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Die vorliegende Erfindung betrifft
biokompatible Membranen mit funktionalen Gruppen, die verwendet
werden, um bioaktive Moleküle
auf den Membranen zu immobilisieren, und ein Verfahren zur Herstellung
solcher Membranen.
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In den vergangenen Jahren ist bei
der Entwicklung medizinischer Hilfsmittel zur Behandlung verschiedener
Erkrankungen und bei der Entwicklung permanenter Implantate zum
Ersetzen von Teilen des menschlichen Körpers großer Fortschritt gemacht worden.
Bei ihrer Verwendung sind viele dieser Hilfsmittel oder Implantate
für kurze
Zeiträume oder
permanent mit Blut in Kontakt.
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Oxygenatoren, die in Herz-Lungen-Maschinen
verwendet werden, und Hämofiltrationsmodule, die
bei der Blutreinigung von Patienten mit Niereninsuffizienz verwendet
werden, sind Beispiele für
membranenhaltige Hilfsmittel, die in der extrakorporalen Blutzirkulation
verwendet werden. Diese Hilfsmittel haben große Oberflächenbereiche, und wenn sie verwendet
werden ist die Exposition gegenüber
dem Blut substantiell. Die Notwendigkeit für blutkompatible Oberflächenbehandlungen
dieser Hilfsmittel ist daher offensichtlich. Weitere Beispiele von
membranhaltigen Hilfsmitteln sind invasive Blutgassensoren und künstliche
Organe, wie beispielsweise künstliche Pankreata
und künstliche
Haut.
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Es ist bekannt, daß chemische
Entitäten
mit biologischer Wirkung auf die Oberfläche eines Substrats gebunden
werden können,
um die Kompatibilität des
Substrats mit dem Blut zu verbessern, indem funktionale Gruppen
auf der Substratoberfläche durch
Oberflächenmodifizierungen
zur Verfügung
gestellt werden. Solche funktionalen Gruppen auf der Substratoberfläche können für eine ionische
Interaktion geladen werden oder kovalent mit funktionalen Gruppen
der chemischen Entität
reagieren.
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Wenn das Blut künstlichen Oberflächen ausgesetzt
ist, werden einige der körpereigenen
Abwehrsysteme aktiviert, wie beispielsweise die Koagulierungs-,
Komplement- und Immunsysteme. von diesen Systemen wird angenommen,
daß sie über gemeinsame
Zwischenstoffe miteinander in Beziehung sind. Um eine Aktivierung
des Koagulationssystems bei einer Kurzzeitexposition des fremden
Materials gegenüber
Blut zu vermeiden, kann Heparin systemisch verabreicht werden. Es
wird routinemäßig verwendet,
hat aber mehrere Nebenwirkungen, wie beispielsweise Blutungen, Thrombozytopenie
oder Osteoporose. Manchmal ist es nur teilweise wirksam, was zu
einer Fibrinablagerung auf dem Fremdmaterial führt, was dann zu einer fehlerhaften
Funktion des Hilfsmittels führt.
Patienten, die blutkontaktierende permanente Implantate erhalten,
hängen
häufig von
lebenslangen Antikoagulationstherapien ab, die häufige Laborüberwachungen notwendig machen.
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Es wurden viele Versuche unternommen,
um die Oberflächen
von Fremdmaterialien zu modifizieren, um sie biokompatibler zu machen.
von einer negativ geladenen Oberfläche wird angenommen, daß sie seltener
eine Plättchenadhäsion verursacht
aber andererseits die Koagulationskontaktaktivierung erhöht. Eine
gegenteilige Wirkung wurde bei positiv geladenen Oberflächen bemerkt.
Synthetische Hämofilter-Membranmaterialien
werden im Hinblick auf die Aktivierung des Komplementsystems als
biokompatibler als auf Cellulose basierende Membranen angesehen.
Andererseits sind die synthetischen Membranen häufig hydrophob, haben eine
starke Proteinadsorption und manchmal schlechtere Filtriereigenschaften.
Hydrophobe Eigenschaften sind auch dafür bekannt, daß sie Plättchenadhäsion fördern.
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Biologisch aktive Substratoberflächen, d.
h. Oberflächen
mit immobilisierten Verbindungen, die aktiv auf molekularer Ebene
am Prozeß des
Verhinderns der Aktivierung der Abwehrsysteme beim Kontakt zwischen
Fremdmaterialien und Körperflüssigkeiten
oder -gewebe teilnehmen, können
durch Endpunktanheftung von Heparin an der Hilfsvorrichtung oder
die Implantatmaterialoberflächen
hergestellt werden, wie in
EP
86186 B1 beschrieben wird. Diese Heparin-modifizierten
Oberflächen
zeigen eine stark verbesserte Biokompatibilität sowohl im Hinblick auf die
Koagulation wie auch die Komplement-Aktivierung.
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Hilfsmittel- oder Implantatmaterialoberflächen haben
im allgemeinen eine niedrige Reaktivität, und die funktionalen Gruppen
müssen
zum Binden der bioaktiven Reagenzien in diese Oberflächen eingefügt werden.
Dies kann durch das Beschichten der Materialoberflächen mit
Verbindungen erreicht werden, die die geeigneten funktionalen Gruppen
enthalten (
EP 86187B2 ),
durch chemisches Aufpfropfen reaktiver Verbindungen (D. E. Bergbreiter
in Chemically Modified Surfaces, H. A. Mottola und J. R. Steinmetz
(Hrg.), 1992 Elsevier Science publishers, S. 133–154), durch eine Plasmabehandlung
mit reaktiven Monomeren oder Gasen (H. Yasuda, Plasma Polymerization,
Academic Press 1985) oder in einigen Fällen durch chemische Reaktionen
der Hilfs mittelmaterialien, um funktionale Gruppen einzuschleusen (D.
