JPS60222773A - ラテツクス試薬の製造方法 - Google Patents

ラテツクス試薬の製造方法

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JPS60222773A
JPS60222773A JP7989984A JP7989984A JPS60222773A JP S60222773 A JPS60222773 A JP S60222773A JP 7989984 A JP7989984 A JP 7989984A JP 7989984 A JP7989984 A JP 7989984A JP S60222773 A JPS60222773 A JP S60222773A
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JP
Japan
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globulin
latex
gamma
reagent
latex reagent
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JP7989984A
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English (en)
Inventor
Michiya Nakagawa
道也 中川
Michio Kuge
久下 倫生
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Sekisui Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Chemical Co Ltd
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Publication date
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (技術分野) 本発明は免疫血清学的診断に用いられるラテックス試薬
の製造方法、特に、自己凝集のない高精度のラテックス
試薬の製造方法に関する。
(従来技術) 抗血清から得られたT−グロブリンをラテックス粒子に
吸着させ、抗原抗体反応を利用して各種の診断を行うた
めの、ラテックス試薬は数多く製造されている。このよ
うなラテックス試薬に抗原を含む試料溶液を接触させる
と凝集反応が起こるため、試料溶液中の抗原の有無が簡
単に確認される。しかし、このようなラテックス試薬は
経時変化を起こしやすく、非特異的な凝集反応を示す場
合がある。これはラテックス粒子に吸着しているγ−グ
ロブリンの90%以上を占めるイムノグロブリンG (
IgG )に多量体が存在し、これがラテックス粒子の
凝集を促進させるためである。IgGは会合しやすい性
質を有し、2量体や3量体などの多量体を形成する。こ
の多量体の含量の高いIgGをラテックスに吸着させて
得られるラテックス試薬は、ラテックス試薬同志が凝集
し見かけの粒径が大きくなる。そのため、凝集反応が検
出されうる下限の濃度付近では凝集反応が陽性になりゃ
すく、正確な判定がなされにくい。ラテックス粒子に吸
着されているIgG i量体もIgG多量体の含量が高
い場合には、長期間の保存により吸着されているIgG
同志の会合が起こりゃすく、その結果。
同じく上記現象が生じる。特開昭54−26327号公
報では、 IgG多量体やIgGによるラテックス粒子
の凝集を抑制するために塩化コリンとショ糖とを添加し
たラテックス試薬が開示されている。特開昭52−12
3295には同様の目的でソジウムボリアネトールスル
ホネートの添加されたラテックス試薬が開示されている
。ペニシラミンが添加されたラテックス試薬もラテック
スの凝集が抑制されることが発明者らの研究により明ら
かにされている。
ラテックス試薬を調製するときには■gG多量体の含量
の少ないγ−グロブリンを使用することが望ましい。T
−グロブリン中のIgG多量体を除去し精製γ−グロブ
リンを得るには液体クロマトグラフィーによる方法がも
っばら利用されている。
しかし、液体クロマトグラフィー法では使用するカラム
の大きさに限度があるため、γ−グロブリンを大量に精
製することが困難である。
(発明の目的) 本発明の目的は、抗血清から得られたT−グロブリンか
らIgG多量体を効率よく除去し、得られた精製T−グ
ロブリンを用いて精度の高いラテックス試薬を製造する
方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、長期間保存しても非特異的凝集反
応の起こらないラテックス試薬の製造方法を提供するこ
とにある。
(発明の構成) 本発明は、γ−グロブリン含有溶液にポリエチレングリ
コールを添加し含有されるIgG多量体を析出・除去し
た精製T−グ貰プリンがIgG多量体を含まないラテッ
クス試薬を供給しうる。との発明者の知見にもとづいて
完成された。それゆえ。
本発明のラテックス試薬の製造方法は(111−グロブ
リンを含有する溶液にポリエチレングリコールを加えて
該γ−グロブリン中に存在するイムノグロブリンG多量
体を析出・除去し、精製T−グロブリンを得る工程、お
よび(2)該精製γ−グロブリンを合成樹脂ラテックス
に吸着させる工程、を包含し、そのことにより上記目的
が達成される。
本発明のγ−グロブリンは抗血清の含まれる溶液に飽和
硫酸アンモニウムを加えて塩析し、析出物を常法により
イオン交換クロマトグラフィーにかけて得られる。 得
られたγ−グロブリンをpi+5.5〜7.0のリン酸
緩衝液に溶解させ、これにポリエチレングリコール(P
EG )を添加するとIgG多量体が析出する。析出し
たIgG多量体を遠心分離などの手段により除去すると
精製T−グロブリンが得られる。リン酸緩衝液がpi(
5,5〜6.3であると、得られる精製γ−グロブリン
の純度はさらに向上する。PEGは溶液の4〜8%とな
るよう1こ加えられる。その分子量は2000〜800
0であり、好ましくは2000〜6000である。分子
量が2000を下まわるとIgG多量体が析出しにくく
なる。分子量が8000を上まわるとPEGの加えられ
た溶液全体の粘度が高くなりIgG多量体の除去操作が
行われにくくなる。このようにして得られた精製T−グ
ロブリンはIgG多量体をほとんど含有しない。
精製T−グロブリンは既知の方法で合成樹脂ラテックス
の表面に吸着される。合成樹脂ラテックスにはポリスチ
レン、ポリビニルトルエン、スチレン成分を含む共重合
体、ビニルトルエンを含む共重合体などが用いられるが
、これに限定されないことはいうまでもない。その粒径
は、好ましくは、 0.03〜1.50μmである。こ
のようにして得られたラテックス試薬はγ−グロブリン
多量体をほとんど含有しないため、ラテックス試薬の経
時安定性を得るために従来方法のように特別の試薬を添
加しなくても自己凝集による非特異的凝集反応は起こら
ない。ラテックスに吸着したIgG単量体同志の凝集も
ほとんど起こらない。
(実施例) 以下に本発明を実施例により説明する。
去隻但土 (A)r−グロブリンの精製:ヤギ産抗ヒトCRP抗血
清を硫酸アンモニウムにより塩析し、さらにDEAEイ
オン交換クロマトグラフィーで精製し。
これを粗T−グロブリン分画とした。粗T−グロブリン
分画が2%の濃度となるようにpH6,0リン酸緩衝液
に溶解させた。 攪拌しながら、これにPEG (分子
量4000)をその含量が5%となるように加えた。析
出した沈澱物を除去し、その上澄を硫酸アンモニウム溶
液で塩析し、精製γ−グロブリンを得た。精製γ−グロ
ブリンはPEGを含有しないことを確認した。
(B)ラテックス試薬の調製: (A)項で得られた精
製γ−グロブリンをpH6,5のリン酸緩衝液にその蛋
白濃度が5μg/mj!となるように溶解させた。精製
γ−グロブリンのリン酸緩衝液1容量部に粒径0.31
μmのスチレン−スチレンスルホン酸ナトリウム共重合
ラテックス(ソープフリータイプ)を2%含有するラテ
ックス液l容量部を加えて37℃で60分間攪拌を行っ
た。これを10.00Orpmで60分間遠心分離した
。沈渣をBSA 1%塩化コリン0.5M、アジ化ナト
リウム0.1%を含有するリン酸緩衝液4容量部に分散
させてラテックス試薬を得た。
(C)ラテックス試薬の評価: (B)項で得られたラ
テックス試薬50μlと表1に示す各濃度のヒトCRP
 50μlとをそれぞれプレート上で混合し凝集反応を
観察しラテックス試薬の感度を調べた。
ラテックス試薬を4℃で保存し、6ケ月後および12ケ
月後に同様の試験を行い、その感度を調べた。
その結果を表1に示す。表1において、−は凝集の全く
認められない状態1士は混合液にかすかに濁りが認めら
れる状態、+は凝集の認められる状態、そして+は強い
凝集の認められる状態を示す。
表1からラテックス試薬は高感度で特異的に凝集反応を
示し、かつその精度は経時的に変化しないことが確認さ
れた。
表1 此1u机1 (A)ラテックス試薬の調製:実施例1 (A)項で得
られる粗γ−グロブリン分画を実施例1(B)項の方法
に準じてラテックスに吸着させてラテックス試薬を得た
(B)ラテックス試薬の評価:実施例1 (C)項の方
法に従って(A)項で得られたラテックス試薬の感度と
経時変化を調べた。その結果を表2に示す。
表2から粗T−グロブリンを用いたラテックス試薬は経
時的に変化して凝集が促進されることが明らかである。
表2 夫m影 (A)r−グロブリンの精製:1IBs抗原をCNBr
活性化セファロースにカップリングし、これをカラムに
充填した。このカラムに家兎11Bs抗血清を流してT
−グロブリンを吸着させた。さらにこのカラムに4.5
M塩化マグネシウム溶液を流して吸着されているγ−グ
ロブリンを溶出させ、粗T−グロブリン分画を得た。 
粗T−グロブリン分画をpH6,2リン酸緩衝液に1%
の濃度となるように溶解させた。攪拌しながら、これに
PEG (分子量6000)をその含量が4%となるよ
うに加えた。析出した沈澱物を除去し、その上澄を硫酸
アンモニウム溶液で塩析し、精製T−グロブリンを得た
精製T−グロブリンはPEGを含有しないことを確認し
た。 ・ (B)ラテックス試薬の調製: (A)項で得ら □れ
た精製T−グロブリンを0.1Mグリシン−水酸化ナト
リウム溶液(pH8,6)にその蛋白濃度が12■/m
ltとなるように溶解させた。精製T−グロブリンの上
記溶液1容量部に粒径0.21μmのスチレンースチレ
ンスルホン酸ナトリウム共重合ラテックス(ソープフリ
ータイプ)を4%含有するラテックス液1容量部を加え
て37℃で120分間攪拌を行った。これを18.00
Orpmで60分間遠心分離した。沈渣をBSA 1%
、蔗糖2%、アジ化ナトリウム0.1%を含有する0、
1Mグリシン−水酸化ナトリウム溶液2容量部に分散さ
せてラテックス試薬を得た。
(C)ラテックス試薬の評価二表3に示す各濃度のHB
s抗原溶液1容量部を5%のBSAを含有するリン酸緩
衝液(pH6,5) 5容量部でそれぞれ希釈した。各
希釈液に(B)項で得られたラテックス試薬0.5容量
部をそれぞれ加えて5分間の濁度の変化を観察した。こ
れを1分間あたりの濁度の変化値に換算した。その値を
表3に示す。ラテックス試薬を4℃で保存し、6ケ月お
よび12ケ月後に同様の試験を行った。その結果を表3
に示す。
濁度は上記被検混合液を5龍長のセルに入れ、波長85
0 nmにおけるODを測定して得た。表3には(1分
間あたりのODの平均変化値X 1000)の値を示す
表3 表3からラテックス試薬を長期間保存しても非特異的凝
集反応が起こらないことが確認された。
ル較開裟 ・ (A)ラテックス試薬の調製:実施例2(A)項で得ら
れる粗T−グロブリン分画を実施例2(B)項の方法に
準じてラテックスに吸着させてラテックス試薬を得た。
(B)ラテックス試薬の評価: (A)項で得られたラ
テックス試薬を用い実施例2(C)項の方法に従ってラ
テックス試薬の凝集性と経時変化についての試験を行っ
た。その結果を表4に示す。
表4 表4から明らかなように粗γ−グロブリンを吸着させた
ラテックス試薬は経時的に変化し、自己凝集反応が起こ
ることが理解できる。
(発明の効果) 本発明では、このように、ラテックス試薬に吸着される
T−グロブリンが高度に精製されIgG多量体が除去さ
れているので、得られるラテックス試薬は自己凝集を起
こさない。そのためラテックス試薬の精度は高(、正確
な判定がなされ得る。
長期間試薬を保存してもラテックス粒子表面に吸着され
たIgG単量体同志による凝集もなく、、そのために、
特異的凝集反応の正確な判定がなされ得る。T−グロブ
リンの精製にはカラムを必要とせずに、γ−グロブリン
溶液にPEGを加えるハ・7チ法により簡単に得られる
ため、一度に大量にラテックス試薬を製造することも可
能である。
以上 出願人 積水化学工業株式会社 手沼にネ市正戎二 (自発) 昭和60年 7月 50 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和59年特許願第79899号 2、発 明 の 名 称 ラテックス試薬の製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 530 住 所 大阪市北区西天満二丁目4番4号特許部東京駐
在T1ミL (03) 434−95525、 補正の
内容 fl 明細書@77頁第1行に、 「5μy/rnl」とあるのを rsmy/dJと訂正する。
(2)第11頁第7行に、 「2容量部」とあるのを 「4容量部」と訂正する。
以 上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、(llγ−グロブリンを含有する溶液にポリエチレ
    ングリコールを加えて該γ−グロブリン中に存在するイ
    ムノグロブリンG多量体を析出・除去し、精製T−グロ
    ブリンを得る工程、および(2)該精製γ−グロブリン
    を合成樹脂ラテックスに吸着させる工程。 を包含するラテックス試薬の製造方法。 2、前記合成樹脂ラテックスの平均粒径が0.03〜1
    .50μmである特許請求の範囲第1項に記載の製造方
    法。 3、前記ポリエチレングリコールの平均分子量が200
    0〜8000である特許請求の範囲第1項に記載の製造
    方法。
JP7989984A 1984-04-19 1984-04-19 ラテツクス試薬の製造方法 Pending JPS60222773A (ja)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5046814A (ja) * 1973-01-15 1975-04-25
JPS52117414A (en) * 1976-02-07 1977-10-01 Plasmesco Ag Methoa of improving compatibility of gammaglobulin
JPS5320415A (en) * 1976-08-06 1978-02-24 Coval M L Production of gammaa globlin capaple of administering into vein and gammaagloblin produced by said method

Patent Citations (3)

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