JP2013509365A - コリスチンの精製方法および精製コリスチン成分 - Google Patents
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Abstract
Description
Care 2006,10:R27(doi:10.1186/cc3995を参照されたい)。
1)主成分(PE1)、関連物質および不純物の毒物学的寄与を明らかにする可能性
2)新たなおよびより正確な薬理学的なおよび薬物動態学的な研究に適した製品
3)様々な不明確な物質を生み出すことなく、明確な誘導体、たとえばコリスチメタン酸塩を合成する可能性
4)規制手順を簡略化する、コリスチンおよびコリスチメタン酸塩の両方についてのより良好なおよびより正確な分析方法を開発する可能性
5)明らかな薬理学的および毒物学的データに基づく一義的な投薬推奨
6)大きい需要のある、「現代的」抗生物質へのコリスチンのアップグレード
を提供する。
本発明は、コリスチンの主成分であるポリミキシンE1の実質的に純粋な(90〜98%純度)、コリスチンモノ成分と呼ばれる製剤の製造方法に関する。
・ 酢酸および高(4M)エタノール濃度中のコリスチン塩基をRPカラムに装填する工程
・ 低(1.6〜2M)エタノール濃度で溶出する工程
によって特徴づけられる。
好適なRP材料の特定を含む作業は、10×250mmスチールカラムでの実験室規模で行われた。
94〜98%)、PE2(0〜0.1)、PE3(0.0)、PE1−Ile(0.2〜1.0%)、PE1−7MOA(0.5〜2.0%)、および総残存不純物 0.5〜2.0%。
「ポリミキシンE1」は、以前はコリスチンAと称された化合物、ならびに
Chemical Abstractsによって7722−44−3と指定された化合物、
ならびに
N2−(6−メチル−1−オキソオクチル)−L−2,4−ジアミノブタノイル−L−スレオニル−L−2,4−ジアミノブタノイル−L−2,4−ジアミノブタノイル−L−2,4−ジアミノブタノイル−D−ロイシル−L−ロイシル−L−2,4−ジアミノブタノイル−L−2,4−ジアミノブタノイル−L−スレオニン環状(10−4)−ペプチド、
ならびに
コリスチンIV
を包含することが意図される。
「硫酸コリスチン」は、コリスチンのあらゆる硫酸塩を包含することが意図される。
「組成物」は、3つ以上の異なる化合物を含むあらゆる混合物、たとえば2つの活性医薬原料の混合物、または1つの活性医薬原料と1つ以上の医薬賦形剤との混合物である。
きる。
「精製」は、所望の化合物の濃度が上げられるあらゆる分離方法である。
「固定相」は、化合物を保持することができるリガンドを含むあらゆる表面である。
「リガンド」は、化合物の結合が起こる、固定相の部分である。
「逆相クロマトグラフィー」は、より極性のまたは帯電した成分が、極性の少ない成分より先に溶出されるあらゆるクロマトグラフィーである。
「高エタノール濃度」は、容積の20%以上、典型的には20%〜30%のエタノール濃度を意味する。
「%v/v」は容積百分率を意味する。
分子の強い極性部分を構成する。
HPLC分画およびHPCLプールを監視するために、分析HPLC法が標準方法をベースとして開発された。改良された方法は、従来のHPLC法を用いたときには目に見えなかった、PE1主ピーク下の少量の関連成分(f1、e1、e2)を明らかに見えるようにした。
実験の部
分取HPLC
10×250カラム:ミリグラム規模でカラム材料を選別するために、スチールカラム10×250mmを使用した。このカラムに、96%エタノールに懸濁された様々な被験樹脂を充填した。
LiChrosphere 60 RP select B(15μm)を96%エタノールに懸濁させ、カラムに充填した。上部フランジを取り付け、すべての過剰のエタノールが除去されるまでピストンを50バールで上向きに押し進めた。1mlの0.1mg/mlのヨウ化カリウム溶液を適用することによってカラムを試験し、吸収を227nm、AUFS=0.05および流量55.5ml/分で測定した。記録されたピークは、満足のいく対称的な狭いガウス(Gauss)曲線であった。
カラム:Dan Process A/Sによって生み出される動的軸圧縮ありの10×250mmステンレススチールMerckカラムおよび50×850mmステンレススチールカラム
ポンプ:低圧側に混合バルブ付きの4つの異なる溶媒入口を持った、0.5〜150ml/分の流量間隔のWaters Delta Prep 4000
検出器:Waters 486調節可能な吸光度検出器(Waters 486 Tunable Absorbance Detector)
積分器:Merck−Hitachi D−2000 Chomato−Integrator
分画収集器:Waters分画収集器(Waters Fraction Collector)
からなった。
分析HPLC:
用いられるカラムは、移動相としてアセトニトリルを使ってNovapak 4,6×150、4μm、C18であった。CH3CN溶液の濃度を21%から(10分の定組成ラン後に)30%まで5分の時間間隔の間に上げた。カラムは温度自動調節しなかったが
、周囲温度(23±2℃)でランを行った。
カラム:Waters Novapak 4,6×150、4μ C18および等価の4,6×250カラム
ポンプ:Watersポンプ制御モジュール(Waters Pump Control
Module)付き2psc.Waters 510
検出器:Waters 490 Eプログラム可能な多波長検出器(Waters 490 E Programmable Mlti−wavelength Detector)
分画収集器:Waters 717 プラス オートサンプラー(Waters 717
plus Autosampler)
からなった。
1)Merck No.9303 LiChroprep RP−18、25〜40μm、バッチ:L 275703 614。
3)Merck No.11023 LiChrospher 60 RP−select B、15μm、(C8)、バッチ:L 139923 633.
4)Merck No.150385 Hibar Fertigsaeule RT
LiChrospher、RP−18、15μm、Cat.50014。
6)ToosoHaas Amberchrom CG 71 S、35μm、Lot
No.23770319。
8)ToosoHaas No.22225 Toyopearl MD−P Butyl、35μm、強疎水性
10×250カラム試行のための化学薬品:
硫酸コリスチン、バッチ:A4660314、Axellia ApS、Copenhagen DK
コリスチン塩基、バッチ:A1551701、Axellia ApS、Copenhagen DK
エタノール、96%、「Danisco Distillers」、Danisco A/S
メタノール、Merck LiChrosolv no.6018
ジメチルスルホキシド、Merck Uvasol No.2950
1,2−プロパンジオール reinst、Merck no.7478
2−プロパノール、LiChrosolvグラジエントグレード、Merck No.1040
酢酸、100% G.R.Merck No.63
1−メチルピロリドン−(2)z.s.、Merck No.806072
トリエチルアミン、Pierce No.25108
テトラヒドロフラン、Fluka No.87367
酢酸アンモニウム p.a.Merck No.1116
硫酸アンモニウム p.a.Merck No.1217
硫酸98%p.a.
水酸化ナトリウムペレット、GR、Merck No.6498
Mili−Q水、Purification lab.、R & D、FCD、Axellia ApS、Copenhagen DK
Millipore、タイプHV膜フィルター、0,45μm。
50×825カラム試行のための化学薬品:
Danisco Distillers、Danisco A/S製のエタノール 96%および99,9%
酢酸、100% G.R.Merck No.63
水酸化ナトリウムペレット、GR、Merck No.6498
NaOH、27% Production dept.
水酸化カリウム、USP XIX、Ferak Berlin No.20907
10×250カラム試行:
次のクロマトグラフ樹脂は、樹脂への強い結合、顕著な尾引き、低いクロマトグラフ純度または低い回収率のいずれかのために、分離目的には不適当であることが分かった:ToosoHaas Amberchrom CG 71 S;ToosoHaas Toyopearl MD−Pエーテル、35μm、ToosoHaas Toyopearl MD−Pブチル、35μm;Merck LiChroprep RP−8、25〜40μm;Merck Hibar Fertigsaeule RT LiChrospher、RP−18、15μm;Eka Nobel Kromasil−100Å、C8、16μm
11mgの硫酸コリスチンを適用された、pH約3,5(50mMのHAc)で60分の間に0%〜60%のエタノールグラジエントでのLichroprep C18、25〜40μmを使った1回目の10×250カラム試行については、良好な収率で約90%の相対クロマトグラフ純度(RCP)が得られた。しかし、同じ条件で45分の間に10〜25%エタノールグラジエントを適用することによってエタノール濃度を下げようと試みたとき、分離はまったく観察されず、顕著な尾引きが観察された。
上記の実験は、幾つかの意外な結果、たとえばa)EHSにやさしい溶媒エタノールがコリスチンの逆相(RP)HPLC分離のための溶出液として有用であること、およびb)分離は、さらなる精製のために硫酸コリスチンを使用する代わりに酢酸の存在下にコリスチン塩基で行うべきであることを与えた。樹脂LiChroprep C18は有望な分離特性を示したが、それがスケールアップに好適であると分かったわけでない。
平衡:0,1M酢酸中5%エタノール
適用:0,1M酢酸中4mlの30%エタノールに溶解させた110mgのコリスチン塩基
溶出液:60℃の温度での0,1M酢酸中15%エタノール
温度:40℃
溶出液流量:2.22ml/分
