WO1995013829A1 - Verwendung von lösungen von vernetztem hämoglobin zur bekämpfung des septischen und hämorrhagischen schocks bei säugetieren - Google Patents

Verwendung von lösungen von vernetztem hämoglobin zur bekämpfung des septischen und hämorrhagischen schocks bei säugetieren Download PDF

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WO1995013829A1
WO1995013829A1 PCT/EP1994/003762 EP9403762W WO9513829A1 WO 1995013829 A1 WO1995013829 A1 WO 1995013829A1 EP 9403762 W EP9403762 W EP 9403762W WO 9513829 A1 WO9513829 A1 WO 9513829A1
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hemoglobin
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PCT/EP1994/003762
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Inventor
Hartmut Osswald
Original Assignee
B. Braun Melsungen Ag
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • the present invention relates to the use of a solution of cross-linked hemoglobin to combat septic and hemorrhagic shock and its consequences in mammals.
  • Septic shock is a common and feared complication in the therapy of patients in intensive care medicine.
  • the mortality rate is regularly at least 80%.
  • the object was achieved by the Use of an aqueous solution of cross-linked hemoglobin to treat septic and hemorrhagic shock in mammals.
  • a solution of an onomeric mammalian hemoglobin in crosslinked form can be used for the purposes of the invention, this solution being essentially free of endotoxins, phospholipids and non-hemoglobin proteins, such as enzymes.
  • Such a solution of a cross-linked hemoglobin can be prepared from a mammalian blood fraction using a method comprising 1) the separation of red blood cells from the mammalian blood fraction; 2) red blood cell hemolysis to form a composition of monomeric hemoglobin and stroma including phospholipids; 3) separation of the hemoglobin by filtration, which is contaminated with at least part of the phospholipid; 4) Purification of the monomeric hemoglobin by high performance liquid chromatography (HPLC) to separate the hemoglobin from all other protein residues of the red blood cells as well as from the phospholipid, enzyme and endotoxin contaminants; 5) crosslinking (polymerizing or aggregating) the monomeric hemoglobin; and 6) partially separating the cross-linked hemoglobin from the non-cross-linked hemoglobin.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the process is carried out under conditions which result in a product which is substantially free of endotoxins, phospholipids and non-hemoglobin proteins such as enzymes and has a defined molecular weight distribution of more than about 90% between 68,000 daltons and 500,000 daltons.
  • hemoglobin according to the invention is a solution of a crosslinked hemoglobin which is essentially free of endotoxins, has a vascular persistence of at least two days, has the property of reversibly binding gaseous ligands such as oxygen, and is usually useful for the transport and supply of oxygen to vital tissues and organs, ie as a blood substitute, as described in EP-A-0 277 289.
  • the product used according to the present invention is a cross-linked hemoglobin, preferably with a molecular weight distribution of more than 90% in the range of 68,000-500,000 daltons; an osmolarity, measured by lowering the freezing point, in the range of 180-320 milliosmol per liter of solution; a final hemoglobin content of 5-25, preferably 9-13 g / dl; a methaemoglobin content of less than 20%, preferably less than 10%; physiological concentrations of sodium chloride and potassium chloride; less than one nanomole of phospholipid per milliliter; less than 1 ppm crosslinking agent; a P ⁇ n in the range 2399.4 to 4798.8 Pa (18 to 36 mmHg), preferably from 3211.2 to 4281.6 Pa (24 to 32 mmHg); and an intravascular half-life of at least four days, with at least a portion of the material remaining in the body for at least 6 to 8 days.
  • p ⁇ n is recognized in the art to describe the interaction between oxygen and hemoglobin, and it stands for the oxygen partial pressure (p0 2 ) at 50% saturation of hemoglobin. This interaction is often represented as an oxygen dissociation curve, with the percent hemoglobin saturation plotted on the ordinate axis and the oxygen partial pressure in Pa [millimeters of mercury (mmHg) or Torr] on the abscissa.
  • intravascular half-life means the period of time in which the initial amount of hemoglobin in an in vivo environment is reduced to half its initial value falls off.
  • the aqueous solution is further characterized by a crosslinking profile in gel permeation chromatography of 50-70% crosslinking, no substance with a molecular weight below 68,000 being detectable.
  • the profile for gel permeation chromatography of the aqueous solution can be characterized by integrating low molecular weight to the total exclusion volume, the degree of crosslinking being 50% to 75 or 80%.
  • a preferred embodiment of this invention shows a molecular weight distribution of more than about 90% in the range of 68,000 to 500,000, with no more than 10 to 15% of the excluded material in the exclusion volume which is in the range of 400,000 to 500,000 MW is higher. After careful filtration, the gel permeation chromatogram also shows that almost none, if anything, of the material is below the 68,000 molecular weight level.
  • the integration can be carried out on this Carry out the last peak in such a way that it is found that at least 20% is in the 68,000 MW range. This fraction does not cause a toxic reaction in the animal, but is only excreted by the kidneys and can be determined by sampling in the urine.
  • the cross-linked hemoglobin solution is essentially endotoxin-free as well as pyrogen-free and does not cause any of the following abnormal and adverse chemical and physiological functions in vivo: (1) it does not activate any complement; (2) causes none hemorrhagic disorders; (3) does not cause abnormal platelet function or aggregation; (4) does not cause abnormal prothrombin times (PT); (5) does not cause abnormal partial thromboplastin times; (6) does not interfere with blood grouping or cross-checking; (7) is non-toxic to the kidneys at 3.5 g / kg body weight or 8 g / dl blood circulation volume; (8) shows a circulatory presence of at least seven days; and (9) acts as a stimulant for accelerated erythropoiesis.
  • cross-linked or "polymerized”. is said to include both intermolecular and intramolecular polyhemoglobin, with at least 50% of the polyhemoglobin in higher than the tetrameric form.
  • endotoxin free can be described for the purpose of the present invention as a solution containing less than 1.0 endotoxin units per milliliter of solution at a concentration of 10 grams of hemoglobin per deciliter of solution.
  • the "endotoxin-free" solution of the cross-linked hemoglobin for use in accordance with this invention contains less than 0.5 and preferably less than 0.25, most preferably less than 0.02 endotoxin units per milliliter of solution (EU / ml ), measured using the Limulus amebocyte lysate (LAL) test.
  • LAL Limulus amebocyte lysate
  • endotoxin s
  • endotoxin s
  • endotoxin the generally cell-bound lipopolysaccharides that are produced as part of the outer layer of bacterial cell walls and that are toxic under many conditions. Injected into an animal Endotoxins fever, diarrhea, hemorrhagic shock and other tissue damage.
  • EU endotoxin unit
  • the process for preparing the crosslinked hemoglobin solution used in the present invention comprises the steps of (1) recovering the crude blood product, (2) fractionating the crude blood product to give a fraction of red blood cells which is substantially free of white blood cells and platelets, (3) mechanically tearing the red blood cell fraction to give a hemoglobin-containing solution, (4) clarifying the hemoglobin-containing solution to give a hemoglobin solution which is essentially free of cell fragments, (5) microporous filtration of the hemoglobin Solution that is substantially free of cell fragments to give a partially sterilized hemoglobin-containing solution, (6) ultrafiltration of the partially sterilized hemoglobin-containing solution to give a size-separated, hemoglobin-containing solution, (7) chromatographic separation of the size-separated hemoglobin-containing solution to a hemoglobi n to be essentially free of phospholipids and non-hemoglobin proteins with the hemoglobin retained on the chromatographic column, (8) eluting the essentially phospholipid-free hemoglobin from
  • any other solution of cross-linked hemoglobin can be used to combat septic or hemorrhagic shock, provided that it has the molecular weight distribution, osmolarity, freedom from phospholipids and pyrogens described above.
  • the starting point is a source of erythrocytes (red blood cells).
  • the starting material can be freshly drawn human blood, aged blood from blood banks, placenta, or it can be packaged erythrocytes obtained from human donation centers. Erythrocytes obtained from animal blood are also equally suitable. Accordingly, blood derived from a variety of sources such as cattle, sheep or pigs can be used. Because of its easy availability, cattle blood obtained from slaughterhouses is the preferred source of erythrocytes.
  • the process requires special techniques for the collection and handling of blood in large quantities.
  • Large collection troicarts are used that draw the blood sterile.
  • the troicarts must be carefully inserted and handled and are connected to approximately 60 cm (2 feet) of tubing.
  • To use the Troicart the skin has to be cut away and peeled back, and the Troicart is then inserted into the The animal's main vessels are placed close to the heart, taking care not to puncture the throat. It is important to avoid the introduction of bacteria and to keep the material endotoxin-free or at a low endotoxin level. This is achieved by using individual containers that are pre-loaded with an anticoagulant, made pyrogen-free and checked again for endotoxins. Typical anticoagulants include sodium citrate. In any case, the endotoxin levels of the containers must be less than 0.01 endotoxin units, measured using the LAL.
  • This solution is then used to fill small vessels which can hold sterile between 7.57 - 37.85 l of collected blood and thus keep the blood in an endotoxin-free state.
  • the blood collected in the container is covered immediately to avoid contact with the environment.
  • the material is cooled, typically to about 4 ° C, to limit bacterial growth.
  • the blood is not yet mixed together; the blood is later tested for endotoxins and sterility to ensure that (1) none of the cows are sick; or (2) the entire batch or amount recovered that day was not contaminated by poor recovery techniques.
  • the blood is brought to central processing, at which time samples are taken from each vessel, and the vessels are checked for endotoxin levels by LAL analysis. If the endotoxin level is higher than 6-7 EU / ml, the blood is discarded. Only if the examination of the individual blood containers shows that the endotoxin levels are below this is the material found to be good for further processing.
  • Typical further processing in the prior art was to suspend and centrifuge the blood (ACD-anticoagulated blood) in a saline solution with a physiological salt concentration in order to effectively separate the plasma proteins and white blood cells from the red blood cells. This suspension process is carried out by means of several “washing” stages, ie 2-4 times, in order to remove all free proteins as possible. In the method according to the invention, however, it was found that this approach was not durable on a practical scale; to separate the hemoglobin product so that it is free from many contaminants, • it is actually not necessary to carry out this washing process at all.
  • the animal's whole blood is passed through a semi-continuous centrifuge, whereby the red blood cells, the white blood cells and the plasma can be separated on any scale.
  • the process uses a semi-continuous bowl centrifuge, the bowl being kept at 15,000 to 18,000 rpm, e.g. a Sharples AS-15 unit.
  • the kettle and top assembly are arranged with an opening of a certain radius that allows discrete layer separation so that red blood cells, white blood cells and plasma can be separated by this process.
  • drum separators such as those manufactured by Beckman Instruments are also part of the typical, also suitable separation devices.
  • the centrifuge is depyrogenated, ie, typically using 0.5 molar sodium hydroxide, for at least 1 hour before installation in the machine housing container.
  • the top Spouts or collection devices are treated in a similar manner to allow complete depyrogenation of all contact surfaces that the blood may encounter.
  • the system is assembled.
  • a sanitary-style rotary lobe pump or peristaltic pump is used to flush fluid through the entire system and manifolds; a solution of 0.5 molar sodium hydroxide is typically used, but other depyrogenation solutions known in the art are also suitable.
  • Towards the end of the rinse it is necessary to lower the pH to a range that is helpful for handling the hemoglobin solution.
  • the blood from the different batches or different cows is introduced into the system and the drain (separated red blood cells) is collected in a separate container under sterile conditions. At this point, however, the process is merged and is no longer • treated depending on the individual animal.
  • an overpressure of sterile nitrogen is applied to the chamber in which the kettle rotates.
  • a steam sterilization cycle can be used to properly sterilize the system by introducing steam into the rotary chamber and steaming it for up to an hour before use. After steaming is complete, the system is cooled, ie, through glycol cooling lines, typically to about 4 ° C. (After collection from the animal, it is important that the blood be brought to a temperature just above freezing, typically around 4 ° C, and left there.)
  • the collection chamber that is, the area around the spouts where the red blood cells are collected at the top of the high-speed rotary boiler, is constructed so that the cells experience vigorous bumps.
  • the red blood cells hit these surfaces, they are broken down by mechanical degradation, in contrast to the use of a hypotonic solution.
  • a hypotonic solution In a hypotonic solution, the red blood cells swell and cause the membrane hydraulic forces to break open.
  • This mechanical degradation is extremely fast and does not produce the small amounts of free small components of the cell membrane that are found in other methods.
  • the red blood cells are collected in a vessel and prepared for the second centrifuge operation.
  • the mechanically disrupted red blood cells are diluted using pure depyrogenated water that has been kept at low temperature, ie, about 4 ° C. Typically, the broken red blood cells are diluted by at least 50%.
  • the red blood cells are introduced into the second separation step; typically a type of centrifuge similar to that used in the first cycle can be used. In a preferred embodiment, a Sharples centrifuge with a 10 cm bowl in a semi-continuous mode and a speed of 15,000 to 18,000 rpm is used. However, the flow rate is considerably reduced: 0.5 1 / min or less is recommended.
  • a different structure of the head part of the centrifuge is used in this step. This step does not separate two layers, such as the composition of plasma, white blood cells and red blood cells. This clarification step leads to the separation of all cell fragments from the released hemoglobin solution.
  • the same care that was used in the first step for depyrogenation and sterility must apply in the second step. Once the material is out of this second step, it is ready for micropore filtration.
  • Micro-pore filtration must be carried out differently than pressure filtration. In a practical sense, pressure filtration for processing hemoglobin solutions on an industrial scale is not acceptable. To successfully use micro pore filtration, either a frame filtration or a hollow fiber filtration system can be used; however, it must be operated so that the pressure drop across the membrane (transmembrane pressure) is carefully maintained at about 3,447 10 Pa [5 pounds per square inch (psi)]. If the pressure drop exceeds the tolerance threshold by 1 to 2 psi, the membrane is quickly blocked by the remaining Zeil fragments, and the flow velocity across the membrane drops to a level that is unacceptable for technical cleaning in a semi-continuous manner.
  • rotary lobe or Sanitary-style peristaltic pumps are used, reducing and restricting the number of closures and shafts that can introduce bacteria and pyrogen contamination.
  • other pump designs known in the prior art for sanitary pumps can also be used. These pumps include centrifugal pumps, gear pumps and tubular diaphragm pumps.
  • the membrane systems are pretreated to ensure depyrogenation and the correct pH. If improperly carried out, pyrogens will be introduced at this point and it will become increasingly difficult to remove them in the course of the remaining process steps.
  • Depyrogenation and pH adjustment are accomplished using standard hygiene and depyrogenation procedures, i.e., typically with sodium hydroxide and extensive washes with pyrogen-free water, to bring the pH to acceptable ranges for the treatment of the hemoglobin solution ( ⁇ pH 9). While the handling of a transmembrane pressure limitation in such a manner is not very well known and has only been practiced on a case-by-case basis in the processing of tissue fluids in recent years, suitable techniques are part of the specialist knowledge.
  • the filtrate side is limited so that the
  • Liquid flow introduced into a tangential flow membrane system and the inlet pressure is approximately
  • the solution is at least partially sterilized and all cell fragments larger than 0.45 ⁇ m have been removed. In some cases it may be necessary to make the solution sterile at this point. In these cases, after the 0.45 ⁇ m micropore filtration has ended, a 0.22 ⁇ m micropore filtration can be used in the same way as the 0.45 ⁇ m micropore filtration. The resulting solution is now ready for the following molecular separations.
  • the next step involves carefully grading the filtration to molecular weight 100,000 (measured in Daltons) using membranes that effectively retain everything with a molecular weight greater than 100,000 and pass everything with a molecular weight less than 100,000.
  • Typical membranes are commercially available from Millipore Corporation and are sold under the trade name Durapore. Everything below these limits, the membrane system is filtered. Hemoglobin (molecular weight approximately 67 - 68,000) passes through this membrane system and is collected in a container battery.
  • the filtered intermediate product is stored in a sterile, pyrogen-free container battery for subsequent operations.
  • a typical device for carrying out the ultrafiltration step is a Millipore, pellicon cassette with a Durapore, membrane; however, other devices known in the art can be used as well.
  • the next ultrafiltration step is to separate the material with molecular weights below 68,000. This isolates small hemoglobin molecules and other small proteins from the whole blood plasma may have been taken away. In all cases, the hemoglobin solution is kept at a concentration of about 5 to 15 g / dl. The filtration carried out with this step results in a certain concentration. At high concentrations, the flow rates prove to be low. In both ultrafiltration processes, in which membranes for MG 100,000 and MG 30,000 are used, the necessary depyrogenation steps and the subsequent testing after washing with pyrogen-free water are normally necessary.
  • pyrogens can be separated, since some pyrogens are between MG 100,000 and 1,000,000.
  • the hemoglobin solution has passed through this tangential flow system in order to allow the perfusion of small molecules through the membrane. In this operation, a return can be carried out or not, which, however, is necessary in the filtration step MG 100,000.
  • the retentate (retained material) is kept in a storage container and checked for endotoxins. In any case, the endotoxins must be below 0.5 EU / ml-, since the separation of high pyrogen concentrations is difficult in subsequent operations.
  • This material is stored under a sterile nitrogen or argon atmosphere, which maintains the stability in the system of the container battery. At this point in the process, the methaemoglobin level is typically below 1%.
  • the filtration steps must be carried out at low temperatures, typically around 4 ° C. Following the filtration, the material is either deep-frozen or divided directly into aliquot batch quantities for chromatographic processing. F. Chromatography
  • the chromatographic system includes pumps, a gradient generator, columns and detectors.
  • a typical pump system comprises a diaphragm pump system with a pumping capacity in the range of 1 to 5 1 / min.
  • Such a system includes a Pulsafeeder 8480 diaphragm pump made of stainless steel or equivalent.
  • a smaller pump is used for the feed system, the flow being in the range of 0.1 1 / min to 1.5 1 / min.
  • this pump is a smaller one, for example in the form of a tubular diaphragm.
  • a typical pump for this operation is a Pulsafeeder 7120.
  • a system for the production of solvent compositions was produced, which comprises flow control valves which supply the appropriate pump system with a proportional amount of two liquids, whereby a liquid composition gradient over time results in a certain ionic strength. With the help of ionic interaction, a chromatographic ion exchange separation is effected on the column system.
  • flow control valves which supply the appropriate pump system with a proportional amount of two liquids, whereby a liquid composition gradient over time results in a certain ionic strength.
  • a chromatographic ion exchange separation is effected on the column system.
  • a typical flow control valve is a Baumann Flow control valve programmed to operate with a standard programmable controller, such as a Texas Instruments 530 programmable controller. All tubing and tubing to the system are sanitary and are 316L tubing approximately 1/2 "to 1" in diameter.
  • the supply system through the gradient generator and through the pump leads to a separating part or a separating column - as is known to experts.
  • the column is typically a stainless steel tube.
  • the stainless steel tube may be connected to a 1/2 "(1.27 cm) diameter tubing so that it includes a long column for separation.
  • the tube or column is typically lined with Teflon for compatibility with the interior Surface, which is helpful when packing the inner medium into the column system.
  • the discharge from the chromatographic system can be monitored by diverting a portion of the stream and passing this small representative amount through a refractive index detector, such as a Model R401 from Waters Associates, or through an ultraviolet detector, typically a Model 441 from Waters Associates.
  • a refractive index detector such as a Model R401 from Waters Associates
  • an ultraviolet detector typically a Model 441 from Waters Associates.
  • the column is fabricated to achieve even distribution of the sample applied to the top of the column and, related to this, even collection of the samples from the column drain.
  • the ratio of length to diameter is important insofar as the creation of a column that is too long or too short has a significant effect on the effectiveness of the separation and the quilibration for carrying out the ion exchange.
  • the column includes separation media which, to some extent, allow irreversible adsorption of phospholipids (irreversible in the simple procedure) and discrete ion exchange separation using a certain gradient elution pattern of the solvent.
  • the separation media include silica gel particles about 50 to 150 ⁇ m in size; the flow through this material is in the range of about 2.5 l / min.
  • the silica gel has an average pore size of 30 nm (300 ⁇ ), measured by BET nitrogen adsorption.
  • This silica gel can be obtained from various manufacturers, e.g. W.R. Grace. Davison Chemical Co ..
  • This gel is the preferred substrate to build on the derivatized surface that provides the functionalized property for separating the hemoglobin solution.
  • the separation media it is first necessary to derivatize the silica gel surface with a special silane, which creates a surface of the diol chemotype on the silica gel surface.
  • This diol can typically be obtained by providing a glycidoxypropyltrimethoxysilane coating on the surface, typically using methods well known in the field of chromatography
  • Suspend the silica gel and silane in a vessel with partial dilution with water The reaction is a water-base reaction and this polymer coats the surface of the silica gel.
  • This reaction, with which the silica gel is coated requires a reaction time of 20 hours at approximately 70 ° C.
  • the material can easily be washed through a series of methanol and acetone washes to get a clean; to give permanently bound, diol-coated silica gel.
  • the material is then dried and prepared for the second step or series of steps, coating the surface with various monomers, and the surface is derivatized to obtain a quaternary amine type surface property to perform the particular type of ion exchange separation.
  • the organic stationary phase is a thin skin made of cross-linked polymer.
  • the cross-linked polymer applied to the surface is made up of two different hydrophilic vinyl monomers. For example, a monomer such as N-methyl acrylamide in 48% strength aqueous solution (Si lar Labs) and methylaminopropyltrimethylammonium chloride can be used.
  • the two monomers have different capabilities; one monomer will copolymerize with another functional monomer, i.e., one that has the desired ion exchange or adsorption properties. It cross-links with other polymer chains and anchors the cross-linked polymer to the silica gel surface.
  • the monomers selected for this purpose have a vinyl function and reactive groups which react in such a way that they can react with one another, forming the bridges necessary for the coating of the surface and the coating of the stationary ones Phase consisting of a functional amine group, which creates the ion exchange capability in the desired range.
  • the suspension solution is evaporated off, the monomers applied to and into the silica gel remaining.
  • the mixture is resuspended in a new solution that also contains a radical initiation system, such as a product from Du Pont, Vazo 64.
  • a radical initiation system such as a product from Du Pont, Vazo 64.
  • the reaction mixture is heated to a point where it is kept at 70-75 ° C , not above and not below.
  • the reaction proceeds and the polymer coats and binds to the surface, including the functional groups that create the surface property used for the chromatographic medium.
  • the reaction is complete, it is necessary to remove unreacted monomer with a series of washes with several solvents such as acetone and methanol. After these washes, the material is dried and ready for use.
  • a typical column diameter is approximately 15 cm (6 ") and a typical column length is 60 cm (2 feet). However, suitable variants are known in the art.
  • the maximum operating pressure is 3.44 MPa (500 psi).
  • the injection is done by pumping the Solution on the column, typically for about 1 minute at a rate of 1 l / min, then the injection is stopped, therefore the loading factor is not greater than 1 liter of material at 7 g / dl.
  • an isocratic flow with buffer eg Tris buffer with pH 8.9 to 9.0
  • the buffer as the primary eluent is then diluted over time.
  • the eluent typically consists of a Tris buffer base solution which is prepared in a concentration of 1.8 g / 1 Tris with a pH of 8.6-9.2.
  • the temperature range for the elution is 3 - 10 ° C. These ranges are important because changing the temperature range also changes the pH of the elution solution.
  • the secondary solution for the elution of the material of interest can be prepared using a solution of Tris buffer, highly purified in the same way as the previous buffer. This buffer also contains salt at 1 molar concentration. The pH of this solution is also adjusted so that it is identical to the original pH solution, which is in the range from 8.6 to 9.2. The phospholipids are released before the elution of the hemoglobin, with the endotoxins being eluted after the hemoglobin peak of interest has been collected.
