CN114344447B - 一种注射用达托霉素及其制备方法 - Google Patents
一种注射用达托霉素及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种注射用达托霉素及其制备方法，其依次通过离子交换树脂、大孔吸附树脂、聚合物树脂、C18树脂进行分离纯化，然后经结晶、复溶、脱盐和特定的冻干工艺制备而成。本发明制备的产品纯度高、外形丰满、不萎缩、不鼓泡、呈多孔性、复溶速度快、残余水分低、颜色浅，含量、澄清度和稳定性大幅提高。产品的质量和稳定性远远高于现生产的产品，提高了临床用药的安全性。本发明工艺简单，更有利于工业化生产，对注射用达托霉素的生产及临床应用具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及达托霉素制备技术领域，具体地说是涉及一种注射用达托霉素及其制备方法。
背景技术
达托霉素是由玫瑰孢链霉菌发酵产生的一种由一个十碳烷侧链与一个由13个氨基酸残基组成的环状β-氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成的酸性环脂肽类抗生素，也是目前全球首个成功开发的环脂肽类抗生素。达托霉素结构新颖、杀菌机制独特，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并杀死革兰氏阳性菌，其特性表现为抑制作用迅速、体内与体外杀菌作用所需的浓度低、抗生素作用的有效性时间长等。此外，达托霉素可以在细胞没有发生自溶的情况下迅速杀死细菌，避免因磷壁酸、肽聚糖和DNA的释放引起炎症反应，因此较一般抗感染药物安全。达托霉素对多数革兰阳性菌都有快速杀灭活性，包括MRSA、糖肽类敏感的金葡菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、耐青霉素的肺炎链球菌、耐万古霉素的菌株、万古霉素中度耐药菌株和耐万古霉素肠球菌、耐药肺炎链球菌等。多种链球菌也具有达托霉素易感性(MIC<1μg/mL)，新分离到的对奎奴普丁/达福普丁具有耐药性的粪肠球菌、凝固酶阴性并耐替考拉宁的葡萄球菌、耐利奈唑胺的粪肠球菌和金黄色葡萄球菌都对达托霉素敏感，但对革兰阴性菌没有活性。可作为MRSA所致骨、关节感染及骨髓炎的替代药物，特别对于那些不能耐受万古霉素治疗的患者。达托霉素抗菌谱广、抗菌活性高、安全性好，具有广阔的应用前景。
达托霉素为发酵类新型抗生素，其化学结构复杂，在酸碱、高温或水溶液条件下会降解产生降解产物，在发酵、纯化、生产和贮藏过程也会产生杂质。目前达托霉素的制备具有以下缺点：
1、目前制备高纯度达托霉素的生产工艺交替使用阴离子树脂FP-DA13、大孔树脂HP-20SS、阴离子树脂PorosD50或Poros 150反复纯化，得到纯度为98％的达托霉素，树脂层析工艺均为常压层析，但其工艺过于繁琐，难以放大，成本较高，收率偏低，不利于工业化规模生产；
2、专利CN101830970A、CN102276696A在其基础上进行了工艺改进，简化了流程、降低了成本，但仍无法完成工业化生产；
3、原料质量不稳定，纯度低，收率低，对注射用达托霉素的含量和稳定性影响较大；
4、注射用达托霉素含量低、杂质多、颜色、澄清度和稳定性较差；
5、注射用达托霉素在稀释剂中重建速率慢；
6、冻干工艺普遍存在的弊端是生产周期长，效率低，生产的产品内部结构不均匀、分层、萎缩和批间均一性较差等问题。
针对上述问题，研究一种适合工业化应用的、高纯度的注射用达托霉素的生产工艺具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种注射用达托霉素及其制备方法，以解决现有技术存在的不利于工业化规模生产，产品含量低、杂质多、颜色、澄清度等较差的问题。
本发明技术方案为：一种注射用达托霉素，所述注射用达托霉素中脱水达托霉素含量为1.0％-1.4％，达托霉素的β异构体含量为0.13％-0.24％，杂质RS-2含量为0.05％-0.08％。
所述注射用达托霉素中达托霉素含量为96％-97.6％，内酯水解物含量为0％。
一种注射用达托霉素的制备方法，包括以下步骤：
(a)将达托霉素发酵液过滤，滤液导入离子交换树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.01-0.5M NaCl水溶液洗脱，最后用1-5M NaCl水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液A；
(b)将浓缩滤液A导入大孔吸附树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用15-25vol％的乙醇水溶液洗脱，最后用35-45vol％的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液B；