固相と溶出液との間のコリスチン成分の平衡をより速く達成させるために、より高い温度を選択したが、実験は、より高い温度が結果にいかなる著しい影響も及ぼさないことを示した。カラムオーブンおよび溶出液相の両方の温度をそれ故、プール純度および収率のいかなる有意な変化もなしに40°/60°から35°/50°に下げた。最後に、0.1M酢酸中5〜15%エタノールグラジエントは30°/40°でランが実行されて良好な結果であり、逆グラジエントが相対クロマトグラフ純度、収率および尾引きプロフィールの大きいプラスの変化に実際に関与することを確認した。
実施例1−RP−HPLC精製;ミニ分取規模
機器:スチールカラム 10×250mm(φ=10mm)
Waters Delta Prep 4000 Prep.Chrom.System
Waters 4000 System Controller
Waters 486 Tunable Absorbance Detector
Waters Fraction Collector
Merck Hitachi D−2000 Chromato−Integrator
樹脂:LiChrospher 60 RP−select B Merck No:11023.
流量:2.22ml/分(300×700mmへのスケールアップ時は約2L/分)
λ:230nm
AUFS:2(検出器感度 ほぼ最低レベル)
A緩衝液:Mili−Q水中の0.10MのCH3COOH中12%エタノール(96%)
適用溶液:5酸当量のCH3COOH 約2,5ミリモル 約0,15mlの100%CH3COOH(17M)の添加による0.10MのCH3COOH中15mlの24%エタノール(96%からの)に溶解されたコリスチン塩基、600mg 約0,5ミリモル;2MのNaOHでpH=7.5に調整された;溶液は膜濾過される(0.45μm)
1)カラムの平衡:A緩衝液で平衡にされる
2)適用:供給管を通して酢酸コリスチン溶液(40mg/ml)を2.22ml/分で適用し、これに1mlのA緩衝液が続く
3)溶出:カラムをA緩衝液で直ちに溶出し、溶出液を1ml分画 約2.22mlにて集める。
5)HPLC分析:E1の面積が20〜30×106AUに達するまで試料を希釈する;高コリスチン標準は典型的には20×106AUに達する;Colistin NovaSを用いて試料を分析する(30分ラン)。
実施例2−RP−HPLC精製;パイロット規模:
機器:スチールカラム 50×830mm(φ=50mm)、「Dan−プロセス」
Waters Delta Prep 4000 Prep.Chrom.System
Waters 4000 System Controller
Waters 486 Tunable Absorbance Detector
Waters Fraction Collector
Merck Hitachi D−2000 Chromato−Integrator
樹脂:LiChrospher 60 RP−select B、Merck No:11023、1Kg
流量:65ml/分(300×700mmへのスケールアップ時は約2L/分)
λ:230nm
AUFS:2(検出器感度 ほぼ最低レベル)
A緩衝液:Mili−Q水中の0.10MのCH3COOH中12%エタノール(96%
)
適用溶液:コリスチン塩基、50g約42ミリモル(そのままで)を、5.83酸当量のCH3COOH 約245ミリモル 約14,5mlの100%CH3COOH(17M)の添加による1000mlの24%エタノール(96%)に溶解させる;pHを2MのNaOHでpH=7.5に調整する;溶液を、フィルター助剤としてCeliteを使用して膜濾過する(0.45)
イオン強度:4〜6mS/cm
1)カラムの平衡:A緩衝液で平衡させる
2)適用:酢酸コリスチン溶液(48mg/ml)を14分の間65ml/分で適用し、引き続きA緩衝液を0.1分の間約43.5g適用する
3)溶出:カラムをA緩衝液で、吸収が漸近線0.010V±10mVに降下してしまうまで溶出し、溶出液を3分間で約585ml、18分画に集める
4)カラムの洗浄:24%エタノールと50%の1,2−プロパンジオールとの混合物200ml(50ml/分で4分)を適用し、これに吸収がゼロレベルまで低下してしまうまでA緩衝液が続く
5)HPLC分析:E1の面積が20〜30×106AUに達するまで試料を希釈する(5×);高コリスチン標準は典型的には20×106AUに達する;Colistin
NovaSを用いて試料を分析する(30分ラン)。
実施例3−全精製および最終ハンドリング;大規模
硫酸コリスチンモノ成分(ポリミキシンE1)は発酵産物であり、それは、その初登場が発酵したブロス中であることを暗示する。ポリミキシンE1を、多種多様な不純物と1リットル当たりたったの2、3グラムのポリミキシンE1および関連物質とを含有するブロスから回収し、精製する。
− たとえばポリミキシンE1(6−メチルオクタン酸の)か、ポリミキシンE2(7−メチルオクタン酸の)かのどちらかを生み出す、脂肪酸鎖の変化であり、
− 分子中のアミノ酸の置換、たとえばコリスチン中のD−ロイシンがD−フェニルアラニンで置き換えられる場合には、関連抗生物質ポリミキシンBの生成である。ポリミキシンE1中のL−ロイシンがイソロイシンで置き換えられる場合には、ポリミキシンE1−イソロイシンが生成される。
分取HPLCによる精製
次の緩衝液を調製する:
緩衝液I:1.6〜2Mエタノールおよび0.1〜0.15M酢酸。この緩衝液を、使用直前に0.45μmフィルターを通して濾過する。
緩衝液II:約6.8Mの1,2−プロパンジオール、約4Mエタノールおよび約0.1M酢酸。この緩衝液を、使用直前に0.45μmフィルターを通して濾過する。
トルの4Mエタノールに懸濁させる。この懸濁液を、30分間撹拌しながら0.3M酢酸を加えることによって溶解させる。pHを水酸化ナトリウムで約7.5に調整し、この溶液を膜フィルター、0.45μmを通して濾過する。酢酸コリスチン溶液をHPLCカラムに通し、樹脂に結合させる。HPLCカラムを約160リットルの緩衝液Iで溶出する。溶出液を分画にて集める。あらかじめ設定した規格に適合する分画を集め、一方分画の残りを捨てる。ポリミキシンE1に関して少なくとも92%の純度のバッチを分画からプールする。ポリミキシンE1の濃縮および過剰のエタノールの除去を逆浸透によって行う。プールを約50g/lに濃縮し、その後DI水(約8容積)で透析する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)による精製
次の緩衝液を調製する:
較正緩衝液:約200mMの(NH4)2SO4;pHを希アンモニアで約7に調整する溶出緩衝液:約200mMの(NH4)2SO4;pHを酢酸で約3.7に調整する
約90リットルの容積のHICカラム(直径35cm)を、250リットルの較正緩衝液、流量約1.7 l/分、引き続き約200リットルの溶出緩衝液、流量約1.0 l/分で平衡させる。
コリスチン塩基モノ成分の沈澱
この溶液をDI水で10g/lに希釈し、それが均質になるまで撹拌する。pHを水酸化ナトリウムで9.6〜9.8に調整し、撹拌を続行し、その間にコリスチン塩基モノ成分が沈澱する。この沈澱をフィルタープレス上での濾過によって回収する。濾過が完了したとき、ケーキを約800リットルのDI水で洗浄し、DI水を空気で置き換える、コリスチンモノ成分ケーキをフィルタープレスから取り出し、冷凍機に貯蔵する。
硫酸コリスチンモノ成分への変換
コリスチン塩基モノ成分を、撹拌しながらDI水に懸濁させ、溶解させる。pHを希硫酸で5.0に調整する。この溶液を0.45μmフィルターを通して濾過する。
凍結乾燥、ミリングおよび貯蔵
濾過した溶液をステンレススチール冷凍乾燥トレーに満たし、範囲−25℃→+45℃のPIC制御温度分布を用いて約70時間凍結乾燥させる。乾燥品を凍結乾燥機から取り出し、所望の粒子分布を得るためにミルにかける。
分析HPLC法
方法1:発酵からコリスチン塩基までの製造過程管理のためのHPLC
機器:
ポンプ:Model 6000A/510
注入器:WISP 712 A
検出器:Model 441
プレフィルター:Guard Pak、Resolve C18(除外してもよい)
カラム:Resolve C18、10×8.5ミクロンまたはNova−Pak、4ミクロン
カラム付属品:RCM 8×10
からなる、Waters自動HPLC機器
方法:定組成法
移動相:
緩衝液:硫酸ナトリウム十水和物、16.1g(0.05M)濃度、酢酸、0.56ml(0.01M)トリエチルアミン 20ml(0.15M)、水で1000mlにする。pHをリン酸で2.5に調整する。
使用前に、アセトニトリル、170gを緩衝液に溶解させて1000mlにする。
アッセイ手順:
流量:1.5ml/分、あるいは1.0ml/分。
注入量:20マイクロL、あるいは25。
検出:214nm、0.1 AUFSまたは1.0 AUFS。
標準品:1mg/mlにするために水に溶解された、硫酸コリスチンの基準標準品
標準品:コリスチン塩基、0.1M塩酸中1.0mg/ml
分析試料:0.5〜1mg/mlを含有するように希釈する。希釈剤:3%リン酸、40ml、およびアセトニトリル、60ml。濁っている場合は遠心分離。
方法2:最終バルク製品までのコリスチン塩基についてのHPLC
機器:
ポンプ:Model 510
注入器:717プラス自動サンプラー
検出器:490E
プレフィルター:Guard Pak、Nova−Pak、C18
カラム:Nova−Pak、C18、60Å、4μm、150×4.6mm
カラムオーブン:Jones Chromatography
Model 7955
からなる、Waters自動HPLC機器
試薬:
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
トリエチルアミン、HPLCグレード
メタンスルホン酸、≧99%
Mili−Q水
緩衝液:硫酸ナトリウム、無水、28.4g(0.10M)、トリエチルアミン 14.0ml(0.55M)、メタンスルホン酸 10.0ml(0.06M)、Milli−Q水で2000mlにする。
A溶出液:50%緩衝液、35%Milli−Q水、15%アセトニトリル。pHをメタンスルホン酸で2.0に調整する。
試料調製:
酢酸コリスチン:0.05M酢酸中1〜2g/l。30分間撹拌し、0.45μm膜フィルターを通して濾過する。
標準品:
2つの工場内標準品、高活性(2000μg/mg)の1つおよび低活性(400μg/mg)の1つを調製する。
流量:0.8ml/分
カラムの温度:25℃
検出:214nm
時定数:1.0秒
AUFS:1.000AU
Auto zero:オン
Wisp温度:25℃
注入量:20μl/ラン
グラジエントプログラム:
方法3:硫酸コリスチンモノ成分についてのHPLC
機器:
ポンプ:Model 510
注入器:717プラス自動サンプラー
検出器:490E
カラム:Nova−Pak、C18、60Å、4μm、250×4,6mm
カラムオーブン:Jones Chromatography
Model 7955
からなる、Waters自動HPLC機器
試薬:
Milli−Q水
アセトニトリル、HPLCグレード
メタンスルホン酸、≧99%
トリエチルアミン、HPLCグレード
硫酸ナトリウム、無水、プロ分析
緩衝液:硫酸ナトリウム、無水、28.4g(0.10M)、トリエチルアミン 14.0ml(0.55M)、メタンスルホン酸 10.0ml(0.06M)、Milli−Q水で2000mlにする。
A溶出液:50%緩衝液、35%Milli−Q水、15%アセトニトリル。pHをメタンスルホン酸で2.0に調整する。
試料調製:
硫酸コリスチンモノ成分:Milli−Q水中2.8mg/ml。15分間撹拌し、0.45μm膜フィルターを通して濾過する。
流量:1.0ml/分
検出波長:214nm
カラム温度:25℃
注入量:40μl
オートサンプラー温度:25℃
グラジエントプログラム:
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Claims (12)
- 酢酸および高エタノール濃度中のコリスチン塩基をカラムに装填する工程と
低エタノール濃度で溶出する工程と
を備える、逆相クロマトグラフィーによるコリスチンの精製方法。 - 前記高エタノール濃度が20%〜30%である、請求項1に記載の方法。
- 前記高エタノール濃度が20%〜24%である、請求項1に記載の方法。
- 前記高エタノール濃度が24%である、請求項1に記載の方法。
- 前記低エタノール濃度が10〜15%である、請求項1に記載の方法。
- 前記低エタノール濃度が12%である、請求項1に記載の方法。
- 前記酢酸濃度が0,1Mである、請求項1に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程をさらに備える、請求項1に記載の方法。
- 移動相のpHが7〜8である、請求項1に記載の方法。
- 前記移動相のpHが7,5である、請求項1に記載の方法。
- 前記高エタノール濃度が24%であり、
前記低エタノール濃度が12%であり、
前記酢酸濃度は0.1Mであり、
前記移動相のpHが7.5であり、そして
前記固定相がC8−樹脂である、
請求項1に記載の方法。 - 請求項11に記載の方法によって製造される製品。
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