CN112979756B - 达托霉素的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了达托霉素的提纯方法。该方法包括：S1，达托霉素中间体料液初步纯化，用第一纳滤膜进行第一次浓缩；S2，将第一浓缩液的pH调至4.0～8.0，上入装有单分散聚合物填料的层析柱第一次吸附；洗脱，得到第一洗脱液；S3，采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩；S4，将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中吸附；洗脱，得到第二洗脱液；S5，采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩；S6，将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，用第四纳滤膜进行第四次浓缩，得到第四浓缩液；S7，调节第四浓缩液pH至3.0～6.0，冻干，得到成品。将该方法用于提取达托霉素，具有更高的产品纯度和纯化收率。

Description

达托霉素的提纯方法

技术领域

本发明涉及生物发酵制药领域，具体而言，涉及一种达托霉素的提纯方法。

背景技术

达托霉素作为新一代环酯肽类抗生素产品，被视为抗生素领域的又一“里程碑”。它是从玫瑰孢链霉菌发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同，它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰氏阳性菌，由于抗菌机理不同，和其他抗生素相比引起细菌耐药性的几率要低很多，是目前治疗革兰氏阳性耐药菌株感染的最佳治疗药物。

达托霉素为发酵产物，产物含量低，与达托霉素结构类似的副产物多，对温度、酸碱等敏感，提取过程中易降解，种种原因造成达托霉素的提取难度大，纯化方法复杂，工业化生产收率低，产品纯度不高。

美国专利US591,222,6描述了一种对达托霉素降解杂质脱水-达托霉素的分离方法，其中用到了反相硅胶色谱法分离。

美国专利US487,484,3公布了一种HP-20、HP-20SS、HP-20树脂反复进行色谱分离的达托霉素纯化方法，指出通过这种方法对达托霉素结构相类似的杂质的分离效果并不好，该专利进一步指出通过反相硅胶色谱法、硅胶正相色谱法或离子色谱法除去这些杂质的尝试也未能显著提高达托霉素的纯度。

公开号为CN105481950A的中国发明专利中公布了一种采用大孔吸附树脂、NM-Q强阴离子交换树脂、反相硅胶NMsil-C18柱分离后用钙盐沉淀结晶，溶解后再用树脂脱盐、活性炭脱色脱内毒素，然后用异丙醇沉淀结晶，最后再用沸腾干燥的方法制备达托霉素的方法，工艺过程较繁杂，生产周期长，加上过程中用到强阴离子交换过程，不利于达托霉素结构类似物如脱水达托霉素和内脂降解物等的控制，且整个过程需用到乙醇和异丙醇两种不同溶剂。

国内其它相关文献报道了萃取法、沉淀法、吸附法和离子交换色谱等多种方法反复交替运用提取达托霉素，工艺步骤繁杂，对与达托霉素结构相类似的杂质去除效果均不理想，影响产品质量，收率较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种达托霉素的提纯方法，以解决现有技术中提纯达托霉素时工序复杂或收率、纯度不佳的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种达托霉素的提纯方法，其包括以下步骤：S1，对达托霉素中间体料液进行初步纯化，然后用第一纳滤膜进行第一次浓缩，得到第一浓缩液；S2，将第一浓缩液的pH值调节至4.0～8.0，然后将其上入装有单分散聚合物填料的层析柱进行第一次吸附，得到第一吸附柱；洗脱第一吸附柱，得到第一洗脱液；S3，采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩，得到第二浓缩液；S4，将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中进行吸附，得到第二吸附柱；洗脱第二吸附柱，得到第二洗脱液；S5，采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩，得到第三浓缩液；S6，将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，然后再用第四纳滤膜进行第四次浓缩，得到第四浓缩液；S7，调节第四浓缩液的pH值至3.0～6.0，然后经冻干，得到达托霉素成品。

进一步地，步骤S2中，单分散聚合物填料的材料选自PS、PSA、PSN中的一种或多种，且单分散聚合物填料的粒径为10～50μm，孔径为100～300埃；优选地，单分散聚合物填料的材料选自PS和/或PSA，且单分散聚合物填料的粒径为30μm，孔径为300埃。

进一步地，步骤S2中，调节pH后的第一浓缩液在层析柱中的上柱量为层析柱体积2～10％，优选为3～6％。

进一步地，步骤S2中，洗脱第一吸附柱时采用的洗脱剂包括第一极性有机溶剂和缓冲盐的水溶液；优选地，第一极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，缓冲盐的水溶液为醋酸盐水溶液；更优选地，第一极性有机溶剂与缓冲盐的水溶液的体积比为1:(2～5)。

进一步地，第一极性有机溶剂为乙醇，缓冲盐的水溶液为醋酸钠水溶液；优选地，醋酸钠水溶液的浓度为0.1～1wt％，pH至为5.0～8.0；更优选地，醋酸钠水溶液的浓度为0.5wt％，pH值为7.5。

进一步地，步骤S2中，洗脱第一吸附柱的过程中采用多次洗脱，且每次洗脱过程中洗脱液中极性有机溶剂的浓度不同且逐渐升高；优选地，洗脱第一吸附柱的过程中，收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液部分合并形成第一洗脱液。

进一步地，步骤S4中，反相硅胶填料为C8和/或C18，反相硅胶填料的粒径为10～50μm，孔径为60～300埃；优选地，反相硅胶填料为C18，反相硅胶填料的粒径为10μm，孔径为100埃。

进一步地，步骤S4中，第二浓缩液在制备柱中的上柱量为制备柱体积的0.5～2％，优选为1.5％；优选地，洗脱第二吸附柱的过程中收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分合并形成第二洗脱液。

进一步地，步骤S4中，洗脱第二吸附柱时采用的洗脱剂为第二极性有机溶剂和水的混合液；优选地，第二极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，且第二极性有机溶剂的浓度为5～30wt％；更优选地，第二极性有机溶剂为乙醇，且第二极性有机溶剂的浓度为10～20wt％。

进一步地，步骤S1中，对达托霉素中间体料液进行初步纯化的步骤包括：收集达托霉素发酵液作为达托霉素中间体料液；对达托霉素中间体料液进行陶瓷膜过滤或板框过滤，得到滤液；采用树脂吸附滤液，再洗脱，得到初步纯化后的达托霉素中间体料液，且其中达托霉素含量≥50.0％；优选地，吸附滤液的树脂为大孔吸附树脂，更优选为XAD1600或HP-20；优选地，洗脱过程中的洗脱剂为20～60wt％的乙醇水溶液。

进一步地，步骤S1中，采用第一纳滤膜进行第一次浓缩的过程中，将初步纯化后的达托霉素中间体料液浓缩至100升中含有1～15kg的达托霉素，优选浓缩至100升中含有3～10kg的达托霉素。

进一步地，步骤S3包括：采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；加入去离子水或纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中的电导率≤300us/cm，得到第二浓缩液；优选地，加入去离子水或纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第二次浓缩后浓缩液体积的去离子水或纯化水进行顶洗。

进一步地，步骤S5包括：采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；加入纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中第二极性有机溶剂的含量≤1wt％，得到第三浓缩液；优选地，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第三次浓缩后浓缩液体积的纯化水进行顶洗。

进一步地，步骤S6包括：在将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，直至超滤至残留1/2～1/5后，加入纯化水顶洗，直至超滤透出液中的达托霉素浓度≤500ug/ml后停止，得到超滤后的第三浓缩液；优选地，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与超滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍残留体积的纯化水进行顶洗。

进一步地，步骤S6中，在得到超滤后的第三浓缩液后，将其采用第四纳滤膜进行第四次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素，优选直至100升中含有8～12kg的达托霉素，得到第四浓缩液。

进一步地，步骤S7中将第四浓缩液的pH值调节至4.0～5.0后进行冻干。

进一步地，步骤S2中，将第一浓缩液的pH值调节至4.5～6.5再进行第一次吸附。

本发明提供了一种高纯度达托霉素的提纯方法，该方法易于按比例应用于商业化生产，包括单分散的聚合物填料反相色谱与反相硅胶色谱法的独特组合。将该方法用于提取达托霉素，其与通过现有技术方法制备的达托霉素相比，表现出更高的产品纯度和纯化收率。与此同时，本发明该方法工序较为简单，不涉及过于复杂的工序。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。除非另有说明，本发明中实践采用化学、生物技术及微生物学中的常规技术和基本术语。

正如背景技术部分所描述的，现有技术中提纯达托霉素时存在工序复杂或收率、纯度不佳的问题。

为了解决上述问题，本发明提供了一种达托霉素的提纯方法，其包括以下步骤：S1，对达托霉素中间体料液进行初步纯化，然后用第一纳滤膜进行第一次浓缩，得到第一浓缩液；S2，将第一浓缩液的pH值调节至4.0～8.0，然后将其上入装有单分散聚合物填料的层析柱进行第一次吸附，得到第一吸附柱；洗脱第一吸附柱，得到第一洗脱液；S3，采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩，得到第二浓缩液；S4，将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中进行吸附，得到第二吸附柱；洗脱第二吸附柱，得到第二洗脱液；S5，采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩，得到第三浓缩液；S6，将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，然后再用第四纳滤膜进行第四次浓缩，得到第四浓缩液；S7，调节第四浓缩液的pH值至3.0～6.0，然后经冻干，得到达托霉素成品。

上述方法易于按比例应用于商业化生产，包括单分散的聚合物填料反相色谱与反相硅胶色谱法的独特组合。将该方法用于提取达托霉素，其与通过现有技术方法制备的达托霉素相比，表现出更高的产品纯度和纯化收率。与此同时，本发明该方法工序较为简单，不涉及过于复杂的工序。

具体地，上述提纯中各步骤的原理或目的如下：

通过初步纯化、第一次浓缩，可以将达托霉素进行初步富集。调整第一浓缩液的pH值至4.0～8.0，能够保证达托霉素在溶液中相对稳定，从而提高其在后续层析柱中的吸附能力。采用装有单分散聚合物填料的层析柱进行第一次吸附，能够降低与达托霉素结构相类似的杂质，特别是达托霉素β异构体的含量，然后再经过第二纳滤膜的浓缩，可以进一步富集达托霉素。其次，将第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中进行吸附，能够进一步降低或除去其它达托霉素结构相类似的杂质。尤其是本发明通过将单分散聚合物填料吸附和反相硅胶填料吸附相耦合提高了对达托霉素结构类似杂质的去除能力，能够更有效地提取达托霉素。再次，通过第三纳滤膜浓缩、超滤膜脱色和去内毒素、第四纳滤膜浓缩，进一步提纯了达托霉素。最后，将第四浓缩液的pH值至3.0～6.0并冻干，能够在低温条件下进行干燥，最大限度地保持产品稳定，最终得到纯度≥98.5％的高纯达托霉素成品，且达托霉素的收率也能够达到30％以上。

为了进一步提高吸附效果，在一种优选的实施方式中，上述步骤S2中，单分散聚合物填料的材料选自PS树脂(苯乙烯/二乙烯基苯)、PSA树脂(苯乙烯/二乙烯基苯)、PSN树脂(聚丙烯酸酯)中的一种或多种，且单分散聚合物填料的粒径为10～50μm，孔径为100～300埃；优选地，单分散聚合物填料的材料选自PS和/或PSA，且单分散聚合物填料的粒径为30μm，孔径为300埃。比如，可用型号有苏州纳微的Uni PS30-300，Uni PSA30-300，Uni PSN30-300，其中30代表粒径30μm，300代表孔径300埃。

在一种优选的实施方式中，上述步骤S2中，调节pH后的第一浓缩液在层析柱中的上柱量为层析柱体积2～10％，优选为3～6％。这样更有利于提高单分散聚合物填料的选择性吸附效果，以进一步提高达托霉素的吸附效果。

经过单分散聚合物填料的选择性吸附，达托霉素被吸附于其上，为了将这些吸附后的达托霉素洗脱下来，在一种优选的实施方式中，上述步骤S2中，洗脱第一吸附柱时采用的洗脱剂包括第一极性有机溶剂和缓冲盐的水溶液(用于调节pH，起缓冲作用)；优选地，第一极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，缓冲盐的水溶液为醋酸盐水溶液；更优选地，第一极性有机溶剂与缓冲盐的水溶液的体积比为1:(2～5)。

进一步优选地，第一极性有机溶剂为乙醇，缓冲盐的水溶液为醋酸钠水溶液；优选地，醋酸钠水溶液的浓度为0.1～1wt％，pH至为5.0～8.0；更优选地，醋酸钠水溶液的浓度为0.5wt％，pH值为7.5。

在一种优选的实施方式中，步骤S2中，洗脱第一吸附柱的过程中采用多次洗脱，且每次洗脱过程中洗脱液中极性有机溶剂的浓度不同且逐渐升高。采用这样的梯度洗脱方式，能够更充分地洗脱吸附在层析柱上的达托霉素。优选地，洗脱第一吸附柱的过程中，收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液部分合并形成第一洗脱液。这样更有利于兼顾产品收率和纯度。

为了进一步提高反相硅胶填料制备柱对达托霉素的吸附效果，在一种优选的实施方式中，上述步骤S4中，反相硅胶填料为C8和/或C18，反相硅胶填料的粒径为10～50μm，孔径为60～300埃；优选地，反相硅胶填料为C18，反相硅胶填料的粒径为10μm，孔径为100埃。

在一种优选的实施方式中，上述步骤S4中，第二浓缩液在制备柱中的上柱量为制备柱体积的0.5～2％，优选为1.5％。这样有利于进一步提高洗脱效果，同时有利于避免过多上柱量导致洗脱液中产品含量过低。优选地，洗脱第二吸附柱的过程中收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分合并形成第二洗脱液。这样有利于进一步兼顾产品的收率和纯度。

在一种优选的实施方式中，上述步骤S4中，洗脱第二吸附柱时采用的洗脱剂为第二极性有机溶剂和水的混合液；优选地，第二极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，且第二极性有机溶剂的浓度为5～30wt％。采用上述洗脱剂具有更好的洗脱效果。更优选地，第二极性有机溶剂为乙醇，且第二极性有机溶剂的浓度为10～20wt％。

上述初步纯化可以采用该领域的常用手段，但为了进一步提高初步纯化效果，为后续的层析柱和制备柱的分离做准备，在一种优选的实施方式中，上述步骤S1中，对达托霉素中间体料液进行初步纯化的步骤包括：收集达托霉素发酵液作为达托霉素中间体料液；对达托霉素中间体料液进行陶瓷膜过滤或板框过滤，得到滤液；采用树脂吸附滤液，再洗脱，得到初步纯化后的达托霉素中间体料液，且其中达托霉素含量≥50.0wt％(需说明的是，这里的≥50.0wt％是纯度，为HPLC检测的色谱纯度)；优选地，吸附所述滤液的树脂为大孔吸附树脂，更优选为XAD1600或HP-20；优选地，洗脱过程中的洗脱剂为20～60wt％的乙醇水溶液。采用上述吸附和洗脱剂具有更好的吸附和洗脱效果。

更优选地，上述步骤S1中，采用第一纳滤膜进行第一次浓缩的过程中，将初步纯化后的达托霉素中间体料液浓缩至100升(浓缩后的中间体料液)中含有1～15kg的达托霉素，优选浓缩至100升中含有3～10kg的达托霉素。

经过步骤S2后，料液中达托霉素变稀，在一种优选的实施方式中，上述步骤S3包括：采用第二纳滤膜对第一洗脱液进行第二次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；加入去离子水或纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中的电导率≤300us/cm，得到第二浓缩液。在进行纳滤膜浓缩处理后，利用去离子水或纯化水进行顶洗能够去除盐和有机溶剂，有利于进一步提高产品纯度。优选地，加入去离子水或纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第二次浓缩后浓缩液体积的去离子水或纯化水进行顶洗。

同理，在一种优选的实施方式中，上述步骤S5包括：采用第三纳滤膜对第二洗脱液进行第三次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；加入纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中第二极性有机溶剂的含量≤1wt％，得到第三浓缩液。这样有利于去除第二洗脱液中的极性有机溶剂。优选地，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第三次浓缩后浓缩液体积的纯化水进行顶洗。

为了进一步提高超滤效果，在一种优选的实施方式中，上述步骤S6包括：在将第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，直至超滤至残留1/2～1/5后，加入纯化水顶洗，直至超滤透出液中的达托霉素浓度≤500ug/ml后停止，得到超滤后的第三浓缩液；优选地，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与超滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍残留体积的纯化水进行顶洗。更优选地，上述步骤S6中，在得到超滤后的第三浓缩液后，将其采用第四纳滤膜进行第四次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素，优选直至100升中含有8～12kg的达托霉素，得到第四浓缩液。

在一种优选的实施方式中，上述步骤S7中将第四浓缩液的pH值调节至4.0～5.0后进行冻干。更优选地，上述步骤S2中，将第一浓缩液的pH值调节至4.5～6.5再进行第一次吸附。

以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

下述实施例与对比例中的达托霉素来源：

使用玫瑰孢链霉菌发酵首先生成达托霉素母核化合物A21978C，然后补加前体癸酸提供侧链来生物合成达托霉素。发酵培养温度控制26～32℃，发酵周期180～220小时，100L罐发酵单位2000～3500ug/ml。

下述实施例与对比例中浓缩用纳滤膜系统的膜材质为聚酰胺等材质，截留分子量为200Da。

下述实施例与对比例中超滤膜系统的膜材质为聚偏氟乙烯、聚醚砜等材质，截留分子量为10KD。

实施例1

达托霉素发酵液60L，发酵单位为2503ug/ml，陶瓷膜过滤后用HP-20吸附树脂吸附、60wt％的乙醇水溶液洗脱得达托霉素中间体料液22L，单位4972ug/ml，达托霉素纯度为53.84％。对该达托霉素中间体料液进行如下操作：

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为2050ml，达托霉素含量为52288ug/ml(相当于100L含达托霉素5.2288kg)，用稀盐酸调pH至4.55。

2)将1)中调pH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PS30-300填料的层析柱，用含25％乙醇的醋酸钠水溶液洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度为0.5％，pH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共26590ml、达托霉素含量为2974ug/ml，用纳滤膜浓缩至约1.5L(相当于100L含达托霉素5.27kg)后加纯化水连续顶洗去除盐和有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为10L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用10％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共26050ml、达托霉素含量为1980ug/ml，用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素5.16kg)后加水连续顶洗去除有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为10L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约200ml后加入纯化水顶洗，维持加水速度与超滤透出速度相当，总加水量为5L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度382ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为1390ml，达托霉素含量为34172ug/ml(相当于100L含达托霉素3.4172kg)。

8)将浓缩液调pH至4.50，放入冻干机冻干，最后得达托霉素47.0g，收率为31.29％，纯度为98.93％，其中β异构体为0.41％，杂质C为0.12％，杂质D为0.09％，脱水达托霉素为0.31％。

实施例2

达托霉素发酵液65L，发酵单位为2118ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂XAD1600吸附、40wt％的乙醇水溶液洗脱得达托霉素中间体料液25L，单位4130ug/ml，达托霉素纯度为56.37％。对该达托霉素中间体料液进行如下操作：

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为2870ml，达托霉素含量为35076ug/ml(相当于100L含达托霉素3.507kg)，用稀盐酸调pH至6.40。

2)将1)中调pH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PSA30-300填料的层析柱，依次用含20％乙醇、30％乙醇的醋酸钠水溶液梯度洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度分别为0.5％，pH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共18425ml，达托霉素含量为4125ug/ml,用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素7.6kg)后加水连续顶洗去除盐和有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为6L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用15％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共18820ml，(相当于100L含达托霉素11.6kg)2605ug/ml，用纳滤膜浓缩至约0.5L(相当于100L含达托霉素9.8kg)后加水连续顶洗去除有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为6L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约250ml后加入纯化水顶洗，维持加水速度与超滤透出速度相当，总加水量为5L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度297ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为550ml，达托霉素含量为83369ug/ml(相当于100L含达托霉素8.3369kg)。

8)将浓缩液调pH至4.91，放入冻干机冻干，最后得达托霉素44.9g，收率为32.61％，纯度为98.65％，其中β异构体为0.54％，杂质C为0.11％，杂质D为0.06％，脱水达托霉素为0.28％。

实施例3

达托霉素发酵液62L，发酵单位为2895ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂XAD1600吸附、20wt％的乙醇水溶液洗脱，得达托霉素中间体料液28.5L，单位4538ug/ml，达托霉素纯度为54.22％。对该达托霉素中间体料液进行如下操作：

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为1550ml，达托霉素含量为81603ug/ml(相当于100L含达托霉素8.1603kg)，用稀盐酸调pH至5.48。

2)将1)中调pH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PSN30-300填料的层析柱，依次用含20％乙醇、32％乙醇的醋酸钠水溶液梯度洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度为0.5％，pH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共21580ml，达托霉素含量为4307ug/ml，用纳滤膜浓缩至约0.8L(相当于100L含达托霉素11.6kg)后间歇加水顶洗去除盐和有机溶剂，每次加水1500ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为7.5L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用20％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共17050ml，达托霉素含量为3485ug/ml，用纳滤膜浓缩至约500ml(相当于100L含达托霉素11.88kg)后间歇加水顶洗去除有机溶剂，每次加水1000ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为8.0L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约250ml后间歇加水顶洗去除有机溶剂，每次加水500ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为5L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度415ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为500ml，达托霉素含量为110354ug/ml(相当于100L含达托霉素11.0354kg)。

8)将浓缩液调pH至4.08，放入冻干机冻干，最后得达托霉素54.2g，收率为30.20％，纯度为98.83％，其中β异构体为0.47％，杂质C为0.11％，杂质D为0.07％，脱水达托霉素为0.30％。

实施例4

达托霉素发酵液70L，发酵单位为1884ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂XAD1600吸附、20wt％的乙醇水溶液洗脱得达托霉素中间体料液20L，单位4643ug/ml，达托霉素纯度为51.25％。

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为2120ml，单位41915ug/ml(相当于100L含达托霉素4.1915kg)，用稀盐酸调PH至4.62。

2)将1)中调PH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PS30-300填料的层析柱，用含22％乙醇、28％乙醇的醋酸钠水溶液洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度为0.5％，PH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共20150ml，达托霉素含量为3268ug/ml,用纳滤膜浓缩至约1.5L(相当于100L含达托霉素4.39kg)后加水连续顶洗去除盐和有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为10L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用8％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共20150ml，达托霉素含量为2223ug/ml，用纳滤膜浓缩至约0.5L(相当于100L含达托霉素8.96kg)后加水连续顶洗去除有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为6L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约200ml后加入纯化水顶洗，维持加水速度与超滤透出速度相当，总加水量为5L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度315ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为600ml，达托霉素含量为68933ug/ml(相当于100L含达托霉素6.8933kg)。

8)将浓缩液调PH至4.25，放入冻干机冻干，最后得达托霉素40.6g，收率为30.79％，纯度为99.28％，其中β异构体为0.19％，杂质C为0.23％，杂质D未检出，脱水达托霉素为0.16％。

实施例5

达托霉素发酵液60L，发酵单位为3082ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂HP-20吸附、60wt％的乙醇水溶液洗脱得达托霉素中间体料液30L，单位4854ug/ml，达托霉素纯度为54.33％。

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为1980ml，达托霉素含量为72040ug/ml(相当于100L含达托霉素7.204kg)，用稀盐酸调PH至6.45。

2)将1)中调PH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PSA30-300填料的层析柱，依次用含22％乙醇、30％乙醇的醋酸钠水溶液梯度洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度分别为0.5％，PH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共28850ml，达托霉素含量为3541ug/ml,用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素10.21kg)后加水连续顶洗去除盐和有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为6L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用14％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共24100ml，达托霉素含量为2630ug/ml，用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素6.34kg)后加水连续顶洗去除有机溶剂，加水速度维持与透出速度相当，总加水量为10L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约300ml后加入纯化水顶洗，维持加水速度与超滤透出速度相当，总加水量为5L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度395ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为610ml，达托霉素含量为96803ug/ml(相当于100L含达托霉素9.68kg)。

8)将浓缩液调PH至3.95，放入冻干机冻干，最后得达托霉素57.8g，收率为31.26％，纯度为98.81％，其中β异构体为0.32％，杂质C为0.36％，杂质D未检出，脱水达托霉素为0.37％。

实施例6

达托霉素发酵液65L，发酵单位为2607ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂HP-20吸附、40wt％的乙醇水溶液洗脱得达托霉素中间体料液32.5L，单位4310ug/ml，达托霉素纯度为55.67％。

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为2300ml，达托霉素含量为60174ug/ml(相当于100L含达托霉素6.0174kg)，用稀盐酸调PH至4.75。

2)将1)中调PH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的PSN30-300填料的层析柱，依次用含22％乙醇、32％乙醇的醋酸钠水溶液梯度洗脱，醋酸钠水溶液中醋酸钠浓度为0.5％，PH为7.5。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共22300ml，达托霉素含量为4347ug/ml，用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素9.69kg)后间歇加水顶洗去除盐和有机溶剂，每次加水2000ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为10L。

4)将脱去盐和有机溶剂的浓缩液上入装有5.0L预处理后的反相硅胶C18填料的制备柱进行制备分离，用22％的乙醇水溶液洗脱；

5)收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分，合并，共17850ml，达托霉素含量为3426ug/ml，用纳滤膜浓缩至约1.0L(相当于100L含达托霉素6.115kg)后间歇加水顶洗去除有机溶剂，每次加水2000ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为10L。

6)将脱去有机溶剂的浓缩液用超滤膜脱色和去内毒素，当超滤至残留约350ml后间歇加水顶洗去除有机溶剂，每次加水500ml循环均匀并浓缩透出相当体积后继续加水，总加水量为6L，超滤结束时超滤透出液中达托霉素浓度456ug/ml。

7)将超滤透出液用纳滤膜浓缩，浓缩液体积为510ml，达托霉素含量为111588ug/ml(相当于100L含达托霉素11.1588kg)。

8)将浓缩液调PH至4.98，放入冻干机冻干，最后得达托霉素55.8g，收率为32.92％，纯度为98.90％，其中β异构体为0.64％，杂质C为0.21％，杂质D为0.04％，脱水达托霉素为0.14％。

对比例1

达托霉素发酵液60L，发酵单位为2426ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂DIAIONHP20吸附、洗脱得达托霉素中间体料液25L，单位4015ug/ml，达托霉素组份为52.77％。对该达托霉素中间体料液进行如下操作：

1)将达托霉素中间体料液用纳滤膜进行浓缩并用水顶洗，浓缩液体积为5100ml，单位19543ug/ml，用稀盐酸调pH至6.50。

2)将1)中调pH后的浓缩液上入装有3.0L预处理过的弱碱性阴离子交换树脂FP-DA13的层析柱，依次用含0.05M氯化钠、0.5M氯化钠的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，洗脱剂pH为7.0～8.0。

3)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共20150ml,单位3858ug/ml。

4)将3)中的收集液上入装有3.0L预处理后的DIAION HP20SS的层析柱进行色谱分离，用20％异丙醇、45％异丙醇梯度洗脱。

5)收集达托霉素纯度≥92.0％的洗脱液，合并，共11280ml,单位5590ug/ml。

6)将5)中收集液上入装有3.0L预处理过的弱碱性阴离子交换树脂FP-DA13的层析柱再次分离，依次用含0.05M氯化钠、0.5M氯化钠的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，洗脱剂pH为7.0～8.0。

7)收集达托霉素纯度≥96.0％的洗脱液，合并，共15520ml,单位2965ug/ml。

8)将7)中收集液浓缩顶洗、超滤、再浓缩，得精制浓缩液480ml,单位85328ug/ml。

9)将浓缩液调pH至4.58，放入冻干机冻干，最后得达托霉素40.5g，收率为27.82％，纯度为96.23％，其中β异构体为0.47％，杂质C为0.68％，杂质D为0.35％，脱水达托霉素为0.70％。

对比例2

达托霉素发酵液62L，发酵单位为3048ug/ml，陶瓷膜过滤后用吸附树脂AMBERLITEXAD1600吸附、洗脱得达托霉素中间体料液28L，单位4733ug/ml，达托霉素组份为52.77％。对该达托霉素中间体料液进行如下操作：

1)将达托霉素中间体料液调pH至6.58，上入装有5.0L预处理过的AMBERLITEFPA98Cl离子交换树脂的层析柱吸附，依次用含0.05M氯化钠、0.5M氯化钠的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，洗脱剂pH为7.0～8.0。

2)收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液，合并，共22400ml,单位5351ug/ml，并用纳滤膜浓缩并加水顶洗去除盐分。

3)将2)中的除盐后的浓缩液上入装有3.0L预处理后的DEAE Sepharose FastFlow弱阴离子凝胶柱进行色谱分离，依次用含0.05M氯化钠、0.5M氯化钠的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，洗脱剂pH为7.0～8.0。

4)收集达托霉素纯度≥92.0％的洗脱液，合并，共15460ml,单位5446ug/ml。

5)将4)中的收集液上入装有3.0L预处理后的DIAION HP20SS的层析柱进行色谱分离，用20％异丙醇、45％异丙醇梯度洗脱。

6)收集达托霉素纯度≥96.0％的洗脱液，合并，共10350ml,单位5615ug/ml。

7)将6)中收集液浓缩顶洗、超滤、再浓缩，得精制浓缩液530ml,单位95917ug/ml。

8)将浓缩液调pH至4.50，放入冻干机冻干，最后得达托霉素50.2g，收率为26.56％，纯度为96.54％，其中β异构体为0.38％，杂质C为0.58％，杂质D为0.64％，脱水达托霉素为0.74％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (31)

1.一种达托霉素的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，对达托霉素中间体料液进行初步纯化，然后用第一纳滤膜进行第一次浓缩，得到第一浓缩液；对所述达托霉素中间体料液进行初步纯化的步骤包括：收集达托霉素发酵液作为所述达托霉素中间体料液；对所述达托霉素中间体料液进行陶瓷膜过滤或板框过滤，得到滤液；采用树脂吸附所述滤液，再洗脱，得到初步纯化后的所述达托霉素中间体料液，且其中达托霉素含量≥50.0％；

S2，将所述第一浓缩液的pH值调节至4.0～8.0，然后将其上入装有单分散聚合物填料的层析柱进行第一次吸附，得到第一吸附柱；洗脱所述第一吸附柱，得到第一洗脱液；所述单分散聚合物填料的材料选自PS、PSA、PSN中的一种或多种，且所述单分散聚合物填料的粒径为10～50μm，孔径为100～300埃；洗脱所述第一吸附柱时采用的洗脱剂包括第一极性有机溶剂和缓冲盐的水溶液；所述第一极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种，所述缓冲盐的水溶液为醋酸盐水溶液；

S3，采用第二纳滤膜对所述第一洗脱液进行第二次浓缩，得到第二浓缩液；

S4，将所述第二浓缩液上入装有反相硅胶填料的制备柱中进行吸附，得到第二吸附柱；洗脱所述第二吸附柱，得到第二洗脱液；所述反相硅胶填料为C8和/或C18，所述反相硅胶填料的粒径为10～50μm，孔径为60～300埃；洗脱所述第二吸附柱时采用的洗脱剂为第二极性有机溶剂和水的混合液；所述第二极性有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中的一种或多种；

S5，采用第三纳滤膜对所述第二洗脱液进行第三次浓缩，得到第三浓缩液；

S6，将所述第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，然后再用第四纳滤膜进行第四次浓缩，得到第四浓缩液；

S7，调节所述第四浓缩液的pH值至3.0～6.0，然后经冻干，得到达托霉素成品。

2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述单分散聚合物填料的材料选自PS和/或PSA，且所述单分散聚合物填料的粒径为30μm，孔径为300埃。

3.根据权利要求2所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，调节pH后的所述第一浓缩液在所述层析柱中的上柱量为所述层析柱体积2～10％。

4.根据权利要求3所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述调节pH后的所述第一浓缩液在所述层析柱中的上柱量为所述层析柱体积3～6％。

5.根据权利要求2所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述第一极性有机溶剂与所述缓冲盐的水溶液的体积比为1:(2～5)。

6.根据权利要求5所述的提纯方法，其特征在于，所述第一极性有机溶剂为乙醇，所述缓冲盐的水溶液为醋酸钠水溶液。

7.根据权利要求6所述的提纯方法，其特征在于，所述醋酸钠水溶液的浓度为0.1～1wt％，pH值为5.0～8.0。

8.根据权利要求7所述的提纯方法，其特征在于，所述醋酸钠水溶液的浓度为0.5wt％，pH值为7.5。

9.根据权利要求6所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，洗脱所述第一吸附柱的过程中采用多次洗脱，且每次洗脱过程中洗脱液中所述第一极性有机溶剂的浓度不同且逐渐升高。

10.根据权利要求9所述的提纯方法，其特征在于，洗脱所述第一吸附柱的过程中，收集达托霉素纯度≥80.0％的洗脱液部分合并形成所述第一洗脱液。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述反相硅胶填料为C18，所述反相硅胶填料的粒径为10μm，孔径为100埃。

12.根据权利要求11所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述第二浓缩液在所述制备柱中的上柱量为所述制备柱体积的0.5～2％。

13.根据权利要求12所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述第二浓缩液在所述制备柱中的上柱量为所述制备柱体积的1.5％。

14.根据权利要求13所述的提纯方法，其特征在于，洗脱所述第二吸附柱的过程中收集达托霉素纯度≥98.5％的洗脱液部分合并形成所述第二洗脱液。

15.根据权利要求11所述的提纯方法，其特征在于，所述第二极性有机溶剂的浓度为5～30wt％。

16.根据权利要求15所述的提纯方法，其特征在于，所述第二极性有机溶剂为乙醇，且所述第二极性有机溶剂的浓度为10～20wt％。

17.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S1中，吸附所述滤液的树脂为大孔吸附树脂。

18.根据权利要求17所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S1中，吸附所述滤液的树脂为XAD1600或HP-20。

19.根据权利要求17所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S1中，洗脱过程中的洗脱剂为20～60wt％的乙醇水溶液。

20.根据权利要求17所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用所述第一纳滤膜进行第一次浓缩的过程中，将初步纯化后的所述达托霉素中间体料液浓缩至100升中含有1～15kg的达托霉素。

21.根据权利要求20所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用所述第一纳滤膜进行第一次浓缩的过程中，将初步纯化后的所述达托霉素中间体料液浓缩至100升中含有3～10kg的达托霉素。

22.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S3包括：

采用所述第二纳滤膜对所述第一洗脱液进行所述第二次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；

加入去离子水或纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中的电导率≤300us/cm，得到所述第二浓缩液。

23.根据权利要求22所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S3中，加入去离子水或纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第二次浓缩后浓缩液体积的去离子水或纯化水进行顶洗。

24.根据权利要求15所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S5包括：

采用所述第三纳滤膜对所述第二洗脱液进行所述第三次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素；

加入纯化水进行顶洗，直至纳滤废水中所述第二极性有机溶剂的含量≤1wt％，得到所述第三浓缩液。

25.根据权利要求24所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S5中，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与纳滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍第三次浓缩后浓缩液体积的纯化水进行顶洗。

26.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S6包括：

在将所述第三浓缩液进行超滤膜脱色和去内毒素，直至超滤至残留1/2～1/5后，加入纯化水顶洗，直至超滤透出液中的达托霉素浓度≤500ug/ml后停止，得到超滤后的所述第三浓缩液。

27.根据权利要求26所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S6中，加入纯化水的方式为连续加水或间歇加水方式，当采用连续加水方式时，维持加水速度与超滤透出速度相同，当采用间歇加水方式时，每次加入1～3倍残留体积的纯化水进行顶洗。

28.根据权利要求26所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S6中，在得到超滤后的所述第三浓缩液后，将其采用所述第四纳滤膜进行所述第四次浓缩，直至100升中含有3～15kg的达托霉素，得到所述第四浓缩液。

29.根据权利要求28所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S6中，在得到超滤后的所述第三浓缩液后，将其采用所述第四纳滤膜进行所述第四次浓缩，直至100升中含有8～12kg的达托霉素，得到所述第四浓缩液。

30.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S7中将所述第四浓缩液的pH值调节至4.0～5.0后进行冻干。

31.根据权利要求1至10中任一项所述的提纯方法，其特征在于，所述步骤S2中，将所述第一浓缩液的pH值调节至4.5～6.5再进行所述第一次吸附。