HU202918B - Process for producing acidic urease - Google Patents

Process for producing acidic urease Download PDF

Info

Publication number
HU202918B
HU202918B HU883602A HU360288A HU202918B HU 202918 B HU202918 B HU 202918B HU 883602 A HU883602 A HU 883602A HU 360288 A HU360288 A HU 360288A HU 202918 B HU202918 B HU 202918B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
enzyme
ferm
ifo
optimum
acid
Prior art date
Application number
HU883602A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT47316A (en
Inventor
Shigeya Kakimoto
Yasuhiro Sumino
Takashi Suzuki
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of HUT47316A publication Critical patent/HUT47316A/hu
Publication of HU202918B publication Critical patent/HU202918B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új ureáz előállítására, amelyet enzimként lehet használni szeszes italok minőségének javítására és karbamid meghatározására klinikai laboratóriumokban, vagy élelmiszerekben.
Az ureáz (E. C. 3. 5. 1. 5) az az enzim, amely a karbamidot ammóniává és széndioxid gázzá bontja le, és amely igen elterjedt a természetben, növényekben, állatokban és mikroorganizmusokban. Kereskedelmi forgalomban is kapható a Canavalia Adans-ból és a Bacillus pasteuriiből készített ureáz. Ezenkívül ismeretesek egyéb ureázok is, így például a mintegy 440 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Corynebacterium lilium, Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter paraffineus, Proteus vulgáris, Microbacterium ammoniaphilum vagy Bordetella bronchiseptica baktériumtörzsek készítenek (lásd a 60-55 119 számú japán közzétételi iratot); a mintegy 440 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Bacillus sp. UR-155 készít (lásd az 59-17 987 számú japán nem vizsgált közzétételi iratot), valamint a mintegy 280 000 molekulatömegű ureáz, amelyet a Pseudomonas aeruginosa és Nocardia erythropolis készít, és amely a 61-257 183 számú japán nem vizsgált szabadalmi leírásban található.
Valamennyi említett ureáznak az optimális pH értéke a semleges és a lúgos tartományban található, a savas tartományban nemcsak labilis és dezaktiválódásra hajlamos, hanem nehezen is lép reakcióba. Különösen abban az esetben, amikor a reakció hőmérséklete szobahőmérséklet feletti, vagy a reakciórendszer szerves oldószert, például alkoholt tartalmaz, ezek az ureázok igen erősen inaktiválódnak.
A fentiek miatt intenzív kutatásokat végeztünk, hogy olyan mikroorganizmust találjunk, amely olyan ureázt termel, amelynek optimális pH-ja a savas tartományban van és ott igen stabil is. Azt találtuk, hogy egy, a Lactobacillus és a Streptococcus nemzetséghez tartozó baktériumtörzs ezt a kívánt ureázt halmozza fel a sejtjeiben. Ezt az enzimet izoláltuk és tisztítottuk, és további kutatásokat végezve jutottunk a jelen találmányhoz.
A találmány tárgya tehát eljárás új, olyan ureáz előállítására, amelynek pH optimuma a savas tartományban van (ezután ezt az ureázt savas ureáznak nevezzük), és amelynek a következő fizikokémiai tulajdonságai vannak:
1) Hatása: 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel,
2) Szubsztrátspecifitása: a karbamidra hat,
3) pH optimuma és pH stabilitása: pH optimuma 1,5 és 5,5 között van, pH 6-8 között 37 ’C-on 30 percig stabil,
4) hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása: hőmérséklet-optimuma a pH-optimumán 55 ’C és 75 ’C között van, pH 6-nál 50 ’C hőmérsékletig 30 percig stabil marad,
5) Inhibitorai: higany(II)-klorid és acetohidroxámsav gátolja,
6) molekulatömege: gélszűréssel meghatározva 100 000-250 000 dalton között,
7) fajlagos aktivitása: a pH-optimumon, 37 ’C-on legalább 20 U/mg fehérje.
Az eljárást úgy végezzük, hogy megfelelő tápközegben tenyésztünk valamely a Lactobacillus fermentum, Lactobacillus renteri, Lactobacillus ruminis, Streptococcus bovis, Streptococcus mitior vagy Streptococcus salivarius fajhoz tartozó mikroorganizmust.
A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazható savas ureázt termelő mikroorganizmusok közül konkrét példaként megemlíthetjük a következőket:
Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14 511, FERM P-8990), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (JFO 14 512, FERM P—8991), Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14 513, FERM P-8992), Lactobacillus reuteri UM-12 (IFO 14 629, FERM P—9456), Lactobacillus reuteri UM-18 (IFO 14 630, FERM P9457), Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14 631, FERM P-9458), Lactobacillus ruminis PG-98 (IFO 14 632, FERM P-9459), Streptococcus mitior PG-154 (IFO 14 633, FERM P-9460), Streptococcus bovis PG-186 (IFO 14 634, FERM P-9461) és Streptococcus salivarius PG-3O3W (IFO 14 746). Az itt szereplő IFO számok az Osakai Fermentációs Intézet (IFO) deponálási számai. Az intézet címe: Institute fór Fermentation, Osaka (IFO) 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japán.
Az FERM P számok a fermentációs kutatóintézet (Fermentation Research Institute (FRI) deponálási számai, cím: Fermentation Research Institute, (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industiy, 1-3, Higshi 1-chome, Tsukuba-shik, Ibaraki-ken 305, Japán.
A Lactobacillus feimentum JCM 5867 (IFO 14 511), Lactobacillus fermentum JCM 5868 (IFO 14 514) és Lactobacillus fermentum JCM 5869 (IFO 14 513) ismert törzsek, amelyek az IFO által kiadott kutatási közleményekben (13. szám, 94. oldal, 1987) szerepelnek.
Ezeket a mikroorganizmusokat, amelyek az FRI-nél voltak deponálva a következő táblázatban szereplő napokon, átalakítottuk a Budapesti Szerződés szerinti deponálássá, és az FRI-nél helyeztük letétbe a következő táblázatban szereplő FERM BP katalógus számokkal.
