CN114478746A - 一种glp-1类似物的纯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GLP‑1类似物的纯化方法及其应用。其中，纯化方法包括：将粗肽溶液进行反相纯化、用水和有机溶剂的混合溶液作为流动相，进行脱盐得到GLP‑1类似物精肽溶液、调节pH至3.5～5.5，在‑20～25℃温度下析出。本发明提供的纯化方法在反相纯化后不进行减压浓缩或膜浓缩，而是脱盐、调节pH后直接析出，无需旋蒸，一方面降低了生产成本和能耗，提高效率；另一方面，本发明得到的纯化产品为固体，稳定性良好，可长久保存不易降解，方便转移；除此之外，本发明提供的纯化工艺简单高效，析出率高，利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物的纯化技术领域，尤其涉及一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是由肠道细胞分泌的一种肠源性激素。GLP-1可以以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而实现血糖的下降，同时还具有减轻体重、保护心血管等作用。由于人体自身产生的GLP-1半衰期极短，在几分钟内即会被二肽基肽酶4所降解，限制了GLP-1的临床应用。对此，制药企业研发了一系列GLP-1类似物，用于二型糖尿病的治疗，如艾塞纳肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽、利拉鲁肽、司美格鲁肽等。与GLP-1相比，GLP-1类似物能够抵抗二肽基肽酶4的降解，在人体内的半衰期更长，生物活性更强，具有良好的临床应用效果和安全性。
现有技术中，关于GLP-1类似物的纯化工艺，最后一步纯化通常为反相纯化。反相纯化的样品含有大量有机溶剂，如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇等，需要通过减压浓缩或膜浓缩的方式去除大部分有机溶剂，同时提高样品浓度后，才能进行冻干，得到GLP-1类似物原料药。例如，专利CN202010825323、CN201910685603和CN201711474148中，完成反相纯化后，均进行了减压浓缩或膜浓缩的操作。当纯化规模放大时，减压浓缩或膜浓缩的耗时很长，且需要相应的设备，在规模化生产、纯化效率、纯化成本上并无优势。专利US6844321B2，介绍了一种GLP-1类似物的析出方法，主要是利用样品浓度、盐、有机溶剂、缓冲盐、pH、温度参数的组合进行结晶析出，整个析出过程较为复杂，需要应用多种试剂。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用。对经过反相纯化、脱盐后的GLP-1类似物精肽溶液进行析出，得到GLP-1类似物晶体，复溶、冻干，最终得到GLP-1类似物原料药。一方面，避免使用耗时较长的减压浓缩或膜浓缩工艺，提高了纯化效率，同时析出晶体的稳定性更优、能长期保存，不易降解；另一方面，本发明的析出工艺更为简便和高效，析出率高，利于大规模生产。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一方面，本发明提供一种GLP-1类似物的纯化方法，包括如下步骤：
步骤一，反相纯化：将含GLP-1类似物的粗肽溶液进行一次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以碳酸氢铵水溶液A1和乙腈B作为流动相，进行梯度洗脱；将一次纯化得到的馏分进行二次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸水溶液A2和乙腈B作为流动相，进行梯度洗脱；
步骤二，脱盐：将步骤一得到的馏分，用水和有机溶剂的混合溶液作为流动相，进行脱盐，得到GLP-1类似物精肽溶液；
步骤三，析出：将步骤二得到的GLP-1类似物精肽溶液的pH调至3.5～5.5，在-20～25℃温度下析出。
作为优选地实施方式，步骤一中，所述含GLP-1类似物的粗肽溶液为GLP-1类似物的氨水溶液；
不同GLP-1类似物的物理性质有所差异，可以通过调节粗肽溶液的pH控制其溶解度。在某些具体的实施方式中，为了使粗肽完全溶解，对于GLP-1类似物，利拉鲁肽粗肽溶液的pH控制在8.0～9.0，司美格鲁肽粗肽溶液的pH控制在7.0～8.0。
作为优选地实施方式，步骤一中，所述一次纯化中，所述流动相中的乙腈的起始体积百分比为20-30％；截止体积百分比为40-50％；
优选地，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为60～100mM；碳酸氢铵水溶液的浓度对纯化过程中的杂质分离效果有一定的影响；
优选地，所述碳酸氢铵水溶液的pH用氨水调节至8.6±0.6；用氨水将碳酸氢铵水溶液的pH调节到合适的范围，可以提高杂质的分离效果；
在本发明的技术方案中，一次纯化中，碳酸氢铵水溶液作为水相，乙腈作为有机相。
作为优选地实施方式，步骤一中，所述二次纯化中，所述二次纯化中，所述流动相中的乙腈的起始体积百分比为25～35％；截止体积百分比为45～55％；
优选地，所述磷酸水溶液的质量浓度为0.2～0.6％；磷酸水溶液的质量浓度对纯化过程中的杂质分离效果有一定的影响；
优选地，所述磷酸水溶液的pH用氨水调至2.6±0.6；用氨水将磷酸水溶液的pH调节到合适的范围，可以提高杂质分离效果；
在本发明的技术方案中，二次纯化中，磷酸水溶液作为水相，乙腈作为有机相。
作为优选地实施方式，步骤二中，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇和异丙醇中的任意一种或任意混合使用；
优选地，步骤二中，所述混合溶液中有机溶剂的体积百分比为10～90％。
作为优选地实施方式，步骤三中，所述pH调至3.5～5.5用酸进行调节，所述酸包括但不限于磷酸、醋酸、甲酸、盐酸、硫酸、硝酸和柠檬酸等，上述酸类可以单一使用也可以任意混合使用；
优选地，步骤三中，所述析出的时间为1.0～36.0h；
在本发明的技术方案中，析出的时间与所述GLP-1类似物精肽溶液的体积有关，体积量大相应的析出需要的时间长。
在某些具体的实施方式中，步骤三中，将步骤二得到的GLP-1类似物精肽溶液的pH调至3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5或它们之间的任意值，在-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或它们之间的任意温度下进行析出。
另一方面，本发明提供上述GLP-1类似物的纯化方法在制备GLP-1类似物原料药中的应用。
在本发明的技术方案中，将所述GLP-1类似物的纯化方法得到的析出沉淀复溶、冻干后即得到所述原料药。
在本发明的技术方案中，所述GLP-1类似物包括但不限于利拉鲁肽、司美格鲁肽、艾塞纳肽、度拉糖肽、利司那肽、贝那鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽和替泽帕肽等。
上述技术方案具有如下优点或者有益效果：
本发明提供GLP-1类似物的纯化方法及其应用，本发明提供的纯化方法，对GLP-1类似物粗肽进行反相纯化后，采用脱盐、调pH将GLP-1类似物析出。
本发明具有以下优点：
1.本发明提供的纯化方法，无需进行减压浓缩或膜浓缩，而是脱盐、调节pH后直接析出，降低了生产成本，能耗低，效率更高；
2.本发明提供的纯化方法得到的纯化产品为固体，稳定性良好，可长久保存不易降解，方便转移；而现有技术中需要进行减压浓缩或膜浓缩，所得样品为液体，稳定性较差，必须马上进行冻干处理，否则容易降解，因此本发明得到的纯化产品稳定性明显优于旋蒸浓缩液体；
3.本发明提供的纯化工艺无需减压浓缩，操作更为简单高效，纯化成本低，析出率高，利于大规模生产。
具体实施方式
下述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下提供的本发明实施例中的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例中，利拉鲁肽粗肽通过基因重组、固相化学合成、液相化学合成或固液相化学合成法制备。
实施例1：利拉鲁肽纯化
步骤一，样品溶解：取利拉鲁肽粗肽约100g(纯度73.36％)，用氨水辅助溶解，控制终点溶液的pH约8.0～9.0、浓度为30±5mg/mL，得到利拉鲁肽粗肽溶液；
步骤二，反相纯化：
一次纯化：以利拉鲁肽粗肽溶液为样品，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以80～100mM碳酸氢铵水溶液(氨水调pH＝8.4±0.2)作为水相，以纯乙腈作为有机相，进行梯度洗脱(有机相体积百分比在60分钟内从30％提高到50％)，得到一次纯化合格馏分；
二次纯化：以一次纯化合格馏分为样品，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.2～0.4％质量浓度的磷酸水溶液(氨水调pH＝2.7±0.2)作为水相，以纯乙腈作为有机相，进行梯度洗脱(有机相体积百分比在50分钟内从35％提高到55％)，得到二次纯化合格馏分；
步骤三，脱盐：取步骤二得到的二次纯化合格馏分为样品，用乙腈体积百分比为60％的乙腈/水混合溶液进行脱盐，得到利拉鲁肽精肽溶液；
步骤四，析出：取上述利拉鲁肽精肽溶液用磷酸调pH＝4.9，在4℃下析出6.0h。
取步骤四中的上清液，用HPLC进行检测、定量，计算得析出率为97.8％。
析出率计算方法：析出率/％＝(利拉鲁肽精肽溶液中的利拉鲁肽浓度-析出后上清液中利拉鲁肽浓度)/利拉鲁肽精肽溶液的利拉鲁肽浓度*100％。
实施例2：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用甲醇体积百分比为90％的甲醇/水混合溶液对利拉鲁肽二次纯化合格馏分进行脱盐。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为96.6％。
实施例3：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用乙醇体积百分比为45％的乙醇/水混合溶液对利拉鲁肽二次纯化合格馏分进行脱盐。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为97.1％。
实施例4：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用异丙醇体积百分比为30％的异丙醇/水混合溶液对利拉鲁肽二次纯化合格馏分进行脱盐。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为96.1％。
实施例5：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用乙腈体积百分比为90％的乙腈/水混合溶液进行脱盐；步骤四中，析出为在4℃下析出4h。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为98.2％。
实施例6：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤四中，采用醋酸调节pH＝5.1，在15℃下析出24h。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为98.5％。
实施例7：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤四中，采用硫酸调节pH＝5.5，在25℃下析出36h。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为96.2％。
实施例8：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤四中，采用盐酸调节pH＝3.5，在0℃下析出8h。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为99.0％。
实施例9：利拉鲁肽纯化
本实施例中，利拉鲁肽纯化过程同实施例1，不同之处在于，步骤四中，采用磷酸调节pH＝4.7，在-20℃下析出6h。
本实施例中，利拉鲁肽的析出率为99.8％。
实施例10：司美格鲁肽纯化
步骤一，样品溶解：取固相化学合成的司美格鲁肽粗肽约100g(纯度73.21％)，用氨水辅助溶解，控制终点溶液pH约7.0～8.0、浓度为40±5mg/mL，得到司美格鲁肽粗肽溶液；
步骤二，反相纯化：
一次纯化：以司美格鲁肽粗肽溶液为样品，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以60～80mM碳酸氢铵水溶液(氨水调pH＝8.8±0.2)作为水相，以纯乙腈作为有机相，进行梯度洗脱(有机相体积百分比在80分钟内从20％提高到40％)，得到一次纯化合格馏分；
二次纯化：以一次纯化合格馏分为样品，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.4～0.6％质量浓度的磷酸水溶液(氨水调pH＝2.3±0.2)作为水相，以纯乙腈作为有机相，进行梯度洗脱(有机相体积百分比在60分钟内从25％提高到45％)，得到二次纯化合格馏分；
步骤三，脱盐：取步骤二得到的二次纯化合格馏分为样品，用乙腈体积百分比为70％的乙腈水溶液进行脱盐，得到司美格鲁肽精肽溶液；
步骤四，析出：取上述司美格鲁肽精肽溶液用磷酸调pH＝4.8，在4℃下析出6.0h。
取步骤四中的上清液，用HPLC进行检测、定量，计算得析出率为96.7％。
析出率计算方法：析出率/％＝(司美格鲁肽精肽溶液中的司美格鲁肽浓度-析出后上清液中司美格鲁肽浓度)/司美格鲁肽脱盐馏分浓度*100％。
实施例11：司美格鲁肽纯化
本实施例中，司美格鲁肽纯化过程同实施例10，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用乙醇体积百分比为60％乙醇/水的混合溶液进行脱盐，得到司美格鲁肽精肽溶液；步骤四中，用醋酸调pH＝4.6，在-10℃下析出6.0h。
本实施例中，司美格鲁肽的析出率为99.7％。
实施例12：司美格鲁肽纯化
本实施例中，司美格鲁肽纯化过程同实施例10，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用乙腈体积百分比为70％的乙腈/水的的混合溶液进行脱盐，得到司美格鲁肽精肽溶液；步骤四中，用醋酸调pH＝4.6，在0℃下析出6.0h。
本实施例中，司美格鲁肽的析出率为98.7％。
实施例13：司美格鲁肽纯化
本实施例中，司美格鲁肽纯化过程同实施例10，不同之处在于，步骤三中，脱盐采用乙腈体积百分比为70％的乙腈/水的混合溶液进行脱盐，得到司美格鲁肽精肽溶液；步骤四中，用醋酸调pH＝4.8，在-20℃下析出6.0h。
本实施例中，司美格鲁肽的析出率为99.9％。
效果实施例：利拉鲁肽原料药
取实施例1中步骤四得到的析出沉淀，分散于纯化水中，用氢氧化钠溶液调pH至7.5以上，溶解澄清后，冻干，最终得到利拉鲁肽原料药，其纯度99.6％，高分子杂质0.02％，纯化收率65.2％。
纯化收率＝{冻干后精肽重量/(粗肽重量*粗肽含量)}*100％
利拉鲁肽原料药的纯度、高分子杂质与析出沉淀的保存天数的关系见表1，从表1中可以看出，实施例1中纯化析出的利拉鲁肽，可长期保存，不会产生明显降解，稳定性良好。
表1
对比例：利拉鲁肽原料药
取实施例1中步骤二得到的二次纯化合格馏分，用乙腈与水的体积比为60％混合溶液进行脱盐，得到利拉鲁肽精肽溶液后，用旋转蒸发仪进行旋蒸，耗时12h。旋蒸完成后，样品开始出现降解，且样品呈液态，需要立即进入冻干步骤，否则会继续降解。冻干后，最终得到利拉鲁肽原料药，纯度99.5％，高分子杂质0.04％，纯化收率65.6％。
纯化收率＝{冻干后精肽重量/(粗肽重量*粗肽含量)}*100％
利拉鲁肽原料药的纯度、高分子杂质与旋蒸后样品的保存天数的关系见表2。
表2
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种GLP-1类似物的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，反相纯化：将含GLP-1类似物的粗肽溶液进行一次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以碳酸氢铵水溶液和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱；将一次纯化得到的馏分进行二次纯化，以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸水溶液和乙腈作为流动相，进行梯度洗脱；
步骤二，脱盐：将步骤一得到的馏分，用水和有机溶剂的混合溶液作为流动相，进行脱盐，得到GLP-1类似物精肽溶液；
步骤三，析出：将步骤二得到的GLP-1类似物精肽溶液的pH调至3.5～5.5，在-20～25℃温度下析出。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述含GLP-1类似物的粗肽溶液为GLP-1类似物的氨水溶液。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述一次纯化中，所述流动相中的乙腈的起始体积百分比为20～30％；截至体积百分比为40～50％；
优选地，所述碳酸氢铵水溶液的浓度为60～100mM；
优选地，所述碳酸氢铵水溶液的pH用氨水调节至8.6±0.6。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述二次纯化中，所述流动相中的乙腈的起始体积百分比为25～35％；截至体积百分比为45～55％；
优选地，所述磷酸水溶液的质量浓度为0.2～0.6％；
优选地，所述磷酸水溶液的pH用氨水调至2.6±0.6。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤二中，所述有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇和异丙醇中的任意一种或任意混合使用；
优选地，步骤二中，所述混合溶液中有机溶剂的体积百分比为10～90％。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述pH调至3.5～5.5用酸进行调节；
优选地，步骤三中，所述析出的时间为1.0～36.0h。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，步骤三中，所述酸选自磷酸、醋酸、甲酸、盐酸、硫酸、硝酸和柠檬酸中的任意一种或几种。
8.权利要求1-7任一所述的纯化方法在制备GLP-1类似物原料药中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述纯化方法得到的的析出沉淀复溶、冻干后即得到所述原料药。
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