PL104234B3 - Sposob otrzymywania tolerowanej srodzylnie gammaglobuliny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania tolerowanej sródzylnie gammaglobuliny z surowego osadu gammaglobuliny, otrzymanego przez frakcjonowanie krio-etanolowe, przez przeprowadzenie wstan nierozpuszczalny czesci gammaglobuliny przeciwdzialajacej dopelniaczowi, w którym surowy osad gammaglobu¬ liny rozpuszcza sie ponownie w roztworze wodnym, który zawiera polimer rozpuszczalny w wodzie i ewentualnie substancje buforowa i nastepnie ponownie wytraca, przy czym surowy osad gammaglobuliny pobiera sie w roztworze wodnym, w którym zawarta jest skrobia hydroksyetylowa o ciezarze czasteczkowym 1000—900000 w stezeniu 1-30% wagowych i nastepnie wytraca sie z roztworu skladnik przeciwdzialajacy dopelniaczowi przez dodanie polimeru rozpuszczalnego w wodzie wedlug patentu glównego nr 99599. W sposobie wedlug patentu glównego niepozadane gammaglobuliny usuwa sie w ten sposób, ze pobiera sie je ponownie w wodnym roztworze w szczególnosci skrobi hydroksyetyiowej o stezeniu 8—10%. Po dodaniu poliglikolu etylenowego mieszanine odwirowuje sie. Tworzacy sie osad zawiera niepozadana czesc gammaglobuli¬ ny, podczas gdy pozadana czesc uzyskuje sie w dalszym etapie odwirowania przy wartosci pH =° 7,2 i 20% poliglikolu etylenowego. Jesli nawet gammaglobuiina, uzyskana w opisany sposób odpowiada wszystkim wymaganiom praktyki lekarskiej, to okazalo sie jednak korzystne zwiekszenie wydajnosci i zapewnienie jeszcze wyzszej jakosci i czystosci zadanej gammaglobuliny. Zadanie to rozwiazano wedlug wynalazku w ten sposób, ze wodny roztwór, zawierajacy gammaglobuline, zadaje sie dodatkowo zawiesina krzemianów warstwowych rodzaju miki w stezeniu 0,2—10% wagowych, po czym po uplywie wystarczajacego czasu reakcji i dodaniu srodka stracajacego, takiego jak poliglikol etylenowy, usuwa sie czesc gammaglobuliny, przewidziana do wydzielania razem z krzemianami warstwowymi. Okreslenie „krzemiany warstwowe rodzaju miki" oznacza krzemiany, których sklad przedstawiaja nastepujace wzory graniczne:2 104 234 a)Me+y.n/(AI3+Cr3+,Fe+3,Fe2+,Mg2+Zn2+Ni2+)^(OH)2 (Si4.xAlxO)1o}x- b Mex-Vn/(AI3+iCr3,Fe3+Fe2+Mg2+ ,Zn2 + , Zn2+, Ni2+,Li+) {%*} + (OH)2(Si4010)}x- We wzorach tych Me+ oznacza kationy znajdujace sie miedzy warstwami, np. jony potasu, sodu, wapnia albo magnezu; wartos'ci dla x nie oznaczaja scislych granic, na ogól przyjmuje sie wartosci 0,1—1,0; symbol y oznacza ciecz speczniajaca i nie stanowi wartosci liczbowej, symbol „o-n" odnosi sie do cieczy speczniajacej y i zmienia sie w szerokich granicach, w zaleznosci od skladu krzemianu warstwowego i rodzaju cieczy specznia¬ jacej. Kationy Me* mozna wymienic zeoI itycznie na inne, takze organiczne kationy. Jako ciecz speczniajaca mozna wprowadzac dowolne czasteczki z wyjatkiem weglowodorów nasyconyci. Ilosc cieczy speczniajacej mozna zmieniac w szerokich granicach. Poniewaz zmienia sie równiez ilosc x jednowartosciowych kationów na jednostke budowy (Si, AI)4Oi 0, to znaczy ladunek warstwowy wynika stad nadzwyczajna róznorodnosc. Intensywne badania dotycza w szczególnosci montmorylonitu (por. „Organische Der'rvate der gilmmerarti- gen ScKichtsilikate", Weiss, Angewandte Chemie 1963, str. 113 i nastepne). Montmorylonit sklada sie z dwuwy¬ miarowo nieskonczonych makroanionów, które sa elektrostatycznie usieciowane przez znajdujace sie miedzy nimi kationy. Energii do speczniania, to znaczy do zwiekszenia odstepu warstw z oddaleniem od siebie ladunków dodatnich i ujemnych, dostarcza hydratacja i solwatacja kationów i warstw anionowych. Poniewaz energia solwatacji jest na ogól znacznie mniejsza niz energia hydratacji, mozna wprowadzac tytko rodzaje czasteczek o wysokiej przenikalnosci dielektrycznej albo zdolne do tworzenia mostków wodorowych. Mozna równiez wprowadzac do krzemianów warstwowych rodzaju miki aminokwasy, peptydy i proteiny. Proteiny wymienia sie przy tym przy niskiej wartosci pH prawie ilosciowo. Ze wzrostem wartosci pH maleje liczba pozycji kationowych w proteinach i wymiana staje sie niecalkowita. Albuminy globuliny i protaminy zostaja tak samo zwiazane. Z globulinami surowicy reakcja przypuszczal¬ nie postepuje od brzegu krysztalów krzemianu tylko okolo 20—30° A do wnetrza. Albuminy rozposcieraja sie miedzy warstwami krzemianu. Odstep warstw 14,5—15,0 A wskazuje, ze dla rozpostartej proteiny Jest do dyspozycji grubosc warstwy maksymalnie 5,5—6 A. Poniewaz w pobranej ilosci gammaglobuliny znajduja sie zarówno nieuszkodzone, jak równiez uszkodzone czasteczki, trzeba dazyc do tego,aby uszkodzone czasteczki w jakikolwiek sposób zwiazac i tym samym uczynic je rózniacymi sie chemicznie od czasteczek nie budzacych zastrzezen pod wzgledem fizjologicznym. Uszkodzone czasteczki sa zdolne do tworzenia wiazan mostków wodorowych. Zostaja one dlatego wzmocnione, umieszczone wewnatrz warstw krzemianu i zwiazane, podczas gdy nieuszkodzone czasteczki gammaglobuliny pozost&ja w roztworze. Uszkodzone czasteczki gammaglobuliny, zwiazane w warstwach krzemianu warstwowego mozna nastepnie latwo usunac, np. przez odwirowanie. Zdolnosc do wymiany kationów wykazuja równiez wedlug Hofmann'a (Z. Kristalogr., A, 98, 1937, 31; Chemie 55, 1942, 283 kaolin i substancje z nim spokrewnione np. haloizyt, Al203 2SI02 '41^0, i niektóre mineraly rodzaju miki, które sa spokrewnione pod wzgledem swej budowy sieci. Zaliczaja sie do nich równiez wermikulit i spokrewniony z nim batawit (wermikulit nie zawierajacy zelaza). Wzór strukturalny batawitu wedlug Weiss'a i Hofmann'a (Z. Naturf. 6b, 405) jest nastepujacy: / <0H1.94 Si2.99 Al1.01 °1o}°'68 + M«J.34 + 2'34H^° Stwierdzono, ze ten material podobnie jak montmorylonit ma wewnatrzkrystaliczna zdolnosc speczniania \ i wysoka zdolnosc wymiany kationów. Badania wykazaly, ze batawit pobiera do 5% wagowych albuminy ludzkiej, przy czym bialko zostalo wkomponowane miedzy warstwy krzemianu. Równiez wermikulit o przyblizonym wzo¬ rze strukturalnym ^(Mg3,AI2,Fey,FeiM//OH/2 [Si335 AIQ,65O10ft0'65 + 0,65 M + wykazuje pozadane wlasciwosci pod wzgledem tworzenia warstw i zdolnosci speczniania. Wermikulit odpowiada trójosmiosciennemu montmorylonitowi, jednakze jego krysztaly sa znacznie wieksze i siec jest wyksztalcona bardziej regularnie.104 234 3 Reasumujac mozna zatem wnioskowac, ze do procesu oczyszczania nadaja sie mineraly, które maja strukture warstwowa, która wykazuje kationy miedzy warstwami krzemianu i maja sklonnosc do speczniania. Zgodnie z doswiadczeniami tego rodzaju mineraly zatrzymuja uszkodzone czasteczki gammaglobuliny, widocznie na podstawie ich silnej aktywacji kationów, a nieuszkodzone czasteczki nie zostaja zwiazane. Wymagane jest przy tym zachowanie okreslonych granic stezenia i wartosci pH. Wedlug wynalazku stosuje sie w szczególnosci mineraly montmorylonit, batawit albo wermikulit. Zaleznie od rozpuszczonej ilosci gammaglobuliny przy ponownym rozpuszczana dodaje sie0,2 do okolo 5% wagowych krzemianów. Wedlug doswiadczen reakcja ta zachodzi w temperaturze 4-20° C i stosuje sie wartosc pH = 4,0—7,6. Czas reakcji wynosi 3—10 godzin. Reakcje przeprowadza sie przy tym korzystnie w ciagu nocy poniewaz przebiega ona stosunkowo powoli i dluzszy czas polepsza wyniki. Wyladowanie krzemianów przepro¬ wadza sie korzystnie przez odwirowanie. Mozna jednak stosowac równiez inne metody, znane z ogólnej techniki postepowania, np. saczenie splawiakowe. Nastepujace przyklady wyjasniaja wynalazek. Przy k l ad I. a/ Oddzielanie gammaglobuliny. Jako substancje wyjsciowa stosuje sie zebrana plazme, która zadaje sie 8% etanolem i wytraca przy wartosci pH ¦ 7,2 w temperaturze minus 3°C. Wydziela sie przy tym frakcja I. Ciecz zadaje sie nastepnie 19% etanolem w temperaturze minus 5°C i przy wartosci pH * .5,8. Wydziela sie przy tym frakcja II-III, która sklada sie z gamma-globulin. Osad rozpuszcza sie ponownie i przy wartosci pH*5 wytraca sie powtórnie 8% etanolem. Pozostalosc nad osadem straca sie ponownie za pomoca 25% etanolu przy wartosci pH = 7,2. Powstajacy przy tym osad ("frakcja U) sklada sie z co najmniej 90% gammaglobuliny. b/ Obnizanie przeciwdzialania dopelniaczowi. Osad gammaglobuliny pobiera sie w buforowanym roztwo¬ rze wodnym o wartosci pH ¦ 7,0 w stezeniu okolo 6%, przy czym do roztworu wodnego dodaje sie okolo 10% skrobi hydroksyetylowej. Do roztworu dodaje sie dalej wodna zawiesine bentonitru SF (glówny skladnik: montmorylonit, uziamienie ponizej 80 ju, producent: Serva Feinbiochemlka, Heidelberg). Roztwór zawiera wtenczas 2,5% wagowego bentonitu i zostaje dobrze wymieszany. Nastepnie roztwór pozostawia sie wciagu 6 godzin w temperaturze 15°C±2°C. Potem usuwa sie bentonit razem z niepozadanymi skladnikami przez odwirowanie po dodaniu 10% poliglikolu etylenowego. c/ Przeprowadzenie do fizjologicznego roztworu soli kuchennej. Otrzymany przy odwirowaniu odciek zawiera zadane skladniki gammaglobuliny, wystepujace w postaci roztworu. Odciek doprowadza sie za pomoca 0,1 NaOH do wartosci pH - 7,2 i zadaje 20% wagowych poliglikolu etylenowego. Wydziela sie przy tym osad skladajacy sie z czystej gammaglobuliny. Osad odzyskuje sie przez odwirowanie i w fizjologicznym roztworze soli kuchennej doprowadza sie do stezenia 5,2% bialka i nastepnie wyjalawia, po czym jest on gotowy do zastosowania terapeutycznego. Przyklad II. Etapy a/ i c/ przeprowadza sie tak samo, jak w przykladzie I, etap b/ zmienia tle w nastepujacy sposób: Osad gammaglobuliny pobiera sie w buforowanym roztworze wodnym p wartosci pH m 7,4 w stezeniu okolo 4% wagowych, przy czym do roztworu wodnego dodaje sie okolo 8% skrobi hydroksyetylowej. Do roztworu dodaje sie dalej wodna zawiesine drobno zmielonego, do wielkosci czastek ponizej 80 y. wermikulitu az do zawartosci 5% wagowych. Calosc poddaje sie silnemu wymieszaniu. Nastepnie roztwór pozostawia sle w ciagu 8 godzin w temperaturze 15° ±2°C. Do roztworu dodaje sie nastepnie okolo 10% wagowych skrobi hydroksyety¬ lowej. Nastepnie usuwa sie wermikulit razem z niepozadanymi skladnikami przez odwirowania. Do tego etapu b/ dolacza sie etap c/ procesu. PL PL

Claims (7)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób otrzymywania tolerowanej sródzylnie gammaglobuliny z surowego osadu gammaglobuliny, otrzymanego przez frakcjonowanie krio-etanolowe, przez przeprowadzenie wstan nierozpuszczalny czesci gammaglobuliny przeciwdzialajacej dopelniaczowi, w którym surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie ponownie w roztworze wodnym, który zawiera polimer rozpuszczalny w wodzie i ewentualnie substancje buforowa i nastepnie ponownie wytraca, przy czym surowy osad gammaglobuliny pobiera sie w roztworze wodnym, w którym zawarta jest skrobia hydroksyetylowa o ciezarze czasteczkowym 1000—900000 w stezeniu 1—30% wagowych i nastepnie wytraca sie z roztworu skladnik przeciwdzialajacy dopelniaczowi przez dodanie polimeru rozpuszczalnego w wodzie wedlug patentu glównego nr 99599, znamienny tym, ze wodny roztwór, zawierajacy gammaglobuline, zadaje sie dodatkowo zawiesina krzemianów warstwowych rodzaju miki w stezeniu 0,2—10% wagowych, po czym po uplywie wystarczajacego czasu reakcji i dodaniu srodka stracajacego, takiego jak poliglikol etylenowy, usuwa sie czesc gammaglobuliny, przewidziana do wydzielenia razem z krzemianami warstwowymi.4 104 234

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako krzemian warstwowy stosuje sie bentonit z glównym skladnikiem montmorylonitem.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako krzemiany warstwowe stosuje sie mineraly batawit albo wermikulit.

4. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze dodaje sie 0,2—5% wagowych krzemianów.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, z n a m i e n n y tym, ze reakcje przeprowadza sie w temperaturze 4—20°C.

6. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze reakcje przeprowadza sie za pomoca krzemianów warstwowych przy wartosci pH roztworu wynoszacej 4,0-7,6.

7. Sposób wedlug zastrz. 1; znamienny tym, ze reakcje przeprowadza sie w ciagu 3—10 godzin. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl