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Antithrontbgene Ausrüstung von Matrix-Oberflächen.
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Die Behandlung von endogenen oder exogenen Intoxikationen mit Hilfe
der Hämodialyse, Hämofiltration, Plasmaseparation und Hämoperfusion sowie der Einsatz
der Herz-Lungen-Maschine (Oxygenatoren) für den extrakorporalen Kreislauf bringt
das Blut des Patienten in Kontakt mit den körperfremden Oberflächen der verwendeten
Schlauch-, Membran- und Adsorptionssysteme.
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Diese Fremdoberflächen aktivieren in Abhängigkeit von dem eingesetzten
Material über diverse Auslösemechanismen (Proteinadsorption, Aktivierung von Gerinnungsfaktoren
etc.) das interne und/oder thrombozytäre Gerinnungssystem. Die daraus resultierende
Bildung von Thromben kann beim zu Behandelnden einerseits zu einem Gefäßverschluß
durch Thrombenembolie führen, andererseits durch die Ablagerung von Gerinnseln auf
den Austauscheroberflächen der Dialysatoren, Hämofiltratoren, Plasmaseparatoren,
Perfusionssäulen, Adsorbermaterialien oder Oxygenatoren zu einer drastischen Herabsetzung
deren spezieller Austausch- bzw. Adsorptionskapazitäten führen.
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Neben der Methode, die Entstehung der Thromben an der Fremdoberfläche
durch intravenöse Gabe von Antikoagulantien wie Heparin und Heparinoiden oder Aggregationshemmern
zu inhibieren, existieren ebenfalls zahlreiche
Bestrebungen, den
Schlauch-, Membran- und Adsorberoberflächen durch Auswahl der Materialien bzw. Herstellungsverfahren
verminderte thrombogene Eigenschaften zu verleihen. Als eine Kombination dieser
beiden Arbeitsrichtungen kann man die Bemühungen bezeichnen, durch Aufbringen von
Substanzen der oben erwähnten Wirkstoffgruppen auf die mit Blut kontaktierten Oberflächen
eine Verbesserung der Antithrombogenität zu erreichen. Die Bindung der Pharmaka
erfolgt dabei in den meisten beschriebenen Verfahren entsprechend dem hydrophoben,
hydrophilen oder ionischen Charakter der Substanzen durch Ausnutzung gleichartiger
adsorptiver Kapazitäten der Oberflächen. (F.F. Holland, E.E. Gidden, R.G. Mason,
E.Klein: ASAIO-Journal 1 (1), 24-36 (1978)).
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Angestrebt wird bei dieser Verfahrensweise keine irreversible Adsorption
der Wirkstoffe, sondern vielmehr deren langsame, kontimierliche Freisetzung von
der Oberfläche während deren therapeutischer Anwendung, um eine pharmakologisch
wirksame Konzentration der Inhibitoren an der Grenzfläche Fremdmaterial/Blut zu
erzielen. Dies garantiert zwar eine Entlastung des Kreislaufsystems des Patienten
durch die geringere Gesamtdosis, die appliziert wird, problematisch ist es jedoch,
während der gesamten Anwendungsdauer eine gleichmäßige Freisetzung der Substanz
zu erreichen, so daß die medizinische Sicherheit des Gesamtsystems fraglich ist.
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Neben der Fixierung von Gerinnungshemmern durch Adsorption, sind von
anderen Autoren einige dieser Substanzen kovalent auf diversen Oberflächen gebunden
worden.
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(M.F.A. Goosen, M.V. Sevton: J. Biomed. Mat Res., 13,347-364 (1979)
(D. Labarre, M. Josefowicz: J. Biomed. Mat. Res., 11,283-295 (1977)
Erfolgversprechend
sind derartige Präparationen, wenn das fixierte Pharmakon eine extrazelluläre Wirkungsweise
besitzt, da im Zellinnern wirkende Substanzen aufgrund ihrer Unbeweglichkeit durch
den Immobilisierungsprozeß nicht mehr durch die Zellmembran ins Cytoplasma transportiert
werden können. 7.U den extrazellulär agierenden Wirkstoffgruppen gehören unter anderem
Heparin, die Heparinoide, sowie Aggregationshemmer, welche auf Oberflächen verschiedenster
Zusammensetzung kovalent immobilisiert werden können. Dieses ist in der Literatur
hinreichend beschrieben, so daß hier nicht näher darauf eingegangen werden braucht.
Ausgangspunkt der Überlegungen, durch Immobilisierung von Heparin und Heparinoiden
und Aggregationshemmern verbesserte antithrombogene Eigenschaften der Oberflächen
zu erzielen, waren Untersuchungen über die Wirkungsweise und Reaktionskinetik des
Heparins. Diese Substanz beschleunigt unter anderem die Hemmung verschiedener Proteasen
des Gerinnungssystems (z.B. Thrombin, Faktor X a) durch Antithrombin III, ohne letzlich
während dieses Prozesses verbraucht zu werden. Nach der Heparin induzierten Ausbildung
eines Enzym-Inhibitor-Komplexes (z.B. Thrombin - Antithrombin III) steht es für
weitere katalytische Funktionen wiederum zur Verfügung.
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Die Methode, Heparin und Heparinoide direkt über Carboxyl-, Sulfonat-oder
Hydroxylgruppen etc. auf das Trägermaterial zu binden, besitzen jedoch den großen
Nachteil, daß die Moleküle zwangsläufig räumlich sehr nah an die Oberfläche gebunden
werden. Dadurch besitzen sie keine Möglichkeit mehr, sich den erforderlichen sterischen
Bindungen während des katalytischen Prozesses optimal anzupassen und büßen dadurch
einen großen Teil ihrer biologischen Aktivität ein. Eine Lösung dieses Problems
ist
die Erfindung, die prinzipiell dazu herangezogen werden kann, die katalytischen
Eigenschaften kovalent immobilisierter Antikoagulantien und Aggregationshemmern
mit extrazellulärer Wirkungsweise und andere Pharmaka mit entsprechender Wirkung,
wie z.B. Heparin und Heparinoide, erheblich zu verbessern.
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Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Herstellung von
antithrombogenen Oberflächen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man, gegen humane
Eiweißkörper antithrombogene Wirkung zeigende Substanzen über einen spacer als "Distanzstück"
mit'einer Länge zwischen 3-150 A, vorzugsweise 12-48 A, chemisch kovalent wie üblich
an aktivierte Oberflächen koppelt.
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Besonders gekennzeichnet ist dieses Verfahren dadurch, daß die antithrombogene
Wirkung zeigende Substanz Heparin bzw. ein Heparinoid ist und daß die antithrombogene
Wirkung zeigende Substanz ein bekannter Aggratiönahemmer ist.
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Spacer sind Monomere, Dimere, Trimere und/oder Oligomere, die an zwei
Enden zu einer Kopplung geeignete funktionelle Gruppen tragen.
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Insbesondere ist Erfindungsgegenstand die Verwendung von so hergestellten
Oberflächen zum Verhindern thrombotischer Ablagerungen an Blutgefäßersatzsystemen.
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Die Erfindung bezieht sich auf Erfahrungen der Affinitätschromatographie,
die ergaben, daß die an das Trägermaterial kovalent fixierten Affinoren besser mit
ihren frei vorliegenden spezifischen Liganden reagieren, wenn zwischen Affinor und
Träger aliphatische Kohlenwasserstoffketten -sogenannte "spacer" als Distanzstücke
- eingeführt werden.
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Dieses sei im folgenden näher erklärt.
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Der Immobilisierungsvorgang kann normalerweise so gewählt und durchgeführt
werden, daß auf dem Träger und dem zu fixierenden Molekül nur bestimmte chemische
Gruppen miteinander reagieren. Proteine, Glucoproteine oder Plysaccharide besitzen
jedoch in den meisten Fällen mehr als nur eine der in Frage kommenden reaktiven
Gruppen, so daß eine exakte Voraussage über die räumliche Ausrichtung des gebundenen
Moleküls nicht möglich ist, Dies ist in Abbildung 1 wiedergegeben, in der auf der
Oberfläche 1 die Affinoren 2, 3, 4, 5 gebunden sind, Gibt man, wie in Abbildung
2 dargestellt, nach der Immobilisierung der Affinormoleküle 2, 3, 4, 5 eine Liganden
6a, 6b, 6c-haltige Lösung über die Oberfläche 1, so kann aufgrund der heterogenen
sterischen Bedingungen, die durch die Immobilisierung geschaffen wurden, lediglich
der Affinor 2 ungehindert einen Liganden 6a binden.
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Fixiert man die Affinoren 2, 3, 4, 5 wie in Abbildung 3 jedoch über
"spacer" ("Distanzstück") 7a, 7b, 7c, 7d an die Oberfläche 1, so wird es einer größeren
Anzahl der Moleküle möglich, Liganden 6a, 6b, 6c zu binden. Die Abbildung 4 verdeutlicht
dieses. Wie in Abbildung 2 wurde hier die Liganden 6a, 6b, 6c-haltige Lösung zu
den auf der Oberfläche 1 über "spacer" 7a, 7b, 7c, 7d gebundenen Affinoren 2, 3,
4, 5 gegeben. Im Unterschied zu Abbildung 2 können jetzt nun auch die Affinoren
4, 5 einen Liganden 6b, 6c binden.
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Bei der kovalenten Immobilisierung von Aggregationshemmern und Antikoagulantien
auf Membran- oder Schlauchoberflächen lassen sich erfindungsgemäß die Vorteile der
Einführung von "spacern" zwischen Affinor und Oberfläche ebenso nutzen, wie es in
Abbildungen 3 und 4 pauschal dargestellt wurde;
denn wie oben bereits
beschrieben, katalysieren Heparin und Heparinoide die Inaktivierung von Gerinnungsproteasen
durch Antithrombin III, was nur durch Eingehen einer kurzfristigen Bindung mit den
Reaktionspartnern erfolgen kannt Zwar können nach dem Immobilisierungsprozeß nicht
mehr alle fixierten Moleküle ihre katalytische Aktivität entfalten, wie die Erfindung
jedoch zeigt, kann die Anzahl der aktiv verbleibenden Moleküle durch deren Fixierung
auf "spacern" drastisch erhöht werden Das eben Gesagte gilt natürlich ebenso für
die Immbilisierung von extrazellulär wirkenden Aggregationshemmern auf einer Oberfläche
Als "spacer" finden solche Moleküle Verwendung, die es erlauben, zwischen der Oberfläche
und dem darauf zu fixierenden Affinor eine Distanzstrecke im Bereich von 3 - 150
Angström, kontrolliert einzustellen. Dieses Ziel kann erreicht werden mit Hilfe
von chemischen Substanzen mit an zwei Enden vorhandenen funktionellen reaktiven
Gruppen, die durch Eingehen einer chemischen Reaktion mit einem Ende an auf der
Oberfläche befindliche funktionelle reaktive Gruppen kovalent gekoppelt werden,
und an deren anderem Ende die Wirkstoffsubstanz ebenfalls über geeignete funktionelle
Gruppen kovalent gebunden werden kann.
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Dabei ist es unerheblich, ob a) bereits auf der Matrixoberfläche (Kunststoffoberfläche
oder Adsorbermaterialoberfläche) ein geeigneter "spacer" vorhanden ist (z.B. Aminoethylcellulose
oder Glycidylcellulose, Poly-(glycidylmethacrylat etc.); b) "spacer"-Molekülreste
bereits in das Wirkstoffmolekül integriert sind; c) zuerst das "spacer"-Molekül
mit einem Ende auf der Matrixoberfläche fixiert wird, und dann erst die Wirksubstanz
angekoppelt wird, oder
d) zuerst das "spacer"-Molekül an die Wirksubstanz
fixiert wird, und dann die so vorbereitete Wirksubstanz über die "spacer" auf der
Matrixoberfläche gebunden wird, oder e) spacer'1-Moleküle in einem Reaktionsschritt
zwischen Matrixoberfläche und Wirksubstanz eingebunden werden.
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Besitzt die Oberfläche der antithrombogen auszurüstenden Matrix noch
keine reaktionsfähigen,zur Fixierung der "spacer"-Moleküle bzw. -Reste erforderlichen
funktionellen Gruppen, insbesondere z*B.
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olefinische Doppelbindungen aromatische Gruppierungen heteroaromatische
Gruppierungen Oxirane Hydroxyl-Halogenid-Isocyanat-Nitril-Amino-Aldehyd-Acetal-Keto-Carboxyl-Ester-Carbonsäurehalogenid-Carbonsäureamid
Sulfonsäurehalogenidgruppen etc.
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so kann durch entsprechende Vorbehandlung die Matrixoberfläche in
der gewünschten Ausführung nach üblichen chemischen Methoden aktiviert werden.
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Als Beispiele seien aufgeführt: a) Polyolefine und Polydiene durch
Oxidation verbleibender olefinischer Doppelbindungen, oder radikalisch induzierte
Pfropfreaktionen; b) PVC und Polyhalogenkohlenwasserstoffe durch partielle HX-Eliminierung
und anschließende Behandlung wie unter a); c) Polyacrylnitrile (PAN), Polyester,
Polyamide, Polyurethane, Polysulfone durch partielle alkalische oder saure Hydrolyse
und anschließende Modifizierung.
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Als "spacer"-Moleküle sind insbesondere Monomere, Dimere, Trimere
und Oligomere geeignet, die an zwei Enden in einer bestimmten Distanz funktionelle
Gruppen tragen, die zu einer Kopplung einerseits mit entsprechend ausgerüsteten
Matrixoberflächen befähigt sind und andererseits mit entsprechenden Gruppen an den
Wirksubstanzen zur Reaktion gebracht werden können.