  • Chromatographic selection methods are UV absorption, refractive index, typically using the device described above, or visual observation of the outflow.
  • the first part of the eluted hemoglobin is discarded as waste; then the discharge begins and continues until the peak (or signal) has decreased to 20% to 10% of the peak height. This is the fraction to be collected and the fraction of interest for cleaning. If collection continues beyond the appropriate retention time, other proteins and / or endotoxins may be collected and the product may become unusable. Likewise, if the material is collected before the peak retention time, the material may contain unacceptable concentrations of endotoxins. The total phospho- lipid and insignificant hemoglobin sub-components are discarded, both the peaks before and after the retention time. This collection process gives intermediate material diluted to approximately 40 to 1 in a pH range of 8.9 to 9.0.
  • the chromatography column After being collected in the chromatographic system, the chromatography column is subjected to a series of washes in order to prepare it for the second loading with unpurified material. If this preparation of the column is not carried out, various sub-components and contaminants are eluted and render subsequent runs worthless.
  • the wash is performed using a 100% pyrogen-free 0.5-1.0 molar NaCl wash for at least 5 minutes or 3 column volumes, and not more than 10 minutes or 6 column volumes.
  • the liquid phase After completion of the buffer gradient and salt rinse, the liquid phase is brought to the initial conditions of 100% Tris buffer, ie 0.18 g / 1 Tris buffer, and the pH is raised to approximately 8.9 + 0 for the hemoglobin elution process , 1 set.
  • Hemoglobin pH ranges were examined however, the pH range 8.9 - 9 in the chromatographic system provides the highest and best isolation of a pure hemoglobin analogue. At lower ranges (8.6 -8.4), hemoglobin is eluted in its pure state, but the loading capacity of the separating material is drastically reduced. At pH levels of 9.5-11, methaemoglobin formation occurs at a rate that does not allow methaemoglobin levels to be kept low. There is also the possibility of mutual contamination. At this higher pH range, the methaemoglobin level can rise 5% within 2 hours.
  • the material eluted from the column is a hemoglobin solution which is essentially free of other proteins, endotoxins and phospholipids. Because of its quality, this material is useful as an intermediate in the preparation of the crosslinked, endotoxin-free, phospholipid-free, hemoglobin solution.
  • the material is either specifically designed for a polymerization reaction or is thawed from the deep-freeze state, it is introduced into a sterile, pyrogen-free reactor which has stirring blades which are arranged in such a way that rapid mixing and high shear are brought about.
  • a typical apparatus is a 3-1 applicon fermenter with a flat paddle stirrer located 1 inch above the bottom of the reactor and with 5.5 inch baffles distributed in the reactor.
  • the hemoglobin solution added to the reactor is placed in a circulatory system, and the hemoglobin solution is withdrawn from the reactor and passed through an exclusion membrane, typically an MG 10,000 exclusion filter, and in a Environment with little 0 2 returned to the reactor.
  • the reactor can be operated with an inert gas, e.g. Argon, shielded.
  • the latter process is carried out so that a vacuum is applied to the reactor and the liquid in the reactor is covered with argon. Extreme care should be taken to avoid the introduction of bacteria at this point; the material is pyrogen-free and shows no endotoxins according to LAL analysis.
  • a sterile pyrogen-free buffer (pH 8.9-9.1) is then added to the reactor through a depyrogenating membrane filter, typically an MG 10,000 filter. At the same time, an MG 10,000 concentration loop is circulated to the volume of liquid supplied and out of the Keep reactor fluid out of balance.
  • the reaction buffer used to neutralize the high pH is a physiological composition of sodium, chloride and potassium with the typical values 120 milliequivalents sodium, 120 milliequivalents chloride and 4 milliequivalents potassium.
  • the pH of the solution is adjusted to a pH of 4.7 to 5.2 with HC1 and Tris base. If the pH is too low during the process of lowering the pH, large amounts of methemoglobin form at the point where the neutralizing acid solution is introduced.
  • the filtration process continues until the pH in the reactor has dropped to a range of 7.4 to 8.0 pH units. At this point the feed is stopped and the crosslinking solution is added.
  • Suitable crosslinking agents are disclosed in U.S. Patent 4,001,200 to Bonsen et al. This citation provides a summary of several exemplary commercially available crosslinking agents, starting at column 6, line 66 to column 8, line 49.
  • Preferred is the class of crosslinking agent with aldehyde function, more preferred are dialdehydes, with glutaraldehyde being the crosslinking agent of choice.
  • glutaraldehyde is typically added at a rate of approximately 100 ml / h.
  • the glutaraldehyde solution is prepared by thawing high purity standard glutaraldehyde (stored at -20 ° C to 4 ° C) within a short period of time, typically 2-5 minutes.
  • This solution which preferably has a concentration of glutaraldehyde of approximately 25%, is then added to pyrogen-free water, the fractions resulting in a solution which preferably corresponds to approximately 5 ml of a 25% solution, diluted in 100 ml of pyrogen-free water.
  • the solution is added to the reactor and the reaction mixture at the rate indicated above.
  • the crosslinking solution and its effect on the crosslinking (polymerization) are monitored by gel permeation chromatography.
  • Gel permeation chromatography requires the use of a column with a hydrophilic filling material with a pore size of 30 nm (300 ⁇ ) with a resolution of more than 24,000 trays per meter.
  • a typical pillar is available from Waters associates; a typical filler is Waters Protein Pak 300SW.
  • the recorded elution chromatogram is integrated over the time of the peak elution and quantified against the starting material.
  • a crosslinking percentage of 50% to 70% is preferably achieved. This number is determined by the percentage of the material eluted from the column with a molecular weight below 600,000 Daltons and over 68,000 Daltons.
  • the solution is ready for the membrane concentration MG 100,000.
  • the tangential flow of the reaction mixture is passed over the membrane, permeating the material with 68,000 or less through the membrane system. This is carried out until an approximately 25% reduction in fluid is achieved.
  • a quench solution i.e., a solution of pyrogen-free lysine, pH 7, is added.
  • the concentration of the lysine solution is 1 g / 1.
  • This lysine solution is added to terminate the polymerization reaction of glutaraldehyde with hemoglobin and to complex excess glutaraldehyde. This material is also believed to attach to unpolymerized glutaraldehyde bound to hemoglobin molecules.
  • the molecular weight distribution is determined, and it is found by gel permeation chromatography that it has stabilized. Filtration is then started to remove excess lysine, excess glutaraldehyde and other species whose molecular weight is less than 100,000 MW.
  • the gel permeation chromatogram of the initial uncrosslinked hemoglobin solution shows molecular weight sizes from 16,000 to 68,000 Daltons, the largest amount being 68,000 Daltons. After filtration, some, no more than 50%, hemoglobin with 68,000 daltons is present and the occurrence of material with a molecular weight of less than 68,000 daltons is undetectable. Filtration of the material after crosslinking also provides an opportunity to balance the electrolyte and pH of the solution, thereby obtaining a balanced physiological solution for injection.
  • the solution of the polymerized hemoglobin thus obtained and avoidable according to the invention has the following features:
  • the molecular weight distribution of the material is such that more than 90% of the material is in the range from 68,000 to 500,000 daltons.
  • the osmolarity measured by lowering the freezing point is typically 220 to 320 milliosmol per liter of solution.
  • the electrophoretic pattern shown in gel electrophoresis has bands in the molecular weight range 68,000 to 500,000.
  • the final hemoglobin content can be adjusted to 5 to 25, preferably 9 to 13 g / dl, and the methemoglobin level is below 20%, preferably below 10%.
  • the sodium, chloride and potassium ion concentrations are non-toxic to the animal or species to be tested on.
  • the thin layer chromatography developed for the phospholipid detection shows a clean plate after the development by applying iodine. Phospholipids, determined by phosphoric acid reduction, cannot be detected, the detection limit being below 1 nmol / ml.
  • Gas chromatography serves as a quantitative measure of free glutaraldehyde. With a gas chromatographic detection limit of 1 pp, no glutaraldehyde can be detected. Apart from hemoglobin, no other protein is present, as determined by gel chromatography and isoelectric focusing methods.
  • the solution generally has less than 0.01 endotoxin units per ml, measured by means of the LAL (Limulus amebocyte lysate) test with a sensitivity scale of 0.01 to 0.1 and is pyrogen-free in all tests. Studies have been carried out on rabbits with this material and it shows the same properties that a p -ogen-free material would show, namely that there is no fever in the rabbits. This material does not produce ar ⁇ ial endotoxin response and other factors in the rabbits tested, since it correlated with hemorrhagic conditions to which a rabbit control group was subjected, which then received a pure plasma fraction with 1/3 of the volume.
  • LAL Liimulus amebocyte lysate
  • the hemoglobin solutions according to the invention which is important — show less clinically significant vasoconstricting properties than other solutions of cross-linked hemoglobin according to the prior art.
  • the material exhibits properties with regard to increased cellular appearance of red blood cells in various mammalian species and does not cause any of the following abnormal and harmful chemical and physiological functions in vivo: (1) it is not complement activating; (2) it does not cause hemorrhagic disorders; (3) it does not cause abnormal platelet function or aggregation; (4) it does not cause abnormal prothrombin times (PT); (5) it does not cause abnormal partial thromboplastin times; (6) it does not interfere with blood typing or crossbreeding; (7) it is non-toxic to the kidneys at 3.5 g / kg body weight or 8 g / dl blood circulation volume (8) it shows circulation resistance of at least seven days; and (9) it acts as a stimulus for accelerated erythropoiesis.
  • the cross-linked hemoglobin solution can be used to treat endotoxin shock in mammals and especially in humans.
  • the solution of the crosslinked hemoglobin can preferably be used for the treatment of long-lasting hypotension, as occurs in endotoxin shock and leads to multiple organ failure.
  • kidney failure especially acute kidney failure, occurs as a result of the endotoxin shock
  • the solution of the cross-linked hemoglobin can also be used for rapid therapy.
  • an isotonic sodium chloride solution with a cross-linked hemoglobin content of 5-25 g / dl, preferably 9-13 g / dl and particularly preferably 9-11 g / dl in a dose of 0.5-10 ml / kg, preferably 0.5-7 ml / kg and particularly preferably 0.5-6 ml / kg body weight are infused intravenously.
  • the solution of the cross-linked hemoglobin is therefore excellently suitable for use in the manufacture of a medicament for the treatment of septic and hemorrhagic shock states, in particular for the treatment of long-lasting hypotension and the resulting multiple organ failure, such as acute kidney failure.
  • Another advantage is that such a solution of cross-linked hemoglobin in vivo does not cause any of the following abnormal and harmful chemical and physiological functions: (1) it is not complement activating; (2) it does not cause hemorrhagic disorders; (3) it does not cause abnormal platelet function or aggregation; (4) it does not cause abnormal prothrombin times (PT); (5) it does not cause abnormal partial thromboplastin times; (6) it affects Blood grouping or crossbreeding not; (7) it is non-toxic to the kidneys at 3.5 g / kg body weight or 8 g / dl blood circulation volume (8) it shows resistance to circulation for at least seven days; and (9) acts as a stimulus for accelerated erythropoiesis.
  • the solution can be administered using administration methods conventional in the art.
  • the solution can also be mixed with water-soluble, physiologically acceptable, polymeric plasma substitutes such as polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and ethylene oxide / propylene glycol condensate.
  • polymeric plasma substitutes such as polyethylene oxide, polyacrylamide, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and ethylene oxide / propylene glycol condensate.
  • the material can also be mixed with colloidal plasma-like substitutes and blood plasma expanders such as linear polysaccharides, including dextrans with molecular weights of 40,000 to 70,000, gum arabic pectins, balanced liquid gelatin and hydroxyethyl starch.
  • septic shock was induced by intravenous short infusion (3 min) of 20 mg / kg body weight lipopolysaccharide (Escherischia coli, serotype 0127: B8).
  • the circulatory response of the animals is characterized by a marked increase in heart rate and a sharp drop in arterial blood pressure, measured via a catheter that was integrated into the carotid artery.
  • a solution of the crosslinked hemoglobin (10 g / 10 ml isotonic NaCl solution) was infused intravenously over 6.5 min.
  • MAP Arterial blood pressure
  • HF heart rate

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verwendung einer wäßrigen Lösung von vernetztem Hämoglobin zur Behandlung des septischen und hämorrhagischen Schocks bei Säugetieren.

Description

Verwendung von Lösungen von vernetztem Hämoglobin zur Bekämpfung des septischen und hämorrhagischen Schocks bei Säugetieren
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Lösung von vernetzten Hämoglobin zur Bekämpfung des septischen und hämorrhagischen Schocks und seinen Folgen bei Säugetieren.
Der septische Schock ist eine häufige und gefürchtete Komplikation bei der Therapie von Patienten in der Intensivmedizin. Die Letalitätsrate beträgt dabei regelmäßig wenigstens 80%.
Der septische Schock wurde bisher mit Vasokonstriktoren, Plasmaexpandern und Plasmaersatz behandelt, was jedoch durchweg keine befriedigenden Ergebnisse lieferte. Gleiches gilt grundsätzlich für den hämorrhagischen Schock bei Blutverlust.
Zu weiteren Einzelheiten zu Schockzuständen und insbesondere zu septischem und hämorrhagischem Schock wird auf "Klinische Pathophysiologie", Georg Thieme Verlag, Herausgeber Walter Siegenthaler (1987) und "Pathophysiology of Sepsis, Schock and organ failure", Springer Verlag, Herausgeber G. Schlag und H. Redϊ (1993) verwiesen.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mittel zur Verfügung zu stellen, durch dessen Verwendung der septische und hämorrhagische Schock wirksam behandelt werden kann.
Es wurde nun völlig überraschend gefunden, daß die für den Sauerstof transport vorgesehene wässrige Lösung von vernetztem Hämoglobin viel wirksamer war als vergleichbare Medikationen, die bisher zur Therapie des niedrigen Blutdrucks bei Schock eingesetzt wurden.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer wässrigen Lösung von vernetztem Hämoglobin zur Behandlung des septischen und hämorrhagischen Schocks bei Säugetieren.
Verwendet werden kann im Sinne der Erfindung eine Lösung eines onomeren Säuger-Hämoglobins in vernetzter Form, wobei diese Lösung im wesentlichen frei ist von Endotoxinen, Phospholipiden und Nicht-Hämoglobin- Proteinen, wie etwa Enzymen.
Eine derartige Lösung eines vernetzten Hämoglobins kann hergestellt werden aus einer Säugerblutfraktion mit .Hilfe eines Verfahrens, umfassend 1) die Abtrennung roter Blutkörperchen aus der Säugerblutfraktion; 2) Hämolyse der roten Blutkörperchen, um eine Zusammensetzung aus monomerem Hämoglobin und Stroma einschließlich Phospholipiden zu bilden; 3) Abtrennung des Hämoglobins durch Filtration, welches wenigstens mit einem Teil des Phospholipids verunreinigt ist; 4) Reinigung des monomeren Hämoglobins durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), um das Hämoglobin von allen anderen Protein-Resten der roten Blutkörperchen wie auch von den Phospholipid-, Enzym- und Endotoxin-Verunreinigungen abzutrennen; 5) Vernetzen (Polymerisieren oder Aggregieren) des monomeren Hämoglobins; und 6) teilweises Abtrennen des vernetzten Hämoglobins vom nichtvernetzten Hämoglobin. Das Verfahren wird unter Bedingungen durchgeführt, die ein Produkt ergeben, das im wesentlichen frei ist von Endotoxinen, Phospholipiden und Nicht-Hämoglobin-Proteinen wie etwa Enzymen und eine definierte Molekulargewichtsverteilung mit mehr als etwa 90% zwischen 68 000 Dalton und 500 000 Dalton aufweist.
Das resultierende Produkt (im folgenden "erfindungsgemäßes Hämoglobin") ist eine Lösung eines vernetzten Hämoglobins, die im wesentlichen frei ist von Endotoxinen, eine vaskuläre Persistenz von wenigstens zwei Tagen aufweist, die Eigenschaft besitzt, gasförmige Liganden wie etwa Sauerstoff reversibel zu binden, und üblicherweise brauchbar ist für den Transport und die Zufuhr von Sauerstoff an lebensnotwendige Gewebe und Organe, also als Blutersatz, wie in der EP-A-0 277 289 beschrieben.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Produkt ist ein vernetztes Hämoglobin, vorzugsweise mit einer Molekulargewichtsverteilung von mehr als 90% im Bereich von 68 000 - 500 000 Dalton; einer Osmolarität, gemessen durch Gefrierpunktserniedrigung, im Bereich von 180 - 320 Milliosmol pro Liter Lösung; einem End-Hämoglobin-Gehalt von 5-25, vorzugsweise 9-13 g/dl; einem Methämoglobin- Gehalt von weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 10%; physiologischen Konzentrationen an Natriumchlorid und Kaliumchlorid; weniger als ein Nanomol Phospholipid pro Milliliter; weniger als 1 ppm Vernetzungsmittel; einem Pςn im Bereich von 2399,4 bis 4798,8 Pa (18 bis 36 mmHg), vorzugsweise 3211,2 bis 4281,6 Pa (24 bis 32 mmHg); und einer intravaskulären Halbwertszeit von wenigstens vier Tagen, wobei wenigstens ein Teil des Materials für wenigstens 6 bis 8 Tage im Körper verbleibt.
Der Ausdruck "Pςn" ist in der Fachwelt anerkannt zur Beschreibung der Wechselwirkung zwischen Sauerstoff und Hämoglobin, und er steht für den Sauerstoff-Partialdruck (p02) bei 50%iger Sättigung von Hämoglobin. Diese Wechselwirkung wird häufig dargestellt als eine Sauerstoff-Dissoziationskurve, wobei die prozentuale Hämoglobin-Sättigung auf der Ordinatenachse aufgetragen wird und der Sauerstoff-Partialdruck in Pa [Millimeter Quecksilber (mmHg) oder Torr] auf der Abszisse aufgetragen wird.
Der Terminus "intravaskuläre Halbwertszeit" bezeichnet die Zeitspanne, in der die anfängliche Hämoglobin-Menge in einer in-vivo-Umgebung auf die Hälfte ihres Anfangswerts abfällt .
Die wässrige Lösung ist ferner gekennzeichnet durch ein Vernetzungsprofil bei der GelpermeationsChromatographie von 50-70% Vernetzung, wobei kein Stoff mit einem Molekulargewicht von unter 68 000 nachweisbar ist.
Das Profil für die GelpermeationsChromatographie der wässrigen Lösung läßt sich charakterisieren durch Integration von niederem Molekulargewicht zu gesamtem Ausschlußvolumen, wobei sich der Vernetzungsgrad auf 50% bis 75 oder 80% beläuft. Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung zeigt eine Molekulargewichtsverteilung von mehr als etwa 90% im Bereich von 68 000 bis 500 000, wobei sich nicht mehr als 10 bis 15% des ausgeschlossenen Materials im Ausschlußvolumen befinden, das im Bereich von MG 400 000 bis 500 000 und höher liegt. Nach sorgfältiger Filtration zeigt das Gelpermeationschromatogramm ferner, daß fast nichts von dem Material, falls überhaupt etwas, unter dem Molekulargewichtsniveau von 68 000 liegt. Der anfängliche Molekulargewichtspeak 68 000 von reinem Hämo¬ globin, gemessen durch Gelpermeationschromatographie, ver¬ breitert sich nach der Polymerisation, so daß die Retentionszeit von MG 68 000 etwas komplexer wird und damit größer - bis zu MG 90 000. Die Integration läßt sich an diesem letzten Peak in einer Weise durchführen, daß gefunden wird, daß wenigstens 20% im MG-Bereich 68 000 liegen. Diese Fraktion verursacht keine toxische Reaktion beim Tier, sondern wird lediglich durch die Nieren ausgeschieden und kann durch Probenahme im Urin festgestellt werden.
Außerdem ist die Lösung des vernetzten Hämoglobins im wesentlichen Endotoxin-frei wie auch pyrogenfrei und verursacht in vivo keine der folgenden anomalen und nachteiligen chemischen und physiologischen Funktionen: (1) er aktiviert kein Komplement; (2) verursacht keine hämorrhagischen Störungen; (3) verursacht keine anomale Blutplättchenfunktion oder -aggregation; (4) verursacht keine anomalen Prothrombin-Zeiten (PT); (5) verursacht keine anomalen partiellen Thromboplastin-Zeiten; (6) stört nicht bei Blutgruppenbestimmung oder Kreuzproben; (7) ist gegenüber den Nieren nicht toxisch bei 3,5 g/kg Körpergewicht oder 8 g/dl Blutzirkulationsvolumen; (8) zeigt eine Kreislaufpräsenz von wenigstens sieben Tagen; und (9) wirkt als Stimulans für beschleunigte Erythropoese.
Die Bezeichnung "vernetzt" oder "polymerisiert" . soll sowohl intermolekulares als auch intramolekulares Polyhämoglobin umfassen, mit wenigstens 50% des Polyhämoglobins in höherer als der tetrameren Form.
Die Bezeichnung "Endotoxin-frei" kann für den Zweck der vorliegenden Erfindung beschrieben werden als eine Lösung, die weniger als 1,0 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter Lösung enthält, bei einer Konzentration von 10 Gramm Hämoglobin pro Deziliter Lösung.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die "Endotoxin-freie" Lösung des vernetzten Hämoglobins für die Verwendung nach dieser Erfindung weniger als 0,5 und vorzugsweise weniger als 0,25, meistbevorzugt weniger als 0,02 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter Lösung (EU/ml), gemessen mit Hilfe des Limulus-Amöbocyten-Lysat(LAL)- Tests. Der LAL-Test wird beschrieben von Nachum et al. , Laboratory Medicine 13, 112-117 (1982), und Pearson III et al., Bioscience j , 461-464 (1980).
Mit der Bezeichnung "Endotoxin(e) " sind die im allgemeinen zellgebundenen Lipopolysaccharide gemeint, die als ein Teil der äußeren Schicht von Bakterien-Zellwänden produziert werden, und die unter vielen Bedingungen toxisch sind. In ein Tier injiziert, verursachen Endotoxine Fieber, Diarrhöe, hämorrhagischen Schock und andere Gewebeschädigungen.
Mit der Bezeichnung "Endotoxin-Einheit" (EU) ist die Bedeutung gemeint, die von der US Pharmacopeial Convention von 1983, S. 3014, gegeben wurde, wonach die EU definiert ist als diejenige Wirkung, die in 0,2 ng der US- Vergleichsstandard-Charge EC-2 enthalten ist. Eine Phiole EC-2 enthält 5000 EU.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Lösung von vernetzten Hämoglobin umfaßt die Schritte (1) Gewinnen des Blutrohprodukts, (2) Fraktionieren des Blutrohprodukts, um eine Fraktion roter Blutkörperchen zu ergeben, die im wesentlichen frei ist von weißen Blutkörperchen und Blutplättchen, (3) mechanisches Zerreißen der Fraktion roter Blutkörperchen, um eine Hämoglobin-haltige Lösung zu ergeben, (4) Klären der Hämoglobin-haltigen Lösung, um eine Hämoglobin-Lösung zu ergeben, die im wesentlichen frei ist von Zellfrag¬ menten, (5) Mikroporenfiltration der Hämoglobin-Lösung, die im wesentlichen frei ist von Zellfragmenten, um eine teilweise sterilisierte Hämoglobin-haltige Lösung zu ergeben, (6) Ultrafiltration der teilweise sterilisierten Hämoglobin-haltigen Lösung, um eine nach Größe getrennte, Hämoglobin-haltige Lösung zu ergeben, (7) chromatographische Trennung der nach Größe getrennten Hämoglobin-haltigen Lösung, um ein Hämoglobin zu ergeben, das im wesentlichen frei ist von Phospholipiden und Nicht¬ Hämoglobin-Proteinen, wobei das Hämoglobin auf der chromatographischen Säule zurückgehalten wird, (8) Eluieren des im wesentlichen Phospholipid-freien Hämoglobins aus der Säule, um eine im wesentlichen Endotoxin-freie Hämoglobin-Lösung zu ergeben, (9) Vernetzen der im wesentlichen Endotoxin-freien Hämoglobin- Lösung, um die Lösung des vernetzten Hämoglobins zu ergeben, und (10) teilweise Trennung der Lösung des vernetzten Hämoglobins durch Filtration, wobei alle Schritte in einer im wesentlichen Endotoxin-freien Umgebung ausgeführt werden.