(c)将浓缩滤液B导入聚合物树脂进行吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.05-0.5M乙酸钠水溶液洗脱，最后用0.6-2M的乙酸钠水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液C；
(d)将浓缩滤液C导入C18树脂进行吸附，吸附完毕后，先用1-10vol％乙醇水溶液洗涤，再用15-40vol％乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超纳滤浓缩，去除内毒素，得到浓缩滤液D；
(e)在浓缩滤液D中加入盐溶液进行结晶，再经抽滤、淋洗、干燥后得到达托霉素粉状物，将达托霉素粉状物溶解，得到效价为6-10万u/mL的达托霉素水溶液，用强酸阳离子树脂对达托霉素水溶液进行脱盐，得到脱盐液；
(f)在所述脱盐液中加入氢氧化钠水溶液，调节pH值至4.0～5.0，然后进行除菌过滤，最后将无菌药液灌装于西林瓶中，冻干后即得所述注射用达托霉素。
步骤(a)中，所述离子交换树脂为IRA958、D002或PD30。
步骤(b)中，所述大孔吸附树脂为HZ801、XAD1600、XRP-S3#中的一种。
步骤(c)中，所述聚合物树脂为NMQ(PS30-300)。
步骤(a)至(d)中，根据图谱收集出峰口大于92％的解吸液，检测收集到的解吸液，将效价大于1000u/mL的解吸液合并进行浓缩。
步骤(a)至(d)中，采用30KD的超滤膜进行超滤。
步骤(e)中，所述盐溶液为氯化钠或乙酸钠；所述强酸阳离子树脂为001*7或1*25，脱盐时pH维持在3.2-3.6。
步骤(f)中，所述氢氧化钠水溶液浓度为0.5mol/L。
步骤(f)中，所述冻干的工艺为：将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达100-300μbar时开始升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持6-8h，升温至-5℃时，保温10-12h，升温至0℃，保温5-8h，升温至10℃，保温2-5h，继续升温至23℃，维持7-10h。
步骤(f)中，冻干过程进行充氮保护。
达托霉素发酵液的制备：
由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生，其发酵生产采用深层通气培养工艺，将达托霉素产生菌通过母瓶扩培，两级或三级发酵，再通过补加前体得到高浓度的达托霉素发酵液。
(一)液氮管制备
用接种环刮下斜面孢子制成孢子悬浮液，摇匀吸出分装至甘油管中，每管装量0.5～1.0ml，于液氮罐中保存。
(二)母瓶种子制备
在无菌条件下，取液氮管用吸管吸取0.1～0.8ml孢子液接入母瓶培养基。
(三)种子和发酵培养基
种子培养基：葡萄糖1％、糊精2％、蛋白胨0.5％、酵母粉1％、KH2PO4 0.05％、MgSO4.7H2O 0.1％、CaCO3 0.5％。
发酵培养基：葡萄糖2％、糊精4％、蛋白胨1％、玉米浆3.0％、酵母粉0.5％、硫酸镁0.5％、硫酸钾0.05％、碳酸钙0.5％、癸酸钠1.0％、色氨酸0～0.5％、L-苏氨酸0～0.5％、天冬氨酸0～0.5％、L-天冬酰胺0～0.5％。
(四)癸酸钠的配制
癸酸钠的配制：称取25％配制总体积的癸酸，加入热蒸馏水，机械搅拌，再称取癸酸重量的1/5的氢氧化钠，将氢氧化钠直接加入溶液中，待基本溶解后，定容至配制体积。制成25％的癸酸钠溶液。
发酵罐配制癸酸钠：将上述25％的癸酸钠加自来水稀释3倍，制成8％的癸酸钠溶液。
(五)补料
发酵培养20h，菌丝浓度≥10％后，开始补加癸酸钠，每天补加1％～3％，根据菌丝浓度调整癸酸钠的补加速度，获得达托霉素发酵液，发酵液经粗过滤后进行后续试验。
与现有技术相比，本发明具有以下优势；
1、采用四种树脂分离纯化达托霉素，步骤明显缩短。
2、滤液直接上柱，省却溶媒浸泡步骤，减少溶媒消耗，更加环保。
3、整个提炼分离过程中所用溶媒量大大减小，节约成本。
4、整个提炼分离过程中所用流动相均为水或乙醇，对操作人员更加安全。
5、采用聚合物树脂去除色素，效果显著优于现有技术。
6、本发明制备的产品纯度高、外形丰满、不萎缩、不鼓泡、呈多孔性、复溶速度快、残余水分低、颜色浅，含量、澄清度和稳定性大幅提高。产品的质量和稳定性远远高于现生产的产品，提高了临床用药的安全性。
7、本发明工艺简单，更有利于工业化生产，对注射用达托霉素的生产及临床应用具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1是实施例1所得纯品的HPLC图谱。
图2是实施例2所得纯品的HPLC图谱。
图3是实施例3所得纯品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用原料或试剂除另有说明外均为市售品，可通过商业渠道购得。
实施例1
步骤(1)：将效价为1026u/mL的30L达托霉素滤液导入直径约10cm的离子交换树脂(体积约为4L)进行富集吸附，用纯水洗涤，用0.01M NaCl洗脱，最后用1M NaCl解吸；收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。最终解析液体积为14L，达托霉素含量为1550u/mL，收率70.5％。
步骤(2)：将步骤(1)得到的解析液用30KD的超滤膜超滤，以上操作温度均控制在20℃以下。得滤液22L，效价为940u/mL。收率为95.3％。
步骤(3)：将步骤(2)所得滤液导入直径为直径约为8cm的大孔吸附树脂(体积约为3L)进行吸附，用纯水洗涤，用15％的乙醇洗脱，再用35％的乙醇进行解吸，收集解吸液，将效价大于800u/mL的解吸液液合并，解析液合并体积为6L，效价为2509u/mL，收率72.8％。
步骤(4)：将步骤(3)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液246mL，效价为55076u/mL，收率为90.0％。
步骤(5)：将步骤(4)所得浓缩液导入直径约1cm的聚合物树脂(体积约为1.5L)进行吸附，用纯水洗涤，用的0.05M乙酸钠水溶液进行洗脱，然后用0.6M的乙酸钠水溶液进行解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共6.9L，效价为1762u/mL，收率为89.7％。
步骤(6)：将步骤(5)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液200mL，效价为55131u/mL，收率为90.7％。
步骤(7)：将步骤(6)所得浓缩液导入直径约4cm的C18树脂(体积约为1.2L)进行吸附；用1％乙醇水洗涤，用15％乙醇水解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共4L，效价为2067u/mL，收率为75.0％。
步骤(8)：将步骤(7)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液131mL，效价为57830u/mL，收率为91.6％。
步骤(9)：在浓缩液中加入盐溶液，滴加水相3BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(10)：将以上混合液进行抽滤，之后用乙醇淋洗滤饼。干燥滤饼，得到达托霉素粉状物。用水溶解达托霉素至6万u/mL，用强酸阳离子的树脂进行脱盐，pH维持在3.2-3.6。
步骤(11)：冻干脱盐液，最终得到达托霉素纯品。得到的达托霉素结晶粉纯度为100.3％，收率为79.8％。
实施例2
步骤(1)：将效价为1026u/mL的30L达托霉素滤液导入直径约10cm的离子交换树脂(体积约为4L)进行富集吸附，用纯水洗涤，用0.5M NaCl洗脱，最后用5M NaCl解吸；收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。最终解析液体积为12L，达托霉素含量为1784u/mL，收率71.4％。
步骤(2)：将步骤(1)得到的解析液用30KD的超滤膜超滤，以上操作温度均控制在20℃以下。得滤液20L，效价为1007u/mL。收率为94.1％。
步骤(3)：将步骤(2)所得滤液导入直径为直径约为8cm的大孔吸附树脂(体积约为3L)进行吸附，，用纯水洗涤，用25％的乙醇洗脱，再用45％的乙醇进行解吸，收集解吸液，将效价大于800u/mL的解吸液液合并，解析液合并体积为6L，效价为2350u/mL，收率70.0％。
步骤(4)：将步骤(3)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液207mL，效价为60044u/mL，收率为88.1％。
步骤(5)：将步骤(4)所得浓缩液导入直径约1cm的聚合物树脂(体积约为1.5L)进行吸附，用纯水洗涤，用的0.5M乙酸钠水溶液进行洗脱，然后用2M的乙酸钠水溶液进行解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共6.7L，效价为1684u/mL，收率为90.8％。
步骤(6)：将步骤(5)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液200mL，效价为51388u/mL，收率为91.1％。
步骤(7)：将步骤(6)所得浓缩液导入直径约4cm的C18树脂(体积约为1.2L)进行吸附；用10％乙醇水洗涤，用40％乙醇水解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共4L，效价为1896u/mL，收率为73.8％。
步骤(8)：将步骤(7)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液123mL，效价为55240u/mL，收率为89.6％。
步骤(9)：在浓缩液中加入盐溶液，滴加水相10BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(10)：将以上混合液进行抽滤，之后用乙醇淋洗滤饼。干燥滤饼，得到达托霉素粉状物。用水溶解达托霉素至6万u/mL，用强酸阳离子的树脂进行脱盐，pH维持在3.2-3.6。
步骤(11)：冻干脱盐液，最终得到达托霉素纯品。得到的达托霉素结晶粉纯度为100.9％，收率为79.6％。
实施例3
步骤(1)：将效价为1026u/mL的30L达托霉素滤液导入直径约10cm的离子交换树脂(体积约为4L)进行富集吸附，用纯水洗涤，用0.32M NaCl洗脱，最后用2.7M NaCl解吸；收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。最终解析液体积为12L，达托霉素含量为1820u/mL，收率71.9％。
步骤(2)：将步骤(1)得到的解析液用30KD的超滤膜超滤，以上操作温度均控制在20℃以下。得滤液20L，效价为1020u/mL。收率为93.4％。
步骤(3)：将步骤(2)所得滤液导入直径为直径约为8cm的大孔吸附树脂(体积约为3L)进行吸附，用纯水洗涤，用19％的乙醇洗脱，再用40％的乙醇进行解吸，收集解吸液，将效价大于800u/mL的解吸液液合并，解析液合并体积为6L，效价为2554u/mL，收率75.1％。
步骤(4)：将步骤(3)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液243ml，效价为56785u/mL，收率为90.0％。
步骤(5)：将步骤(4)所得浓缩液导入直径约1cm的聚合物树脂(体积约为1.5L)进行吸附，用纯水洗涤，用的0.23M乙酸钠水溶液进行洗脱，然后用0.44M的乙酸钠水溶液进行解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共7L，效价为1788u/mL，收率为90.7％。
步骤(6)：将步骤(5)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液205mL，效价为55315u/mL，收率为90.6％。
步骤(7)：将步骤(6)所得浓缩液导入直径约4cm的C18树脂(体积约为1.2L)进行吸附；用7％乙醇水洗涤，用25％乙醇水解析，收集解吸液，将效价大于500u/mL的解吸液液合并，得解析液共4L，效价为2124u/mL，收率为74.9％。
步骤(8)：将步骤(7)所得收集液用30KD的超滤膜超滤后，纳滤浓缩，浓缩至6万单位，得到浓缩液131mL，效价为58654u/mL，收率为90.4％。
步骤(9)：在浓缩液中加入盐溶液，滴加水相7BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(10)：将以上混合液进行抽滤，之后用乙醇淋洗滤饼。干燥滤饼，得到达托霉素粉状物。用水溶解达托霉素至9万u/mL，用强酸阳离子的树脂进行脱盐，pH维持在3.2-3.6。
步骤(11)：冻干脱盐液，最终得到达托霉素纯品。得到的达托霉素结晶粉纯度为101.5％，收率为78.8％。
对比例1
步骤(1)：接达托霉素发酵液50L，然后采用1BV的丁醇浸泡，搅拌2小时，过滤，顶水1BV，吹干。
步骤(2)：步骤(1)所得液体静置30分钟，分液。丁醇相中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(3)：步骤(2)所得水相加入10wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(4)：步骤(3)所得滤液加入0.5BV的丁醇，在加入酸调pH至2.3-2.7。萃取分液。
步骤(5)：步骤(4)所得丁醇相中加入10wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(6)：步骤(5)所得滤液中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(7)：步骤(6)所得水相上PD30柱子，水洗2BV，0.1M氯化钠溶液洗杂3BV，然后用0.5M氯化钠溶液进行解析，收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(8)：合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(9)：步骤(8)所得滤液加入10wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(10)：步骤(9)所得滤液上色谱三号柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(11)：步骤(10)所得合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(12)：步骤(11)所得滤液上二次色谱三柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(13)：步骤(12)所得合并解析液减压浓缩。
步骤(14)：步骤(13)所得浓缩液加入加入盐溶液，滴加水相3BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(15)：步骤(14)结晶液过滤干燥得到精粉。
对比例2
步骤(1)：接达托霉素发酵液50L，然后采用1BV的丁醇浸泡，搅拌2小时，过滤，顶水1BV，吹干。
步骤(2)：步骤(1)所得液体静置30分钟，分液。丁醇相中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(3)：步骤(2)所得水相加入5wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(4)：步骤(3)所得滤液加入0.5BV的丁醇，在加入酸调pH至2.3-2.7。萃取分液。
步骤(5)：步骤(4)所得丁醇相中加入5wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(6)：步骤(5)所得滤液中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(7)：步骤(6)所得水相上PD30柱子，水洗2BV，0.1M氯化钠溶液洗杂3BV，然后用0.5M氯化钠溶液进行解析，收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(8)：合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(9)：步骤(8)所得滤液加入5wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(10)：步骤(9)所得滤液上色谱三号柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(11)：步骤(10)所得合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(12)：步骤(11)所得滤液上二次色谱三柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(13)：步骤(12)所得合并解析液减压浓缩。
步骤(14)：步骤(13)所得浓缩液加入加入盐溶液，滴加水相10BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(15)：步骤(14)结晶液过滤干燥得到精粉。
对比例3
步骤(1)：接达托霉素发酵液50L，然后采用1BV的丁醇浸泡，搅拌2小时，过滤，顶水1BV，吹干。
步骤(2)：步骤(1)所得液体静置30分钟，分液。丁醇相中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(3)：步骤(2)所得水相加入1wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(4)：步骤(3)所得滤液加入0.5BV的丁醇，在加入酸调pH至2.3-2.7。萃取分液。
步骤(5)：步骤(4)所得丁醇相中加入1wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(6)：步骤(5)所得滤液中加入0.2BV的0.3M磷酸氢二钾溶液。搅拌2小时，静置30分钟，分液。
步骤(7)：步骤(6)所得水相上PD30柱子，水洗2BV，0.1M氯化钠溶液洗杂3BV，然后用0.5M氯化钠溶液进行解析，收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(8)：合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(9)：步骤(8)所得滤液加入1wt％的活性炭，搅拌2小时，过滤。
步骤(10)：步骤(9)所得滤液上色谱三号柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(11)：步骤(10)所得合并解析液用10KD的超滤膜超滤。
步骤(12)：步骤(11)所得滤液上二次色谱三柱子，水洗6BV，10％异丙醇洗杂3BV，25％异丙醇解析。收集效价大于1000u/mL的解吸液并合并。
步骤(13)：步骤(12)所得合并解析液减压浓缩。
步骤(14)：步骤(13)所得浓缩液加入加入盐溶液，滴加水相7BV的乙醇并搅拌过夜。
步骤(15)：步骤(14)结晶液过滤干燥得到精粉。
对上述实施例制备的产品进行表征，结果见表1所示。
表1：
对比结果显示：本发明制备达托霉素与现有技术相比，在含量、纯度、色级和溶媒消耗等指标上都具有很大优势。
实施例4
药液配制、灌装：在配料罐中加入预配体积80％的注射用水，充氮以排出液体中的空气及氧气，投入处方量的实施例1制备的达托霉素至配料罐中，搅拌均匀。加入0.5mol/L的NaOH溶液(为防止局部浓度过浓，滴加速度宜慢)，调节pH值至4.0～4.5。料液合格后，通过颇尔公司的过滤器对药液双级除菌过滤，输送至数控液体灌装机，无菌药液灌装于西林瓶中，半压塞；注意控制装量在合格范围。
充氮冷冻干燥：将硅油进口温度冷至-42℃以下后保温3小时。将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达300μbar时开始升温。冻干机自动开始干燥，进行板层升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持6h，升到-5℃时，保温10h。板层开始升温至0℃，维持5h。升温至10℃，维持2h，继续升温。制品的最终温度23℃，维持时间7h。进行压力测试，测试合格后进入压塞温度阶段，达到压塞温度后，开始箱体放气，进行自动压塞，压塞结束后，放气至常压，开始出箱。
实施例5
药液配制、灌装：在配料罐中加入预配体积80％的注射用水，充氮以排出液体中的空气及氧气，投入处方量的实施例1制备的达托霉素至配料罐中，搅拌均匀。加入0.5mol/L的NaOH溶液(为防止局部浓度过浓，滴加速度宜慢)，调节pH值至4.0～4.5。料液合格后，通过颇尔公司的过滤器对药液双级除菌过滤，输送至数控液体灌装机，无菌药液灌装于西林瓶中，半压塞；注意控制装量在合格范围。
充氮冷冻干燥：进箱结束后，进行冷冻，将硅油进口温度冷至-42℃以下后保温5小时。将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达100μbar时开始升温。冻干机自动开始干燥，进行板层升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持8h，升到-5℃时，保温12h。板层开始升温至0℃，维持8h。升温至10℃，维持5h，继续升温。制品的最终温度23℃，维持时间10h。进行压力测试，测试合格后进入压塞温度阶段，达到压塞温度后，开始箱体放气，进行自动压塞，压塞结束后，放气至常压，开始出箱。
实施例6
药液配制、灌装：在配料罐中加入预配体积80％的注射用水，充氮以排出液体中的空气及氧气，投入处方量的实施例2制备的达托霉素至配料罐中，搅拌均匀。加入0.5mol/L的NaOH溶液(为防止局部浓度过浓，滴加速度宜慢)，调节pH值至4.5～5.0。料液合格后，通过颇尔公司的过滤器对药液双级除菌过滤，输送至数控液体灌装机，无菌药液灌装于西林瓶中，半压塞；注意控制装量在合格范围。
充氮冷冻干燥：将硅油进口温度冷至-42℃以下后保温3小时。将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达300μbar时开始升温。冻干机自动开始干燥，进行板层升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持6h，升到-5℃时，保温10h。板层开始升温至0℃，维持5h。升温至10℃，维持2h，继续升温。制品的最终温度23℃，维持时间7h。进行压力测试，测试合格后进入压塞温度阶段，达到压塞温度后，开始箱体放气，进行自动压塞，压塞结束后，放气至常压，开始出箱。
实施例7
药液配制、灌装：在配料罐中加入预配体积80％的注射用水，充氮以排出液体中的空气及氧气，投入处方量的实施例3制备的达托霉素至配料罐中，搅拌均匀。加入0.5mol/L的NaOH溶液(为防止局部浓度过浓，滴加速度宜慢)，调节pH值至4.5～5.0。料液合格后，通过颇尔公司的过滤器对药液双级除菌过滤，输送至数控液体灌装机，无菌药液灌装于西林瓶中，半压塞；注意控制装量在合格范围。
充氮冷冻干燥：进箱结束后，进行冷冻，将硅油进口温度冷至-42℃以下后保温5小时。将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达100μbar时开始升温。冻干机自动开始干燥，进行板层升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持8h，升到-5℃时，保温12h。板层开始升温至0℃，维持8h。升温至10℃，维持5h，继续升温。制品的最终温度23℃，维持时间10h。进行压力测试，测试合格后进入压塞温度阶段，达到压塞温度后，开始箱体放气，进行自动压塞，压塞结束后，放气至常压，开始出箱。
实施例4-7冻干时将西林瓶由原研的10ml调整至20ml规格，在灌装量不变的基础上，西林瓶内药液表面积增大，高度降低。西林瓶规格变更后药液受冷、热更均匀，冻干时间缩短、生产效率提高、成品外形丰满、不萎缩、不鼓泡、色泽均匀、呈多孔性、结构牢靠、复溶速度快、残余水分更低。
对比例4-6
现有冻干工艺：将硅油进口温度冷至-40℃后保温3小时。将冷阱温度冷至-37℃后抽真空，真空到达100-200μbar时开始升温。干燥升温到-5℃后，自动打开渗气阀，真空度升至200μbar，维持15-20h。升温至0℃，维持5-6h。升温至10℃，维持2-3h，继续升温。制品的最终温度20℃，维持时间5-8h。进行压力测试，测试合格后进入压塞温度阶段，达到压塞温度后，开始箱体放气，进行自动压塞，压塞结束后，放气至常压，开始出箱。取上述现有工艺下三个批次产品作为对比例4-6。
对上述实施例产品进行表征，具体如下：
1、药物pH值、澄清度、复溶时间测试
本品复溶后的pH值、澄清度和复溶时间为冻干产品制备成功与否的重要指标之一。取实施例4-7及对比例4-6，去掉瓶上的聚丙烯瓶盖，暴露胶塞的中间部分，通过胶塞中部缓缓将0.9％氯化钠注射液10ml注入本品瓶中，请注意将注射器针头靠在瓶壁上，轻轻转动瓶子，确保本品粉末全部浸入。将润湿的产品静置10分钟，轻转动或晃动瓶子直到溶液完全溶解。复溶完全后，检测药品pH值、澄清度，结果见表2，根据注射用达托霉素质量标准(Q/RD J03·05·1143)可知，对比例和实施例复溶后pH值、澄清度的测试结果均符合要求。但与对比例相比，实施例性状明显更好。实施例的复溶时间也比对比例更快。
表2：
2、稳定性试验
实施例4-7以及对比例4-6的0天检测数据见表3。
表3-1：
表3-2：
由表3和注射用达托霉素质量标准(Q/RD J 03·05·1143)可知，对比例和实施例的性状、水分、pH值、澄清度、含量、杂质均符合要求。但与对比例相比，实施例的水分和杂质更低，含量更高、澄清度更好。说明本发明使用极简配方减少了辅料的种类注射用达托霉素的用药安全；通过改善达托霉素分离提纯方法、冻干工艺、包材规格，增加配液和冻干过程充氮保护极大地提高了注射用达托霉素的质量和重建速率。
3、加速试验
考察条件25℃±2℃/RH60±5％放置6个月进行加速试验考察，对第6个月各项考察项目进行检测，检测结果见表4。
表4-1：
表4-2：
4、长期试验
取实验例样品和对比例样品，在温度2℃-8℃条件下放置进行长期试验，对第12个月各考察项目进行检测，结果见表5。
表5-1：
表5-2：
由表4和表5加速试验和长期试验可以看出，各对比例稳定性较差，长期和加速后性状、pH值、澄清度、水分、含量以及有关物质的变化较大，且大多不符合标准。而本发明制备的注射用达托霉素在性状、pH值、澄清度、水分、含量以及有关物质等各项指标明显优于现生产的注射用达托霉素，尤其是长期和加速考察条件下质量稳定，产品关键指标无波动，稳定趋势良好。
综上所述，本发明制备的原料药含量高、纯度高、色级低、工艺简单溶媒只有水和乙醇，既降低了对操作人员的伤害和溶媒的使用量又减少了生产成本，适合工业化生产。本发明制备的注射用达托霉素产品颜色浅、澄清度高、含量高、杂质低、复溶快，长期和加速后颜色、澄清度、含量、杂质变化较小，稳定性好，临床使用的安全性高。经对比可知，本发明生产的产品的质量和稳定性均高于现生产的产品。
Claims (10)
1.一种注射用达托霉素，其特征在于，所述注射用达托霉素中脱水达托霉素含量为1.0%-1.4%，达托霉素的β异构体含量为0.13%-0.24%，杂质RS-2含量为0.05%-0.08%；
所述注射用达托霉素的制备方法包括以下步骤：
（a）将达托霉素发酵液过滤，滤液导入离子交换树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.01-0.5 M NaCl水溶液洗脱，最后用1-5M NaCl水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液A；
（b）将浓缩滤液A导入大孔吸附树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用15-25vol%的乙醇水溶液洗脱，最后用35-45vol%的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液B；
（c）将浓缩滤液B导入聚合物树脂进行吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.05-0.5M乙酸钠水溶液洗脱，最后用0.6-2M的乙酸钠水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液C；
（d）将浓缩滤液C导入C18树脂进行吸附，吸附完毕后，先用1-10vol%乙醇水溶液洗涤，再用15-40vol%乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超纳滤浓缩，去除内毒素，得到浓缩滤液D；
（e）在浓缩滤液D中加入盐溶液进行结晶，再经抽滤、淋洗、干燥后得到达托霉素粉状物，将达托霉素粉状物溶解，得到效价为6-10万u/mL的达托霉素水溶液，用强酸阳离子树脂对达托霉素水溶液进行脱盐，得到脱盐液；
（f）在所述脱盐液中加入氢氧化钠水溶液，调节pH值至4.0～5.0，然后进行除菌过滤，最后将无菌药液灌装于西林瓶中，冻干后即得所述注射用达托霉素。
2.根据权利要求1所述的注射用达托霉素，其特征在于，其达托霉素含量为96%-97.6%，内酯水解物含量为0%。
3.一种注射用达托霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）将达托霉素发酵液过滤，滤液导入离子交换树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.01-0.5 M NaCl水溶液洗脱，最后用1-5M NaCl水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液A；
（b）将浓缩滤液A导入大孔吸附树脂进行富集吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用15-25vol%的乙醇水溶液洗脱，最后用35-45vol%的乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液B；
（c）将浓缩滤液B导入聚合物树脂进行吸附，吸附完毕后，先用纯水洗涤，再用0.05-0.5M乙酸钠水溶液洗脱，最后用0.6-2M的乙酸钠水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超滤浓缩，得到浓缩滤液C；
（d）将浓缩滤液C导入C18树脂进行吸附，吸附完毕后，先用1-10vol%乙醇水溶液洗涤，再用15-40vol%乙醇水溶液解吸，收集解吸液，将解吸液进行超纳滤浓缩，去除内毒素，得到浓缩滤液D；
（e）在浓缩滤液D中加入盐溶液进行结晶，再经抽滤、淋洗、干燥后得到达托霉素粉状物，将达托霉素粉状物溶解，得到效价为6-10万u/mL的达托霉素水溶液，用强酸阳离子树脂对达托霉素水溶液进行脱盐，得到脱盐液；
（f）在所述脱盐液中加入氢氧化钠水溶液，调节pH值至4.0～5.0，然后进行除菌过滤，最后将无菌药液灌装于西林瓶中，冻干后即得所述注射用达托霉素。
4.根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（a）中，所述离子交换树脂为IRA958、D002或PD30；步骤（b）中，所述大孔吸附树脂为HZ801、XAD1600、XRP-S3#中的一种；步骤（c）中，所述聚合物树脂为PS30-300。
5.根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（a）至（d）中，根据图谱收集出峰口大于92%的解吸液，将解吸液合并进行浓缩。
6. 根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（a）至（d）中，采用30 KD的超滤膜进行超滤。
7.根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（e）中，所述盐溶液为氯化钠或乙酸钠；所述强酸阳离子树脂为001*7或1*25树脂，脱盐时pH维持在3.2-3.6。
8.根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（f）中，所述氢氧化钠水溶液浓度为0.5mol/L。
9.根据权利要求3述的制备方法，其特征在于，步骤（f）中，所述冻干的工艺为：将冷阱温度冷至-40℃后抽真空，真空到达100-300μbar时开始升温，干燥升温到-10℃后，自动打开渗气阀，真空度升至250μbar，维持6-8h，升温至-5℃时，保温10-12h，升温至0℃，保温5-8h，升温至10℃，保温2-5h，继续升温至23℃，维持7-10h。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（f）中，冻干过程进行充氮保护。
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