Mikroorganizmus FRI-nél történt Bp. deponálás dátuma Szerződés szerinti katalógusszám
Lactobacillus fermentum JCM 5867 1986. október 4. FERM BP-1454
Lactobacillus fermentum JCM 5868 1986. október 4. FERM BP-1445
Lactobacillus fermentum JCM 5869 1986. október 4. FERM BP-1446
Lactobacillus reuteri UM-12 1987. július 7. FERM BP-1904
HU 202918 Β
Mikroorganizmus FRI-nél történt Bp. deponálás dátuma Szerződés szerinti katalógusszám
Lactobacillus reuteri UM-18 1987. július 7. FERM BP-1905
Lactobacillus reuteri Rt-5 1987. július 7. FERM BP-1447
Lactobacillus ruminis PG-98 1987. július 7. FERM BP-1906
Streptococcus mitior PG-154 1987. július 7. FERM BP-1448
Streptococcus bovis PG-186 1987. július 7. FERM BP-1449
A PG-3O3W törzset 1988. április 14-én deponáltuk téri UM-18, Lactobacillus reuteri Rt-5 és Lactobacil-
az FRI-nél, mint FERM BP-1856. lus ruminis PG-98 bakteriológiai tulajdonságait a kö- A Lactobacillus reuteri UM-12, Lactobacillus reu- vetkezőkben ismertetjük. 15
Törzs UM-12 UM-18 RT-5
Eredet Egér ürülék Egér ürülék Patkány ürülék
Sejt morfológia rövid pálcika (0,6-0,8 · 1,0-15) rövid pálcika (0,6-0,8 · 1,0-15) rövid pálcika (0,6-0,8 · 1,0-15)
Mozgékonyság - - -
Spóraképzés - - -
Festés + + +
Oxigénigény mikroaerofil mikroaerofil fakultatív anaerob
Oxidáció-fermentáció teszt fermentatív fermentatív fermentatív
Fermentáció típus heterofermentatív, DL-tejsav heterofermentatív, DL-tejsav heterofermentatív, DL-tejsav
Kataláz - -
Oxidáz - - -
Nitrát redukáció - - -
Zselatin cseppfolyósítás - - -
Keményítő hidrolízis - - -
Eszkulin bontás - - -
MR teszt + + +
VP teszt - -
Indol-termelés - - -
Hidrogén-szulfid termelés - - -
NH3 termelés argininből + + +
Lakmusztej sav képződik sav képződik sav képződik
Gáztermelés glükózból + + +
Optimális növekedési hőmérséklet (’C) 25-45 30—45 25-45
45 ’C-on növekedés + + +
15 ’C-on növekedés - - -
pH 4-en növekedés + + +
PH 9,6-on növekedés - - -
Növekedés 3 % NaCl jelenlétében + - +
Növekedés 6,5 % NaCl jelenlétében Savtermelés — —
Adonit - - -
Arabinóz + - -
Arabit -- - -
Arbutin - - -
Cellobióz - - -
Dulcit - - -
Fruktóz - - -
Galaktóz + + +
Glükonát + + +
Glükóz + + +
Glicerol - - -
HU 202 918 Β
Törzs UM-12 UM-18 RT-5
Inozit — —
Inulin - - -
Laktóz + + +
Maltóz + + +
Mannit - - -
Mannóz - - -
Melezitóz - - -
Melibióz + + +
a-Metilglükozid - - -
Raffinóz + + +
Rhamnóz - - -
Ribóz + - + (gyengén)
Szalicin - - -
Szorbit - - -
Szorbóz - - -
Keményítő - - -
Szacharóz + + +
Trehalóz - - -
Xilóz + - -
Xilit - - -
Auxotrófia
Niacin + +
Tiamin + + +
Kolin-klorid - + -
Riboflavin + -
Ca-pantotenát + + +
Piridoxal - + -
Folsav - - -
DNS GC-tartalma (%) 39,8 40,7 40,3
Peptidoglikán típus Lys Lys Lys
Asp Asp Asp
Alá Alá Alá
Glu Glu Glu
A Lactobacillus ruminis PG-98 bakteriológiai tulaj-
donságai a következők: 40 Eredet sertés (cecum)
Eredet sertés (cecum) Hidrogén-szulfid termelés -
NH3 termelés argininból -
Sejt morfológia rövid pálcika Lakmusztej nincs változás
(0,6-0,8 · 1,0-1,5) 45 Géztermelés glükózból -
Mozgékonyság - Optimális növekedési
Spóraképzés - hőmérséklet, ’C-ban 30-37
Grám festés + Növekedés 45 “C-on
Oxigénigény mikroaerofil Növekedés 15 ’C-on -
Oxidációs-fermentáció teszt fermentatív 50 Növekedés pH 4,0-nál -
Fermentáció típus homo L-tejsav Növekedés pH 9,6-nál -
Kataláz — Növekedés 3 % NaCl jelenlétében -
Oxidáz — Növekedés 6,5 % NaCl jelenlétében -
Nitrát redukció - a-hemolízis -
Zselatin cseppfolyósítás - 55 β-hemolízis -
Keményítő hidrolízis + (gyengén) Savtermelés
Eszkulin bontás + Adonit —
MR teszt + (gyengén) Arabinóz -
VP teszt - Arabit -
Indol termelés - 60 Arbutin —
HU 202 918 Β
Eredet sertés (cecum)
Cellobióz +
Dulcit - 5
Fruktóz +
Galaktóz +
Glükonát -
Glükóz +
Glicerin - 10
Inozit -
Inulin -
Laktóz -
Maltóz +
Mannit - 15
Mannóz +
Melezitóz —
Melibióz -
a-metil-glükozid -
Raffmóz + 20
Rhamnóz —
Eredet sertés (cecum)
Ribóz
Szalicin +
Szorbit —
Szorbóz -
Keményítő +
Szacharóz +
Trehalóz —
Xilóz -
Xilit -
DNS GC-tartalma (%) 45,6
Peptidoglikán típus n-DAP Alá Glu
A PG-154, PG-186 és PG-3O3W törzsek bakteriológiai tulajdonságai a következők:
Törzsek
Tulajdonságok PG-154 PG-186 PG-303W
Eredet sertés intestinum sertés colon sertés intestinumj
Sejtek alakja ejunum Coccus Coccus duodenum Coccus
(0,8-1,0 · 0,8-1,0) μ (0,8-1,0 · 0,8-1,0) μ (0,8-1,0 ·
Mozgékonyság 0,8-1,0) μ
Spóraképzés - - -
Grám festés + + +
Oxigénigény fakultatív fakultatív fakultatív
anaerob anaerob anaerob
Oxidáció-fermantáció teszt fermentatív fermentatív fermentatív
Fermentáció típus homo L-tejsav homo L-tejsav homo L-tejsav
Kataláz - - -
Oxidáz — - -
Nitrogén redukció - - -
Zselatin cseppfolyósítás - - -
Keményítő hidrolízis - + (gyengén) +
Eszkulin bomlás - - +
MR teszt + + -4»
VP teszt + (gyengén) + (gyengén) 4-
Indol képződés - - ND
NH3 képzés argininból - - -
Lakmusztej sav képződik sav képződik ND
Gázképződés glükózból (gyengén) (gyengén) ND
Optimális növekedési hőmérséklet (’C) 30-37 25-37 30-37
Növekedés 45 ’C-on - -
Növekedés 15 ‘C-on — - -
Növekedés pH 4,0-nál - - ND
Növekedés pH 9,6-nál - - -
Növekedés 4 %-os vizes nátrium-klorid oldatban
HU 202 918 Β
Törzsek
Tulajdonságok PG-154 PG-186 PG-303W
Növekedés 6,5 %-os vizes
nátrium-klorid oldatban - - -
Növekedés 40 %-os epe-agarban + (gyengén) + (gyengén) +
Műkőid növekedés (szacharóz közeg) - - -
a-hemolízis - + (gyengén) + (gyengén)
β-hemolízis - - -
Savképződés
adonit ND ND -
arabinóz - - -
arbutin + (gyengén) + +
cellobióz + + +
fruktóz + + +
galaktóz + + +
glükonát - - -
glükóz + + +
glicerin - - -
inozit - - ND
Inulin - - -
Laktóz + + +
Maltóz + + +
Mannit - - -
Mannóz - + +
Melezitóz - - -
Melibióz - - -
Raffinóz + - +
Rhamnóz - - -
Ribóz - -
Szalicin + + +
Szorbit - -
Szacharóz + + +
Trehalóz - +
Xilóz - - -
Xilit ND ND -
DNS GC-tartalma (%) 40,3 40,1 ND
A fenti táblázatban a Lys, Asp, Alá, Glu, Om, Ser és m-DAP jelentése sorrendben: lizin, aszparaginsav, alanin, glutaminsav, omitin, szerin és mező-diaminopimelinsav. Az ND jel azt jelenti, hogy nem végeztünk kísérletet, A fenti bakteriológiai tulajdonságok alapján a törzseket megpróbáltuk rendszertani osztályba sorolni. Ehhez a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Volume 2 (1986) kézikönyvet használtuk. Ennek alapján az UM-12, UM-18 és Rt-5 törzseket a Lactobacillus reuteri-hez sorolhatjuk, habár bizonyos kisebb eltéréseket tapasztalhatunk az irodalomban megjelölt tulajdonságoktól: az UM-18 és az Rt-5 törzsek negatív eredményt adtak arabinózból, fruktózból és ribózból való savtermelésre (habár az Rt-5 enyhén pozitív volt: ribózból történő savtermelésre). Mivel az UM-12 és az Rt-5 egymástól csak a növekedési hőmérsékletben és az auxotrófiában tér el, ezeket kölcsönös variánsnak tekinthetjük. A PG-98 törzs tulajdonságai lényegében azonosak a Lactobacillus ruminis tulajdonságaival. Továbbá jogosan állítjuk, hogy a PG-154-es törzs, habár a- hemolízise negatív, a Streptococcus mitior törzs; a PG-186-os törzs, habár az esz55 kulin hidrolízise negatív, a Streptococcus bovis törzs és a PG-303-as pedig a Streptococcus salivarius törzs.
