KR20170061228A

KR20170061228A - 테이코플라닌 회수방법 및 정제방법

Info

Publication number: KR20170061228A
Application number: KR1020150165573A
Authority: KR
Inventors: 김재종; 임시규; 이금순; 김동환; 유정현; 이보미; 김슬기; 이소라
Original assignee: (주) 제노텍
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-06-05
Also published as: KR101802191B1

Abstract

과제: 테이코플라닌 회수 및 정제에 용매가 다량 필요하고, 대규모 설비가 요구되며, 시간이 많이 소요된다.
해결방법: 본 발명은 테이코플라닌 발효배양액을 pH 1.5 ~ 3.0의 산성 조건으로 만들어 테이코플라닌을 침전하여 수-혼화성 유기용매를 사용하여 간단한 공정으로 높은 수율로 회수할 수 있다. 또한, 본 발명은 조정제 시료의 테이코플라닌을 산성용매 조건으로 세척후 용출하여 테이코 2를 포함하는 불순물을 제거하여 테이코플라닌을 고순도로 정제할 수 있다.

Description

테이코플라닌 회수방법 및 정제방법{Recovery method and purification method for teicoplanin}

본 발명은 글라이코펩타이드계 항생제인 테이코플라닌 A2의 효율적인 회수방법 및 정제방법에 관한 것이다.

글라이코펩타이드계 항생제는 세균의 세포벽 합성을 저해하는 항생제로 주로 그람 양성세균의 감염병 치료제로 사용된다. 이들은 메치실린 내성 황색 포도상 구균(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 감염증의 특효 치료약으로 사용된다. 특히 글라이코펩타이드계 항생제 중 테이코플라닌은 메치실린 내성 포도상 구균 (MRSA)뿐만 아니라, 반코마이신 내성 장구균 (VRE) 등의 심각한 약제 내성 감염질병의 치료제로 고려되고 있으며, 병원에서 주로 주사제로 사용되고, 경구 투여도 가능한 항생제이다. 특히, 테이코플라닌은 반코마이신보다 높은 반감기 및 근육주사가 가능하다는 사용상의 장점이 있는 우수한 항생제이다.

테이코플라닌은 처음에는 테이코마이신 A2 (Teichomycin A2)로 명명되었으며, 방선균속인 액티노플라네스 테이코마이세티쿠스 (Actioplanes teichomyceticus) nov. sp. ATCC 31121에 의해 생성된다고 보고되었다 [J. Antibiotics 31 (1978), p. 170-177, J. Antibiotics 31 (1978), p. 276-283]. 이후, 테이코마이신 A2는 테이코플라닌으로 명명되었고, 여러 개의 연관된 화합물의 혼합체임이 밝혀졌다 [J. Antibiotics 37 (1984), p. 615-620, J. Antibiotics 42(1989), p. 361-366].

테이코플라닌은 대한약전에 따르면 테이코플라닌 A2 복합체가 80% 이상이며, 테이코플라닌 A3 군이 15% 이하인 품질을 요구하고 있다. 이러한 품질 기준을 만족하는 테이코플라닌의 수득하는 방법은 여러 문헌에서 제시되었다. 이들 방법에서 액티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효 배양액으로부터 테이코플라닌을 수득하는 방법으로 제시된 것은 배양액과 균체로부터 유기용매로 용제로 사용하여 추출하는 방법(J. of Antibiotics, 31 (3) 170-177, 1978, 미국 특허 제4,239,751호, 미국 특허 제4,696,817호)과, 배양액을 알칼리로 조정한 후 균체를 여과하여 회수하는 방법(대한민국 특허 제10-0184644호), 그리고 배양액에 흡착수지를 혼합하여 배양한 후 테이코플라닌이 흡착된 수지를 회수하여 획득하는 방법(대한민국 특허 제10-0321304호) 등이 제시되고 있다. 1차 배양액으로부터 수득된 테이코플라닌 함유물은 유기용매 추출물의 경우 감압농축 혹은 물의 추가를 통해 용매를 제거하거나 용매의 함유비를 낮추어 합성 흡착수지, 이온교환수지, 친화성 수지에 결합한 후 적절히 용매로 용출하여 수득하는 방법이 제시되고 있다.

종래 테이코플라닌 정제기술은 유기용제를 과량 사용해야 하고, 흡착수지의 흡착력이 1 ~ 30 g/L 수준으로 낮아 이에 따라 필요한 흡착수지의 양이 증가하고 용리 용제의 부피가 필연적으로 늘게 되어 경제적인 부담이 뒤따른다.

또한, 국제적으로 통용되고 있는 의약품 기준에 따르면 불순물로 테이코플라닌 A3 군이 10% 이하, 기타군이 5% 이하를 만족해야 한다. 연구에 따르면, 장기 배양 또는 정제과정 중에 테이코플라닌의 트랜스아미네이션 반응(transamination reaction)으로 테이코 2 (Teico 2)가 생성된다 [J. Antibiotics 49 (1995), pp 644-650]. 테이코 2는 불순물로 기타군에 속하며, 테이코플라닌의 산업적 생산과정에서 테이코 2의 제거는 테이코플라닌의 품질을 높이는 과정에 매우 중요하다. 그러나 테이코 2는 테이코플라닌과 구조적으로 유사하며, 물성이 유사하여 통상의 정제과정에서 제거가 어렵다.

테이코플라닌은 아실기를 보유하고 있어 다른 글라이코펩타이드계 항생제보다 소수성이 높다. 그러므로 테이코플라닌은 통상적으로 발효 종료 후의 회수에 있어 중성 이하 pH에서 배양 상등액에만 아니라 균체와 같은 고형물에 다량 함유되어 있다. 이로부터 적절한 회수를 위해 pH를 알칼리(pH 11.0)로 조정하여 여과, 혹은 원심분리하여 배양 상등액을 회수하여 사용하거나, 혹은 배양액에 유기 용매를 가하여 회수하는 방법을 사용한다.

이러한 방법은 종종 다량의 용매의 사용과 많은 부피의 용액이 발생하고 이에 따른 산업적 생산 설비의 규모의 증가가 필연적으로 뒤따른다. 또한 많은 부피의 용액을 흡착하기 위한 공정운용 시간이 소모된다.

따라서, 본 발명은 공정상 부피를 최소화하고 또한 불순물을 효과적으로 제거할 수 있는 간단한 테이코플라닌 회수 및 정제방법을 제공하려는 것을 목표로 한다. 또한, 본 발명은 불순물인 테이코플라닌 A3군과 특히 기타 군에 속하는 에피머화된 테이코플라닌 불순물인 테이코 2의 제거에 매우 효과적인 테이코플라닌 분리 정제 방법을 제공하고자 한다.

이에 본 발명자들은 테이코플라닌 발효 배양여액을 산성 pH로, 더욱 바람직하게는 pH 1.5 ~ 4.0의 강산성으로 침전하여 테이코플라닌을 높은 수율로 회수하는 방법을 발명하였으며, 또한 이 침전물로부터 용매, 바람직하게는 수-혼화성 유기용매를 사용하여 회수하는 방법을 발명하였다. 또한, 본 발명자들은 조 정제시료의 테이코플라닌을 산성용매 조건으로 세척한 후 산성용매 조건으로 용출하여 테이코 2를 포함하는 불순물을 제거하여 테이코플라닌을 고순도로 정제하는 방법을 발명하였다.

