DK151609B - Fremgangsmaade til udvinding af intravenoest kompatibelt gammaglobulin - Google Patents

Description

, DK 151609 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af intravenøst kompatibelt gammaglobulin fra et udfældet gammaglobulin-råbundfald fra blod, udvundet ved hjælp af kendte metoder, som fx· ved cryoethanol-fraktionering, ved hvilken den antikomplementære gammaglobulin-bestanddel i en vandig opløsning af råbundfaldet bindes til en vandopløselig hydroxyethylstiveIse, HES, og udfældes med polyethylenglycol, hvorefter det indtil da i opløsning forblivende intravenøskompatible gammaglobulin udfældes med en større koncentration af polyethylenglycol som angivet i DE-patentskrift 25.00.076, og kendt fra beskrivelsen til dansk patentansøgning 5843/75 (almindelig tilgængelig 03 JUL 1976).

Selv om den anførte fremgangsmåde frembringer et gammaglobulin, som tilfredsstiller alle fordringer i den medicinske praksis, har det dog vist - 2 -

DK 151609B

sig fordelagtigt at forhøje udbyttet og at sikre en bedre reproducerbarhed og en lettelse af fremstillingen*

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved, at der til den vandige, gam-maglobulinholdige opløsning af råbundfaldet yderligere tilsættes en opslem-ning af glimmeragtige lagsilikater i en koncentration på 0,2 - 10 vægt-%, og at man efter forløbet af en tilstrækkelig reaktionstid og tilsætning af po-lyethylenglykolen fjerner den uønskede gammaglobulin-bestanddel sammen med lagsilikaterne.

Ved "glimmeragtige lagsilikater" forstås silikater, hvis sammensætning gengives ved følgende grænseformler: a) MeJr0_n[(Al3+,Cr3+,Fe3+,Fe2+,Mg2+,Zn2+,Ni2+)2i3(OH)2(Si4_xAlxO)10]x" b) MejY0.n[(Al3+,Cr3+,Fe3+,Fe2+,Mg2+,Zn2+,Ni2+,Li+)^3X}+ (0H)2(Si40)10]x“

Kationerne Me* kan udskiftes zeolitisk med andre, også organiske kat-ioner* Som kvsldningsvæske Y kan indføres vilkårlige molkyler med undtagelse af trættede carbonhydrider.

Mængden af kvældningsvæske kan varieres inden for meget vide grænser.

Da også nængden x af de monovalente kationer pr. (Si, Al g-byggeelement, dvs. lagladningen, varierer, fremkommer der en overordentlig stor mangfoldighed.

Ifølge opfindelsen anvendes der som lagsilikat fortrinsvis bentonit med hovedkomponenten montmorillonit eller mineralerne batavit eller vermiculit.

Den intensive forskning har navnlig beskæftiget sig med Montmorillonit (jvf. Bibliografi i "Organische Derivate der glimmerartigen Schichtsilikate" af Weiss; angewandte Chemie 1963; side 113 ff.). Montmorillonit består af todimensionalt uendelige makro-anioner, som er elektrostatisk forgrenet over de derimellem liggende kationer. Energien til kvældningen, dvs. til forøgelse af lagafstanden under fjernelse af de positive og negative ladninger fra hinanden, leveres af hydratationen eller solvatationen i kationerne og i an-ionlagene. Da solvatationsenergien almindeligvis er væsentlig mindre end hydratationsenergien, kan der kun indlejres molekylarter med høj dielektricitetskonstant eller med evne til dannelse af hydrogenbroer.

Også aminosyrer, peptider og proteiner kan indlejres i glimmeragtige lagsilikater. Proteiner udveksles ved lav pH-værdi næsten kvantitativt. Med stigende pH-værdi synker antallet af de kationiske positioner i proteinerne, og udskiftningen bliver ufuldstændig.

- 3 -

DK 151609B

Albuminer, globuliner og prolaminer bindes ligeledes. Hed serumglobuli-ner synes reaktionen kun at skride ca. 20 - 30 Å frem fra silikatkrystallernes rand til det indre. Albuminer udbredes mellem silikatlagene. Lagafstanden på 14, 5 - 15,0 Å viser, at der for det udbredte protein kun står en lagtykkelse på maksimalt 5,5 - 6 A til disposition.

Da der i den opløste gammaglobulinmaangde befinder sig både ubeskadigede og beskadigede molekyler, må man bestræbe sig for på en eller anden måde at binde de beskadigede molekyler og dermed gøre dem kemisk forskellige fra de fysiologisk fejlfri molekyler. De beskadigede molekyler er i stand til at danne hydrogenbrobindinger* De indlejres og bindes derfor i forøget grad i silikatlagene, medens de ubeskadigede gammaglobulinmolekyler forbliver i opløsningen. De i lagsilikaternes lag bundne gammaglobulinmolekyler lean derfor let fjernes, fx. ved centrifugering.

Den ifølge opfindelsen Ønskede kationbytterevne viser ifølge HOFMANN (Z.Kristallogr. (A) 98 (1937) 31; Chemie 55 (1942)283) også kaolin og dermed beslægtede stoffer, (fx. Halloysit, AI2O3*2Si02*4H20) og visse glimmeragtige mineraler, som er beslægtet med hensyn til gitteropbygningen·

Hertil hører også vermiculit og det dermed beslægtede batavit (* jernfrit vermiculit). Strukturformlen for batavit fremgår af WEISS og HOFFMANN (Zeitschrift fur Naturforschung, 6b, 405) som følger: i*Mg2,64Al0,33*l ^^1,94^2,99^1,01°^} °'68+ m9o/34 + 2,34H20

Det har vist sig, at dette materiale såvel som Montmorillonit har indrekrystallinsk kvældningsevne og høj kationbytterevne. Undersøgelserne viste, at batavit optager indtil 5 vægtprocent humanalbumin, hvorved æggehvidestofferne blev indlejret mellem silicatlagene. Også vermiculit med den tilnærmede strukturformel {(Mg3,Al2,Fef,FefI)(OH)2[si3i35Al0/65O10]}0'65'+ 0,65M+ udviser de ønskede egenskaber med hensyn til lagdannelsen og kvældningsev-nen. Vermiculit svarer til et trioktaedrisk montmorillonit, men dets krystaller er meget større, og gitteret er mere regelmæssigt udformet.

Sammenfattende kan således konstateres, at der til renseprocessen kan anvendes sådanne mineraler, som udviser en lagstruktur, der har kationer mellem silicatlagene, og som er tilbøjelige til kvældning. Ifølge de eksperimentale erfaringer bindes ved sådanne mineraler de defekte gammaglobulin- - 4 -

DK 151609B

molekyler - åbenbart på grund af deres stærke kationaktlvering - , medens de ubeskadigede ikke bindes.

I forbindelse med gammaglobuliner er en fremgangsmåde blevet kendt, hvor den proteinfraktion, som skal renses, i en fysiologisk saltopløsning ved en pH-værdi på 6 - 8.5 tilsættes bentonit (OS-patentskrift 34.49.316).

Det har dog vist sig, at der med den kombinerede anvendelse af hydroxyethyl-stivelse og et materiale, som binder protein, kan opnås en særlig stor renhed, dvs. praktisk taget 100%, naturligt gammaglobulin. Dette er muligt ved stort udbytte og let reproducerbare betingelser, hvis fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes.

Opfindelsen er nærmere forklaret i det følgende ved hjælp af nogle eksempler.

Eksempel 1« (a) fraskillelse af gammaglobulinet:

Man går ud fra en samlet plasma, til hvilken tilsættes 8% ethanol, og som blev udfældet ved en pH-værdi på 7,2 ved -3*C. Herved udskilles fraktion I. Til den derover stående væske tilsættes derefter ved -5‘C og en pH-værdi på 5,8 19% ethanol. Derved udskilles fraktionen II-III, som består af gammaglobuliner. Bundfaldet opløses atter og udfældes påny ved pH 5 og 8% ethanol. Den forblivende rest fældes påny med 25% ethanol ved pH 7,2. Det herved dannede bundfald (= fraktion 11) består af mindst 90% gammaglobulin.

(b) formindskelse af den antikomplementære virksomhed:

Gammaglobulinbundfaldet optages i en bufret, vandig opløsning med en pH-værdi på 7,0 og i en koncentration på ca. 6%, hvorhos der til den vandige opløsning er tilsat ca. 10% HES. Til opløsningen tilsættes endvidere en vandig opslæmning af bentonit SF (hovedkomponenter: montmorillonit; kornstørrelse under 80μ, producent: SERWA Feinbiochemika, Heidelberg). Opløsningen indeholder derefter 2,5 uægt-% bentonit og omrøres godt. Derefter lader man opløsningen stå i 6 timer ved en temperatur på 15*C ±2‘C. Derpå fjernes ben-tonit'en sammen med de uønskede bestanddele ved centrifugering efter tilsætning af 10% polyethylenglycol.

(c) omdannelse til en fysiologisk kogsaltopløsning:

Det ved centrifugeringen fremkomne filtrat indeholder de ønskede, som opløsning foreliggende gammaglobulinbestanddele. Filtratet bringes med 0,1 NaOH på en pH-værdi af 7,2, og der tilsættes 20 vægt-% polyethylenglycol. Derved udskilles bundfald af rent gammaglobulin. Bundfaldet udvindes ved

DK 151609B

- 5 - centrifugering og bringes i en fysiologisk kogsaltopløsning op på en koncentration på 5,2% æggehvidestof og sterilfiltreres derpå. Derefter er det klar til terapeutisk anvendelse.

Eksempel 2.

Trinnene (a) og (c) er de samme som i eksempel 1. Trin (b) modificeres som følger :

Gamma globulinbundfaldet opløses i en bufret, vandig opløsning med en pH-værdi på 7,4 og i en koncentration på ca. 4 vægt-%, hvorhos der til den vandige opløsning er tilsat ca. 8% HES. Til opløsningen tilsættes yderligere en vandig opslæmning af finmalet vermiculit (partikelstørrelse under 80 μ) i en mængde på op til 5 vægt-%. Det hele omrøres kraftigt. Derefter lader man opløsningen stå 8 timer ved en temperatur på 15*C ±2*C. Til opløsningen tilsættes derefter ca. 10 vægt-% polyethylenglycol. Sluttelig fjernes vermicu-lit’en sammen med de uønskede bestanddele ved centrifugering.

Derefter følger trin (c).

Ved beregninger og målinger på immun-elektrophoresediagrammer kan konstateres, at udbyttet af rent gammaglobulin forøges, når fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes. Det udvundne gammaglobulin er ikke modificeret eller kemisk ændret. Det er absolut intravenøskompatibelt og har praktisk taget ingen antikomplementære egenskaber. Derudover udviser det en høj stabilitet, således som det kunne påvises ved lagringsforsøg.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til udvinding af intravenøst kompatibelt gammaglobulin fra et udfældet gammaglobulin-råbundfald fra blod, udvundet ved hjælp af kendte metoder, som fx. ved cryo-ethanol-fraktionering, ved hvilken den an-tikomplementære gammaglobulin-bestanddel i en vandig opløsning af råbundfaldet bindes til en vandopløselig hydroxyethylstivelse og udfældes med poly-ethylenglycol, hvorefter det indtil da i opløsning forblivende intravenøskompatible gammaglobulin udfældes med en større koncentration af polyethy-lenglycol, kendetegnet ved, at der til den vandige, gammaglobulin-holdige opløsning af råbundfaldet yderligere tilsættes en opslemning af glimmeragtige lagsilikater i en koncentration på 0,2 - 10 vægt-%, og at man efter forløbet af en tilstrækkelig reaktionstid og tilsætning af polyethy-lenglykolen fjerner den uønskede gammaglobulin-bestanddel sammen med lagsilikaterne.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som lagsilikat anvendes bentonit med hovedkomponenten montmorillonit.

3. Fremgangsmåde ifølge lerav 1, kendetegnet ved, at der som lagsilikat anvendes mineralerne batavit eller vermiculit.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 3, kendetegnet ved, at der tilsættes 0,2-5 vægt-% lagsilikater.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 - 4, kendetegnet ved, at reaktionen sker ved en temperatur på 4*C til 20*C.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at reaktionen med lagsilikaterne sker ved en pH-værdi af opløsningen på 4,0 - 7,6.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at reaktionstiden andrager mellem 3-10 timer. v