Ezeknek a baktériumtörzseknek a tenyésztése a savas ureáz felhalmozása érdekében a szokásos eljárással történhet, például stacionárius tenyésztéssel, rázótenyésztéssel, merített aerob tenyésztéssel vagy szilárd tenyésztéssel, folyamatosan vagy időszakosan. Különösen előnyös a stacionárius tenyésztés. A tápközeg lehet bármely mikroorganizmusok tenyésztésére alkalmazott közeg. Szénforrásként egy vagy több anyag használható azok közül, amelyeket a tenyésztendő törzs asszimilálni képes. Ilyen anyagok a szénhidrátok, olajok és zsírok, zsírsavak, szerves savak, alkoholok és egyebek. Nitrogénforrásként szerves nitrogéntartalmú anyagokat alkalmazhatunk, például peptont, szójalisztet, őrölt gyapotmagot, kukoricaáztató folya60
HU 202 918 Β dékot, keményítő kivonatot, húskivonatot, malátakivonatot, savót és hasonlókat. Ezenkívül alkalmazhatunk szervetlen nitrogéntartalmú vegyületeket is, például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-nitrátot, ammónium-foszfátot és hasonlókat. Ezeket a forrásokat használhatjuk önmagukban vagy kombinálva. Az említett szén- és nitrogénforrásokon kívül a tápközeg előnyösen egyéb elengedhetetlen faktorokat és serkentőket is tartalmaz, például ásványi anyagokat, aminosavakat, vitaminokat stb., amelyek a növekedést és az enzim indukciót elősegítik. Ezenfelül adagolhatunk a tápközeghez karbamidot és tiokarbamidot, hogy bizonyos esetekben a savas ureáz indukcióját segítsük. A tenyésztés alatti pH érték és habzás kézbentartására előnyös lehet maró alkálihidroxid-oldat, nátriumkarbonát-oldat vagy valamely kalciumsó hozzáadása.
Inkubációs hőmérsékletként olyan hőmérsékletet választhatunk, amely megfelel a törzs növekedésének. Általában előnyösen végezhetjük a tenyésztést 15 és 55 ’C, még előnyösebben 25 és 45 ’C között. Az inkubációs időt úgy választjuk meg, hogy az elegendő legyen az organizmus növekedésére és a savas ureáz termelésére. Általában az időtartam 5 és 120 óra közötti. Ha a tenyésztést a fenti feltételekkel végezzük, a savas ureáz általában a mikroba sejtekben található. Ezért az élő sejteket, amelyeket a tenyésztő közegből centrifugálással, ülepitéssel, flokulálással vagy porózus polimer vagy kerámia membránon történő szűréssel választunk el, a következő műveletnek vagy műveleteknek kell alávetni: fagyasztásos, olvasztásos kezelés, homogenizáló kezelés, ultrahangos szétválasztás, ozmózis nyomáson alapuló kezelés, sejtfal membrán sejtbomlás, felületaktív anyagokkal végzett kezelés stb. Az így oldhatóvá tett enzimet ezután valamely szokásos enzimtisztító módszerrel megtisztítjuk. Ilyenek a protaminkezelés, frakcionális kicsapás, szerves oldószeres kezelés, izoelektromos fókuszálás, elektroforézis, ioncserélő kromatográfia, gélszűfés, af10 finitás kromatográfia, kristályosítás és hasonlók. így olyan enzimterméket kapunk, amely homogén, mint egy fehérje.
Az enzimaklivitás kísérleti meghatározása
A jelen találmányunkban említett ureáz aktivitásértékeket 37 ’C- on pH 4,0-nál határoztuk meg a következő eljárással. Az enzimoldatból megfelelő hígításban 2 ml137 ‘C hőmérsékleten inkubáltunk, pontosan 5 percig. Ehhez a hígított enzimhez 2 ml 37 ’C-ra előmelegített szubsztrátoldatot adtunk. A keveréket ráztuk, és a reakciót 37 ’C hőmérsékleten pontosan 30 percig folytattuk. Közvetlenül a reakció után 4 ml 10 %-os triklór-ecetsavat adagoltunk az elegyhez, és azt centrifugáltuk (8000 ford7perc, 5 percig). A felülúszót (2 ml) elválasztottuk, és vízzel 20 ml-re egészítettük ki. Ebből az oldatból 4 ml-hez 2 ml A színező reagens oldatot adtunk, és enyhén kevertük. Ezután 2 ml B színező reagens oldatot adtunk az elegyhez és újra enyhén kevertük, majd a reakciót 37 ’C-on 30 percig folytattuk. Ekkor szobahőmérsékleten meghatároztuk 640 nm-nél az elnyelést, összehasonlító mintaként vizet alkalmaztunk.
Másrészt a fenti enzimhigításból 2 ml-t a szubsztrátoldat helyett 2 ml 0,2 mólos citrátpufferrel ráztunk, és a reakciót 37 ’C hőmérsékleten pontosan 30 percig folytattuk. A kapott reakcióelegyet ugyanúgy kezeltük, mint a fentiekben, és így állítottuk elő az összehasonlító enzimmintát.
Ezenfelül 2 ml standard ammóniumszulfát oldatot (50 pg/ml), 1 ml 10 %-os triklór-ecetsavat és 0,5 ml 0,2 mólos citrátpuffert 20 ml-re hígítottunk vízzel, és a kapott oldatot ugyanannak a festési előhívást eljárásnak vetettük alá, mint a fentiekben, és így kaptuk a standard oldatot. Másrészt 1 ml 10 %-os triklór-ecetsavat és 0,5 ml 0,2 mólos citrátpuffert 20 ml-re hígítottunk vízzel, és a kapott oldatot a fentiekben ismertetett színezést eljárásnak vetettük alá. így kaptuk a standard összehasonlító mintát.
Az enzimaktivitást a következő egyenlettel határoztuk meg.
Enzimaktivitás (U/mg) az enzimes oldat OD-ja — az összehasonlító enzimes oldat OD-ja , hígítást faktor 1 a standard oldat OD-ja - a standard összehasonlító minta Od-ja ' enzimmennyiség (mg) 30
Egységnyinek fogadjuk el azt az enzimmennyiséget, amely 1 perc alatt 1 pmól NHj-at termel (1 U).
A fenti meghatározási eljárásban alkalmazott reagenseket és vizsgálati oldatokat a következőképpen készítjük:
A szubsztrátoldatot úgy készítjük, hogy 1,0 g karbamidot 0,2 mólos citrátpufferben oldjuk 100 ml-ig. A 10 %-os triklór-ecetsavat úgy készítjük, hogy 10 g triklór-ecetsavat vízben oldunk 100 ml-re. Az A színező reagens oldatot (fenol-nitroprusszid-nátrium oldat) úgy készítjük, hogy 5 g fenolt és 25 mg nitroprusszid-nátriumot vízben oldunk 500 ml-re. A B színező reagens oldatot (lúgos nátrium-hipoklorit oldat) úgy készítjük, hogy 5 g nátrium-hidroxidot és 74 ml nátrium-hipoklorit oldatot (effektív klór koncentráció: 5 %) vízben oldunk 500 ml-re.
A 0,2 mólos citrátpuffert úgy készítjük, hogy 25,18g citromsavat (monohidrátot) és 23,59 g nátrium-citrátot (dihidrátot) vízben oldunk 1000 ml-re (pH -4,0).
A standard ammónium-szulfát oldatot (50 pg/ml) úgy készítjük, hogy lemérünk pontosan 250,Q,mg ammónium-szulfátot, azt feloldjuk vízben 25QLml térfogatra, majd ebből az oldatból 5 ml-t vízzel 100 ml-re hígítunk.
A hagyományos ureáztól eltérően a találmány szerint előállított új ureáz pH optimuma a savas tartományba esik. Ezenfelül ez az ureáz felülmúlja a hagyományos ureázt pH-stabilitás, hőmérséklet-stabilitás és alkoholstabilitás szempontjából is. Ebből következik, hogy találmány szerint előállított ureáz kereskedelmi szempontból igen hasznos enzim.
Például ennek az ureáznak a fajlagos aktivitása több mint 20 U/mg fehérje, és ezért kisebb mennyiségben is eléggé aktív ahhoz, hogy alkoholos oldatokból le7
HU 202 918 Β bontsa és eltávolítsa a karbamidot (lásd a 104 155/1989 számon közzétett japán szabadalmi leírást), így az ilyen termékek minőségének javítására használható. Másrészt ez az ureáz igen hatékony reagens karbamid meghatározáshoz vér- és vizeletmintákból a klinikai laboratóriumi vizsgálatok során, valamint alkoholos italokban (lásd a 104 199/1989. számon közzétett japán szabadalmi leírást), valamint egyéb felhasználási célokra. Például a szakéban a karbamid meghatározást igen nagy pontossággal végezhetjük, ha a karbamidot evvel az enzimmel bontjuk el, és az indofenol módszert használjuk.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1., 2., 3. és 4. ábrán a pH és hőmérséklet, valamint az 1. példában előállított ureáz enzimes aktivitásának összefüggését tüntetjük fel.
Az 1. ábrán, amely a pH aktivitásgörbét mutatja 37°C hőmérsékleten, a ·, az o és az x sorrendben a 0,1 mólos citrátpufferben, 0,1 mólos acetátpufferben és a 0,1 mólos veronál-ecetsav-HCl-pufferben végzett meghatározás eredményét tünteti fel.
A 2. ábra, amely az enzim pH-stabilitását mutatja, a maradék aktivitást ábrázolja 30 perc után, 37 ’-C hőmérsékleten.
A 3. ábra a hőmérséklet-aktivitás görbét mutatja ρΗ-4-es értéknél 0,1 mólos citrátpufferben.
A 4. ábra, amely az enzim hőmérséklet-stabilitását mutatja, a maradék aktivitást tünteti fel 30 perc után különféle hőmérsékleteken, o jelenti a pH -4-et és a • pH 6-ot 0,1 mólos citrátpufferben.
Az 5-8., 9-12., 13-16., 17-20., 21-24., 25-29. és 29-32. ábra a pH és a hőmérséklet, valamint sorrendben a 2., 3., 4., 5., 6., 7. és 8. példa szerint előállított ureáz enzimes aktivitása közötti összefüggést mutatja. Az 5-32. ábrán látható kísérleteket 0,1 mólos citrátpufferben végeztük. Kivételt képeznek ezalól a pHstabilitás vizsgálatok.
A következőkben néhány példával illusztráljuk a találmányt.
1. Példa
A kereskedelmi forgalomban kapható GAM félfluid tápközegben tenyésztett (a tápközeg a Nissui Seiyaku Co., Ltd., Japán terméke) Lactobacillus reuteri Rt-5-ot (IFO 14 631, FERM BP-1447) 10 db 200 ml-es Erlenmeyer-lombikban oldjuk. A lombikok 50 ml következő összetételű sterilizált oltóközeget tartalmaznak: 3 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,005 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O) és 0,001 % nikkel-szulfát (6 H2O) (pH - 7,0, 30 %-os nátrium-hidroxiddal semlegesítve). A lombikokat stacioner körülmények között 34 ’C hőmérsékleten 24 órán keresztül inkubáljuk. Az így készített oltóközegeket 10 db 2 literes Erlenmeyer-lombikba töltjük át. Az egyes lombikok 1 liter azonos összetételű sterilizált tápközeget tartalmaznak. Az inkubációt stacioner körülmények között 32 ’C hőmérsékleten 2 napig végezzük. Az eljárással 10 liter tenyésztőfolyadék állítható elő, a savas ureáz aktivitása 21,6 U/ml.
A fenti tenyésztőfolyadékból centrifugálással nyerjük ki a sejteket, majd azokat 0,05 M foszfátpufferral (pH - 7,2) kétszer mossuk, és 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2), 1 mM EDTA-t és 1 mM ditiotreitolt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióhoz ezután 2 liter 0,1-0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt adunk, majd mechanikusan szétbontjuk 4500 ford./percnél 20 percen keresztül. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk, és a felülúszóhoz etanolt adagolunk 80 %-os végkoncentrációval. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük össze és 1 mM EDTA és 1 mM 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 mólos trisz-HCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Se-phadex G-100-as oszlopra visszük (7,5 cm átmérőjű, és 90 cm hosszú), az adszorpciót és az eluciót ugyanezzel a pufferoldattal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az eluátumot Sephadex G-200-as oszlopra visszük (4,5 cm átmérőjű és 150 cm hosszú), amely ugyanezzel a pufferrel van kiegyenlítve, az adszoipciót és az eluciót itt is ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE-Sephadex CL-6B adszorpciós oszlopra visszük, az eluálást a gradiens eluálási módszerrel végezzük. Ugyanezt a pufferoldatot alkalmazzuk, amely 0-0,7 M nátrium-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az oldatot ultraszűrővel koncentráljuk, Amicon 8200 UK50-es membránt alkalmazva (molekulatömeg leválasztása 50 000-nél). A puffért ekkor 0,005 M foszfátpufferral váltjuk fel (pH - 7,0), amely 1 mM 2-merkapto-etanolt tartalmaz. Ezután az oldatot affinitás-gélkromatográfiás oszlopra visszük (4 cm átmérőjű és 50 cm hosszú), amelyet Affiprep 10-zel (a Bio-Rad cég terméke) és adszorpciós célra szolgáló hidroxi-karbamiddal készítettünk el. Gradiens eluálást végzünk 0,005-0,044 M foszfátpufferral. Az aktív frakciókat egyesítjük, és a fent említett ultraszűrőt alkalmazva töményítjük. Ezután frakcionális kicsapást végzünk, majd liofilizáljuk a terméket. így 104 mg tisztított enzimport kapunk. Ennek a pornak a fajlagos aktivitása 336,5 U/mg fehérje, poliakrilamidgélelektroforézissel egyetlen fehérje sávot mutat. A tisztítási lépéseket az 1. táblázatban tüntettük fel.
A fenti módszerrel kapott liofilizált savas enzim enzimkémiai és fizikokémiai tulajdonságai a következők:
A savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidből és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben az etil-karbamidra, biurétra, metilkarbamidra, allantoinsavra és allantoinra (lásd a 2. táblázatot).
