CN115806591B - 一种维拉卡肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度维拉卡肽的纯化方法，涉及生物分子分离纯化技术领域；本发明提供了一种维拉卡肽的纯化制备方法，本发明的离子交换色谱法纯化可以除去合成过程中的残留溶剂和大部分杂质；纳滤浓缩过程可以控制样品的氯离子含量，提高最终产品的有效成分含量。本发明提供的纯化方法得到的是维拉卡肽的盐酸盐，利于纯化制备；且所得维拉卡肽含量高、纯度高、收率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子分离纯化技术领域，具体涉及一种维拉卡肽的纯化方法。
背景技术
维拉卡肽是由AMGEN INC开发的一种新颖的拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物。2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv。其一般制成盐酸盐。其序列结构如下图所示：
。
在通过有机合成方法构建二硫键后，会有一定的副产物产生，以及原料及中间体残留，产品纯度较低，需要进行纯化。专利CN106928320A中采用C18填料、TFA/水-乙腈作为流动相进行纯化，最终产物为TFA盐，其收率仅有52%；专利CN110054662A，中先采用TFA/水-乙腈进行纯化，再用HAc/水-乙腈体系进行二纯，还需要加入盐酸进行冻干，其操作步骤繁琐，且终产物中仍含有乙酸根离子；专利WO2021IN00006介绍了多种纯化方法，但是需要用到大量有机溶剂，成本较高，不利于规模化生产，有些方法使用了高氯酸盐，不利于安全生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纯度高、收率高与肽含量高的维拉卡肽的纯化制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
本发明提供了一种维拉卡肽的纯化方法，包括以下步骤：
提供维拉卡肽粗品，将维拉卡肽粗品溶解，得到维拉卡肽粗品溶液；
将维拉卡肽粗品溶液采用离子色谱分离纯化法进行纯化，得到维拉卡肽纯品溶液；
将维拉卡肽纯品溶液采用纳滤的方法进行脱盐浓缩并进行冷冻干燥，得到维拉卡肽的成品；
维拉卡肽粗品溶液的浓度为1~100mg/mL。
本发明采用离子交换色谱法纯化可以除去合成过程中的残留溶剂（包括三氟乙酸、乙二硫醇、甲基叔丁基醚等）、残留保护基和大部分杂质；纳滤浓缩过程可以控制样品的氯离子含量，提高最终产品的有效成分含量；且本发明提供的纯化方法得到的是维拉卡肽的盐酸盐，利于纯化制备；所得维拉卡肽含量高、纯度高、收率高。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法的参数包括：
样品浓度为10~100mg/mL；
色谱柱填料：阳离子色谱；
流动A相：磷酸二氢钠水溶液，磷酸二氢钠水溶液的浓度为1~10mmol/L，用磷酸调节pH，范围为2~5；
流动B相：氯化钠水溶液，氯化钠水溶液的浓度为0.1~2mol/L，用盐酸调节pH，范围为2~5；
线流速：50~300cm/h；
梯度洗脱程序为：
0~60min：n1vol%→m1vol%流动B相；n1为0~20，m1为30~100；
检测波长：200~250nm。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽粗品溶解所用溶剂为流动相A。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离法纯化维拉卡肽后得到第一纯化维拉卡肽；将第一纯化维拉卡肽配制成维拉卡肽盐溶液进行纳滤浓缩。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法中离子色谱柱的有效长度≥150 mm；直径为10~200 mm。
更进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱柱中离子色谱柱填料为阳离子交换树脂；填料粒径为30~80μm；填料孔径为1000A。
更进一步地，在本发明的一些实施方式中，检测器应为紫外检测器，检测波长为200~250 nm。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：5vol%→55vol%第一流动B相。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：10vol%→60vol%第一流动B相。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：10vol%→50vol%第一流动B相。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：0vol%→100vol%第一流动B相。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，采用纳滤的方法进行脱盐浓缩的参数包括：
单次纳滤浓缩的体积比在1~10倍；
单次纳滤后应加入5~10倍浓缩液体积的去离子水；
反复纳滤浓缩稀释3次以上。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，冷冻干燥参数包括：
冷冻干燥的预冻温度在-20~-40℃；
冷冻干燥过程中真空度低于100pa；
冷冻干燥一次升华干燥温度在-20~0℃；
冷冻干燥的解析干燥温度在10~40℃；
冷冻干燥的冻干时间在24~72小时。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，本发明中维拉卡肽粗品采用离子色谱分离纯化法纯化后，还包括将所得离子交换色谱纯化馏分进行纳滤浓缩并冷冻干燥，得到维拉卡肽纯品。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽的收率高于60%，且肽含量高于78%。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽的纯度高于99.25%。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽纯品的纯度为99.28~99.52%。
更进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽纯品的纯度高于99.8%。
进一步地，在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽纯品的收率为62.5~70.1%，纯度为99.28~99.52%，肽含量在79.18~85.31%。
本发明的离子交换色谱法纯化可以除去合成过程中的残留溶剂（包括三氟乙酸、乙二硫醇、甲基叔丁基醚等）、残留保护基和大部分杂质；纳滤浓缩过程可以控制样品的氯离子含量，提高最终产品的有效成分含量；且本发明提供的纯化方法得到的是维拉卡肽的盐酸盐，利于纯化制备；所得维拉卡肽含量高、纯度高、收率高。因此，本发明是一种纯度高、收率高与肽含量高的维拉卡肽的纯化制备方法。
附图说明
图1为维拉卡肽纯化后的高效液相色谱图。
具体实施方式
现在通过优选的实施方案和实施例更详细地描述本发明，然而，这些实施方案和实施例仅用于示例目的，而不应理解为以任何方式限定本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。本发明的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均优选为市售产品。
需要说明的是，本发明使用的术语“流动相”是指引入色谱柱的溶剂。
需要说明的是，本发明所用维拉卡肽粗品优选采专利CN114524860A中的方法进行合成；具体制备方法包括：（1）液相合成Fmoc-D-Ala-D-Arg(Pbf)-OH二肽片段1；（2）液相合成Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-OH二肽片段2；（3）依次偶联氨基酸：二肽片段1、二肽片段2、二肽片段1、N-Ac-D-Cys(Mmt)-OH，获得片段A；（4）脱除片段A中Cys(Mmt)的保护基，获得片段B，再与Boc-Cys(Npys)-OH偶联后，裂解获得维拉卡肽粗品，粗品纯度86.85%。
在本发明中，维拉卡肽粗品溶解的溶剂优选为磷酸二氢钠水/磷酸溶液，所述磷酸二氢钠水/磷酸溶液的浓度为1~10mmol/L，优选为4~6mmol/L；pH范围2~5，优选为2~3。
在本发明中，维拉卡肽粗品溶液中维拉卡肽的浓度1~100 mg/mL，优选为40~60mg/mL。
本发明中维拉卡肽粗品溶解后，优选还包括进行过滤，得到维拉卡肽粗品溶液。
本发明得到维拉卡肽粗品溶液后，本发明对维拉卡肽粗品溶液进行离子交换色谱法分离纯化，得到维拉卡肽纯品。
在本发明中，离子交换色谱纯化的参数包括：
离子色谱柱的有效长度≥150mm，优选的为200mm；直径为10~200mm，直径与生产规模相关；离子色谱填料为阳离子交换树脂，优选为弱阳离子交换树脂；填料粒径为30~80μm，优选为30μm；填料孔径为1000A。
在本发明的一些实施方式中，流动相A：磷酸二氢钠水/磷酸溶液，磷酸二氢钠水/磷酸溶液的浓度为1~10mmol/L，pH范围2~5；磷酸二氢钠水/磷酸溶液浓度优选为4~6mmol/L；pH范围优选为2~3。
在本发明的一些实施方式中，流动相B：氯化钠/盐酸水溶液，氯化钠水溶液的浓度为0.1~2mol/L，pH范围2~5；氯化钠/盐酸水溶液浓度优选为0.8~1.5mol/L，pH范围优选为2~3。
在本发明的一些实施方式中，流速范围为50~ 300cm/h，优选为100~200cm/h，更优选为150cm/h。
在本发明的一些实施方式中，梯度洗脱程序为：
0~60min：n1vol%→m1vol%流动B相；n1为0~20，m1为80~100；具体优选为：0~60min：0vol%→80vol%第一流动B相。
在本发明的一些实施方式中，检测波长：200~250nm，优选为210~230nm，更优选为210nm。
在本发明的一些实施方式中，维拉卡肽粗品采用色谱分离纯化法纯化后，得到纯化维拉卡肽溶液；将纯化维拉卡肽溶液进行纳滤脱盐；在本发明中的馏分是本领域技术人员根据常识进行选择和合并的。在本发明中，进行纳滤脱盐操作时，选择反复稀释浓缩3次以上，优先地操作次数应为5~8次；稀释的试剂优选为纯化水；稀释的倍数为5~10倍，优选为7倍；纳滤膜为GE1812型。
在本发明中，离子交换色谱纯化能够除去粗品中含有的残留溶剂和大部分杂质。
在本发明中，纳滤浓缩能够除去离子交换色谱纯化后收集液中含有的钠离子、磷酸根离子以及氯离子，并因浓缩次数以及稀释倍数不同、从而控制终产品中维拉卡肽的肽含量。
纳滤浓缩后，本发明优选还包括将所得纳滤浓缩后维拉卡肽溶液进行冷冻干燥，得到维拉卡肽纯品。
在本发明中，纯化后的产品应使用平板冷冻干燥机进行干燥；平板冻干预冻温度应设置在-20~-40℃，优选地为-40~-30℃；平板冻干过程中真空度应低于100pa，优选为低于50pa；平板冻干一次升华干燥温度应在-20~0℃，优选为-10~-5℃；平板冻干解析干燥温度应在10~40℃，优选为20~30℃；平板冻干时间应在24~72小时，优选为40~50小时。
下面结合实施例对本发明提供的维拉卡肽粗品的纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：
维拉卡肽粗品的合成：
称量化合物N-Ac-D-Cys(SH)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Dpm-NH2(58.05g)，向反应瓶中加入氯仿(900mL)，再加入Boc-Cys(Npys)-OH(8.73g)，搅拌至溶液澄清；使用冷却循环泵将反应液温度冷却至0℃左右。加入DIPEA(6.6mL)，在25℃温度下继续搅拌一天；TLC(DCM:MeOH:HAc＝100:1:0.5)监控反应，反应完全后，反应液在30℃条件下，旋蒸浓缩至成粘稠物，向粘稠物中加入甲醇(200mL)，搅拌2小时，过滤，滤饼用150mL甲醇冲洗三次，将滤饼在40℃条件下真空干燥5小时，得到化合物51.18 g，其结构式如下。
。
将上述的化合物，以10mL/g化合物的比例加入511mL裂解试剂TFA:H2O:PhSMe:Anisole:TIS＝88:5:3:2:2，室温磁力搅拌进行裂解反应3小时，然后将反应液缓慢倒入冰冻MTBE(5.1L)中，搅拌30分钟后，冰箱中静置1.5小时，离心，用300mL乙醚洗涤三次，得到的固体样品在30℃温度下干燥2小时，再用350mL甲醇打浆2小时，过滤，将滤液在30℃温度下旋干后得到粗肽32.58g，即维拉卡肽粗品，其中粗肽HPLC纯度约为86.85％。
实施例2：
一种维拉卡肽的纯化方法，包括：
（1）称取实施例1中维拉卡肽粗品32.58g，用5mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 2.95溶解至500mL，再用0.45μm玻璃纤维膜进行过滤，得到维拉卡肽粗品溶液。
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为200mL/min（约151cm/h）；以5mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 2.95溶液为流动A相，1mol/L氯化钠水溶液pH 2.98为流动B相，梯度洗脱程序为：30min，0vol%→80vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集目标馏分，纯度为99.52%（如图1所示），最大单杂为0.26%，得到纯化维拉卡肽收集液2.8L。
（3）将上述维拉卡肽收集液使用GE1812型纳滤膜进行浓缩，将样品液在纳滤仪中进行加压循环，待样品体积在800mL时停止加压，加入5L纯化水进行循环稀释，循环3分钟后继续加压进行纳滤浓缩；反复操作4次后，取出约400mL样品浓缩液，用于冻干（成分a）；剩余溶液继续进行前述步骤循环浓缩3次后取出，体积约800mL，用于冻干（成分b）；用约3L分3次清水反复循环冲洗纳滤系统，收集清洗液用于冻干（成分c）。
将上述产品使用平板冷冻干燥机放置在不同板层的冻干盘中进行冷冻干燥，执行冻干程序如下表：
表1 样品的冷冻干燥步骤
| 步骤 | 温度(℃) | 升/降温速率(℃/min) | 持续时间(min) | 真空度(Pa) |
| 预冻 | -40 | -1 | 180 | N/A |
| 一次升华 | -5 | +1 | 24 | 20 |
| 解析干燥 | 25 | +1 | 24 | 0 |
待冻干程序结束后进行压升测试，压升值为0.15pa/min，说明已经完全干燥，在环境湿度20%条件下进行称量，最终得到维拉卡肽，计算样品纯化收率；使用外标法检测成分a、成分b、成分c中的肽含量。
实施例3：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为265ml/h(约200cm/h)；以10mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 2.95溶液为流动A相，1.5mol/L氯化钠/水溶液pH 2.98为流动B相，梯度洗脱程序为：40min，10vol%→50vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
实施例4：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为330mL/min（约250cm/h）；以8mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 3.6溶液为流动A相，2mol/L氯化钠/水溶液pH 3.0为流动B相，梯度洗脱程序为：30min，0vol%→80vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
实施例5：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
将上述产品使用平板冷冻干燥机放置在不同板层的冻干盘中进行冷冻干燥，执行冻干程序如下表：
表2 样品的冷冻干燥步骤
| 步骤 | 温度(℃) | 升/降温速率(℃/min) | 持续时间(min) | 真空度(Pa) |
| 预冻 | -30 | -1 | 200 | N/A |
| 一次升华 | -10 | +1 | 30 | 20 |
| 解析干燥 | 30 | +1 | 60 | 0 |
待冻干程序结束后进行压升测试，压升值为0.15pa/min，说明已经完全干燥，在环境湿度20%条件下进行称量，最终得到维拉卡肽，计算样品的收率，并使用外标法检测成分a、成分b、成分c中的肽含量。
实施例6：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
将上述产品使用平板冷冻干燥机放置在不同板层的冻干盘中进行冷冻干燥，执行冻干程序如下表：
表3 样品的冷冻干燥步骤
| 步骤 | 温度(℃) | 升/降温速率(℃/min) | 持续时间(min) | 真空度(Pa) |
| 预冻 | -20 | -1.5 | 240 | N/A |
| 一次升华 | -15 | +1 | 60 | 20 |
| 解析干燥 | 35 | +1 | 30 | 0 |
待冻干程序结束后进行压升测试，压升值为0.15pa/min，说明已经完全干燥，在环境湿度20%条件下进行称量，最终得到维拉卡肽，计算样品的收率，并使用外标法检测成分a、成分b、成分c中的肽含量。
实施例7：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
本发明为了提高了维拉卡肽的纯度，在离子交换色谱纯化步骤中的流动相B中添加浓度为1~2mol/L6-氨基己酸盐酸盐水溶液，其中6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液的体积比为0.5~1:1；将6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液共同作为流动相B，能够更好的去除维拉卡肽中的杂质，得到纯度较高的收集液。具体的，
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为200mL/min（约151cm/h）；以5mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH2.95溶液为流动A相，1mol/L6-氨基己酸盐酸盐水溶液与1mol/L氯化钠水溶液（其中6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液的体积比为0.5:1）为流动B相，pH 2.98，梯度洗脱程序为：30min，0vol%→80vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集目标馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
实施例8：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为200mL/min（约151cm/h）；以5mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 2.95溶液为流动A相，1mol/L6-氨基己酸盐酸盐水溶液与1mol/L氯化钠水溶液（其中6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液的体积比为1:1）为流动B相，pH 2.98，梯度洗脱程序为：30min，0vol%→80vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集目标馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
对比例1：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为60mL/min（约45cm/h）；以8mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 5.5溶液为流动A相，2mol/L氯化钠/水溶液pH 3.0为流动B相，梯度洗脱程序为：30min，0vol%→80vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集#馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
对比例2：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
（2）上样后，进行离子交换色谱纯化法，离子交换色谱纯化的参数包括：色谱柱为100mm*200mm的UniGel-30CM填料（粒径30um，孔径1000A）；流速为200mL/min（约151cm/h）；以5mmol/L磷酸二氢钠水溶液pH 2.95溶液为流动A相，1mol/L氯化钠/水溶液pH 2.98为流动B相，梯度洗脱程序为：80min，50vol%→100vol%第一流动B相，检测波长为210nm，对各洗脱液进行高效液相色谱法检测，收集馏分，得到纯化维拉卡肽收集液。
对比例3：
一种维拉卡肽的纯化方法，其他步骤均与实施例2相同，与实施例2不同的是：
将上述产品使用平板冷冻干燥机放置在不同板层的冻干盘中进行冷冻干燥，执行冻干程序如下表：
表4 样品的冷冻干燥步骤
| 步骤 | 温度(℃) | 升/降温速率(℃/min) | 持续时间(min) | 真空度(Pa) |
| 预冻 | -50 | -1 | 180 | N/A |
| 一次升华 | -5 | +1 | 24 | 20 |
| 解析干燥 | 50 | +1 | 24 | 0 |
待冻干程序结束后进行压升测试，压升值为0.15pa/min，说明已经完全干燥，在环境湿度20%条件下进行称量，最终得到维拉卡肽，计算样品的收率，并使用外标法检测成分a、成分b、成分c中的肽含量。
试验例：
1. 维拉卡肽的纯度
将实施例2-4与对比例1-2的步骤（2）中得到的纯化维拉卡肽经高效液相色谱法检测，测得维拉卡肽的纯度如下表所示。
表5 纯化维拉卡肽的纯度
| 试样 | 纯度(%) |
| 实施例2 | 99.52 |
| 实施例3 | 99.28 |
| 实施例4 | 99.49 |
| 实施例7 | 99.89 |
| 实施例8 | 99.91 |
| 对比例1 | 97.83 |
| 对比例2 | 98.16 |
由表5可以看出，实施例2-4的步骤（2）中得到的纯化维拉卡肽的纯度高于99.25%，高于对比例1-2，这表明采用本发明的纯化制备方法，得到的维拉卡肽具有较高的纯度，采用离子交换色谱法纯化能够除去合成过程中的残留溶剂（包括三氟乙酸、乙二硫醇、甲基叔丁基醚等）、残留保护基和大部分杂质，以提高维拉卡肽的纯度；实施例7与实施例8中维拉卡肽的纯度高于99.8%，对比实施例2与实施例7-8，实施例7-8中维拉卡肽的纯度高于实施例2，这表明在流动相B中加入6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液并结合盐酸溶液共同作为流动相B，其进一步提高了维拉卡肽的纯度。
2. 维拉卡肽的收率与肽含量
测得实施例2、实施例5、实施例6与对比例3的步骤（3）中得到的维拉卡肽样品的收率以及成分a、成分b、成分c中的肽含量如下表所示。
表6 样品维拉卡肽的收率以及肽含量
由表6可以看出，实施例2、实施例5、实施例6的步骤（3）中得到的维拉卡肽的收率高于60%，且肽含量高于78%，高于对比例3，这表明采用本发明的纯化制备方法得到的维拉卡肽具有较高的收率以及含有较高的肽含量，采用纳滤浓缩步骤可以控制样品的氯离子含量，提高最终产品的有效成分杂质，得到收率与肽含量较高的维拉卡肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种维拉卡肽的纯化方法，包括以下步骤：
提供维拉卡肽粗品，将所述维拉卡肽粗品溶解，得到维拉卡肽粗品溶液；
将所述维拉卡肽粗品溶液采用离子色谱分离纯化法进行纯化，得到维拉卡肽纯品溶液；
将所述维拉卡肽纯品溶液采用纳滤的方法进行脱盐浓缩并进行冷冻干燥，得到维拉卡肽的成品；
所述维拉卡肽粗品溶液的浓度为1~100mg/mL；
所述离子色谱分离纯化法的参数包括：
样品浓度为10~100mg/mL；
色谱柱填料：阳离子交换树脂；
流动A相：磷酸二氢钠水溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为1~10mmol/L，用磷酸调节pH，范围为2~5；
流动B相：6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液，所述氯化钠水溶液的浓度为0.1~2mol/L，所述6-氨基己酸盐酸盐水溶液的浓度为1~2mol/L，其中6-氨基己酸盐酸盐水溶液与氯化钠水溶液的体积比为0.5~1:1，用盐酸调节pH，范围为2~5；
线流速：50~300cm/h；
梯度洗脱程序为：
0~60min：n1vol%→m1vol%流动B相；n1为0~20，m1为30~100；
检测波长：200~250nm；
所述采用纳滤的方法进行脱盐浓缩的参数包括：
单次纳滤浓缩的体积比在1~10倍；
单次纳滤后加入5~10倍浓缩液体积的去离子水；
反复纳滤浓缩稀释3次以上；
所述冷冻干燥参数包括：
所述冷冻干燥的预冻温度在-20~-40℃；
所述冷冻干燥过程中真空度低于100pa；
所述冷冻干燥一次升华干燥温度在-20~0℃；
所述冷冻干燥的解析干燥温度在10~40℃；
所述冷冻干燥的冻干时间在24~72小时。
2.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述维拉卡肽粗品溶解所用溶剂为流动相A。
3.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离法纯化维拉卡肽后得到第一纯化维拉卡肽；将所述第一纯化维拉卡肽配制成维拉卡肽盐溶液进行纳滤浓缩。
4.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离纯化法中离子色谱柱的有效长度≥150 mm；直径为10~200 mm。
5.根据权利要求4所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱柱中离子色谱填料为阳离子交换树脂；填料粒径为30~80μm；填料孔径为1000A。
6.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：5vol%→55vol%第一流动B相。
7.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：10vol%→60vol%第一流动B相。
8.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：10vol%→50vol%第一流动B相。
9.根据权利要求1所述的一种维拉卡肽的纯化方法，其特征在于：所述离子色谱分离纯化法中的梯度洗脱程序为：0~60min：0vol%→100vol%第一流动B相。
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