E. Bergbreiter in Chemically Modified Surfaces, H. A. Mottola und
J. R. Steinmetz (Hrg.), 1992 Elsevier Science publishers, S. 133–154). An
funktionale Gruppen, die durch irgendeines dieser Verfahren erzeugt
wurden, können
mit konventionellen chemischen Verfahren biologisch aktive Reagenzien
angehängt
werden, um ionisch oder kovalent gebundene biologisch wirksame Verbindungen
auf den Materialoberflächen
zur Verfügung
zu stellen.
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Jedes Verfahren zur Vorbehandlung
einer Oberfläche
zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen muß die folgenden
Kriterien erfüllen:
- – Die
Vorbehandlung muß funktionale
Gruppen erzeugen, die in dem unterliegenden Material gut verankert
sind, so daß die
Verbindungen, die funktionale Gruppen enthalten, bei der Verwendung
nicht in den Blutfluß auslecken.
- – Die
funktionalen Gruppen müssen
in ausreichend großen
Mengen vorhanden sein, um eine Bindung einer adäquaten Anzahl an bioaktiven Molekülen zu erlauben.
- – Die
funktionalen Gruppen müssen
auf der Materialoberfläche
exponiert sein, um für
die Bindung bioaktiver Verbindungen zur Verfügung zu stehen.
- – Die
Eigenschaften des Bulkmaterials sollten nicht ungünstig verändert sein.
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Die meisten Verfahren der Herstellung
funktionaler Gruppen zur Immobilisierung bioaktiver Verbindungen
haben im Hinblick auf die oben genannten Kriterien Nachteile. Die
Beschichtung der Materialoberflächen
mit funktionalen Verbindungen führt
häufig
zu Beschichtung mit einer schlechten Adhärenz an der Substratoberfläche. Eine
Plasmabehandlung oder eine Aktivierung durch chemisches Pfropfen
ist bei Hilfsmitteln mit einigen Gestaltungsformen, z. B. auf der
Innenseite der Hohlfasern, nicht möglich. Eine direkte chemische
Behandlung einer Materialoberfläche
macht häufig
rigorose chemische Reaktionsbedingungen notwendig und ist daher
auf einige wenige Materialien begrenzt. Nicht alle Vorbehandlungsverfahren
erzeugen ausreichende Mengen funktionaler Gruppen und infolgedessen
ist die Menge der immobilisierten bioaktiven Verbindung nicht ausreichend,
um eine Biokompatibilität
zu erfüllen.
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Bei der Behandlung eines Hilfsmittels,
das eine Membran inkorporiert, müssen
die physikalischen Eigenschaften des Membranmaterials, wie beispielsweise
die Porengröße, die
Wasserausscheidung und das Durchtreten von Molekülen einer bestimmten Größe, in Betracht
gezogen werden. Einige der Vorbehandlungsverfahren, die oben beschrieben wurden,
würden
die physikalischen Eigenschaften einer Membran ändern oder die Poren dieser
Membran sogar verstopfen.
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Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der
oben erwähnten
Nachteile des Standes der Technik ausgemacht.
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Eine Polymermembran kann durch eine
Phasenumkehrtechnik durch Präzipitieren
einer Lösung des
membranbildenden Polymers in einem Koagulationsbad eines Nichtlösungsmittels,
normalerweise Wasser, hergestellt werden (W. Pusch und A. Walch, Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 21 (1982) S. 660–685).
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Eine Gußlösung zur Membranbildung wird aus
einer Lösung
eines membranbildenden Polymers, z. B. Cellulose, Celluloseacetat
oder einem anderen Cellulosederivat, Polysulfon, Polyacrylnitril oder
jedem anderen membranbildenden Material, in einem Lösungsmittel
oder einem Gemisch aus Lösungsmitteln
zusammengesetzt. Als Lösungsmittel können Dimethylacetamid,
Dimethylsulfoxid, Aceton, Dimethylformamid, Formamid, N-Methylpyrrolidon, Cyclohexanon,
organische und anorganische Säuren oder
Gemische daraus ebenso wie andere Lösungsmittel verwendet werden.
Es ist auch möglich,
eine geringe Menge eines Nichtslösungsmittels
zu dem Lösungsmittel
oder dem Gemisch aus Lösungsmitteln
für das
membranbildende Polymer zuzugeben, vorausgesetzt, daß das Gesamtgemisch
ein Lösungsmittel
für das
Polymer bleibt.
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Ein Koagulationsbad, das ein Nichtlösungsmittel
für das
membranbildende Polymer enthält,
koaguliert die Gußlösung und
bildet die Membran. Das Koagulationsbad kann ein Gemisch eines Nichtslösungsmittel
und einer geringen Menge eines Lösungsmittels
sein.
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Eine Hohlfasermembran kann durch
dieses Verfahren unter Verwendung einer Spinndüse, die in Form einer Röhre in einer Öffnung angeordnet
ist, gebildet werden. Aus den Spinndüsen werden zwei Ströme extrudiert,
wobei ein Strom, der aus der Drücklösung besteht,
die das membranbildende Polymer umfaßt, durch die ringförmige Öffnung extrudiert
wird, und der zweite Strom aus einer Kernflüssigkeit besteht, die durch
die mittlere Röhre
extrudiert wird. Die Kernflüssigkeit
und das Koagulationsbad enthalten ein Nichtlösungsmittel für das membranbildende
Polymer und beide nehmen an der Koagulation der Drücklösung und
der Bildung der Membran teil (H. I. Mahon und B. J. Lipps, Encyclop.
Polym. Sci. Technology, 15 (1971), S. 258–272). Die Kernflüssigkeit
kann auch ein Öl
sein, das mit der Polymerlösung und
dem Koagulationsbad nicht mischbar und ihnen gegenüber Reaktionsträger ist,
z. B. Isopropylmyristat.