HU 202 918 Β
1. táblázat
Tisztítási lépések Összes fehérje Összes aktivitás (· 103 U) Fajlagos aktivitás (U/mg fehérje) Kitermelés (%)
Sejtmentes kivonat 14,1 183,3 13,0 100,0
Etanol 5.2 157,6 30,3 86,0
Sephadex G-100 3,0 140,1 46,7 76,4
Sephadex G-200 1,0 78,7 78,7 42,9
DEAE-Sepharose 0,37 60,7 164,0 33,1
CL-6B
Affinitás gél 0,10 35,4 354,0 19,3
Liofilizátum 0,10 35,0 336,5 19,1
2. táblázat (6) Molekulatömege
Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 220 000 dalton.
Szubsztrát
Fajlagos aktivitás (%)
Karbamid 100,0 20 (7) Izoelektromos pont
Allantoin 1,2 Poliakrilamid gélen történő izoelektromos fókuszá-
AUantoinsav 8,8 lással meghatározva az enzim izoelektromos pontja
Biurét 64,1 4,7.
Metil-karbamid 4,9
Etil-karbamid 41,1 25 (8) Kristályszerkezet
Ezt az enzimet nehezen lehet kristályosítani.
(3) pH-optimuma és pH-stabilitása
Amint az az 1. ábrán látható, az enzim pH-optimuma 2 és 4,5 között található. A 2. ábrán a maradék aktivitás látható, miután az enzimet 37 ’C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentetjük. Amint az a 2. ábrából látható, az enzim stabil 6 és 8 pH között, és elfogadható a stabilitása 2 és 10 pH között.
(4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása
Amint az a 3. ábrán látható, az enzim hőmérsékletoptimuma 60-70 ’C. A 4. ábrán az enzim maradék aktivitása látható, miután pH - 4-nél és pH - 6-nál különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük. Amint az a 4. ábrán látható, az enzim pH 6-os értéknél 60 ’C-ig stabil és elfogadható a stabilitása pH - 4-nél is, egészen 60 ‘C-ig.
(5) Inhibitorai
Amint az a 3. táblázatból látható, az enzim inhibitorai a higany(II)-klorid, ezüst-nitrát, jód-ecetsav és acetohidroxámsav.
3. táblázat
Inhibitor K loncentráció Fajlagos aktivitás (%)
nélkül 100,0
AgNO3 0,05 mM 0,7
HgCl2 0,05 mM 0,6
jódecetsav 1,00 mM 15,4
Acetohidroxámsav 10,00 mM 10,0
(9) Elemanalízis
Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 1,7 mól (pH - 4-nél, 0,1 mólos citrátpufferral).
2. példa
Az 1. példában ismertetett módon, de Lactobacillus fermentum JCM 5867-ből (IFO 14 511, FERM BP1454) készített oltótenyészetet oltunk 10, 2 literes Erlenmeyer-lombikba, amely 1 liter következő összetételű sterilizált tápközeget tartalmaz: 4 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,5 % karbamid, 0,05 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O), 0,002 % nikkel-szulfát (6 H2O), 0,002 kobaltszulfát (7 H2O), 0,005 % ón(II)-szulfát és 0,001 % stroncium-szulfát (pH - 7,0, amelyet 30 % NaOH-val állítunk be) és stacionárius tenyésztést végzünk 32 ’C hőmérsékleten 2 napon keresztül. Az eljárással 10 liter baktériumtenyészetet tartalmazó folyadékot kapunk, amelynek savas ureáz aktivitása 5,6 U/ml.
A sejteket a fenti folyadék centrifugálásával gyűjtjük össze, majd 0,05 M foszfátpufferral kétszer mossuk (pH - 7,2), és 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2), 1 M EDTA-t és 1 M ditio-treitolt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Ekkor hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt, majd a sejtszuszpenziót mechanikusan szétbontjuk 4500 ford/percnél 20 percig végzett kezeléssel. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk, majd a felülúszóhoz etanolt adagolunk 80 %-os végkoncentrációnál.
HU 202 918 Β
5. táblázat
Az üledéket centrifugálással választjuk el, és 1 M EDTA-t és 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 M triszHCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszorpciós oszlopra visszük (7,5 cm átmérőjű és 90 cm hosszú). Az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük és Sephadex G-200-as adszorpciós oszlopra visszük (4,5 cm átmérőjű és 150 cm hosszú). Az eluálást ugyanezzel a puffénál végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és ezután DEAE-Sephadex Α-50-es, ugyanezzel a pufferral kiegyensúlyozott oszlopra visszük, gradiens eluálást végzünk ugyanezzel a pufferral, amely 0-0,7 M nátrium-kloridot is tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ennek az oldatnak a fajlagos aktivitása 35,2 U/mg fehérje, és az aktivitási kitermelés 43,7 %. A termék enzimkémiai tulajdonságait a következőkben mutatjuk be.
B savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben az etil-karbamidra, biurétra, metil-karbamidra és allantoinsavra (lásd a 4. táblázatot).
4. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás (%)
Karbamid 100,0
Allantoin 0,0
Allantoinsav 3,7
Biurét 72,0
Metil-karbamid 14,0
Etil-karbamid 46,0
(3) pH-optimum és pH-stabilitás
Amint azt az 5. ábra mutatja, a pH-optimum pH - 3 körül található. A 6. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C-on különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 6. ábrán látható, az enzim 6 és 8 pH között stabil.
(4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása
Amint a 7. ábra mutatja, ennek az enzimnek a hőmérséklet-optimuma 60-70 ’C között található. A 8, ábra tünteti fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4-nél és pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 8. ábrán látható, az enzim pH - 6-nál 80 ’C-ig, pH - 4-nél 60 ’C-ig stabil.
(5) Inhibitorai
Amint az 5. táblázatban látható, az enzimet a higany(II)-klorid, az ezüst-nitrát, a réz-szulfát, a jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja.
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
AgNO3 0,05 mM 0,4
CuSO4 5H2O 0,40 mM 47,6
HgCl2 0,005 mM 0,8
jódecetsav 1,00 mM 14,9
acetohidroxámsav 10,00 mM 16,0
(6) Molekulatömeg
Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva ennek az enzimnek a mokekulatömege mintegy 210 000 és 220 000 dalton között található.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen történő izoelektromos fókuszálással meghatározva az enzim izoelektromos pontja 4,8.
(8) Kristályszerkezet
Az enzimet nehezen lehet kristályosítani.
(9) Elemanalízis
Nem végeztük a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 1,0 mM (pH - 2-nél 0,1 M citrátpufferral).
3. példa
Kereskedelmi forgalomban kapható GAM félfluid tápközegen tenyésztett (a tápközeg a Nissui Seiyaku cég terméke) Streptococcus bovis PG-186-ot (IFO 14 634, FERM BP-1449) 10, 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba oltunk, amely egyenként 50 ml következő összetételű sterililzált oltótápközeget tartalmaz: 4 % glükóz, 1,5 % polipepton, 1 % húskivonat, 0,8 % élesztőkivonat, 0,5 % nátrium-klorid, 0,2 % vízmentes nátrium-acetát, 0,5 karbamid, 0,005 % mangán-szulfát (mintegy 4 H2O) és 0,001 % nikkel- szulfát (6 H2O) (pH - 7,0, 30 %-os NaOH-val semlegesítve). A lombikokat álló kultúrában 34 ’C hőmérsékleten 24 órán keresztül inkubáljuk. Az így elkészített oltótenyészetet 10 db 2 literes Erlenmeyer lombikba töltjük, amely egyenként 1 liter azonos összetételű sterilizált tápközeget tartalmaz és az inkubálást álló körülmények között 32 ’C hőmérsékleten 2 napig végezzük. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, melynek savas ureáz aktivitása 7,6 U/ml.
