PL239311B1 - Sposób izolowania czystego składnika siarczanu polimyksyny E - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania czystego składnika siarczanu polimyksyny E, zwłaszcza wybranego spośród: siarczanu polimyksyny E1 lub siarczanu polimyksyny E2.

Stan techniki

Polimyksyna E (zwana również kolistyną) jest znanym od ponad 60 lat antybiotykiem produkowanym na drodze biosyntezy przez drobnoustrój Bacillus polymyxa var. colistinus. Stanowi ona mieszaninę peptydów o charakterze zasadowym. Składnikami mieszaniny są polimyksyny: E1, E2, E3, E4, E1 -I, E2-I, E6, E1-Nva, 2,3-dehydro E1 i E1-7MOA, przedstawione na wzorze 1, przy czym dominującymi składnikami są polimyksyna E1 i polimyksyna E2.

Oczyszczona kolistyną zawiera zazwyczaj około 60% polimyksyny E1. Faktem jest, że mieszaniny pochodzące z różnych źródeł produkcji mogą różnić się swoim składem, który ponadto może w sposób znaczący odbiegać od przyjętych norm dotyczących procentowego udziału poszczególnych składników, głównie polimyksyn E2 oraz E1 ale też i innych składników o mniejszym udziale.

Do wytwarzania preparatów farmaceutycznych stosuje się siarczan kolistyny, otrzymywany poprzez działanie kwasem siarkowym na oczyszczoną kolistynę, lub półsyntetyczny kolistymetat sodowy.

W związku z obserwowaną obecnie rosnącą lekoopornością na najczęściej stosowane antybiotyki, takie jak β-laktamy, rośnie zapotrzebowanie kliniczne na preparaty zawierające rzadziej stosowane substancje aktywne, które mogą być przydatne w klinicznym zwalczaniu zakażeń drobnoustrojami lekoopornymi. Prowadzi to do wzrostu zainteresowania polimyksyną E oraz rodzi potrzebę opracowania nowoczesnych preparatów antybiotykowych opartych na jej składnikach.

Klasyczne sposoby wyodrębniania i oczyszczania siarczanu kolistyny polegają na sorpcji antybiotyku z przesączu brzeczki fermentacyjnej na kationicie karboksylowym w formie soli lub w formie wodorowej, a następnie elucji złoża jonitowego, oczyszczeniu eluatu i wydzieleniu siarczanu polimyksyny E z oczyszczonego roztworu na drodze liofilizacji lub wytraceniu rozpuszczalnikami organicznymi. Polski opis patentowy PL77448 opisuje tego rodzaju sposób otrzymywania czystego siarczanu polimyksyny E.

Z przyczyn historycznych, w przypadku polimyksyny E nie obowiązują tak rygorystyczne wymogi jak w przypadku nowoczesnych leków, w szczególności w zakresie dotyczącym toksykologii oraz zawartości zanieczyszczeń. Obowiązująca farmakopea określa jedynie wymagane zakresy zawartości dominujących składników oraz minimalną aktywność przeciwdrobnoustrojową dopuszczonej do stosowania w lecznictwie kolistyny. Powoduje to, że składy różnych preparatów kolistyny są istotnie różne, a każdy z producentów samodzielnie określa zalecane dawki, w tym maksymalną dopuszczalną dawkę oferowanego preparatu. W efekcie, ustalenie właściwego dawkowania jest bardzo kłopotliwe w praktyce klinicznej, zwłaszcza w przypadku podawania dożylnego.

W przypadku stosowania dożylnego głównymi rodzajami toksyczności obserwowanymi podczas stosowania kolistyny jest nefrotoksyczność i neurotoksyczność. Można przypuszczać, że część z nich wywoływana jest przez składniki polimyksyny E, które nie są kluczowe dla uzyskania jej aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Należy również oczekiwać, że oczyszczenie najważniejszych składników aktywnych polimyksyny E pozwoliłoby ustalić ścisły skład stosowanej w lecznictwie mieszaniny uzyskiwanej przez ich zmieszanie w określonych i optymalnych proporcjach.

Opis patentowy EP2470555 ujawnia sposób oczyszczania kolistyny za pomocą chromatografii w układzie odwróconych faz, w którym zasadę kolistyny rozdziela się stosując układ eluentów składający się z wodnego roztworu etanolu z niewielkim dodatkiem kwasu octowego.

Cel wynalazku

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wyodrębniania oczyszczonych siarczanów polimyksyny E1 i polimyksyny E2, które mogłyby być wykorzystane do opracowania nowoczesnego preparatu antybiotykowego o ściśle ustalonym składzie i aktywności przeciwdrobnoustrojowej, pozwalającego na jego precyzyjne dawkowanie i przynajmniej częściowe uniknięcie powikłań związanych z zanieczyszczeniami i niewłaściwym dawkowaniem.

Szczególnym celem wynalazku jest zaproponowanie metody chromatograficznego rozdziału mieszaniny będącej surową kolistyną, która to metoda mogłaby być stosowana w skali przemysłowej. Szczególnie pożądane jest uzyskanie maksymalnego rozsunięcia frakcji E1 i E2 oraz uniknięcie stosowania toksycznego metanolu. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu otrzymywania

PL 239 311 Β1 czystego siarczanu polimyksyny E1 oraz czystego siarczanu polimyksyny E2 z mieszaniny zawierającej te substancje, zwłaszcza z preparatu siarczanu polimyksyny E.

Nieoczekiwanie tak określony cel został uzyskany w prezentowanym wynalazku.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania czystego składnika siarczanu polimyksyny E, zwłaszcza wybranego spośród: siarczanu polimyksyny E1 lub siarczanu polimyksyny E2, za pomocą chromatografii w układzie odwróconych faz, charakteryzujący się tym, że wodny roztwór mieszaniny zawierającej siarczan polimyksyny E1 i siarczan polimyksyny E2 oraz od 0,01% do 5% obj., korzystnie 0,1% kwasu mrówkowego, nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą C12 i następnie wymywa się wodnym roztworem acetonitrylu zawierającym od 0,01% do 5% obj., korzystnie 0,1%, kwasu mrówkowego, przy czym identyfikuje się i zbiera się frakcję odcieku zawierającą wybrany składnik siarczanu polimyksyny E, korzystnie siarczan polimyksyny E1 lub siarczan polimyksyny E2.

Korzystnie, wymywanie prowadzi się z gradientem stężenia acetonitrylu zwiększanego liniowo od wartości 1% do 61% obj., przy czym wymywanie prowadzi się przez okres od 5 do 100 minut.

Równie korzystnie, wymywanie prowadzi się ze stałym stężeniem acetonitrylu wybranym z zakresu od 5% do 50% obj.

Korzystnie, frakcję zawierającą wybrany składnik identyfikuje się analizując odciek metodą spektrometrii mas lub wykonując pomiar absorbancji przy długości fali 215 nm.

W szczególnej realizacji wynalazku mieszaniną zawierającą siarczan polimyksyny E1 i siarczan polimyksyny E2 jest siarczan kolistyny.

W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku rozdział chromatograficzny prowadzi się metodą HPLC, przy czym stosuje się przepływ odpowiadający przepływowi w zakresie od 0,5 ml/min do 1,5 ml/min na kolumnie o średnicy 4,6 mm i długości 250 mm.

Zwiększenie średnicy kolumny chromatograficznej pozwala na zwiększenie szybkości przepływu. Dotyczy to zwłaszcza realizacji wynalazku, w której rozdział prowadzi się metodą HPLC. Wartość przepływu powinna być wówczas dostosowana proporcjonalnie do kwadratu średnicy stosowanej kolumny.

W przypadku zmiany średnicy kolumny nową wartość przepływu można wyliczyć z następującego wzoru:

P₂ = Pi * (śr₂)² / (śrj² gdzie:

Pi oznacza przepływ dla kolumny 1

P₂ oznacza przepływ dla kolumny 2 śn oznacza średnicę kolumny 1 śr₂ oznacza średnicę kolumny 2

W poniższej tabeli podano przykładowe, szczególnie korzystne wartości przepływów dla kolumn o różnej średnicy.

Wymiar kolumny (średnica x długość) [mm]	Wartość przepływu [ml/min]
4,6x250	1
21,2x250	21,24
30 X 250	42,53
50 x 250	118,15

Korzystnie, w sposobie według wynalazku pH fazy ruchomej wynosi < 4, korzystnie od 2 do 2,5.

Korzystnie, wybrany składnik siarczanu polimyksyny E izoluje się dodatkowo z zawierającej go frakcji poprzez wytrącanie w pH o wartości od 11 do 12, a następnie liofilizację oraz ponowne rozpuszczanie w roztworze kwasu siarkowego w pH od 3 do 5 i ponowną liofilizację.

PL 239 311 B1

Ujawniony sposób nadaje się do wydajnego oddzielania poszczególnych składników siarczanu polimyksyny E i może być stosowany w przemyśle. Szczególnie korzystna realizacja sposobu według wynalazku to preparatywna chromatografia HPLC.

W opisanych poniżej przykładach wykonania uzyskano siarczan polimyksyny E1 o czystości 78,9% z wydajnością 97,9%, natomiast siarczan polimyksyny E2 o czystości 90,8% z wydajnością 87,5%. Możliwe jest uzyskanie wyższej czystości > 90% poprzez ponowne przeprowadzenie rozdziału chromatograficznego.

Dzięki zaproponowanemu zgodnie z wynalazkiem doborowi eluentów, żywicy chromatograficznej oraz pozostałych warunków wykonywania HPLC nieoczekiwanie uzyskano nie tylko całkowite rozdzielenie frakcji siarczanu polimyksyny E1 i siarczanu polimyksyny E2, ale również ich znaczne rozsunięcie. W przykładowej realizacji (metoda D) odstęp pomiędzy maksimami obydwu frakcji wynosi około 10 minut. Dzięki temu, w sposobie według wynalazku, możliwe jest nanoszenie na kolumnę dużych ilości rozdzielanego preparatu. Pozwala to na wykorzystanie wynalazku do prowadzenia rozdziału w skali przemysłowej.

W przypadku wykorzystywania siarczanu surowej polimyksyny E niespełniającej norm określonych w farmakopei, sposób według wynalazku może służyć do uzdatniania surowca niespełniającego norm w surowiec im odpowiadający.

Szczegółowy opis wynalazku

W opisanych poniżej przykładach wykonania wykorzystano surowy siarczan kolistyny, niespełniający wymogów farmakopealnych, o zawartości polimyksyn E1 i E2, które występują w tym przypadku na nieodpowiednim poziomie. Na Fig. 1 przedstawiono chromatogram dla wyjściowego siarczanu kolistyny uzyskany w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28.4 Colistin Sulfate. Piki o RT 9.5 min oraz o RT 18.0 min odpowiadają polimyksynie E2 (57,2%) oraz E1 (27,9%).

Dla porównania na Fig. 2 przedstawiono chromatogram dla certyfikowanego materiału odniesienia (EPRS, Y0000277, batch 4.0) uzyskany w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28.4 Colistin Sulfate. Piki o RT 9.4 min oraz o RT 18.0 min odpowiadają polimyksynie E2 (37,1%) oraz E1 (46,3%).

Rozdział polimyksyn E przeprowadzono przy zastosowaniu techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych. Przystąpiono do dobrania odpowiednich warunków do rozdziału siarczanu kolistyny w skali preparatywnej. W tym celu zastosowano kolumny z wypełnieniem typu C-12 o wymiarach 4.6 x 250 mm i średnicy ziarna 4 mikrony. Następnie metodę przeskalowano do kolumny preparatywnej o wymiarach 21,2 x 250 mm wypełnionej tym samym złożem. Do detekcji odcieku z kolumny wykorzystano metodę spektrometrii mas, w której monitorowano obecność w odcieku z kolumny jonów pseudomolekularnych [M+3H]³+ tożsamych dla głównych składników siarczanu kolistyny; polimyksyn E2 (385.92 m/z) oraz E1 (390.59 m/z) oraz wykres sumarycznego prądu jonowego (TIC - Total Ion Current). Faktem jest, że niektóre z pozostałych składników siarczanu kolistyny posiadają te same wartości jonów pseudomolekularnych, jednak różnią się one zarówno czasem retencji na kolumnie oraz wartością pola pod sygnałem. Z uwagi na powyższe można je od siebie rozróżnić. Metody testowano pod kątem możliwości przeładowania złoża poprzez nanoszenie bardzo dużych ilości siarczanu kolistyny na pojedynczy przebieg chromatograficzny. Jest to kluczowy aspekt w przebiegach preparatywnych, ponieważ pozwala oszczędzić czas i środki użyte do procesu rozdzielania.

Przetestowano przebiegi gradientowe oraz izokratyczne, po czym oceniono ich potencjał do zastosowania w rozdzielaniu polimyksyn E w skali preparatywnej. Metody charakteryzują się wprowadzaniem siarczanu kolistyny w wodnym roztworze kwasu mrówkowego (0,1% obj.) na kolumnę chromatograficzną, a następnie wymywaniem układem woda/acetonitryl z dodatkiem 0,1% obj. kwasu mrówkowego o pH fazy ok. 2-2,5. Okazało się, że opracowane metody chromatograficzne pozwalają na dobre rozdzielenie polimyksyn E2 oraz E1 uzyskując frakcje o czystości > 90%.

Na Fig. 3 przedstawiono chromatogram dla wyizolowanej kolistyny E2 uzyskany w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28.4. Pik E2 o RT 9.5 min (93,6%), RT 8,8 min (1,8%), RT 10,5 min (E3 - 2,1%), pozostałe zanieczyszczenia < 0,6%.

Na Fig. 4 przedstawiono chromatogram dla wyizolowanej kolistyny E1 uzyskany w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28,4. Pik E1 o RT 18,1 min (93,8%), RT 16,6 min (2,3-dehydro E1 - 2,2%), RT 19.6 min (E1-7MOA - 3,3%), pozostałe zanieczyszczenia < 0.3%.

PL 239 311 B1

P r z y k ł a d 1. Testowanie różnych warunków HPLC w skali analitycznej.

Okazało się, że złoże Phenomenex Jupiter Proteo 90A, C-12, 4 μm charakteryzuje się dobrą selektywnością do rozdziału polimyksyn E1 oraz E2. Przeprowadzono eksperymenty ilustrujące wpływ składu eluentów oraz ilość naniesionego siarczanu kolistyny na rozdział E1 oraz E2.

Analityczne HPLC:

Użyte odczynniki:

- ultraczysta woda klasy MiliQ o oporności 18 ΜΩ cm,

- acetonitryl czystości gradientowej Lichrosolv Reag. Ph Eur, Merck

- kwas mrówkowy do analizy EMSURE ACS, Reag. Ph Eur, Merck

- siarczan kolistyny.

Przeanalizowanie potencjału metod gradientowych i izokratycznych do rozdziału w skali preparatywnej:

Kolumna Phenomenex 4,6 x 250 mm ze złożem Jupiter Proteo 90A, C-12, 4 μm.

Chromatograf firmy Shimadzu:

- pompy LC-20AD,

- system do automatycznego nanoszenia próbki SIL-20AC,

- termostat kolumny CTO-20AC,

- interfejs CBM-20A,

- detektor: spektrometr mas LCMS-IT-TOF ze źródłem typu ESI.

Użyte eluenty:

- faza A: woda typu MiliQ z 0,1% obj. dodatkiem kwasu mrówkowego,

- faza B: acetonitryl czystości gradientowej z 0,1% obj. dodatkiem kwasu mrówkowego.

Przepływ ustawiono na 1 ml/min, rozdział prowadzono w temperaturze pokojowej w przedziale temp. 22-25°C.

Wykonano testowe przebiegi analityczne z zastosowaniem różnego gradientu nanosząc odpowiednio 10 μl roztworu siarczanu kolistyny w fazie A o stężeniu 0,25 mg/ml (2,5 μg siarczanu kolistyny): - w metodzie gradientowej A z liniowym wzrostem udziału fazy B od 1% do 61% w czasie 30 minut. Wyniki zaprezentowano na Fig. 5, która przedstawia wykres sumarycznego prądu jonowego, z którego wyizolowano sygnał mierzony dla jonów pseudomolekularnych dla polimyksyny E2 oraz E1 w metodzie gradientowej A przy naniesieniu 2,5 μg siarczanu kolistyny.

- w metodzie gradientowej B z liniowym wzrostem udziału fazy B od 1% do 31% w czasie 30 minut. Wyniki zaprezentowano na Fig. 6, która przedstawia wykres sumarycznego prądu jonowego, z którego wyizolowano sygnał mierzony dla jonów pseudomolekularnych dla polimyksyny E2 oraz E1 w metodzie gradientowej B przy naniesieniu 2,5 μg siarczanu kolistyny.

- w metodzie gradientowej C z liniowym wzrostem udziału fazy B od 8% do 17% w czasie 30 minut. Wyniki zaprezentowano na Fig. 7, która przedstawia wykres sumarycznego prądu jonowego, z którego wyizolowano sygnał mierzony dla jonów pseudomolekularnych dla polimyksyny E2 oraz E1 w metodzie gradientowej C przy naniesieniu 2,5 μg siarczanu kolistyny.

Okazało się, że dobrą selektywność można uzyskać dla metody gradientowej C, która zapewnia rozdzielenie polimyksyn E1 oraz E2, a także ich głównych śladowych zanieczyszczeń np. polimyksyny E3 oraz E1-7MOA.