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Beispiele sind z.B.: α,# - Dihalogenide α,# - Diisocyanate
α,# - Dinitrile α,# - Dicarbonsäuren ,4J - Dicarbonsäurehalogenide α,#
- Dicarbonsäureester - Cr - Dialdehyde α Ç - Diole α,# - Diamine # -
Amino-Carbonsäuren # - Hydroxy-Carbonsäuren
verkappte Dialdehyde
bzw.4i-Hydroxyaldehyde, die aus cyclischen Enoläthern bei geeigneter Reaktionsführung
entstehen; verkappte Disäuren und 4-Hydroxy- bzw.62-Aminosäuren aus cyclischen Estern
bzw. Säureamiden, Oligoethylen- und Propylenglykole, Oligoethylenimine, Mono-,Di,Tri
und Oligosaccharide, Mono-,Di,Tri- und Oligopeptide.
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Die Kettenglieder zwischen den beiden funktionellen Endgruppen in
oC - und W-Stellung können aliphatischer, alicyclischer oder aromatischer Art in
homologer oder auch heterologer Reihe sein. Durch Verwendung geeigneter Derivate
der "spacer" kann die Hydrophilie bzw.
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Hydrophobie in gewünschtem Maße beeinflußt werden.
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Beispiele Die Immobilisierung des Antikoagulanz Heparin kann beispielsweise
wie folgt durchgeführt werden: 1. 1 - 10 cm Cellulosefolie werden nach dem Wässern
in eine Mischung aus 1 N NaOH/Dioxan 4 : 1 - 1 : 10, vorzugsweise 1 : 1, gelegt.
Nach 15 Minuten erfolgt die Zugabe einer geeigneten Menge einer Heparinlösung, welche
30 - 500 IU Heparin/ml, vorzugsweise 250 - 320 IU/ml enthält. Unmittelbar anschließend
wird die Kopplungsreaktion durch Hinzupipettieren von 0,05 - 0,5 ml Butanglykoldiglycidyläther
pro Milliliter des Gesamtvolumens gestartet und der Ansatz für 10 - 120 Minuten,
vorzugsweise 45 Minuten, bei einer Temperatur von 4 - 600C, vorzugsweise 250C, unter
Schütteln inkubiert.
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Zur Entfernung überschüssiger Reagentien wird die modifizierte Cellulosefolie
nacheinander mit 1 N NaOH/Dioxan 1 : 1, bidestilliertem Wasser und isotoner Kochsalzlösung
gewaschen. Die Bestimmung der auf der Oberfläche fixierten Heparinmenge mit biologischer
Aktivität wurde nach TEIEN et al durchgeführt und erbrachte Werte zwischen 100 -
1000 IU pro Quadratmeter Cellulosefolie.
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(TEIEN A,N,, LIE M. and ABILDGAARD U*; Assay of heparin in plasma
using a chromogenic substrate, Thromb.Res.8 (1976) p.413.), (TEIEN A*N*,LIE M.:
Evaluation of an amidolytic method: Increased sensitivity by adding purified antithrombin
III.
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Thrombosis Research 10 (1977) p 399).
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2. Cellulosefolien werden nach dem Wässern mit Perjodsäure (125 mg
in 25 ml Acetatpuffer, pH = 3 - 4) für 5 - 30 Min.
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bei 0 bis 400C oxidiert. Nach Spülen mit Wasser und einem geeigneten
Reduktionsmittel wird die Folie bei dem pH, der dem pH5 des eingesetzten Amins entspricht,
mit einem 0t,-Diamin versetzt. Überschüssige Reagenzien werden mit bidestilliertem
Wasser abgespült. Die so präparierte Folie wird einer Heparinlösung (10.000 IU/ml),
deren pH auf 4 bis 4,5 ist, ausgesetzt; zur Kopplung des Heparins wird ein wasserlösliches
Carbodiimid zugesetzt. Nach 5 bis 60 Min. Reaktionszeit bei Raumtemperatur erfolgt
die Entnahme der Folie sowie ein Waschvorgang.
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Die Heparinaktivitätsbestimmung ergab Werte im Bereich 2 von 100
bis 1200 IU Heparin / m Folie.
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3. 1 - 10 cm einer 2-Aminoäthylgruppenhaltigen Cellulose werden mit
einer Heparinlösung (10.000 IU/ml), deren pH auf 4 bis 4,5 eingestellt ist, sowie
mit einem wasserlöslichen, zur Kopplung geeigneten Carbodiimid versetzt.
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Nach Abspülen der überschüssigen Reagenzien wurde die Heparinaktivität
bestimmt. Je nach Reaktionsdauer, Zeit, Temperatur und eingesetzten Reagenzienmengen
wurden Heparinaktivitäten von 90 bis 1300 IU/m² Folie gefunden