A fenti tenyészetet centrifugáljuk, így nyerjük ki a sejteket, amelyeket azután kétszer 0,05 M foszfátpufferral (pH - 7,2) mosunk, majd 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2) 1 mM EDTA-t és 1 mM ditiotreitolt tartalmazó oldatban szuszpendálunk. Ekkor hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű
-101
HU 202918 Β üveggyöngyöt, és a sejtszuszpenziót mechanikusan szétbontjuk 4100 ford/perccel 20 percig kezelve. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk és etanolt adunk a felülúszóhoz 80 %-os végkoncentrációig. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük össze és 0,05 M trisz-HCl-pufferban (pH » 7,0), amely 1 mM EDTA-t és 2-merkapto-etanolt is tartalmaz, oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszoipciós oszlopra visszük (átmérő: 1(5 cm, hosszúság: 90 on), és az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az eluátumot azonos pufferral kiegyenlített Sephadex G-200-as adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 4,5 cm, hosszúság: 150 cm), és az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE- Sephadex CL-6B adszorpciós oszlopra visszük, az eluálást gradiens eluálási módszerrel végezzük ugyanezzel a pufferoldattal, amely 0 és 0,7 M közötti nátriuim-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az oldatot ultraszűrővel koncentráljuk, Amicon 8200 UK-50-es membránt alkalmazunk (molekulatömeg leválasztóképessége 50 000 daltonnál). A puffért ekkor egy 1 mmól 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,005 M foszfátpufferral váltjuk fel (pH - 7,0). Ezután az oldatot affinitásgélkromatográfiás oszlopra visszük (átmérő: 4 cm, hosszúság: 50 cm), amelyet Affiprep 10-zel (a BioRad cég terméke) és adszorpciós célú hidroxi-karbamiddal készítettünk el. Gradiens-eluálást végzünk 0,005 M és 0,044 M közötti foszfátpufferral. Az aktív frakciókat egyesítjük, és a fent említett ultraszűrővel töményítjük. Ezután frakcionális kicsapást végzünk, és a terméket liofilizáljuk. így 104 mg tisztított enzimport kapunk. Ennek a pornak a fajlagos aktivitása 124 U/mg fehérje.
Az így előállított liofilizált savas enzim enzimkémiai és fizikokémiai tulajdonságai a következők:
C savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim a karbamidra hat (6. táblázat)
6. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás (%)
Karbamid 100,0
Allantoinsav 0,0
Biurét 0,0
Etil-karbamid 0,0
(3) pH-optimuma és pH-stabilitása Amint az a 9. ábrán látható, az enzim pH-optimuma körül van. A 10. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 ’C-on különböző pH-értékeknél percig pihentettük. Amint az a 10. ábrából látható, az enzim 6 és 10 közötti pH-értéknél stabil.
(4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása Amint az a 11. ábrán látható, az enzim hőmérséklet-optimuma 60-70 ’C között van. A 12. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál és különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük.
Amint az a 12. ábrából látható, az enzim pH - 6-nál 50 ’C-ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint a 7. táblázat mutatja, az enzimet a higany(II)klorid és az acetohidroxámsav gátolja.
7. táblázat
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCli 1 mM 0,0
Jódecetsav 10 mM 89,8
Acetohidroxámsav 10 mM 9,8
(6) Molekulatömeg
A poliakrilamid-gélelektroforézises módszerrel az enzim molekulatömege mintegy 190 000 dalton [lásd H. Eng et all; Can. J. Microbial., 32, 487 (1986)].
Sephadex G-200-as gélszűréssel az enzim molekulatömegét mintegy 170 000 daltonnak találtuk.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja mintegy 4,7.
(8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
Nem végeztük a kristályosodási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 0,2 mM (pH - 5,0, 0,1 mólos citrátpuffer).
4. példa
A 3. példában ismertetett eljárással Streptococcus mitior PG-154-et (IFO 14 633, FERM BP-1448) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot készítünk, amelynek aktivitása 5,4 U/ml.
Az így előállított tenyésztőfolyadékot centrifugálva nyerjük ki a sejteket, amelyeket kétszer 0,05 M foszfátpufferral mosunk (pH - 1(2), majd 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2) 1 mM EDTA-t és 1 mM ditio-treitolt tartalmazó oldatban szuszpendálunk. Ezután a sejtszuszpenzióhoz hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt, és mechanikus szétbontásnak vetjük alá 4500 fordulat/perc kezeli
-111
HU 202 918 Β
9. táblázat léssel 20 percig. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszóhoz etanolt adagolunk 80 % végkoncentrációval. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük, és 1 mM EDTA-t és 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 M trisz-HCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 7,5 cm, hosszúság: 90 cm), és az eluálást ugyanezzel a pufferoldattal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az eluátumot ezután Sephadex G-200-as, ugyanezzel a pufferral kiegyenlített adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 4,5 cm, hosszúság: 150 cm) és az eluálást szintén ezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE Sephadex CL-6B adszorpciós oszlopra visszük, az eluálást a gradiens eluálási módszerrel végezzük ugyanezzel a pufferral, amely még 0 és 0,7 M közötti nátrium-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az oldat fajlagos aktivitása 76,3 U/mg fehérje, az aktivitás 38,7 %-os. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők:
D savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim főleg a karbamidra és bizonyos mértékig a biurétra és az etil-karbamidra hat (8. táblázat).
8. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás (%)
Karbamid 100,0
Allantoinsav 0,0
Biurét 22,0
Etil-karbamid 18,8
(3) pH-optimuma és pH-stabilitása
Amint a 13. ábra mutatja, az enzim pH-optimuma 4 és 5 között van. A 14. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 14. ábrán látható, az enzim 4 és 8 közötti pHértékeknél stabil.
(4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás
A 15. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 60 ’C körül van. A 16. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 16. ábráról látható, az enzim pH - 6-nál 60 °C-ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint a 9. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid, jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja.
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCl2 1 mM 0,0
Jódecetsav 10 mM 0,6
Acetohidroxámsav 10 mM 19,2
(6) Molekulatömeg
Poliakrilamid-gélelektroforézissel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 160 000 dalion. Sephadex G-200-as gélszűréssel az enzim molekulatömegét 240 000 daltonnak találtuk.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,6 körül van.
(8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 0,3 mM (pH - 4-nél, 0,l mólos citrátpufferral).
5. példa
A 3. példában ismertetett eljárással Streptococcus salivarius PG-3O3W-t (IFO 14 746, FERM BP-1856) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter tenyésztőfolyadékot kapunk, amelynek aktivitása 4,3 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 4. példában ismertetett tisztítási eljárásnak vetjük alá, és így egy 68,2 U/mg fehérje fajlagos aktivitású enzimet kapunk. Az aktivitási százalék 41,2 %. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők:
E savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim főleg a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben a biurétre és az allantoinsavra (lásd a 10. táblázatot).
10. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás (%)
Karbamid 100,0
Allantoinsav 12,0
Biurét 60,0
Etil-karbamid 50,0
-121
HU 202918 Β (3) pH-optimum és pH-stabilitás
Amint a 17. ábra mutatja, az enzim pH-optimuma
4. A 18. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 ’C hőmérsékleten különböző pHértékeknél 30 percig pihentettük. Amint a 18. ábrából látható, az enzim 6 és 11-es pH-érték között stabil.
(4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás
A 19. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 60-70 ’C között van. A 20. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6 értéknél különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük. Amint a 20. ábrából látható, az enzim 6-os pH-értéknél 60 ’C-ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint a 11. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja.
11. táblázat
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCl2 0,05 mM 2,0
Jódecetsav 10,00 mM 100,0
Adetohidroxámsav 10,00 mM 15,2
(6) Molekulatömeg
Poliakrilamid-gélelektroforézissel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 110 000 dalton. Sephadex G-200-as gélszűréssel végezve a meghatározást az enzim molekulatömegét körülbelül 140 000 daltonnak találtuk.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,7.
(8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 0,2 mM (pH - 4, 0,1 mólos citrátpuffer).
6. példa
Az 1. példában ismertetett módon Lactobacillus ruminis PG-98-at tenyésztünk (IFO 14 632, FERM BP-1906). Az eljárással 10 liter .baktériumtenyésztő folyadékot állítunk elő, amelynek savas ureáz aktivitása 5,2 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással tisztítjuk, és így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 36,7 U/mg fehérje. Az aktivitás százaléka
42,8 %. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők:
F savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitás
Az enzim főként a karbamidra hat és bizonyos mértékig az etil-karbamidra és a biurétre (lásd a 12. táblázatot).
12. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás (%)
Karbamid 100,0
Allantoinsav 0,0
Biurét 26,0
Etil-karbamid 5,0
(3) pH-optimum és pH-stabilitás
A 21. ábrán látható, hogy az enzim pH-optimuma
5. A 22. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 ’C hőmérsékleten különböző pHértékeken 30 percig pihentettük. Amint az a 22. ábrából látható, az enzim pH - 4 és 8 közötti értékeken stabil.
(4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás
A 23. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 55 és 60 ’C között van. A 24. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint a 24. ábrából látható, az enzim pH - 6 értéknél 55 ’C-ig, pH - 4 értéknél 30 ’C-ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint azt a 13. ábra mutatja, az enzimet a higany(II)-klorid, a jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja.
13. táblázat
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCl2 0,05 mM 0,0
Jódecetsav 10,00 mM 50,0
Acetohidroxámsav 10,00 mM 0,0
(6) Molekulatömeg
Sephadex G-200 gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 150 000 dalton.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,7.
-131
HU 202 918 Β
15. táblázat (8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 1,2 mM (pH - 5, 0,1 mólos citrátpuffer).
7. példa
Az 1. példában leírt eljárással Lactobacillus reuteri UM-12-t (IFO 14 629, FERM BP-1904) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, amelynek savas ureáz aktivitása 3,6 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással kezeljük. így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 33,4 U/mg fehérje. Az aktivitási százalék 45,3 %. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők:
G savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspcecifitása
Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékig az etil-karbamidra és biurétre (lásd a
14. táblázatot).
14. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás
Karbamid 100,0
Allantoinsav 0,0
Biurét 7,9
Etil-karbamid 25,5
(3) pH-optimuma és pH-stabilitás
A 25. ábra szerint az enzim optimális pH-ja 4. A 26. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 ’C hőmérsékleten különböző pH-értékeken 30 percig pihentettük. Amint az a 26. ábrán látható, az enzim pH « 4 és 8 között stabil.
(4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás
A 27. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 70-75 ’C között van. A 28. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4 és pH 6 értéknél 30 percig pihentettük. Amint a 28. ábrán látható, az enzim pH - 6-nál 75 ’C-ig, pH - 4-nél pedig 65 ’C-ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint az a 15. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja.
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCli 0,05 mM 0,0
Jódecetsav 10 mM 100,0
Acetohidroxámsav 10 mM 17,1
(6) Molekulatömeg
Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 210 000 dalton.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,8.
(8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
A kristályosítási nehézségek miatt nem végeztünk.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 1,3 mM (pH - 4, 0,1 mólos citrátpuffer).
8. példa
Az 1. példában ismertetett eljárással Lactobacillus reuteri UM-18-at (IFO 14 630, FERM BP-1905) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, amelynek savas ureáz aktivitása 4,5 U/ml. Ezt a tenyészetet a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással tisztítjuk, és így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 39,8 U/mg fehérje. Az aktivitási százalék 41,7 %. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők:
H savas ureáz (1) Hatása
Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel.
(2) Szubsztrátspecifitása
Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékig az etil-karbamidra, biurétra és allantoinsavra (lásd a 16. tázlázatot).
16. táblázat
Szubsztrát Relatív aktivitás
Karbamid 100,0
Allantoinsav 12,3
Biurét 82,4
Etil-karbamid 66,2
-141
HU 202 918 Β
18. táblázat (3) pH-optimuma és pH-stabilitása
A 29. ábra szerint az enzim pH-optimuma 3. A 30. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 ’C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 30. ábrából látható, az enzim 5 és 8 közötti pH-értékeknél stabil.
(4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás
A 31. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 70-75 ’C. A 32. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4-nél és pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 32. ábrából látható, az enzim pH - 6-nál 70 “C-ig, pH - 4-nél 65 ’C- ig stabil.
(5) Inhibitorok
Amint az a 17. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja.
17. táblázat
Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%)
nélkül 100,0
HgCh 0,05 mM 0,0
Jódecetsav 10,00 mM 99,0
Acetohidroxámsav 10,00 mM 7,9
(6) Molekulatömeg
Sephadex G-200-as gélszúréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 230 000.
(7) Izoelektromos pont
Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,5.
(8) Kristályszerkezet
Az enzim nehezen kristályosítható.
(9) Elemanalízis
Nem végeztünk a kristályosítási nehézségek miatt.
(10) Km
Az enzim Km-értéke 4,8 mM (pH - 3, 0,1 mól citrátpuffer).
1. Vizsgálati példa
A 3-5. példában előállított C, D és E savas ureázok enzimaktivitását mértük úgy, hogy a reakcióoldat különböző koncentrációkban etanolt is tartalmazott. Amint az a 18. táblázatból látható, ezek az ureázok a karbamidra gyakorolt hatásukat 20 vagy 50 % etanol jelenlétében is képesek kifejteni.
Savas ureáz Relatív aktivitás %
Etanol-koncentráció %
0 20 50
C savas ureáz 100 84,2 51,6
D savas ureáz 100 85,0 50,4
E savas ureáz 100 82,6 47,6
2. Vizsgálati példa
Az 1., 2., 6., 7. és 8. példában előállított A, B, F, G és H savas ureáz, valamint a Canavalia Adans ureáz koncentrációit 10 U/ml-re állítjuk be, és ezeket az enzimaktivitásokat vizsgáljuk 20 % etanol jelenlétében, 20 ’C hőmérsékleten. Az eredményeket a 19. táblázatban tüntettük fel.
19. táblázat
Savas ureáz Relatív aktivitás (%)
A savas ureáz 100,0
B savas ureáz 95,0
F savas ureáz 107,0
G savas ureáz 119,7
H savas ureáz 121,6
Canavalia Adans ureáz* 0,5
* Megjegyzés: A Canavalia Adans-ból nyert ureáz, amelynek pH-optimuma 7,0, a P.L. Biochemicals, Inc., UDA cég terméke.

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás savas ureáz előállítására - fizikokémiai tulajdonságai a következők:
    (1) hatása: 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel, (2) szubsztrátspecifitása: a karbamidra hat, (3) pH-optimuma és pH-stabilitása: pH-optimuma 1,5 és 5,5 között van, pH 6-8 között 37 ’C-on 30 percig stabil, (4) hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása: hőmérséklet-optimuma és pH-optimumán 55 ‘C és 75 ’C között van, pH 6-nál 50 ’C hőmérsékletig 30 percig stabil marad, (5) inhibitorai: higany(II)-klorid és acetohidroxámsav gátolja, (6) molekulatömege: gélszűréssel meghatározva 100 000-250 000 dalton között, (7) fajlagos aktivitása: a pH-optimumon, 37 ’C-on legalább 20 U/mg fehéije azzal jellemezve, hogy megfelelő tápközegben tenyésztünk valamely a Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus reminis, Streptococcus bovis, Streptococcus mitior vagy Streptococcus salivarius fajhoz tartozó mikroorganizmust, majd a tenyésztőfolya15
    -151
    HU 202 918 Β dékból kinyerjük a savas ureázt. (Elsőbbsége: 1987.07.
    09.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Lactobacillus fermentum JCM 5867 (IFO 14 511, FERM BP-1454)-t alkalma- 5 zunk. (Előbbsége: 1987. 07. 09.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Lactobacillus reuteri Rt-5 (IFO 14 631, FERM BP-1447)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 07. 09.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Lactobacillus ruminis PG98 (IFO 14632, FERM BP-1906)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 07. 09.)
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Lactobacillus reuteri UM12 (IFO 14 629, FERM BP-1904)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 07. 09.)
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikrooiganizmusként Lactobacillus reuteri UM18 (IFO 14 630, FERM BP-1905)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1987. 07. 09.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikrooiganizmusként Streptococcus bovis PG186 (IFO 14 634, FERM BP-1449)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 04. 14.)
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, 10 hogy mikroorganizmusként Streptococcus mitior PG154 (IFO 14 633, FERM BP-1448)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 04. 14.)
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Streptococcus salivarius
    15 PG-303W (IFO 14 746, FERM BP-1856)-t alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 04. 14.)
HU883602A 1987-07-09 1988-07-08 Process for producing acidic urease HU202918B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP17175087 1987-07-09
JP9235688 1988-04-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT47316A HUT47316A (en) 1989-02-28
HU202918B true HU202918B (en) 1991-04-29

Family

ID=26433800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU883602A HU202918B (en) 1987-07-09 1988-07-08 Process for producing acidic urease

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5093255A (hu)
EP (1) EP0298641B1 (hu)
KR (1) KR960014702B1 (hu)
CN (1) CN1037617C (hu)
AU (1) AU615661B2 (hu)
BG (1) BG48218A3 (hu)
BR (1) BR8803412A (hu)
CA (1) CA1333889C (hu)
DE (1) DE3884295T2 (hu)
ES (1) ES2058287T3 (hu)
HU (1) HU202918B (hu)
MX (1) MX173764B (hu)
NZ (1) NZ225225A (hu)
PT (1) PT87941B (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4837017A (en) * 1987-03-12 1989-06-06 Leveen Harry H Urease antigen product and process
EP0654273A1 (en) * 1993-11-18 1995-05-24 Harry H. Leveen Pharmaceutical product and method for treatment
FR2715166B1 (fr) * 1994-01-18 1996-04-26 Orstom Souches bactériennes phylogénétiquement proches du genre Lactobacillus et du genre Bacillus, procédé de culture et applications.
US5846752A (en) * 1996-07-26 1998-12-08 Board Of Trustees Operating Michigan State University Mutant urease and method of use for determination of urea
US7717857B2 (en) * 2007-04-25 2010-05-18 Stc.Unm Diagnosis of P. aeruginosa infection in the lungs of patients
JP2011193857A (ja) * 2010-03-24 2011-10-06 Sumitomo Chemical Co Ltd Ｎ−カルバモイルアミノ化合物の製造方法
JP2011217737A (ja) * 2010-03-24 2011-11-04 Sumitomo Chemical Co Ltd ５−（アミノメチル）−２−クロロチアゾールの製造方法
CN102242109B (zh) * 2011-04-29 2012-11-07 江南大学 一种保持固定化酸性脲酶酶膜稳定性的方法
CN103571815B (zh) * 2013-10-29 2016-03-02 江南大学 一种高效制备食品级酸性脲酶的方法及应用
CN105861235B (zh) * 2016-06-22 2019-11-08 江南大学 一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法
CN107723259A (zh) * 2017-10-17 2018-02-23 华北水利水电大学 一种培养具有高脲酶活性的巴氏生孢八叠球菌的方法
CN109735575B (zh) * 2019-01-18 2022-04-22 东南大学 一种从土壤中直接提取植物脲酶制备碳酸钙的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5620830A (en) * 1979-07-26 1981-02-26 Matsushita Electric Ind Co Ltd Rotation transmitting device
JPH0657149B2 (ja) * 1986-01-13 1994-08-03 サッポロビール株式会社 ウレア−ゼ及びその製造法
AU598305B2 (en) * 1986-10-14 1990-06-21 Gekkeikan Sake Company, Ltd. Quality improvement of alcoholic liquors
EP0280398B1 (en) * 1987-02-06 1993-06-30 NAGASE & COMPANY, LTD. Method for producing acid urease, and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR960014702B1 (ko) 1996-10-19
MX173764B (es) 1994-03-28
ES2058287T3 (es) 1994-11-01
EP0298641B1 (en) 1993-09-22
AU1871688A (en) 1989-01-12
PT87941A (pt) 1989-06-30
BG48218A3 (en) 1990-12-14
EP0298641A2 (en) 1989-01-11
HUT47316A (en) 1989-02-28
BR8803412A (pt) 1989-01-24
CN1036405A (zh) 1989-10-18
CN1037617C (zh) 1998-03-04
PT87941B (pt) 1995-03-01
DE3884295T2 (de) 1994-01-20
MX12205A (es) 1993-09-01
EP0298641A3 (en) 1990-01-31
AU615661B2 (en) 1991-10-10
KR890002391A (ko) 1989-04-10
DE3884295D1 (de) 1993-10-28
NZ225225A (en) 1991-06-25
CA1333889C (en) 1995-01-10
US5093255A (en) 1992-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5932463A (en) Gluconobacter alcohol/aldehyde dehydrogenase
HU202918B (en) Process for producing acidic urease
US3871963A (en) Microbial protease and preparation thereof
US4315988A (en) Thermophilic collagenases, thermophilic bacteria capable of producing thermophilic collagenases, and process for producing said collagenases
EP0260137B1 (en) Assay method using novel NAD synthetase and a process for production of the enzyme
US5281527A (en) Process for producing pullalanase
US4902622A (en) Novel α-1,6-glucosidase and process for producing the same
US4610964A (en) Novel microorganism and its use in a process for the preparation of alpha amylase
WO2001016302A1 (fr) Nouvelle enzyme thermostable digerant le collagene, nouveau micro-organisme produisant l'enzyme et methode de production de l'enzyme
CA1336414C (en) D-amidase and process for producing d-–-alanine and/or l-–-alanineamide
EP0871719A1 (en) Psychrophilic protease and psychrophilic bacteria
EP0365158B1 (en) Process for production of l-alanine dehydrogenase and a microorganism strain of the genus sporolactobacillus
JP3799784B2 (ja) ２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドおよび２’−デオキシグアノシンの製造法
EP0243167A1 (en) A novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same
EP0206595B1 (en) Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism
Kawahara et al. Isolation and characterization of a new type of collagenase producing bacterium, Bacillus alvei DC-1
US5252470A (en) D-amidase and process for producing D-α-alanine and/or L-α-alanineamide
US4496655A (en) Process for the production of tyramine oxidase
JPH01148192A (ja) カルニチンの製造法
KR960007741B1 (ko) 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법
JP3873512B2 (ja) Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法
EP0739978A2 (en) Hydantoinase from agrobacterium tumefaciens and its use for the preparation of optically pure N-carbamyl-D-amino acids from racemic hydantoins
Jung et al. Purification and Characterization of a Bacteriolytic Enzyme from Alkalophilic Bacillus sp.
KR0127100B1 (ko) 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법
JPH0147150B2 (hu)

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee