆脲酶*                          0.5
-----------------------------------------------
注：Jack豆脲酶是从Jack豆得到的脲酶，其最优PH为7.0，它是来自P、L.Biochenicls Inc；USA公司。

Claims (9)

1.生产具有下列物理化学特性的酸性脲酶的方法：
(1)作用
它使1摩尔脲和1摩尔水生成2摩尔氨气和1摩尔二氧化碳
(2)底物特异性
它主要是有效地作用于脲
(3)最优PH和PH稳定性
它最优PH为1.5到5.5；它在37℃，PH6-8时放置30分钟仍是稳定的
(4)最优温度和温度稳定性
它在最优PH下的最优温度为55-75℃，在PH6时温度达50℃能保持稳定性30分钟
(5)抑制剂
它被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制
(6)分子量
用凝胶过滤测定分子量为100,000到250,000
(7)比活性
它在最优PH和37℃时比活性不小于20单位/毫升蛋白质；
该方法包括在培养基中培养一种选自发酵乳杆菌(LactobacillusFermentum)JC M5867，reuteri乳杆菌Rt-5、um-12和um-18，ruminis乳杆菌PG-98，牛链球菌(Streptococus bovis)PG-186，轻型链球菌(Streptococcus mitior)PG-154或唾液链球菌(Streptococcus salivarius)PG-303W的微生物，从而在细菌培养液中产生和积累酸性脲酶，再从培养液收集该酸性脲酶。
2.根据权利要求1的方法，其中的微生物是发酵乳杆菌JCM5867(IF014511，FERM BP-1454，CCTC M87078)。
3.根据权利要求1的方法，其中的微生物是reuteri乳杆菌Rt-5(IFO14631，FERM BP-1447，CCTCC M87081)。
4.根据权利要求1的方法，其中的微生物是ruminis乳杆菌PG-98(IFO14632，FERM BP-1906，CCTCC M88059)。
5.根据权利要求1的方法，其中的微生物是reuteri乳杆菌UM-12(IFO14629，FERM BP-1904，CCTCC M88057)。
6.根据权利要求1的方法，其中的微生物是reuteri乳杆菌UM-18(IFO014630，FERM BP-1905，CCTCC M88058)。
7.根据权利要求1的方法，其中的微生物是牛链球菌PG-186(IFO14634，FERM BP-1449，CCTCC M87084)。
8.根据权利要求1的方法，其中的微生物是轻型链球菌PG-154(IFO14633，FERM BP-1448，CCTCC M87083)。
9.根据权利要求1的方法，其中的微生物是唾液链球菌PG-303W(IFO14746，FERM BP-1856，CCTCC M88060)。
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