Ponadto, wykonano również przebiegi, w których nanoszono większe ilości siarczanu kolistyny. Nieoczekiwanie, naniesienie 2,5 mg siarczanu kolistyny (1000 x więcej) oraz 12,5 mg (5000 x więcej) na kolumnę analityczną o wym. 4,6 x 250 mm w dalszym ciągu umożliwia niemal ilościowe rozdzielenie związków, które ulegają wspólnemu wymywaniu z kolumny w bardzo wąskim przedziale czasu. Na Fig. 8 przedstawiono wykres sumarycznego prądu jonowego, z którego wyizolowano sygnał mierzony dla jonów pseudomolekularnych dla polimyksyny E2 oraz E1 w metodzie gradientowej C przy naniesieniu 2.5 mg siarczanu kolistyny.

Poza metodami gradientowymi korzystne jest stosowanie wymywania izokratycznego, które w zależności od masy nanoszonego siarczanu kolistyny prowadzi się stosując wodny roztwór acetonitrylu o stężeniu zawartym w przedziale między 1% a 61% z dodatkiem 0,1% obj. kwasu mrówkowego. Przykładową metodą rozdziału stosującą wymywanie izokratyczne jest metoda D, w której zachowane są wszystkie parametry sprzętowe jak w przypadku metod gradientowych A-C. Jedynym odstępstwem było osobne przygotowanie roztworu do wymywania związków z kolumny, który przygotowuje się poprzez zmieszanie 91 objętości fazy A oraz 9 objętości fazy B. Możliwe jest również mieszanie faz do zadanego układu stosując mieszalnik po stronie wysokich ciśnień w systemie chromatograficznym. Na

PL 239 311 B1

Fig. 9 przedstawiono przykładowy przebieg izokratyczny dla siarczanu kolistyny na kolumnie analitycznej w metodzie D. Chromatogram przedstawia wykres sumarycznego prądu jonowego zarejestrow anego dla jonów pseudomolekularnych w przedziale 220-2000 m/z w obu polaryzacjach (+/-).

P r z y k ł a d 2. HPLC preparatywna.

Do przeskalowania metody rozdziału siarczanu kolistyny zastosowano kolumnę o wym. 21,2 x 250 mm o tym samym wypełnieniu co kolumna analityczna. Zastosowano wymywanie izokratyczne.

Kolumna Phenomenex 21,2 x 250 mm ze złożem Jupiter Proteo 90A, C-12, 4 μm.

Chromatograf firmy Shimadzu:

- pompy LC-20AP,

- pętla do manualnego nanoszenia o obj. 10 ml,

- interfejs CBM-20A,

- detektor SPD-20A ustawiony na 215 nm.

Użyte eluenty:

- Roztwór acetonitrylu w wodzie o stężeniu zawierającym się w przedziale od 1% do 61%. Przygotowany poprzez zmieszanie w odpowiednim stosunku wody typu MiliQ z 0,1% obj. dodatkiem kwasu mrówkowego oraz acetonitrylu czystości gradientowej z 0,1% obj. dodatkiem kwasu mrówkowego.

Naniesiono 2 g siarczanu kolistyny rozpuszczonego w wodzie MiliQ z 0,1% obj. dodatkiem kwasu mrówkowego do objętości łącznej 10 ml. Przepływ faz przez kolumnę przeskalowano do 22 ml/min, rozdział prowadzono w temp. pokojowej w przedziale temp. 22-25°C, zbierając odciek w 40 ml frakcjach zaczynając od RT ok. 12 min. Punkt startowy zbierania odcieku determinowano obserwacją charakterystycznego wzrostu absorbancji na detektorze. Punkt końcowy określano poprzez spadek i następujące po tym wyrównanie się absorbancji na detektorze na poziomie ok. 10 mAU. Poszczególne frakcje analizowano przy użyciu HPLC-MS-IT-TOF stosując metodę D.

Na Fig. 10 przedstawiono wykresy sumarycznego prądu jonowego dla analiz HPLC-MS zebranych frakcji 1-12 po przebiegu preparatywnym uzyskanych w metodzie D.

Na Fig. 11 przedstawiono wykresy sumarycznego prądu jonowego dla analiz HPLC-MS zebranych frakcji 13-23 po przebiegu preparatywnym uzyskanych w metodzie D.

P r z y k ł a d 3. Izolowanie wybranych siarczanów polimyksyn E z frakcji po przebiegu preparatywnym.

Frakcje o zidentyfikowanym składzie jakościowym, zawierające rozdzielone polimyksyny E1 oraz E2 zostały następnie połączone. Do roztworów dodawano kroplami wody amoniakalnej do osiągnięcia pH 11-12. W tych warunkach obserwuje się powolne wytrącanie koloidalnego osadu zasady kolistyny. Następnie, roztwór zamrożono w temp. -80°C i poddano liofilizacji. Suchy puch zawieszono w wodzie typu MiliQ i miareczkowano 1% roztworem kwasu siarkowego do pH 3-5 i uzyskania klarownego roztworu, po czym ponownie go zamrożono w temp. -80°C i zliofilizowano. Suchy produkt zważono uzyskując masy 1000.9 mg dla siarczanu polimyksyny E2 oraz 692,5 mg dla siarczanu polimyksyny E1. Przeprowadzono analizę chromatograficzną zgodną z Ph Eur 28,4 dla substancji Colistin Sulfate.

Na Fig. 12 przedstawiono chromatogram uzyskany dla frakcji siarczanu E1 w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28,4 Colistin Sulfate. Skład: E2 - RT 9,4 min. (5,1%), E3 - RT 10,4 min. (1,7%), 2,3-dehydro E1 - RT 16,5 min. (2,1%), E1 - RT 18,0 min. (78,9%), E1-7MOA - RT 19,5 min (10,4%).

Na Fig. 13 przedstawiono chromatogram uzyskany dla frakcji siarczanu E2 w metodzie zgodnej z Ph. Eur. 28.4 Colistin Sulfate. Skład: E2 - RT 9,4 min. (90,8%), E3 - RT 10,4 min. (1,9%).

Wnioski

Opracowana metoda pozwala na uzyskiwanie surowca, w którym zawartość pożądanej polimyksyny E1 zostaje podniesiona z wyjściowego składu wynoszącego 27,9% do 78,9%. Z naniesionego na kolumnę surowca wyjściowego o masie 2000 mg (558 mg czystego E1) uzyskuje się 692,5 mg frakcji siarczanu E1 (546,3 mg czystego E1) zatem odzysk substancji jest ilościowy i wynosi 97,9%. W przypadku, gdy pożądana jest wyższa czystość polimyksyny E1 należy przeprowadzić ponowny rozdział chromatograficzny i odrzucić skrajne frakcje (patrz Fig. 4).

PL 239 311 B1

Claims (8)

1. Sposób izolowania czystego składnika siarczanu polimyksyny E, zwłaszcza wybranego spośród: siarczanu polimyksyny E1 lub siarczanu polimyksyny E2, za pomocą chromatografii w układzie odwróconych faz, znamienny tym, że wodny roztwór mieszaniny zawierającej siarczan polimyksyny E1 i siarczan polimyksyny E2 oraz od 0,01% do 5% obj., korzystnie 0,1% kwasu mrówkowego, nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żywicą C12 i następnie wymywa się wodnym roztworem acetonitrylu zawierającym od 0,01% do 5% obj., korzystnie 0,1% kwasu mrówkowego, przy czym identyfikuje się i zbiera się frakcję odcieku zawierającą wybrany składnik siarczanu polimyksyny E, korzystnie siarczan polimyksyny E1 lub siarczan polimyksyny E2.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymywanie prowadzi się z gradientem stężenia acetonitrylu zwiększanego liniowo od wartości 1% do 61% obj., przy czym wymywanie prowadzi się przez okres od 5 do 100 minut.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymywanie prowadzi się ze stałym stężeniem acetonitrylu wybranym z zakresu od 5% do 50% obj.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcję zawierającą wybrany składnik identyfikuje się analizując odciek metodą spektrometrii masowej lub wykonując pomiar absorbancji przy 215 nm.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaniną zawierającą siarczan polimyksyny E1 i siarczan polimyksyny E2 jest siarczan kolistyny.

6. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz. 1-5, znamienny tym, że rozdział chromatograficzny prowadzi się metodą HPLC, przy czym stosuje się przepływ odpowiadający przepływowi w zakresie od 0,5 ml/min do 1,5 ml/min na kolumnie o średnicy 4,6 mm i długości 250 mm.

7. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz. 1-6, znamienny tym, że pH fazy ruchomej wynosi < 4, korzystnie od 2 do 2,5.

8. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrz. 1-7, znamienny tym, że wybrany składnik siarczanu polimyksyny E izoluje się z zawierającej go frakcji poprzez wytrącanie w pH o wartości od 11 do 12, a następnie liofilizację, oraz ponowne rozpuszczanie w roztworze kwasu siarkowego w pH od 3 do 5 i ponowną liofilizację.