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In EP-A-0090483 und EP-B-87228 werden ein
Verfahren zur Oberflächenmodifizierung
von hautfreien ("skinless"), mikroporösen Polyamidmembranen
beschrieben, wobei ein Oberfächen-modifizierendes
Polymer mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20.000 mit funktionalen
Gruppen (Amino, Hydroxyl, Carboxylsulfonsäuren und andere) zu der Gußlösung in
Anteilen um 1%, bezogen auf das Gewicht des Polyamidharzes, hinzugegeben
wird. Wenn die Membran in einem Koagulationsbad präzipitiert
wird, das ein Nichtslösungsmittel
für Polyamid ist,
wird das Oberflächen-modifizierende
Polymer ein integraler Bestandteil der Membran, das hauptsächlich auf
der Oberfläche
der Membran exponiert ist. Das Oberflächen-modifizierende Polymer
erhöht
die Hydrophilität
der Membran und kann der Membran gegenüber einem pH-Profil ein ungewöhnliches
Zeta-Potential verleihen. Diese Eigenschaften erlauben die selektive
Entfernung von Partikeln, d. h. negative Partikel können durch
eine positiv geladene Membran gemäß diesen Patent entfernt werden.
Weitere nützliche
Eigenschaften dieser Membranen sind die Fähigkeit, gelöste Metallkontaminationen
durch Komplexbildung zu entfernen, z. B. aus Flüssigkeit zur Gewinnung kostbarer
Metalle in der Metallisierungsindustrie oder nach einer weiteren
Modifizierung der modifizierten Membran, um eine Affinität für bestimmte
biologische Verbindungen beim Verarbeiten biologischer oder biochemischer
Präparate
zu verleihen, wie beispielsweise bei der Entfernung oder Isolierung
biologischer oder pharmazeutischer Materialien zur Herstellung von
Substanzen in der pharmazeutischen Industrie. Weitere Anwendungen
dieser Membranen sind die Immobilisierung von Enzymen zur Nahrungsmittelverarbeitung
oder Herstellung von Pharmazeutika. Die immobilisierten Enzyme bieten
günstige
Wege zum Trennen des Enzyms vom Produkt nach der Reaktion, wie auch
ein Mittel zur gleichzeitigen Entfernung bestimmter Kontaminanten,
wie beispielsweise Zelltrümmern,
die eine gewöhnliche
Kontaminante bei kommerziellen Enzympräparaten ist.
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In EP-A-0090483 und EP-B-087228 sind
weder medizinische Anwendungen, wie beispielsweise die Verwendung
in medizinischen Hilfsmitteln oder Implantaten, noch verbesserte
Biokompatibilität
der Oberflächenmodifizierten
Membranen erwähnt.
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EP-A-0497185 offenbart ein Verfahren
zum Herstellen einer Polysulfonmembran, die Proteine nicht adsorbiert,
durch ein Phasenumkehrungsverfahren, bei dem die Gußlösung ein
Polyurethanpräpolymer
mit hydrophilem Isocyanat als Abschußkappen zusätzlich zum Polysulfonpolymer
enthält,
sowie auch eines oder mehrere Nichtlösungsmittel für das Polysulfon
wie auch eines oder mehrere Lösungsmittel
dafür.
Das Koagulationsbad enthält
einen Katalysator zum Beschleunigen der Polymerisierung des Präpolymers.
Während
des Membranbildungsprozesses leckt das Präpolymer zusammen mit dem Nichtlösungsmittel
der Gußlösung in
die Koagulationslösung
fast vollständig
aus der Membran heraus. Wenn es die Membranoberfläche erreicht,
wird eine geringe Menge des Präpolymers
polymerisiert, um ein interpenetrierendes Polymernetzwerk zu bilden, welches
eine hydrophile, Proteine nicht adsorbierende Membranoberfläche zur
Verfügung
stellt. Die Oberflächenmodifizierten
Membranen haben auch einen großen
Oberflächenbereich,
der sie für
die Immobilisierung von Enzymen oder anderen reaktiven Mitteln geeignet
macht.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Oberflächen-modifiziertes
Substratmaterial, wie im vorliegenden Anspruch 1 definiert wird,
zur Verwendung beim Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder -gewebe, wobei
eine bioaktive Verbindung, die in der Lage ist mit den Abwehrsystemen
des Körpers
zu interagieren, auf dem Substrat immobilisiert ist, indem es kovalent
an funktionale Gruppen, die auf der Oberfläche des Substrats zur Verfügung gestellt
werden, gebunden wird, um die Aktivierung dieser Abwehrsysteme oder
inaktivierender Verbindungen, die durch solche Abwehrsysteme erzeugt
werden, zu verhindern. Erfindungsgemäß ist das Substrat eine Membran,
die mindestens ein membranbildendes Polymer umfaßt, und die funktionalen Gruppen
werden durch das Inkorporieren von mindestens einer Oberflächenmodifizierenden
Verbindung mit funktionalen Gruppen in das membranbildende Polymermaterial
beim Bilden der Membran daraus zur Verfügung gestellt.
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Die vorliegende Erfindung stellt
auch ein Verfahren zum Herstellen einer Oberflächen-modifizierenden Membran
mit einer antithrombotischen Verbindung, die an die funktionalen
Gruppen der Membranoberfläche
gebunden sind, zur Verfügung,
umfassend die Schritte:
- (a) Herstellen einer
Membran aus einer Gußlösung, umfassend
ein membranbildendes Polymer und
- (b) Präzipitieren
des membranbildenden Polymers in einem Koagulationsbad, wobei
- (c) funktionale Gruppen, an die antithrombotische Verbindungen
gebunden werden können,
in der Oberfläche
der Membran inkorporiert werden, indem ein Oberflächen-modifizierendes
Polymer hinzugegeben wird, das diese funktionalen Gruppen entweder
der Gußlösung oder
dem Koagulationsbad verleiht, wobei das Oberflächen-modifizierende Polymer
ausgewählt
ist aus Polyaminen, Polyanhydriden, Polycarbonsäuren, Polyisocyanaten, Polyepoxiden,
Polycarbodiimiden, Polyalkoholen und Polysacchariden, und
- (d) anschließendes
Koppeln einer antithrombotischen Verbindung, die in der Lage ist
mit den körpereigenen
Abwehrsystemen zu interagieren, an die funktionalen Gruppen auf
der Oberfläche
der Membran, um die Aktivierung dieser Abwehrsysteme zu verhindern,
oder um Verbindungen, die durch solche Abwehrsysteme erzeugt werden,
zu inaktivieren.