본 발명에서 테이코플라닌 발효 배양여액은 테이코플라닌 생산 미생물, 바람직하게는 액티노플라네스 테이코마이세티쿠스의 발효배양액으로부터 균체 및 고형물을 제거하여 회수한 배양액을 의미한다. 균체 및 고형물의 제거는 원심분리, 드럼여과, 필터프레스여과, 나노필터여과와 같이 일반적인 생물공학자가 할 수 있는 여과방법을 적용하며, 어느 하나를 특정하지는 않는다. 테이코플라닌 발효 배양여액은 통상의 방법에 따르면 pH 6.0 ~ 11.5의 범위를 가진다. 본 발명은 발효 배양여액을 산성 조절제, 바람직하게는 염산, 황산 용액 등의 무기산 또는 초산 등의 유기산 용액을 첨가 및 혼합하여 산성, 바람직하게는 pH 1.5 ~ pH 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 1.5 ~ 2.5로 조절하여 테이코플라닌을 침전하여 수득하는 방법을 제공한다. 침전물은 공지된 통상의 방법, 예컨대 원심력을 이용하거나, 필터를 이용하거나, 또한 침강을 통해 수득할 수 있다. 본 발명의 방법에서 벗어난 pH 조건에서 침전 단계를 수행하는 경우에는 테이코플라닌의 안정성을 담보할 수 없으며, 또한, 테이코 2의 분리도가 낮아 순도가 저하되며 수율이 감소한다.

본 발명에서 상기 방법으로 수득한 침전물은 테이코플라닌을 용해할 수 있는 용매와 혼합하여 회수할 수 있다. 테이코플라닌을 용해할 수 있는 용매로는 물과 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤, C3-C4-니트릴로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이의 혼합용매를 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 물과 수-혼화성 용매인 아세톤, 이소프로판올, 메탄올, 에탄올과 이들의 1종 이상의 혼합용매가 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는 이소프로판올 20~70%(v/v) 수혼합용매, 아세톤 20~70%(v/v) 수혼합용매를 사용한다.

본 발명의 방법을 이용하면 배양여액에서 테이코플라닌의 순도가 5 ~ 10%(w/v)인데 반해 회수된 테이코플라닌 용액에서는 20 ~ 40%(w/v)의 순도에 도달할 수 있으며, 또한 회수된 테이코플라닌 용액의 부피가 배양여액의 1/5 ~ 1/20(v/v)로 감소하게 된다. 이때의 테이코플라닌 회수율은 60 ~ 80%(w/v)를 만족할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에서는 테이코플라닌을 의약품 품질을 만족하는 수준으로 정제하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명에서 제공되는 상기 방법에 의해 회수된 테이코플라닌 용액은 더욱 높은 수준으로 정제를 위해 흡착수지, 친화성 수지 또는 이온교환수지를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 방향족계(aromatic type), 수식된 방향족계(aromatic chemically modified type), 메타아크릴계(methacrylic type), 폴리아미드계(polyamide type) 군에서 1종 이상의 수지를, 더욱 바람직하게는 방향족계의 스티렌/다이비닐벤젠 (styrene-divinylbenzene) 중합체 수지를 선택하여 이용할 수 있다.

테이코플라닌의 흡착은 0 ~ 20%(v/v)의 유기용매에서 수행되며, pH는 중성에서 알칼리 범위로 바람직하게는 pH 6.0 ~ 9.0 바람직하게는 pH 7.0 ~ 8.5에서 수행된다. 흡착 후에 세척은 산성(pH 2.0 ~ 5.0) 탈염수로 세척되며, 산성의 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합용매로 추가 세척하며, 이때 수-혼화성 용매는 바람직하게는 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤, C3-C4-니트릴로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택된다. 또한, 추가 세척시에는 수-혼화성 용매를 물과 5 ~ 30%(v/v)로 혼합하여 사용하며, 더욱 바람직하게는 10 ~ 20%(v/v)의 혼합용매를 사용한다. 상기 세척 용매는 산성 범위, 바람직하게는 pH 1.5 ~ 5.0, 더욱 바람직하게는 pH 1.5 ~ 3.0의 범위에서 수행된다. 세척은 바람직하게는 수지 부피의 3배 ~ 20배의 용매로 수행되며, 더욱 바람직하게는 8배 ~ 12배로 수행된다.

세척이 된 수지로부터 테이코플라닌의 용출은 20 ~ 70%(v/v)의 수-혼화성 용매를 이용하며, 수-혼화성 용매는 바람직하게는 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤, C3-C4-니트릴로 이루어진 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 30 ~ 50%(v/v)의 아세톤 또는 아이소프로필알콜과 물의 혼합용매가 선택된다. 상기 용출용매는 산성 범위에서, 바람직하게는 pH 1.5 ~ 5.0, 더욱 바람직하게는 pH 1.5 ~ 3.0의 극산성범위에서 수행된다. 용출은 바람직하게는 수지 부피의 3 ~ 20배 용출용매를 가하여 수행되며, 더욱 바람직하게는 3 ~ 10배를 가하여 수행된다. 본 발명에서 로딩, 세척, 용출시 유속은 0.5 BV/hr ~ 4 BV/hr의 범주에서 수행가능하며, 유속이 본 발명의 구성에 영향을 미치지는 아니한다.

본 발명의 방법에서 제시한 pH 범위를 벗어난 알칼리 조건에서 수세, 세척 또는 용출 과정 중 한 과정을 수행하는 경우에는 테이코플라닌의 안정성을 담보할 수 없으며, 또한 약 산성 및 중성 조건의 실시는 색도를 낮출 수 없고, 테이코 2의 분리도가 낮아 순도가 저하되며 수율이 감소한다. 그러므로, 본 발명에서 산성 용매를 이용한 수세, 세척과 용출은 색도 제거, 테이코플라닌의 안정성 확보, 그리고 획득 수율의 증대라는 효과를 제공한다. 본 발명의 상기 정제방법으로 순도 85%(w/w) 이상의 의약품 품질 기준을 만족하는 테이코플라닌을 수득할 수 있다.

본 발명의 방법으로 수득한 테이코플라닌은 활성탄 처리, 결정화와 같은 방법을 통해 일부 잔존 색도를 제거할 수도 있으며, 고형물로 획득할 수 있으며, 동결건조, 진공건조를 통해 분말로 확보할 수도 있다. 본 발명에서 제공하는 방법은 테이코플라닌 A2 정제의 어느 한 단계에 제공될 수 있다.

본 발명의 배양여액을 산성으로 조정하여 테이코플라닌을 침전시킴으로써 불순물을 제거하고 테이코플라닌을 회수하는 방법을 이용하면 간단한 공정으로 높은 수율의 테이코플라닌을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 흡착수지와 산성 용매를 이용한 테이코플라닌 용출과 세척은 색도 제거, 테이코플라닌의 안정성 확보, 그리고 획득 수율의 증대라는 효과를 제공한다. 본 발명의 정제방법으로 순도 85% 이상의 의약품 품질 기준을 만족하는 테이코플라닌을 수득할 수 있다.

도 1은 본 발명을 통해 분리 및 정제하고자 하는 테이코플라닌의 구조이다.
도 2는 본 발명을 통해 제거하고자 하는 불순물인 대표적인 테이코2의 구조이다.
도 3은 테이코플라닌 시료의 HPLC 그래프이며, A는 컬럼 정제 전 조정제 시료의 HPLC 그래프이고, B는 본 발명의 방법으로 정제된 시료의 HPLC 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 설명한다. 아래 발명의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1>

본 발명의 방법을 수행하면서 얻은 다양한 중간체 용액 또는 최종 생성물에 대하여 HPLC 방법으로 함량 및 순도를 측정하였다. 이동상 A는 인산이수소나트륨 이수화물 7.80 g을 증류수 1.650 L에 녹이고 아세토나이트릴 300 mL를 넣어 수산화나트륨 용액으로 pH 6.0으로 조정하고 증류수를 넣고 2 L로 조정한 후 탈기하여 사용하였다. 이동상 B는 인산이수소나트륨 이수화물 7.80 g을 증류수 550 mL에 녹이고 아세토나이트릴 1.4 L를 넣어 수산화나트륨 용액으로 pH 6.0으로 조정하고 증류수로 2 L로 조정한 후 탈기하여 사용하였다. 크로마토그래피 피크는 UV 254 nm에서 검출하였고, 컬럼은 C18을 (THERMO Hypersil GOLD, ,250 mm x4.6 mm, 5 μm) 사용하였다. 유속은 1.8 ml/min 이었고, 크로마토그래피 동안 구배는 아래 표 1과 같다.

	이동상
시간 (분)	A (%)	B (%)
0~ 32	100 -> 70	0 -> 30
32~40	70 -> 50	40 -> 50
40~42	50 -> 100	50 -> 0

<실시예 2>

테이코플라닌 수득을 위해 5 L 항아리 발효기에서 발효하였다. 발효를 위해 말토덱스트린 50 g/L, 포도당 20 g/L, 콩가루 10 g/L, 펩톤 5 g/L, 효모 엑스 5 g/L, 탄산칼슘 5 g/L, 염화나트륨 1.2 g/L, 황산마그네슘 0.5 g/L, 염화칼슘 0.1 g/L의 조성으로 된 배지 3L에 종배양된 액티노플라네스 테이코마이세티쿠스를 접종하여 33 ℃의 온도에서, 교반속도 600 ~ 800 rpm, 통기량 0.5 ~ 1 vvm으로 유지하며 6일 동안 배양을 실시하였다. 발효배양의 최종 pH는 7.8 이하가 되도록 유지하였다. 이때 배양된 테이코플라닌의 농도는 약 4.1 g/L이었다.

<실시예 3>

실시예 2에서 발효된 테이코플라닌 함유 배양액 2.8 L에 배양액 부피 약 0.5배의 물을 가수하여 혼합하고 여기에 묽은 수산화나트륨 용액 (2N NaOH)을 혼합하여 pH 11.0 조정한 후 7% (w/v)의 규조토를 가한 후 여과하여 균체 및 고형분을 제거하고, 테이코플라닌이 함유된 배양 여액 4 L를 회수하였다. 이 배양 여액 100 ml에 묽은 염산 용액 (5N HCl)을 혼합하여 pH 8.5로 조정하여 준비하였다. 이때 배양 여액 중 테이코플라닌의 농도는 2.62 g/L, 순도는 약 12%였다. 배양여액을 각 10 ml 씩 시험관에 분주하여 묽은 염산 용액 (5N HCl)을 혼합하여 pH 2.0 ~ 7.0으로 조정하였다. 조정 후 냉장조건 (6℃)에서 약 12시간 정치 후 관찰한 결과 침전이 발생함을 육안으로 확인할 수 있었으며, 침전물은 원심분리(3000 g, 10 분)하여 회수하였다. 회수된 침전물은 갈색의 양태를 보였으며, pH가 산성으로 갈수록 침전물의 양이 많았다. 다만, pH 4.0 이하의 조건에서는 침전물량이 비슷한 정도였다. 원심분리한 상등액에 잔류하고 있는 테이코플라닌을 실시예 1의 방법으로 HPLC 분석하여 침전물에 존재하는 테이코플라닌의 회수율을 평가하였으며 (표 1), 그 결과 pH 2.0에서 상등액에 잔류된 테이코플라닌이 약 25% (침전물에 약 75%) 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 pH 조절제를 사용하여 배양여액을 산성으로 조절할 경우 간단히 테이코플라닌을 수득할 수 있음을 확인할 수 있었다.

처리 pH	상등액의 테이코플라닌 농도 (g/L)	상등액의 테이코플라닌 양 (%)	침전물의 테이코플라닌 양 (%)	상등액의 흡광도 Abs 450	침전물량 *
pH 8.5 (무처리구)	2.62	100.0	0	3.670	-
pH 2.0	0.65	24.9	75.1	0.920	+++++
pH 3.0	0.74	28.4	71.6	0.925	++++-
pH 4.0	1.04	39.6	60.4	1.300	++++-
pH 5.0	1.86	70.9	29.1	1.880	++-
pH 6.0	2.38	91.0	9	2.420	+-
pH 7.0	2.55	97.4	2.6	3.580	+

* 상대적인 침전물의 양을 표시함

<실시예 4>

실시예 1에서 회수한 테이코플라닌이 함유된 배양 여액 2 L를 묽은 염산 용액 (5 N HCl)을 가하고 혼합하여 pH 2.0으로 조정한 후 실온에서 6시간 방치한 다음, 냉장 상태에서 추가 6시간 동안 방치하였다. 방치 중에 관찰한 결과, 실온에서 6시간 후에 다량의 침전물이 발생하였으며, 이를 추가로 냉장 방치한 경우 조금 더 많은 침전물이 생성됨을 확인하였다. 침전물은 원심분리 (3000g, 10분)로 회수하였으며, 이를 적량씩 나누어 아래 표 3과 같이 아세톤 또는 이소프로필 알콜과 물의 혼합용매를 사용하여 침전물에 존재하는 테이코플라닌을 용해하여 HPLC로 분석하여 상대적 회수율을 측정하였다. 각 용매는 사용한 배양여액의 0.1 배 부피를 투입하여 혼합하였으며, pH는 8.5로 조정하였고 약 1시간 교반한 후 원심분리하여 용해 상등액을 회수하여 측정하였다. 3번 시험의 평균을 측정하였으며, 최대 표준 편차는 ± 4 이하로 비교적 일정하게 용해됨을 확인할 수 있었다. 각 용매에서 50%의 물 혼합 용매에 의한 회수율이 가장 높았으며, 가장 좋은 용해 조건은 아세톤 50%이었다.

아세톤 (v/v %)	상대적 테이코플라닌 회수율 (%)	이소프로필알콜 (v/v %)	상대적 테이코플라닌 회수율 (%)
20	85.2	10	86.0
30	86.7	20	88.9
40	87.9	30	91.5
50	100.0	40	96.7
60	94.6	50	98.3
70	95.6	70	97.9

<실시예 5>

실시예 1에서 회수한 배양 여액 각 100 ml를 묽은 염산 용액 (5 N HCl)을 가하여 혼합하여 pH 2.0으로 조정한 후 실온에서 6시간 방치 후 원심분리하여 침전물과 침전상등액을 분리하였다. 회수한 침전물에 5 (0.1배), 7.5 (0.15배), 10 ml (0.2배)의 물을 가하여 혼합하고, 묽은 수산화나트륨 (5N NaOH)을 가하여 pH 8.5로 조정하였다. 여기에 사용한 물과 같은 부피의 아세톤을 가하여 최종 50% 아세톤 (pH 8.5)이 되도록 하여 혼합 용해하였다. 한 시간 정도 혼합 후에 원심분리로 침전물을 분리하여 제거하고 테이코플라닌이 함유된 용해 상등액을 회수하여 HPLC로 분석하여 배양여액과 비교하여 테이코플라닌의 회수율을 측정하였다 (표 4). 전체 회수율은 60 ~ 69%였으며, 0.1배 ~ 0.2배 조건의 용해단계 (침전물에서부터의 회수율)에서 최소 약 80%, 최대 약 95% 테이코플라닌 회수율을 확인할 수 있었다.

		테이코플라닌 회수율 (%)
배양여액		100.0
침전상등액		27.1
침전물 용해물** (50% 아세톤)	0.1배	60.5 (82.9)*
	0.15배	60.6 (83.1)
	0.2배	69.2 (94.9)

* 괄호 안의 숫자는 침전물에서부터 테이코플라닌의 회수율

** 배양 여액 부피에 대비한 50% 아세톤 사용량배수

<실시예 6>

실시예 3과 같은 방법으로 테이코플라닌 용해 상등액을 확보하였다. 이때 용해에 사용한 용매는 50% 아세톤이며, 부피는 배양여액의 0.1배를 사용하였다. 이 용액에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 테이코플라닌 A2의 순도 약 30%, 농도 약 80 g/L의 시료를 준비하였다. 이를 아래 표 5의 수지가 충진된 컬럼에 과 로딩한 후 흡착된 테이코플라닌 양을 계산하였다. 그 결과, 이온 결합수지의 흡착량이 매우 낮았으며, 다공성 흡착수지인 HP20의 경우 30 g/L이었으며, 고결합성능을 가지는 합성 흡착수지의 경우 최대 83 g/L까지 흡착이 가능하였다. 고결합성능 수지를 사용하면 전체 수지 사용량이 감소하므로 컬럼 공정에서 용매의 사용량을 획기적으로 줄일 수 있다.

수지	테이코플라닌 최대 흡착량 (g/L)
SK1B	9
PA408	8
PK208	3
WK60L	3
CM650C	2
HP20	30
NM100	80
NM200	65
CG161M	83
CG161C	80

<실시예 7>

최종 테이코플라닌 함유 배양액 2.8 L에 배양액 부피의 약 0.5배의 물을 가하여 혼합하고, 여기에 묽은 수산화나트륨 용액 (2N NaOH)을 혼합하여 pH를 11.0으로 조정한 후 7% (w/v)의 규조토를 가하고 여과하여 균체 및 고형분을 제거하여 테이코플라닌이 함유된 배양 여액 4 L를 회수하였다. 이때 테이코플라닌 A2의 순도는 약 17%, 농도는 1.4 g/L였다. 이중 약 1400 mg의 테이코플라닌이 함유된 배양 여액 1 L에 묽은 염산 용액 (5 N HCl)을 가하고 혼합하여 pH 2.0으로 조정한 다음, 냉장고(6℃)에서 하룻밤 정치한 후 여과하여 침전물을 수득하였다. 이 침전물에 물 50 ml를 가하여 혼합하고 묽은 가성소다 (5N NaOH)로 pH 8.5로 조정하고, 아세톤을 약 50 ml 가하여 50% 아세톤 용액 (pH 8.5)에서 1시간 정도 교반하였다. 교반 후 필터를 사용하여 용해되지 않은 고형물을 제거하고 테이코플라닌이 함유된 용해 상등액을 회수하였다. 이 상등액을 HPLC로 분석한 결과(도 3의 A), 테이코플라닌 A2의 순도가 약 29%, 전체량 약 930 mg이었으며, 이때 불순물은 테이코플라닌 A3군이 63%, 기타 군이 7%이었고, 이를 감압농축하여 아세톤이 15% 이하가 되도록 하여 준비하였다. 이를 CG161m (Amberchrom, Rome and Hass사) 약 5 mL가 충전된 유리컬럼 (1.5 x 20 cm)에 로딩하였다. 유리컬럼에 탈염수 (pH 4.5) 50 mL를 통액하여 수세하고, 15% 이소프로필알콜 (pH 2.0) 50 ml로 추가 세척하였다. 세척 후 30% 이소프로필알콜 (pH 2.0) 25 ml로 테이코플라닌을 용출하였다. 용출액은 각 5 ml씩 분액하여 테이코플라닌을 회수하였다. 컬럼작업의 유속은 0.5 ~ 4 BV/hr 사이에서 진행하였다. 테이코플라닌이 함유된 초기 분획물 4개를 혼합하여 pH 8.5로 조정한 다음, HPLC로 분석한 결과 테이코플라닌 A3 군에서 테이코플라닌의 순도가 1.12%, 테이코플라닌 A2 군에서 순도가 95.39%, 기타 군에서 테이코플라닌 순도가 3.49%로, 매우 우수한 순도의 테이코플라닌이 용출되었다(도 3의 B). 이때 수율은 65.9%였다. 이러한 본 발명의 방법은 특히 테이코 2를 포함하는 기타군의 제거에 매우 유용하였다.

<실시예 8>

실시예 5와 동일한 방법으로 테이코플라닌을 정제하였다. 단 15% 이소프로필알콜과 30% 이소프로필알콜의 pH를 각각 pH 1.5, pH 2.5, pH 3.0으로 조정하여 수행하였다. 이때 회수된 테이코플라닌 A3군에서 0.9 ~ 1.5%, A2 군에서 88 ~ 94%, 기타군에서 3.0 ~ 6.5%의 테이코플라닌이 얻어져 매우 우수한 순도의 테이코플라닌이 용출되었다. 이때 수율은 60 ~ 75%였다.

Claims

a) 테이코플라닌 생산 미생물 발효 배양액에서 균체 및 고형물을 제거하여 발효 배양 여액을 얻는 단계;
b) 상기 발효 배양 여액의 pH를 1.5 ~ 4.0으로 조정하는 단계;
c) 테이코플라닌이 함유된 침전물을 회수하는 단계; 및
d) 테이코플라닌이 함유된 침전물에서 테이코플라닌을 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합용매로 용출하는 단계;를 포함하는 테이코플라닌 회수방법.
청구항 1에 있어서,
b) 단계의 pH 조정은 염산, 황산 및 유기산 중 1종 이상을 이용하여 수행함을 특징으로 하는 테이코플라닌 회수방법.
청구항 1에 있어서,
b) 단계의 pH를 1.5 ~ 2.5로 조정하는 것을 특징으로 하는 테이코플라닌 회수방법.
청구항 1에 있어서,
d) 단계의 수-혼화성 유기용매는 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤, C3-C4-니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 테이코플라닌 회수방법.
청구항 4에 있어서,
d) 단계의 수-혼화성 유기용매는 아세톤 및 이소프로필알콜 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 테이코플라닌 회수방법.
청구항 1에 있어서,
d)의 용출단계에서 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합비는 30 ~ 70: 70 ~ 30% (v/v)임을 특징으로 하는 테이코플라닌 회수방법.
a) 조 테이코플라닌을 흡착수지에 흡착시키는 단계;
b) pH 1.0 ~ 5.0의 산성조건으로 흡착수지를 수세하는 단계;
c) 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합용매를 pH 1.0 ~ 5.0으로 조정하여 흡착수지를 세척하는 단계; 및
d) pH 1.0 ~ 5.0으로 조정된 산성조건의 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합용매로 테이코플라닌을 용출하는 단계;를 포함하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
a) 단계의 흡착수지는 방향족계(aromatic type), 수식된 방향족계(aromatic chemically modified type) 및 메타아크릴계(methacrylic type) 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
a) 단계의 흡착수지는 스티렌/다이비닐벤젠 (styrene-divinylbenzene) 중합체 수지임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
b) 단계의 산성조건 수세는 pH 1.5 ~ 3.0으로 수행함을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
d) 단계의 수-혼화성 유기용매는 C3-C4-알콜, C3-C4-케톤, C3-C4-니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
c) 단계와 d) 단계의 수-혼화성 유기용매와 물의 혼합용매의 산성조건은 pH 1.5 ~ 3.0임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
c) 세척단계의 혼합용매는 유기용매의 혼합비가 5 ~ 30%(v/v)임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.
청구항 7에 있어서,
d) 용출단계의 혼합용매는 유기용매의 혼합비가 20 ~ 70%(v/v)임을 특징으로 하는 테이코플라닌 정제방법.