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Wie oben erwähnt wurde, können die
Oberflächen-modifizierten
Membranen dieser Erfindung durch alternative Verfahren hergestellt
werden, die nachfolgend als Verfahren A und Verfahren B bezeichnet
werden.
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Verfahren
A
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- (i) Herstellung einer Gußlösung, die das membranbildende
Polymer enthält;
und
- (ii) Präzipitieren
der Membran aus der Gußlösung in
ein Koagulationsbad, das die Oberflächen-modifizierende Verbindung
enthält.
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Verfahren
B
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- (i) Herstellung einer Gußlösung, die das membranbildende
Polymer und die Oberflächen-modifizierende
Verbindung enthält;
und
- (ii) Präzipitieren
der Membran aus der Gußlösung in
ein Koagulationsbad.
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Bevorzugte Ausführungsformen dieser zwei Verfahren
werden nun in genauerem Detail beschrieben.
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Verfahren
A
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Eine Gußlösung wird durch das Lösen des membranbildenden
Polymers in einem Lösungsmittel hergestellt,
z. B. Cellulose, Celluloseacetat, Polysulfon, sulfoniertem Polysulfon,
Polyamid, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat oder anderen membranbildenden
Polymeren. Das Lösungsmittel,
das geeignet ist, ist Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Aceton, Dimethylformamid,
Formamid und eine organische oder anorganische Säure oder Gemische daraus. Es ist
auch möglich,
einen geringen Anteil eines Nichtlösungsmittels hinzuzugeben,
vorausgesetzt, daß das gesamte
System ein Lösungsmittel
für das
Polymer bleibt. Die Konzentration des membranbildenden Polymers
liegt bevorzugt zwischen 15 und 30%, mehr bevorzugt zwischen 20
und 28%, die am meisten bevorzugte Konzentration ist 25%.
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Die Membran wird auf der Gußlösung in
einem Nichtlösungsmittel
präzipitiert,
typischerweise aus einem hydrophilen Lösungsmittel, bevorzugt aus Wasser,
möglicherweise
mit einer geringen Menge eines hinzugegebenen Lösungsmittels, für das membranbildende
Polymer. Die Oberflächenmodifizierende
Verbindung wird in diesem Gemisch aus Nichtlösungsmittel und Lösungsmittel
bei einer Konzentration gelöst,
die typischerweise zwischen 0,5 und 10%, bevorzugt zwischen 0,5
und 4%, mehr bevorzugt bei 1% liegt. Die Oberflächen-modifizierende Verbindung wird
durch Präzipitierung
auf die Oberfläche
der Membran inkorporiert. Die Oberflächen-modifizierende Verbindung
ist bevorzugt aus organischen Verbindungen, die funktionale Gruppen
wie beispielsweise Amino, Hydroxyl, Carbonsäure, Carbonsäureanhydrid,
Isocyanat, Epoxy, Carbodiimid, Sulfonsäure tragen, oder anderen reaktiven
funktionalen Gruppen ausgewählt.
Die funktionalen Verbindungen können Polymere
sein, z. B. Polyamine wie Polyethylenimin (PEI) oder Polylysin,
Polycarbonsäuren
wie Polyacrylsäure,
Polyalkohole wie Polyvinylalkohol oder Polysaccharide, Polyanhydride,
Polyisocyanate, Polyepoxide, Polycarbodiimid oder andere funktionale
Polymere. Die funktionalen Verbindungen können auch niedermolekulargewichtige
Verbindungen sein, die durch eine Affinität, die nicht eine Verknüpfung ist (kovalent,
ionisch oder Van Der Waals-Bindungen), auf der Oberfläche der
Membran haftet.
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Typischerweise ist die Oberflächen-modifizierende
Verbindung ein Polymeramin mit einem Molekulargewicht von über 25.000,
bevorzugt ein Polyethylenimin.
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Die präzipitierte Oberflächen-modifizierte Membran
wird vorsichtig mit Wasser gespült
und dann mit einer bioaktiven Verbindung und einem Kupplungsmittel
umgesetzt.
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Das bioaktive Reagens kann durch
konventionelle Kupplungstechniken an die funktionalen Gruppen der
Membranoberflächen
gekoppelt werden. Beispielsweise können an eine Membranoberfläche, die
Aminogruppen enthält,
aminhaltige Verbindungen, wie beispielsweise Proteine, zum Beispiel
durch ein Dialdehyd, wie beispielsweise Glutardialdehyd, gekoppelt
werden. Carbonsäureliganden
können nach
der Aktivierung mit einem wasserlöslichen Carbodiimid, z. B.
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC),
gekoppelt werden. Hydroxylverbindungen können an eine aminierte Oberfläche, die
durch Bisepoxirane oder ein Carbonyldiimidazol aktiviert worden
ist, gekoppelt werden. Eine Oberfläche, die Carbonsäuregruppen
enthält,
kann zum Koppeln von Aminogruppen oder Hydroxylgruppen durch Behandlung
mit EDV aktiviert werden. Anhydride auf einer Membranoberfläche können durch eine
Behandlung mit Diaminen in Aminogruppen umgewandelt werden oder
zu Carbonsäuregruppen
hydrolysiert werden. An Isocyanate, Epoxide oder Carbodiimide auf
der Oberfläche
können
bioaktive Verbindungen, die Amino- oder Hydroxygruppen enthalten, gekoppelt
werden.
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Eine bioaktive Verbindung auf einer
Membranoberfläche
verleiht der Oberfläche
durch das Interagieren mit den Abwehrsystemen des Körpers eine Biokompatibilität, um die
Aktivierung der Abwehrsysteme zu verhindern oder um Verbindungen zu
inaktivieren, die durch solche Abwehrsysteme erzeugt wurden. Die
bioaktive Verbindung, die an die Oberfläche gekoppelt werden soll,
können
Glycosaminoglycane, typischerweise Heparin, andere Antikoagulationsmittel
wie Hirudin, Prostaglandine, Antithrombine oder thrombolytische
oder fibrinolytische Mittel wie Streptokinase, Urokinase oder Gewebeplasminogenaktivator
(tPA) oder andere Verbindungen oder Gemische daraus, die durch irgendeinen Mechanismus
die Abwehrsysteme des lebenden Körpers
aktiv beeinflussen, sein. Die Biokompatibilität von Oberflächen-immobilisiertem
Heparin ist gut dokumentiert, und Heparin ist deswegen als bioaktive
Verbindung bevorzugt.
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Heparin kann auf eine aminierte Oberfläche durch
Multipunkt- oder Endpunktanheftung gekoppelt werden. Die Multipunktanheftung
wird durch das Verwenden irgendeines der oben beschriebenen Reagenzien
zum Koppeln der freien Aminogruppen, Carbonsäuregruppen oder Hydroxylgruppen
des Heparins an eine aminierte Oberfläche erreicht.
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Heparin, das durch Endpunktanheftung
mit beibehaltener biologischer Wirkung des Heparinsmoleküls gekoppelt
wird, wird bevorzugt, um die Membran biokompatibel zu machen. Die
Endpunktanheftung von Heparin wird durch das Koppeln teilweise degradierten
Heparins (Salpetersäure),
welches endständige
freie Aldehydgruppen enthält,
erreicht. Mit Polyethylenimin als Oberflächenmodifizierendes Mittel
ist das Kopplungsmittel ein Reduktionsmittel, das in der Lage ist,
die Schiffschen Basen zu reduzieren, die zwischen den endständigen Aldehydgruppen
des modifizierten Heparins und den Aminogruppen der Membranoberfläche gebildet
werden. Bevorzugt ist dieses Reduktionsmittel Natriumcyanoborhydrid (EP-86182
B2). Die erhaltene biokompatible (Heparin gekoppelte) Membran wird
vorsichtig gespült,
um nicht gekoppeltes Heparin zu entfernen.
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Verfahren
H
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Die Oberflächen-modifizierte Verbindung wird
in einer Konzentration, die zwischen 0,5 und 10% variiert, mehr
bevorzugt zwischen 0,5 und 4% und am meisten bevorzugt bei 1%, zur
Gußlösung hinzugegeben,
welche wie in Verfahren A hergestellt wird. Die Oberflächen-modifizierte
Verbindung wird aus der Gruppe ausgewählt, die in Verfahren A erwähnt wurde,
aber mit der Einschränkung,
daß sie
in der Gußlösung löslich sein
muß. Die
Membran wird in einem Nichtlösungsmittel,
wie oben beschrieben wurde, präzipitiert.
Auch bei diesem Verfahren werden die Oberflächen-modifizierenden Verbindungen auf
die Oberfläche
der Membran als Folge der eher hydrophilen Art der Oberflächenmodifizierenden
Verbindung dirigiert.
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Ein bioaktives Mittel wird dann auf
die Oberflächen-modifizierte
Membran, wie in Verfahren A beschrieben, gekoppelt.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zum Herstellen biokompatibler Membranen zur Verwendung
bei der Hämofiltration
und anderen Blutreinigungsbehandlungen zur Verfügung. Durch das Einschließen funktionaler
Verbindungen, bevorzugt polymerer Amine, in die Membran während der
Herstellung dieser Membranen und durch das Immobilisieren von Heparin
mit Hilfe von Aminogruppen werden Membranen mit verbesserter Blutkompatibilität, verglichen
mit den entsprechenden Membranen ohne immobilisiertes Heparin, erhalten.
Wenn die funktionalen Verbindungen während der Herstellung der Membranen
inkorporiert werden und nicht bei einem Reaktionsschritt der darauf
folgt, sind die physikalischen Eigenschaften der Membran, wie beispielsweise
die Porengröße, die
Wasserausscheidung und das Durchlassen von Molekülen einer bestimmten Größe, leicht
kontrollierbar. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung
ist, daß das
Koppeln von Heparin in einem Schritt durchgeführt werden kann, da funktionale
Gruppen auf der Membranoberfläche
vorhanden sind.
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Beispiele
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Die folgenden nicht begrenzenden
Beispiele stellen die Erfindung weiter dar.
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Beispiel 1
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Herstellung
aminierter Celluloseacetatmembranen gemäß Verfahren A
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Eine Gußlösung wurde durch das Lösen von 25
g Celluloseacetat (Eastman CA-398-10 USP grade) in 75 g eines Gemisches
aus Dimethylformamid und Formamid in einem Verhältnis von 5 : 1 hergestellt.
1 cm3 der Gußzusammensetzung wurde auf
einer sauberen Glasplatte ausgebreitet und dann in ein Koagulationsbad
getaucht, das eine 1%ige wäßrige Lösung aus
Polymin SN (BASF) war. Die aminierten Membranen werden für einige
Minuten zum Absetzen in dem Bad gelassen, ausgiebig mit Wasser gewaschen,
in einer 15%igen Glycerollösung
in Wasser für
1 Stunde eingetaucht und bei Umgebungsbedingungen getrocknet.
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Heparinisierung
der aminierten Celluloseacetatmembranen
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Heparin wurde auf die flachen aminierten Membranschichten,
die wie beschrieben hergestellt wurden, gekoppelt, indem die Membranen
in einer Lösung
von teilweise durch Salpetersäure
degradiertem Heparin (25 mg), welches im wesentlichen wie in EP-86186
beschrieben hergestellt wurde, in Wasser, das Natriumcyanoborhydrid
enthält
(2,5 mg) und Natriumchlorid (880 mg) bei pH 3,9 und 50°C über 2 Stunden
belassen wurden. Die heparinisierte Membran wurde ausgiebig mit
Wasser, Boratpuffer pH 9 und Wasser gespült, um nicht kovalent gebundenes Heparin
zu entfernen.
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Die Menge Oberflächen-immobilisierten Heparins,
gemessen durch das Verfahren, das von Riesenfeld und Roden, Anal.
Biochem. 188 (1990), S. 383–389
beschrieben wurde, und das hinsichtlich der Hintergrundwerte korrigiert
wurde, betrug 2,8 μg/cm2.
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Vergleichsbeispiel 1
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Membranen aus Celluloseacetat wurden
wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, aber die Zugabe von PEI
oder anderen funktionalen Polymeren wurde weggelassen. Diese Membranen
wurden wie oben beschrieben mit Heparin behandelt. Es konnte kein
Oberflächen-gebundenes
Heparin nachgewiesen werden.
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Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel
2
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Herstellung
aminierter Polysulfonmembranen gemäß Verfahren A
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20 g Polysulfon (Udel polysulfone
P3500 Natural 11, AMOCO, Molekulargewicht 45.000) wurden in BO g
eines Gemisches aus Dimethylacetamid und Polyvinylpyrrolidon in
einem Verhältnis
von 6 : 2 gelöst
und wie in Beispiel 1 verarbeitet. Die Heparinisierung der Membran
gemäß Beispiel
1 ergab eine heparinisierte Membran mit einer Oberflächendichte von
1,0 μg Heparin/cm2. Die Membranen aus Polysulfon wurden wie
oben hergestellt, aber die Zugabe von PEI oder anderen funktionalen
Polymeren wurde weggelassen. Diese Membranen wurden wie oben beschrieben
mit Heparin behandelt. Es wurde kein Oberflächen-gebundenes Heparin nachgewiesen.
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Beispiel 3
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Herstellung aminierter
Celluloseacetatmembranen gemäß Verfahren
B
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Beispiel 1 wurde wiederholt, aber
die Gußlösung, Polymin
P (BASF, 1%), wurde hinzugegeben und das Koagulationsbad war Wasser.
Die Heparinisierung der Membran gemäß Beispiel 1 ergab eine heparinisierte
Membran mit einer Oberflächendichte von
8,8 μg Heparin/cm2.
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Beispiel 4
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Herstellung aminierter
Polysulfonmembranen gemäß Verfahren
B
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Beispiel 2 wurde wiederholt, aber
die Gußlösung, Polymin
P (1%), wurde hinzugegeben und das Koagulationsbad war Wasser. Die
Heparinisierung der Membran gemäß Beispiel
1 ergab eine heparinisierte Membran mit einer Oberflächendichte
von 2,9 μg
Heparin/cm2.
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Die Beispiele 1 bis 4 zeigen, daß durch
das Praktizieren dieser Erfindung Aminogruppen zum Koppeln einer
wesentlichen Menge an Heparin auf den Oberflächen der Membranen zur Verfügung gestellt
werden.
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Beispiel 5
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Leck-Test
heparinisierter Membranen
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Die heparinisierten Membranen der
Beispiele 3 und 4 wurden mit einer Albuminlösung über 24 Stunden behandelt, gut
mit Wasser gespült
und auf Heparin untersucht. Der Heparingehalt war 7,6 bzw. 2,8 μg/cm2, was eine minimale oder überhaupt
keine Ausleckung des immobilisierten Heparins anzeigte.
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Beispiel 6
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Herstellung von Celluloseacetatmembranen
enthaltend Anhydridogruppen gemäß Verfahren
B
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Beispiel 1 wurde wiederholt, aber
die Gußlösung enthielt
Polymaleinanhydrid (1%, Polysciences Inc.). Das Koagulationsbad
war Wasser, welches 1,3-Diaminopropan (1% G/G) enthielt. Die Heparinisierung
der Membran gemäß Beispiel
1 ergab eine heparinisierte Membran mit einer Oberflächendichte von
1,9 μg Heparin/cm2.
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Beispiel 7
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Herstellung aminierter
Celluloseacetat-Hohlfasermembranen gemäß Verfahren A
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Eine Spinnlösung wurde durch das Lösen von
25 g Celluloseacetat in 75 g eines Gemisches aus Dimethylformamid
und Formamid in einem Verhältnis
von 5 : 1 hergestellt. Die Spinnlösung wurde bei einer Rate von
4 cm3/min in die ringförmige Öffnung einer Düse (innerer
Durchmesser des Rings 0,3 mm, äußerer Durchmesser
des Rings 0,5 mm) injiziert. Die Düse wurde 2 cm über dem
Koagulationsbad (Wasser) plaziert. Durch die Röhre, die in der Mitte der Öffnung positioniert
war (äußerer Durchmesser
des Röhrchens
0,3 mm, innerer Durchmesser des Röhrchens 0,15 mm), wurde die
Kernflüssigkeit,
die eine 1%ige wäßrige Lösung von
Polymin SN war, hindurchgepumpt. Die austretende Hohlfaser bewegte
sich bei einer Rate von 9 m/min durch das Koagulationsbad; vom Ausfluß des Koagulationsbades
aus wurde die Hohlfaser in das Waschbad geleitet und danach wurde
sie auf eine Spule aufgewickelt, die in einem zweiten Waschbad rotierte.
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Die Hohlfasern wurden in Bündel geschnitten,
in eine 10% Lösung
Glycerol über
mehrere Stunden eingetaucht und dann getrocknet und in Plastikbehältnissen
einer solchen Art eingeschlossen, die für gewöhnlich für Dialyseeinheiten verwendet
werden, mit einer Länge
von 6 cm bzw. 1 cm im Durchmesser. Der Oberflächenbereich der Membran betrug
36 cm2.
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Heparinisierung
der aminierten Hohlfasern
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Eine Hohlfaser-Dialyseeinheit, die
wie beschrieben hergestellt wurde, wurde im wesentlichen gemäß Beispiel
1 heparinisiert. Um eine Heparinoberfläche an den Enden und den klebrigen
Oberflächen
zu erhalten, wurden sie mit Polymin SN in Wasser behandelt, wie
im wesentlichen in
EP
86187B2 beschrieben, bevor die Hämofiltrationseinheit zusammengebaut
und heparinisiert wurde. Die Menge des Oberflächen-gebundenen Heparins auf
den Fasern der heparinisierten Einheit betrug 3,6 μg/cm
2.
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Dieses Beispiel zeigt, daß Heparin
an Hohlfasern gekoppelt werden kann, die erfindungsgemäß hergestellt
werden.
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Beispiel 8
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Blutkompatibilitätstest der
heparinisierten Hohlfaser-Filtrationsmodule (Ratte)
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Heparinisierte Hohlfaser-Minimodule
wurden gemäß Beispiel
7 hergestellt, um Minifilter einer Größe zu erhalten, die für Experimente
in Ratten geeignet ist. Die Koagulationskompatibilität der Filter
wurde in einem Rattenmodell unter Verwendung eines Blutdruckabsenkens über dem
Filter als Maßstab
der Koagulation (Klumpenbildung) in dem Filter zu untersuchen. Sprague-Dawley-Ratten,
die 325–420
g wogen, wurden mit Inactin (Thiobarbiturat 120 mg/kg Körpergewicht)
anästhesiert.
Heparinisierte Polyethylenkatheter (im wesentlichen heparinisiert,
wie in
EP 86187B2 beschrieben)
wurden in die V. jugularis sin und A. carotis dx inseriert. Der
Katheter aus A. carotis dx. wurde mit einer peristaltischen Pumpe
(Ismatec Mölnlycke,
Schweden) verbunden, die so kalibriert war, daß sie einen Blutfluß von 2,0
ml/min erreichte. Eine Minifiltereinheit wurde mit der Pumpe verbunden
und mit dem Katheter, der in die V. jugularis sin inseriert war.
Die Filtratseite des Filtermoduls wurde mit Kochsalzlösung gefüllt und
die Filtratporti wurden verschlossen. Gould P 23 ID-Meßfühler für die Druckmessungen
wurden mit dem extrakorporalen Blutkreislauf direkt vor und nach
dem Filtermodul verbunden, und ein Druckabsinken über dem
Filter wurde kontinuierlich unter Verwendung eines Grass-Polygrad-Modells
7A überwacht.
Alle Blut kontaktierenden Röhren
und Verbindungsstücke
in dem Kreislauf waren im wesentlichen gemäß
EP 86187B2 heparinisiert. Es wurde kein Heparin
systemisch injiziert.
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Der Druckunterschied über die
Minifilter mit Fasern gemäß der Erfindung
war konstant bei 10 bis 30 mm Hg (was auf eine nicht signifikante Aktivierung der
Koagulation hinwies) über
50 bis 75 Minuten (typischerweise 60 Minuten), worauf ein abrupter
Anstieg des Drucks auf bis zu 400 mg Hg auftrat, was darauf hinwies,
daß eine
Klumpenbildung in dem Filtermodul auftrat, und das Experiment wurde
unterbrochen.
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Kontrollexperimente unter Verwendung
des oben beschriebenen Rattenmodells wurden mit Minifiltern durchgeführt, die
aus Hohlfasern gemacht wurden, die gemäß Beispiel 7 hergestellt wurden,
aber bei denen Polymin SN in der Kernflüssigkeit ausgeschlossen wurde
und das Heparinisierungsverfahren weggelassen wurde. Der Druckunterschied über den Filtern
fing sofort nach Beginn des Rattenexperiments an zu steigen, was
auf eine sofortige Aktivierung der Koagulation und Klumpenbildung
hinwies. Typische Werte waren 50, 100 und 150 bis 200 mm Hg nach
10, 15 bzw. 20 Minuten nach Beginn des Experiments. Nach 40 bis
50 Minuten betrug der Druckunterschied 400 mm Hg, was eine starke
Klumpenbildung in dem Filtermodul anzeigte.
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Nach dem Experiment wurden die Filtermodule
ausgebaut, mit Salzlösung
gespült
und untersucht. Die Klumpenbildung wurde hauptsächlich an den Eingangsöffnungen
aber auch bei den Ausgängen
sowohl der Kontrollfilter und der Filter mit den erfindungsgemäß hergestellten
Fasern beobachtet. Das Spülen
des Blutes in den Kontrollfasern mit Salzlösung konnte aufgrund der massiven
Klumpenbildung in den Fasern nicht durchgeführt werden. Das Blut in den
erfindungsgemäß hergestellten
Fasern wurde leicht mit Salzlösung
ausgespült,
und nach dem Spülen
gab es kein Anzeichen einer Klumpenbildung in den Fasern.
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Blutproben wurden direkt vor, 1,5
und 10 Minuten nach dem Beginn des Experiments entnommen und direkt
nach dem Experiment. Die zitrierten Blutproben wurden sofort zentrifugiert,
um plättchenarmes
Plasma zu erhalten, und wurden bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Die Plasmaproben wurden auf Heparinaktivität untersucht unter Verwendung
eines Tests, der auf der Inhibierung von Thrombin beruht. Der Test
verwendet das chromogene Substrat 5-2238 (Chromogenix, Mölndal, Schweden)
und hat ein Detektionsniveau von 0,02 IE/ml (T. Mätzsch et al.,
Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 651–657). Es konnte keine Heparinaktivität in irgendeiner
der Plasmaproben nachgewiesen werden, was die in vivo Stabilität der Heparinbindung
gemäß der vorliegenden
Erfindung beweist. Es konnte weiter zeigen, daß die verbesserte Leistung
der heparinisierten Filter nicht auf dem Auslecken des Heparins in
den Blutkreislauf beruht, sondern durch die verbesserte Biokompatibilität verursacht
wird, die der vorliegenden Erfindung zuzuschreiben ist.
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Beispiel 9
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Blutkompatibilitätstest heparinisierter
Hohlfaser-Filtrationsmodule (Schwein)
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Hohlfasermodule von voller Größe mit einem Oberflächenbereich
von 0,72 m
2 wurden gemäß Beispiel 7 hergestellt. Für das Experiment
wurde ein Schwein mit einem Körpergewicht
von 37 kg verwendet. In beide Leistengegenden des Tiers wurde 10
Fr Polyurethankatheter in die Hüftarterie
und die Hüftvene
inseriert. In die Katheter der linken Leistengegend wurde ein heparinisierter
Filter, der gemäß Beispiel
7 hergestellt wurde, über
ein PVC-Röhrenset
verbunden. Mit dem Kathetern der rechten Leistengegend wurde ein
Filter der gleichen Größe aber
mit Fasern aus nicht heparinisiertem, nicht aminiertem Celluloseacetat
auf gleiche Weise verbunden. Alle anderen Bestandteile in dem Kreislauf
waren heparinisiert, wie im wesentlichen in
EP 86187B2 beschrieben. Es wurde
keine externe Pumpe verwendet, so daß die Antriebskraft der arterielle
Druck des Schweins war. Während
des Experiments wurde der Druck vor und nach beiden Filtermodulen
mit einem Grass-Polygrafen
aufgezeichnet. Der Blutfluß durch
die Filtermodule wurde mit einem schallnahen T101-Flowmeter gemessen,
das mit einer Stromzangensonde ausgerüstet ist. Aufgrund der großen Größe der Filtermodule konnte
der Entwicklung von Blutverklumpungen an den Ein- und Ausgängen mit
dem Auge gefolgt werden. Es wurde kein Heparin oder andere Antikoagulationsmittel
bei dem Experiment verabreicht.
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An dem heparinisierten Filtermodul
konnten nach 5,5 Stunden kleine Blutklumpen am Ausgang erkannt werden,
wobei der Fluß konstant
blieb. Beim Eingang wurden keine Blutklumpen beobachtet. Das Experiment
wurde wie beabsichtigt nach 9 Stunden beendet. Die Klumpen waren
etwas in der Größe angestiegen
und der Fluß war
um 25% reduziert. Der erste Blutklumpen trat nach 1 Stunde beim
Ausgang und nach 2,5 Stunden am Eingang der nicht heparinisierten
Kontrollfiltermodule auf. Nach 3 Stunden begann der Blutfluß schnell
zu sinken und nach 4 Stunden betrug er nur noch 25% der ursprünglichen Blutflusses.
Zu diesem Zeitpunkt wurde das Filtermodul vollständig mit Blutklumpen verschlossen,
der Fluß stoppte
und das Filtermodul wurde entfernt.
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Dieses Experiment zeigt die verbesserte Blutkompatibilität eines
Hohlfaser-Hämofiltrationsmoduls,
das erfindungsgemäß hergestellt
wurde, mit voller Größe.
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Beispiel 10
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Permeabilitätsstudien
heparinisierter Hohlfasermembranen
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Heparinisierte Minifiltereinheiten
für Rattenexperimente
wurden gemäß Beispiel
7 hergestellt. Nicht heparinisierte Minifilter ohne Polyethylenimin
in den Fasern wurden gemäß Beispiel
7 für die
Kontrollexperimente hergestellt. Die Diffusionsausscheidung, die
Ultrafiltrationsraten und die Siebkoeffzienten der Minifilter wurden
in anästhesierten
und nephrektomierten Sprague-Dawley-Ratten im wesentlichen unter
Verwendung des gleichen experimentellen Ansatzes, der in Beispiel
8 beschrieben wurde, untersucht, aber es wurden 100 IE an Heparin
i. v. direkt vor dem Beginn des Experiments an die Ratte verabreicht.
Die Siebkoeffizienten betrugen 1,0 für Harnstoff und Creatinin sowohl
bei heparinisierten (n = 3) und nicht heparinisierten (n = 2) Filtern,
und die Ultrafiltrationsraten waren ebenfalls bei den Filtern ähnlich.
Die Diffusionstransport wurde im Hinblick auf die Ausscheidung von
Harnstoff, Creatinin und Inulin bei heparinisierten (n = 4) und
nicht heparinisierten (n = 3) Filtern untersucht. Die Mittelwerte ± S. D.
bei heparinisierten und nicht heparinisierten Filtern betrugen 0,47 ± 0,07
ml/min bzw. 0,44 ± 0,08
ml/min für Harnstoff:
0,34 ± 0,08
ml/min bzw. 0,31 ± 0,04
ml/min für
Creatinin und 0,22 ± 0,08
ml/min bzw. 0,16 ± 0,04 ml/min
für Inulin.
Als Schlußfolgerung
kann eine Heparinisierung der Hohlfasern erfindungsgemäß ohne signifikante
Veränderungen
der Eigenschaften der Fasern in Bezug auf die Konvektions- und Diffusionstransporte
von Metaboliten erreicht werden.