Grundsätzlich kann aber auch jede andere Lösung von vernetztem Hämoglobin zur Bekämpfung von septischem oder hämorrhagischem Schock eingesetzt werden, sofern sie die oben beschriebene Molekulargewichtsverteilung, Osmolarität, Phospholipid- und Pyrogenfreiheit aufweist.
Dennoch soll nachstehend beispielhaft ein Verfahren beschrieben werden, welches zur Herstellung der .Lösungen von vernetztem Hämoglobin geeignet ist, welches erfindungsgemäß verwendet werden kann.
A. Blutgewinnung
Ausgangspunkt ist eine Quelle für Erythrocyten (rote Blutkörperchen). Solchermaßen kann das Ausgangsmaterial frisch entnommenes menschliches Blut sein, überaltertes Blut aus Blutbänken, Plazenta, oder es können abgepackte Erythrocyten sein, erhalten von Humanspenderzentralen. Ferner sind auch aus Tierblut erhaltene Erythrocyten genausogut geeignet. Demgemäß kann Blut verwendet werden, das aus einer Vielzahl von Quellen stammt wie etwa Rindern, Schafen oder Schweinen. Aufgrund seiner leichten Verfügbarkeit ist Rinderblut, erhalten aus Schlachthäusern, die bevorzugte Erythrocyten-Quelle.
Das Verfahren macht spezielle Techniken bei der Gewinnung und Handhabung von Blut in großen Mengen erforderlich. Es werden große Sammel-Troicarts verwendet, die das Blut steril entziehen. Die Troicarts müssen sorgfältig eingeführt und gehandhabt werden und sind an Schläuche von ungefähr 60 cm (2 Fuß) Länge angeschlossen. Um den Troicart einzusetzen, muß das Fell weggeschnitten und zurückgeschält werden, und der Troicart wird dann in die Hauptgefäße des Tieres nahe am Herzen eingesetzt, wobei darauf zu achten ist, daß der Schlund nicht punktiert wird. Es ist wichtig, das Einschleppen von Bakterien zu vermeiden und das Material Endotoxin-frei oder auf niedrigem Endotoxin-Spiegel zu halten. Dies wird erreicht durch Verwendung einzelner Behälter, die mit einem Antikoagulationsmittel vorbeschickt, pyrogenfrei gemacht und nochmals auf Endotoxine geprüft werden. Zu den typischen Antikoagulationsmitteln gehört Natriumeitrat. Auf alle Fälle müssen die Endotoxin-Spiegel der Behälter unter 0,01 Endotoxin-Einheiten liegen, gemessen mit Hilfe des LAL.
Mit dieser Lösung werden dann kleine Gefäße beschickt, die zwischen 7,57 - 37,85 1 gesammeltes Blut steril fassen können und somit das Blut in Endotoxin-freiem Zustand halten. Das gesammelte Blut im Behälter wird sofort abgedeckt, um Kontakt mit der Umgebung zu vermeiden. Nach Beendigung des Sammelvorgangs wird das Material gekühlt, typischerweise auf ungefähr 4°C, um das Bakterienwachstum einzuschränken. Zu diesem Zeitpunkt wird das Blut noch nicht zusammengemischt; das Blut wird später auf Endotoxine und Sterilität geprüft, um sicherzustellen, daß (1) keine der Kühe krank ist; oder (2) durch eine schlechte Gewinnungstechnik die gesamte Charge oder gewonnene Menge dieses Tages nicht kontaminiert wurde.
B. Abtrennung der roten Blutkörperchen
Das Blut wird zur zentralen Verarbeitung gebracht, zu welchem Zeitpunkt aus jedem Gefäß Proben entnommen werden, und die Gefäße durch LAL-Analyse auf Endotoxin-Spiegel geprüft werden. Ist der Endotoxin-Spiegel höher als 6- 7 EU/ml, dann wird das Blut verworfen. Nur wenn die Prüfung der einzelnen Blutbehälter ergibt, daß die Endotoxin-Spiegel darunter liegen, wird das Material als gut für die Weiterverarbeitung befunden. Die typische Weiterverarbeitung im Stand der Technik bestand darin, das Blut (ACD-antikoaguliertes Blut) in einer Salzlösung mit physiologischer Salz-Konzentration zu suspendieren und zu zentrifugieren, um die Plasmaproteine und weißen Blutkörperchen wirksam von den roten Blutkörperchen zu trennen. Dieser Suspendiervorgang wird durchgeführt mittels mehrerer "Wasch"-Stufen, d.h., 2- 4mal, um möglichst alle freien Proteine abzutrennen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wurde jedoch gefunden, daß dieser Ansatz im praktischen Herstellungsmaßstab nicht haltbar war; zur Abtrennung des Hämoglobin-Produkts, so daß es frei von vielen Verunreinigungen ist, • ist es tatsächlich nicht notwendig, diesen Waschvorgang überhaupt durchzuführen.
Beim bevorzugten Verfahren wird das Vollblut vom Tier, sobald es auf Endotoxine geprüft ist, durch eine halbkontinuierlich arbeitende Zentrifuge geleitet, wobei die roten Blutzellen, die weißen Blutzellen und das Plasma in beliebig großem Maßstab abgetrennt werden können. Bei dem Verfahren wird eine halbkontinuierlich arbeitende Kessel-Zentrifuge eingesetzt, wobei der Kessel bei 15 000 bis 18 000 U/min gehalten wird, z.B. eine Sharples-AS-15- Einheit. Der Kessel und der obere Aufbau werden mit einer Öffnung eines bestimmten Radius angeordnet, der eine diskrete Schichtentrennung gestattet, so daß rote Blutzellen, weiße Blutzellen und Plasma durch diesen Vorgang abgetrennt werden können. Zwar wird die Sharples- Kessel-Zentrifuge bevorzugt, doch gehören zu den typischen, ebenfalls geeigneten Trenngeräten auch Trommel- Zentrifugen, wie sie von Beckman Instruments hergestellt werden.
Zur Vorbereitung dieses Arbeitsgangs wird die Zentrifuge depyrogeniert, d.h., typischerweise unter Verwendung von 0,5 molarem Natriumhydroxid, wenigstens 1 h lang vor Installierung in den Maschinengehäusebehälter. Die oberen Tüllen oder SammelVorrichtungen werden in ähnlicher Weise behandelt, so daß vollständige Depyrogenierung aller Kontaktoberflächen möglich ist, auf die das Blut treffen kann. Sobald die Teile den Depyrogenierungsvorgang durchlaufen haben, wird das System zusammengesetzt. Eine Drehkolbenpumpe oder Schlauchpumpe in Sanitärausführung wird verwendet, um Flüssigkeit durch das gesamte System und die Sammelanschlüsse zu spülen; typischerweise wird eine Lösung von 0,5 molarem Natriumhydroxid verwendet, doch sind auch andere der Fachwelt bekannte Depyro- genierungslösungen geeignet. Gegen Ende der Spülung ist es erforderlich, den pH bis in einen Bereich zu senken, der der Handhabung der Hämoglobin-Lösung dienlich ist. Dies wird erreicht durch eine Wasserspülung, die den pH bis in einen Bereich von ungefähr 7-9 senkt. In einigen Fällen war es aufgrund der Dichteunterschiede zwischen Depyrogenierungslösung und Wasser nötig, eine Säurelösung zu verwenden, um die beim Depyrogenierungsschritt eingesetzte starke Base neutralisieren zu helfen. All diese Lösungen müssen vor Verwendung bei den Wäschen depyrogeniert und geprüft werden.
Sobald das pH-Niveau auf unter 9 gebracht worden ist, werden Proben von den austretenden Strömen der Ze trifuge erhalten, und die Endotoxin-Prüfung wird vorgenommen. Ist ein Endotoxin-Spiegel von 0,01 EU/ml oder weniger erreicht, so ist das System bereit zur Trennung von Blut. Bei dieser Trennung ist jedoch kritisch, daß die Fließgeschwindigkeit des Bluts in die Zentrifuge mit ausreichend großer Geschwindigkeit erfolgen soll, um das in der Sharples-Zentrifuge verursachte Ausmaß an Sedimentierung roter Blutkörperchen zu beschränken. Ist die Fließgeschwindigkeit zu gering, so setzen sich die roten Blutkörperchen im Zentrifugenkessel ab und können nicht in einem separaten Behälter getrennt oder gesammelt werden. Bei einer Zentrifuge mit einem Kessel von etwa 10 cm Durchmesser ist eine Fließgeschwindigkeit von über 2,5 bis 3 1/min, aber nicht mehr als 6 1/min erforderlich, um die Sedimentierung einzuschränken. Wird eine größerer Kessel oder werden andere g-Kräfte eingesetzt, dann sind andere Fließgeschwindigkeiten erforderlich, wobei die speziellen Parameter zum Fachwissen gehören.
Sobald alle Parameter festgelegt sind, wird das Blut aus den verschiedenen Ansätzen oder verschiedenen Kühen in das System eingeführt, und der Ablauf (abgetrennte rote Blutkörperchen) wird unter sterilen Bedingungen in einem separaten Behälter aufgefangen. An diesem Punkt jedoch wird der Ablauf zusammengeführt und wird nicht • mehr je nach einzelnem Tier behandelt. Um jegliche pH-Schwankungen oder zu Anfang mögliche Einschleppung von Bakterien in die Zentrifuge auszuschließen, wird ein Überdruck sterilen Stickstoffs auf die Kammer gegeben, in der sich der Kessel dreht. Zur richtigen Sterilisierung des Systems kann ein Dampf-Sterilisierungszyklus angewandt werden, indem Dampf in die Drehkesselkammer eingeführt und diese bis zu einer Stunde lang vor Verwendung bedampft wird. Nach Beendigung des Bedampfens wird das System gekühlt, d.h., durch Glycol-Kühlleitungen, typischerweise auf ungefähr 4°C. (Nach Entnahme vom Tier ist es wichtig, daß das Blut auf eine Temperatur gerade oberhalb des Gefrierens gebracht, typischerweise auf ungefähr 4°C, und dort belassen werden soll. )
Bei der Abtrennung der roten Blutkörperchen ist es wichtig, daß die Auffangkammer, d.h., der Bereich um die Tüllen, wo die roten Blutkörperchen am oberen Ende des Hochgeschwindigkeitsdrehkessels aufgefangen werden, so aufgebaut ist, daß die Zellen kräftige Stöße erfahren. Indem die roten Blutzellen auf diese Oberflächen auftreffen, werden sie durch mechanischen Abbau zerbrochen, im Gegensatz zur Verwendung einer hypotoni¬ schen Lösung. (In einer hypotonischen Lösung schwellen die roten Blutkörperchen und bringen die Membran aufgrund hydraulischer Kräfte zum Aufbrechen.) Dies ist ein Übergang von der normalen Verfahrensweise des Anschwellens von Zellen, um sie durch hydraulischen Druck zu lysieren, hin zu der des mechanischen Abbaus. Dieser mechanische Abbau ist außerordentlich schnell und erzeugt nicht in dem hohen Maß freie kleine Bestandteile der Zellmembran, wie sie bei anderen Methoden gefunden werden. Die roten Blutkörperchen werden in einem Gefäß aufgefangen und für den zweiten Zentrifugen-Arbeitsgang vorbereitet.
C. Klärung der roten Blutkörperchen
Sobald das Blut verarbeitet ist und die roten Blutzellen von den weißen Blutzellen und Plasma getrennt sind, werden die mechanisch aufgebrochenen roten Blutzellen verdünnt, wobei reines depyrogeniertes Wasser verwendet wird, das bei niedriger Temperatur, d.h., ungefähr 4°C, gehalten wurde. Typischerweise werden die aufgebrochenen roten Blutzellen um wenigstens 50% verdünnt. Dann werden die roten Blutkörperchen in den zweiten Trennungsschritt eingebracht; typischerweise kann ein ähnlicher Zentrifugentyp wie beim ersten Arbeitsgang verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Sharples-Zentrifuge mit einem 10 cm-Kess.el in halbkontinuierlicher Arbeitsweise und einer Drehzahl von 15 000 bis 18 000 U/min verwendet. Allerdings wird die Fließgeschwindigkeit erheblich vermindert: Empfohlen werden 0,5 1/min oder weniger. Im Unterschied zum ersten Verarbeitungsschritt wird bei diesem Schritt ein anderer Aufbau des Kopfteils der Zentrifuge eingesetzt. Bei diesem Schritt wird keine Trennung zweier Schichten bewirkt wie etwa die Zusammensetzung Plasma, weiße Blutzellen und rote Blutzellen. Diese Klärungsstufe führt zur Abtrennung aller Zeil-Fragmente von der freigesetzten Hämoglobin-Lösung. Die gleiche Sorgfalt, die im ersten Schritt für die Depyrogenierung und die Sterilität aufgewandt wurde, muß im zweiten Schritt walten. Sobald das Material aus diesem zweiten Schritt gewonnen ist, ist es fertig für die Mikroporenfiltration.
D. Mikroporenfiltration
Bei einer Mikroporenfiltration muß anders vorgegangen werden als bei der Arbeitsweise der Druckfiltration. Im praktischen Sinne ist die Druckfiltration für die Verarbeitung von Hämoglobin-Lösungen im technischen Maßstab nicht annehmbar. Um die Mikroporenfiltration erfolgreich einzusetzen, kann entweder ein Rahmen- Filtrations- oder ein Hohlfaser-Filtrationssystem verwendet werden; es muß jedoch so betrieben werden, daß der Druckabfall quer durch die Membran (der Transmembran- Druck) sorgfältig um ungefähr 3,447«10 Pa [5 pounds per Square inch (psi)] gehalten wird. Übersteigt der Druckabfall die Toleranzschwelle um 1 bis 2 psi, dann wird die Membran durch die verbliebenen Zeil-Fragmente rasch verstopft, und die Flußgeschwindigkeit quer durch die Membran fällt auf ein Niveau, das für eine technische Reinigung in halbkontiuierlicher Arbeitsweise unannehmbar ist.
Während der Tangentialfluß dieses Materials quer durch clie Membran bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 bis 5 1/min liegt, liegt der Fluß durch die Membran in der Größenordnung von 0,1 bis 0,2 1/min. Diese Betriebsgeschwindigkeit wird beibehalten, um Zeil- Fragmente davon abzuhalten, sich auf der Membran anzusammeln. Sobald die Konzentration der Lösung tan- gential zur Membran auf weniger als 10% der Anfangslösι:ng abfällt, wird die verbleibende Lösung verworfen oc „r wieder mit Wasser verdünnt, um zusätzliches Produkt zu extrahieren und dadurch eine höhere Ausbeute an Hämoglobin vom System zu erhalten.
Beim Filtrationssystem können Drehkolben- oder Schlauchpumpen in Sanitärausführung verwendet werden, womit sich die Zahl der Verschlüsse und Wellen verringert und beschränkt, die die Einschleppung von Bakterien und Pyrogen-Kontamination hervorrufen können. Es können jedoch auch andere Pumpenausführungen verwendet werden, die im Stand der Technik zum Sanitärpumpen bekannt sind. Zu diesen Pumpen gehören Kreiselpumpen, Zahnradpumpen und röhrenförmige Membranpumpen.
Die Membransysteme werden vorbehandelt, um die Depyrogenierung und den richtigen pH sicherzustellen. Bei unsachgemäßer Durchführung werden an diesem Punkt Pyrogene eingebracht, und es wird zusehends schwieriger, sie im Verlauf der verbleibenden Verfahrensschritte zu entfernen. Depyrogenierung und pH-Einstellung werden bewerkstelligt unter Verwendung standardmäßiger Hygiene- und Depyrogenierungsverfahren, d.h., typischerweise mit Natriumhydroxid und umfangreichen Waschungen mit pyrogenfreiem Wasser, um den pH auf annehmbare Bereiche für die Behandlung der Hämoglobin-Lösung zu bringen (< pH 9) . Während die Handhabung einer Transmembran- Druckbegrenzung in derartiger Weise nicht sehr bekannt ist und erst in den letzten Jahren von Fall zu Fall bei der Verarbeitung von Gewebeflüssigkeiten praktiziert- wurde, gehören geeignete Techniken zum Fachwissen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Begrenzung der Filtratseite vorgenommen, so daß die
Flußgeschwindigkeit auf ihren stationären
(nichtverstopfenden) Zustand beschränkt ist. Wird ein
Flüssigkeitsstrom in ein Membransystem mit Tangentialfluß eingebracht, und der Einlaßdruck beträgt ungefähr
1,379®10 Pa (20 psig), der Auslaßdruck 0 Pa, und die
Filtratseite der Membran ist auf 0 Pa, woraus sich ein durchschnittlicher Transmembrandruck (ATP) von
5 0,689®10 Pa (10 psi) ergibt, so zeigt die zu filtrierende
Lösung die Neigung, in die poröse Membranoberfläche zu drängen und sie zu fül" ~ι. Die Membran wird erheblich verstopft und wird durch ...e Tangentialscherung, die durch den Querfluß der Flüssigkeit erzeugt wird, nicht gesäubert. Durch Begrenzung des Auslasses (Filtrat), so daß der ATP nur 0,0689 - 0,1379 Pa (1 bis 2 psi) beträgt, säubert der Tangentialfluß die Oberfläche, und der Fluß durch die Membran bleibt konstant, wenn auch gering gegenüber den anfänglichen Flußgeschwindigkeiten mit hohem ATP. Der Fluß unter Bedingungen des stationären Zustands kann 0,2 1/min bei 0,0689 - 0,1379 Pa (1 bis 2 psi) ATP betragen und 1 bis 1,2 1/min bei 1,379®105 Pa (20 psi) ATP. Der ATP von 1,379®105 Pa (20 psi) wird jedoch konstant bleiben und den Fluß innerhalb von Minuten auf null abfallen lassen.
M i t B e e n d i g u n g d i e s e s e r s t e n Mikroporenfiltrationsschrittes ist die Lösung wenigstens teilweise sterilisiert, und alle Zellfragmente größer als 0,45 μm sind entfernt. In einigen Fällen kann es erforderlich werden, die Lösung an diesem Punkt steril zu machen. In diesen Fällen kann, nachdem die 0,45-μm- Mikroporenfiltration beendet ist, eine 0,22-μm- Mikroporenfiltration in gleicher Weise wie die 0,45-μm- Mikroporenfiltration angewandt werden. Die entstandene Lösung ist nun bereit für die folgenden molekularen Trennungen.
E. Ultrafiltration
Zum nächsten Schritt gehört das sorgfältige Abstufen der Filtration bezüglich Molekulargewicht 100 000 (gemessen in Dalton) unter Verwendung von Membranen, die alles mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 wirksam zurückhalten und alles mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 hindurchlassen. Typische Membranen sind im Handel erhältlich von Millipore Corporation und werden unter dem Handelsnamen Durapore vertrieben. Alles unterhalb dieser Grenzen wird durch das Membransystem filtriert. Hämoglobin (Molekulargewicht ungefähr 67 - 68 000) passiert dieses Membransystem und wird in einer Behälterbatterie aufgefangen.
Dieser umfangreiche Membranfiltrationsvorgang bedarf sorg¬ fältiger Überwachung, da sich die Membran innerhalb von Stunden verstopft und der Filtrationsfluß rasch abnimmt. Deswegen ist es notwendig, die Membran regelmäßig mit einer reinen Wasserlösung zu spülen. Das Spülen vermindert die Zellfragmente, die ansonsten die Membran bedecken und verschließen, wodurch sich die Flußgeschwindigkeit der Hämoglobin-Lösung verringert. Der Zeitzyklus des Tangentialquerflusses über diese Membran kann bis zu 2 h betragen und hat keinen Einfluß auf den Methämoglobin- Spiegel oder die Eignung des Hämoglobins für den vorgesehenen Zweck. Sobald das Flüssigkeitsvolumen nach der Mikroporenfiltration auf ungefähr 30% seines Volumens während der Ultrafiltration verringert ist, kann steriles pyrogenfreies Wasser zugesetzt werden, um höhere Ausbeuten an Hämoglobin-Lösung zu erzielen. Die maximale Verdünnung beträgt etwa 50%. Dieses Material kann auch verworfen werden. Ist das 30%ige ursprüngliche Material verdünnt, so kann es wiederum auf etwa 30% vermindert werden, zu welchem Zeitpunkt es verworfen wird. Das filtrierte Zwischenprodukt wird für nachfolgende Arbeitsgänge in einer sterilen, pyrogenfreien Behälterbatterie aufbewahrt. Eine typische Vorrichtung zur Ausführung des Ultra¬ filtrationsschritts ist eine Millipore,-Pellicon-Kassette mit einer Durapore,-Membran; ebensogut können jedoch auch andere der Fachwelt bekannte Vorrichtungen verwendet werden.
Beim nächsten Ultrafiltrationsschritt geht es um die Abtrennung vom Material mit Molekulargewichten unter 68 000. Hierdurch werden kleine Hämoglobin-Moleküle und andere kleine Proteine isoliert, die vom Vollblutplasma mitgenommen worden sein können. In allen Fällen wird die Hämoglobin-Lösung bei einer Konzentration von etwa 5 bis 15 g/dl gehalten. Die mit diesem Schritt vorgenommene Filtration erbringt eine gewisse Konzentrierung. Bei hoher Konzentration erweisen sich die Flußgeschwindigkeiten als gering. Bei beiden UltrafiltrationsVorgängen, bei denen Membranen für MG 100 000 und MG 30 000 eingesetzt werden, sind die notwendigen Depyrogenierungsschritte und das anschließende Prüfen nach Waschen mit pyrogenfreiem Wasser normalerweise erforderlich.
Beim Trennungsschritt MG 100 000 können Pyrogene abgetrennt werden, da einige Pyrogene zwischen MG 100 000 und 1 000 000 liegen. Mit der Depyrogenierung der Membran für Molekulargewicht 30 000 und der Vorbereitung dieses Membranpakets für den FiltrationsVorgang hat die Hämoglobin-Lösung dieses Tangentialflußsystem passiert, um die Perfusion kleiner Moleküle durch die Membran zu gestatten. Bei diesem Arbeitsgang kann eine Rückführung vorgenommen werden oder nicht, welche beim Filtrationsschritt MG 100 000 allerdings erforderlich ist. Das Retentat (zurückgehaltenes Material) wird in einem Lagerbehälter gehalten und auf Endotoxine geprüft. Auf alle Fälle müssen die Endotoxine unter 0,5 EU/ml-, liegen, da bei nachfolgenden Arbeitsgängen die Abtrennung hoher Pyrogenkonzentrationen schwierig ist. Dieses Material wird unter einer sterilen Stickstoff- oder Argon-Atmosphäre aufbewahrt, die die Stabilität im System der Behälterbatterie aufrechterhält. An diesem Punkt des Verfahrens liegt der Methämoglobin-Spiegel typischerweise unterhalb 1%. Die Filtrationsschritte müssen bei niedrigen Temperaturen ausgeführt werden, typischerweise bei etwa 4°C. Im Anschluß an die Filtration wird das Material entweder tiefgefroren oder für die chromatographische Verarbeitung direkt in aliquote Chargenmengen geteilt. F. Chromatographie
Vor der chromatographischen Trennung liegt das Material in einer Konzentration von nicht weniger als 2 g/dl und nicht höher als 11 g/dl vor. Zum chromatographischen System gehören Pumpen, ein Gradientengenerator, Säulen und Detektoren.
Ein typisches Pumpsystem umfaßt ein Diaphragma-Pumpsystem mit einer Pumpleistung im Bereich von 1 bis 5 1/min. Zu einem solchen System gehört eine Diaphragma-Pumpe Pulsafeeder 8480 aus rostfreiem Stahl oder etwas Gleichwertiges. Für das Zufuhrsystem wird eine kleinere Pumpe verwendet, wobei der Durchfluß im Bereich von 0,1 1/min bis 1,5 1/min liegt. Typischerweise ist diese Pumpe eine kleinvolumigere, etwa in röhrenförmiger Diaphragma-Ausführung. Eine für diesen Arbeitsgang typische Pumpe ist eine Pulsafeeder 7120. Zur Zusammenstellung des chromatographischen Systems - so, daß es einwandfrei arbeitet - ist es erforderlich, daß zwei große Systeme so zusammengesetzt werden, daß das eine als Betriebssystem für die Chromatographie des Materials verwendet wird, während das andere System zum Spülen, Reinigen und Regenerieren der Säule verwendet wird-
Es wurde ein System zur Erzeugung von Lösungsmittelzusammensetzungen angefertigt, das Durchflußkontrollventile umfaßt, die dem passenden Pumpsystem eine proportionale Menge zweier Flüssigkeiten zuführen, wobei ein zeitlicher Flüssigkeit¬ zusammensetzungsgradient einer bestimmten Ionenstärke ent¬ steht. Mit Hilfe ionischer Wechselwirkung wird eine chromatographische Ionenaustauschtrennung auf dem Säulensystem bewirkt. Die Anfertigung dieses oder gleichwertiger Systeme gehört zum Fachwissen.
Ein typisches Durchflußkontrollventil ist ein Baumann- Durchflußkontrollventil, das so programmiert ist, daß es mit einer standardmäßigen programmierbaren Steuerung arbeitet, zum Beispiel einer programmierbaren Steuerung Texas Instruments 530. Alle Rohrleitungen und Schlauchleitungen zum System sind sanitärmäßig und sind aus 316L-Schlauchleitung von ungefähr 1/2" bis 1" Durchmesser. Das Zufuhrsystem durch den Gradienten¬ generator und durch die Pumpe führt zu einem Trennungsteil oder einer Trennsäule - wie der Fachwelt bekannt.
Die Säule ist typischerweise eine Röhre aus rostfreiem Stahl. Die Röhre aus rostfreiem Stahl kann verbunden werden mit Schlauchleitung vom Durchmesser 1,27 cm (1/2"), so daß sie eine lange Säule zur Erzielung einer Trennung umfaßt. Die Röhre oder Säule ist typischerweise mit Teflon ausgekleidet, um Verträglichkeit mit der inneren Oberfläche herzustellen, was beim Packen des inneren Mediums in das Säulensystem hilfreich ist.
Der Abfluß aus dem chromatographischen System kann dadurch überwacht werden, daß ein Teil des Stromes abgezweigt und diese kleine repräsentative Menge durch einen Brechungsindexdetektor geleitet wird, etwa ein Modell R401 von Waters Associates, oder durch _ einen Ultraviolettdetektor, typischerweise ein Modell 441 von Waters Associates. Diese Systeme können verwendet werden, um den Abflußstrom aus der Säule zu überwachen, um den Punkt festzustellen, an dem das interessierende Protein gerade eluiert wird.
Sind erst einmal alle Parameter festgelegt und die Richtlinien gesetzt, ist ein Detektor iir System nicht mehr nötig, und das Sammeln der Fraktionen läßt sich mittels einfacher Zeit-Elutionsprofile durchführen.
Diese Materialien können entweder angefertigt oder bezogen werden von verschiedenen Zulieferern von Rohrleitungen und Schlauchleitungen technischer Qualität. Die Säule wird angefertigt, um gleichmäßige Verteilung der Probe zu erzielen, die am Kopf der Säule aufgebracht wird, sowie - was damit in Zusammenhang steht - gleichmäßiges Auffangen der Proben vom Abfluß der Säule. Von Bedeutung ist das Verhältnis von Länge zu Durchmesser insoweit, als die Schaffung einer zu langen oder zu kurzen Säule sich deutlich auf die Wirksamkeit der Trennung und die quilibrierung zur Durchführung des Ionenaustausches auswirkt.
Die Säule umfaßt Trennungsmedien, die in gewissem Ausmaß irreversible Adsorption von Phospolipiden (irreversibel bei der einfachen Arbeitsweise) und eine diskrete Ionenaustauschtrennung unter Anwendung eines bestimmten Gradientenelutionsmusters des Lösungsmittels gestatten. Die Trennungsmedien umfassen Kieselgel-Teilchen mit einer Größe von etwa 50 bis 150 um; der Durchfluß durch dieses Material liegt im Bereich von etwa 2,5 1/min.
Das Kieselgel besitzt eine durchschnittliche Porengröße von 30 nm (300 Ä) , gemessen durch BET-Stickstoff- Adsorption. Dieses Kieselgel kann bezogen werden von verschiedenen Herstellern, z.B. W.R. Grace . Davison Chemical Co.. Dieses Gel ist das bevorzugte Substrat, um darauf die derivatisierte Oberfläche aufzubauen, die die funktionalisierte Eigenschaft zur Trennung der Hämoglobin- Lösung liefert.
Zur Herstellung der Trennungsmedien ist es notwendig, die Kieselgel-Oberfläche zunächst mit einem speziellen Silan zu derivatisieren, das auf der Kieselgel-Oberfläche eine Oberfläche vom Diol-Chemotyp erzeugt. Dieses Diol kann typischerweise erhalten werden durch Schaffung eines Glycidoxypropyltrimethoxysilan-Überzugs auf der Oberfläche, mit Methoden, die auf dem Gebiet der Chromatographie wohlbekannt sind, typischerweise durch Suspendieren des Kieselgels und des Silans in einem Gefäß unter teilweiser Verdünnung mit Wasser. Die Reaktion ist eine Wasser-Base-Reaktion, und dieses Polymer beschichtet die Oberfläche des Kieselgels. Diese Reaktion, mit der das Kieselgel beschichtet wird, erfordert eine Reaktionszeit von 20 h bei ungefähr 70°C. Sobald diese Beschichtung des Kieselgels erreicht ist, kann das Material in einfacher Weise durch eine Reihe von Methanol- und Aceton-Wäschen gewaschen werden, um ein sauberes; permanent gebundenes, Diol-beschichtetes Kieselgel zu ergeben. Das Material wird dann getrocknet und für den zweiten Schritt oder eine Reihe von Schritten vorbereitet, wobei die Oberfläche mit verschiedenen Monomeren beschichtet wird, und die Oberfläche wird derivatisiert , um eine Oberflächeneigenschaft vom Typ eines quartären Amins zur Durchführung der speziellen Art der Ionenaustauschtrennung zu erhalten. Die organische stationäre Phase ist eine dünne Haut aus vernetztem Polymer. Das auf die Oberfläche aufgebrachte vernetzte Polymer ist aufgebaut aus zwei verschiedenen hydrophilen Vinyl-Monomeren. Zum Beispiel kann ein Monomer wie etwa N-Methylacrylamid in 48%iger wäßriger Lösung ( Si lar Labs ) und Methylaminopropyltrimethylammoniumchlorid verwendet wer¬ den.
Die beiden Monomere haben verschiedene Fähigkeiten; ein Monomer wird mit einem anderen funktioneilen Monomer copolymerisieren, d.h., eines, das die erwünschten Ionenaustausch- oder Adsorptionseigenschaften aufweist. Es vernetzt mit anderen Polymer-Ketten und verankert das vernetzte Polymer an der Kieselgel-Oberfläche.
Die für diesen Zweck ausgewählten Monomere besitzen eine Vinyl-Funktion und reaktive Gruppen, die in einer Weise reagieren, daß sie miteinander reagieren können, unter Bildung der für die Beschichtung der Oberfläche notwendigen Brücken sowie der Beschichtung der stationären Phase, bestehend aus einer funktionellen Amin-Gruppe, wodurch die lonenaustauschfähigkeit im erwünschten Bereich erzeugt wird.
Sobald diese beiden Monomere in der wäßrigen Lösung suspendiert sind sowie mit einer Methanol-Lösung des Kieselgels, wird die Suspensionslösung abgedampft, wobei die auf und in das Kieselgel aufgebrachten Monomere zurückbleiben. An dieser Stelle wird die Mischung in einer neuen Lösung resuspendiert, die auch ein RadikalinitiierungsSystem enthält, etwa ein Produkt von Du Pont, Vazo 64. Zur Initiierung der Reaktion wird die Reaktionsmischung auf einen Punkt erhitzt, wo sie bei 70- 75°C gehalten wird, nicht darüber und nicht darunter.
Bei dieser Temperatur geht die Reaktion vonstatten, und das Polymer beschichtet die Oberfläche und wird daran gebunden, einschließlich der funktionellen Gruppen, welche die für das chromatographische Medium verwendete Oberflächeneigenschaft erzeugen. Nach Beendigung der Reaktion ist es notwendig, unumgesetztes Monomer mit einer Reihe von Waschungen mit mehreren Lösungsmitteln wie etwa Aceton und Methanol abzutrennen. Nach Beendigung dieser Waschungen wird das Material getrocknet und ist fe tig zur Verwendung.
Ein typischer Säulendurchmesser ist etwa 15 cm (6"), und eine typische Säulenlänge ist 60 cm (2 Fuß). Geeignete Varianten gehören jedoch zum Fachwissen. Der maximale Betriebsdruck ist 3,44 MPa (500 psi). Die Einspritzung erfolgt durch Pumpen der Lösung auf die Säule, typischerweise ungefähr 1 Minute lang mit einer Geschwindigkeit von 1 1/min, dann wird die Einspritzung beendet. Daher ist der Beladungsfaktor nicht größer als 1 Liter Material bei 7 g/dl. Nach Beendigung der Beladung mit Hämoglobin-Lösung wird ein isokrater Durchfluß mit Puffer (z.B. Tris-Puffer mit pH 8,9 bis 9,0) auf die Säule angewandt, und der Durchfluß wird fortgesetzt bis zu einem Zeitpunkt, ,an dem Gradient oder der Durchfluß variabler Zusammensetzung einsetzt. Der Puffer als das primäre Elutionsmittel wird dann mit der Zeit verdünnt. Typischerweise besteht das Elutionsmittel aus einer Tris- Puffer-Basislösung, die bereitet wird in einer Konzentra¬ tion von 1,8 g/1 Tris mit einem pH von 8,6 - 9,2. Der Temperaturbereich für die Elution beläuft sich auf 3 - 10°C. Diese Bereiche sind von Bedeutung, da durch Änderung des Temperaturbereichs auch der pH der Elutionslösung geändert wird. Die Sekundärlösung für die Elution des interessierenden Materials kann hergestellt werden unter Verwendung einer Lösung von Tris-Puffer, in gleicher Weise hochgereinigt wie der vorherige Puffer. Dieser Puffer enthält zusätzlich auch Salz zu 1 molarer Konzentration. Der pH dieser Lösung ist ebenfalls eingestellt, so daß sie identisch ist mit der ursprünglichen pH-Lösung, die im Bereich von 8,6 bis 9,2 liegt. Die Freisetzung der Phospholipide findet vor der Elution des Hämoglobins statt, wobei die Endotoxine eluiert werden, nachdem der interessierende Hämoglobin-Peak aufgefangen ist.
Chromatographische Selektionsmethoden sind UV-Absorption, Brechungsindex, typischerweise unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Geräts, oder visuelle Beobachtung des Ausflußstroms. Typischerweise wird der erste Teil des eluierten Hämoglobins als Abfall verworfen; dann beginnt das Auffangen des Ausflusses und wird fortgesetzt, bis der Peak (oder das Signal) auf 20% bis 10% der Peak-Höhe abgenommen hat. Dies ist die Fraktion, die aufzufangen ist, und die für die Reinigung interessierende Fraktion. Wird das Auffangen über die entsprechende Retentionszeit hinaus fortgesetzt, dann können andere Proteine und/oder Endotoxine aufgefangen werden, und das Produkt kann unbrauchbar werden. Ebenso kann beim Auffangen vor der Peak-Retentionszeit das Material unannehmbare Kon¬ zentrationen an Endotoxinen enthalten. Die Gesamt-Phospho- lipide und unwesentlichen Hämoglobin-Unterkomponenten werden verworfen, sowohl die Peaks vor als auch nach der Retentionszeit. Dieses Auffangverfahren ergibt Zwischenproduktmaterial, das auf ungefähr 40 zu 1 verdünnt ist, in einem pH-Bereich von 8,9 bis 9,0.
In diesem pH-Bereich ist es erforderlich, das Material schnell einzuengen. In diesem verdünnten Zustand gehen Auftreten und Bildung von Methämoglobin mit hoher Geschwindigkeit vor sich. Zur Durchführung der Konzentrierung kann eine Membran mit MG 10 000 oder weniger verwendet werden. Annehmbar sind entweder Rahmen- Tangentialfluß- oder Hohlfaserflußsysteme. Zu den typi¬ schen Systemen gehört eine Millipore,-Pellicon-Kassette. Sobald Konzentrationsniveaus von 7 bis 10 g/dl und Methämoglobin-Spiegel von weniger als 1,5% erreicht sind, werden die Fraktionen für die Langzeitlagerung gesammelt. An diesem Punkt kann das Material auch in ein Reaktorsystem zur anschließenden Polymerisationsreaktion überführt werden.
Nach dem Auffangen im chromatographischen System wird die Chromatographiesäule einer Folge von Wäschen unterzogen, um sie für die zweite Beladung mit ungereinigtem -Material vorzubereiten. Wird diese Vorbereitung der Säule nicht durchgeführt, dann werden verschiedene Unterkomponenten und Verunreinigungen eluiert und machen nachfolgende Durchläufe wertlos. Typischerweise wird die Wäsche vollzogen unter Anwendung einer 100% pyrogenfreien 0,5 - 1,0 molaren NaCl-Wäsche für wenigstens 5 min oder 3 Säulenvolumina, und nicht mehr als 10 min oder 6 Säulenvolumina. Nach Beendigung der Puffergradienten- und Salzspülung wird die flüssige Phase auf die Anfangsbedingungen von 100% Tris-Puffer gebracht, d.h., 0,18 g/1 Tris-Puffer, und der pH wird für den Hämoglobin- Elutionsvorgang auf ungefähr 8,9 + 0,1 eingestellt. Bereiche für den Hämoglobin-pH wurden zwar untersucht, doch liefert der pH-Bereich 8,9 - 9 im chromatographischen System die höchste und beste Isolierung eines reinen Hämoglobin-Analogons. Bei niedrigeren Bereichen (8,6 -8,4) wird Hämoglobin in reinem Zustand eluiert, doch wird die Beladbarkeit des Trennmaterials mit Material drastisch herabgesetzt. Bei pH-Niveaus von 9,5 -11 geht die Methämoglobin-Bildung mit einer Geschwindigkeit vor sich, die es nicht erlaubt, die Methämoglobin-Spiegel niedrig zu halten. Außerdem besteht die Möglichkeit der gegenseitigen Verunreinigung. Bei diesem höheren pH-Bereich kann der Methämoglobin-Spiegel innerhalb 2 h 5% ansteigen. Das aus der Säule eluierte Material ist eine Hämoglobin-Lösung, die im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, Endotoxinen und Phospholipiden. Dieses Material ist aufgrund seiner Qualität brauchbar als Zwischenprodukt bei der Herstellung der Lösung des vernetzten, Endotoxin- freien, Phospholipid-freien, Hämoglobins.
G. Polymerisationsreaktion (Vernetzung)
Ist das Material entweder für eine Polymerisationsreaktion speziell vorgesehen oder vom tiefgefrorenen Zustand aufgetaut, wird es in einen sterilen pyrogenfreien Reaktor eingebracht, der über Rührblätter verfügt, die so angeordnet sind, daß schnelle Vermischung und hohe Scherung bewirkt werden. (Eine typische Apparatur ist ein 3-1-Applicon-Fermenter mit einem Flachschaufelrührer, der sich 1 inch über dem Boden des Reaktors befindet, und mit 5,5-inch-Prallflachen im Reaktor verteilt. Dies ist notwendig, um die Bildung von großen Polymeren zu verhindern, wenn das Vernetzungsmittel zugegeben wird.) Die dem Reaktor zugegebene Hämoglobin-Lösung wird in ein Kreislaufsystem gebracht, und die Hämoglobin-Lösung wird aus dem Reaktor abgezogen und durch eine Ausschlußmembran geleitet, typischerweise ein Ausschlußfilter MG 10 000, und in einer Umgebung mit wenig 02 in den Reaktor zurückgeführt. (Der Reaktor kann mit einem Inertgas, z.B. Argon, abgeschirmt werden.) Der letztere Vorgang wird so durchgeführt, daß ein Vakuum an den Reaktor angelegt und die Flüssigkeit im Reaktor mit Argon bedeckt wird. Äußerste Vorsicht ist geboten, um die Einschleppung von Bakterien an diesem Punkt auszuschließen; das Material ist pyrogenfrei und zeigt gemäß LAL-Analyse keine Endotoxine.
Dann wird dem Reaktor ein steriler pyrogenfreier Puffer (pH 8,9 - 9,1) durch ein depyrogenierendes Membranfilter zugesetzt, typischerweise ein Filter MG 10 000. Gleichzeitig wird eine Konzentrationsschleife MG 10 000 im Kreislauf geführt, um das Volumen zugeführter Flüssigkeit und aus dem Reaktorsystem austretender Flüssigkeit im Gleichgewicht zu halten.
Der zur Neutralisierung des hohen pH verwendete Reaktions- puffer ist eine physiologische Zusammensetzung aus Natrium, Chlorid und Kalium mit den typischen Werten 120 Milliäquivalente Natrium, 120 Milliäquivalente Chlorid und 4 Milliäquivalente Kalium. Der pH der Lösung wird mit HC1 und Tris-Base auf einen pH von 4,7 bis 5,2 eingestellt. Ist der pH während des Vorgangs der pH-Senkung zu niedrig, bilden sich große Mengen Methämoglobin an dem Punkt, an dem die neutralisierende Säurelösung eingebracht wird. Der Filtrationsprozeß wird fortgeführt, bis der pH im Reaktor auf einen Bereich von 7,4 bis 8,0 pH-Einheiten gefallen ist. An diesem Zeitpunkt wird die Zufuhr beendet, und die vernetzende Lösung wird zugegeben.
Geeignete Vernetzungsmittel sind offenbart in US-Patent 4 001 200 an Bonsen et al.. Dieses Zitat gibt eine Zusammenfassung mehrerer beispielhafter, im Handel erhältlicher Vernetzungsmittel, beginnend bei Spalte 6, Zeile 66 bis Spalte 8, Zeile 49. Bevorzugt ist die Klasse von Vernetzungsmitteln mit Aldehyd-Funktion, mehr bevorzugt sind Dialdehyde, wobei Glutaraldehyd das Vernetzungsmittel der Wahl ist. Bei Verwendung von Glutaraldehyd wird der Glutaraldehyd typischerweise mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 100 ml/h zugegeben. Typischerweise wird die Glutaraldehyd- Lösung hergestellt durch Auftauen von Glutaraldehyd mit hohem ReinheitsStandard (bei -20°C bis 4°C gelagert) innerhalb einer kurzen Zeitspanne, typischerweise 2-5 min. Diese Lösung, die vorzugsweise eine Konzentration an Glutaraldehyd von ungefähr 25% aufweist, wird dann pyrogenfreiem Wasser zugesetzt, wobei die Anteile eine Lösung ergeben, die vorzugsweise etwa 5 ml einer 25%igen Lösung, verdünnt in 100 ml pyrogenfreien Wassers ent¬ spricht. Die Lösung wird mit der oben angegebenen Geschwindigkeit dem Reaktor und der Reaktionsmischung zugesetzt.
Die Überwachung der vernetzenden Lösung und ihrer Wirkung auf die Vernetzung (Polymerisation) erfolgt durch Ge lpermeations chromatographie . Di e Gelpermeationschromatographie erfordert die Verwendung einer Säule mit einem hydrophilen Füllmaterial mit 30 nm (300 Ä) Porengröße mit einem Auflösungsvermögen von mehr als 24 000 Böden pro Meter. Eine typische Säule ist er¬ hältlich bei Waters associates; ein typisches Füllmaterial ist Waters Protein Pak 300SW. Das aufgezeichnete Elutionschromatogramm wird über die Zeit der Peak-Elution integriert und gegen das Ausgangsmaterial quantifiziert. Vorzugsweise wird ein Vernetzungsprozentanteil von 50% bis 70% erreicht. Diese Zahl wird ermittelt durch den Prozentanteil des aus der Säule eluierten Materials mit einem Molekulargewicht unter 600 000 Dalton und über 68 000 Dalton.
H. Membrankonzentrierung
Sobald mehr als 50-55% Vernetzung erreicht sind, was über die Gelpermeationschromatographie berechnet wird, ist die Lösung bereit für die Membrankonzentrierung MG 100 000. Im Laufe dieser Membranfiltration wird der Tangentialfluß der Reaktionsmischung über, die Membran geleitet, unter Permeation des Materials mit 68 000 oder darunter durch das Membransystem. Dies wird durchgeführt, bis eine etwa 25%ige Flüssigkeitsverminderung erreicht ist.
An dem Punkt, an dem die Vernetzung als vollständig erachtet wird, wird eine Abschrecklösung, d.h., eine Lösung von pyrogenfreiem Lysin, pH 7, zugesetzt. Die Konzentration der Lysin-Lösung beträgt 1 g/1. Diese Lysin- Lösung wird zugegeben, um die Polymerisationsreaktion von Glutaraldehyd mit Hämoglobin zu beenden und überschüssigen Glutaraldehyd zu komplexieren. Auch wird angenommen, daß dieses Material sich an unpolymerisierten Glutaraldehyd anlagert, der an Hämoglobin-Moleküle gebunden ist. Nach Beendigung der Zugabe wird die Molekulargewichtsverteilung bestimmt, und durch gelpermeationschromatographische Messung wird gefunden, daß diese sich stabilisiert hat. Dann wird mit der Filtration begonnen, um überschüssiges Lysin, überschüssigen Glutaraldehyd und sonstige Spezies abzutrennen, deren Molekulargewicht unter MG 100 000 liegt.
Das Gelpermeationsehromatogramm der anfänglichen unvernetzten Hämoglobin-Lösung zeigt Molekulargewichtgrößen von 16 000 bis 68 000 Dalton, wobei die größte Menge bei 68 000 Dalton liegt. Nach der Filtration liegt einiges, nicht mehr als 50%, Hämoglobin mit 68 000 Dalton vor, und das Auftreten von Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 68 000 Dalton ist nicht nachweisbar. Die Filtration des Materials nach dem Vernetzen gibt auch Gelegenheit, Elektrolyten und pH der Lösung auszugleichen, wodurch eine ausgewogene physiologische Lösung für die Injektion erhalten wird.
II. DAS PRODUKT Typischerweise die so erhaltenen und gemäß der Erfindung vermeidbare .Lösung des polymerisierten Hämoglobins weist folgende Merkmale auf: Die Molekulargewichtsverteilung des Materials ist so, daß mehr als 90% des Materials im Bereich von 68 000 bis 500 000 Dalton liegt. Die mittels Gefrierpunktserniedrigung gemessene Osmolarität beträgt typischerweise 220 bis 320 Milliosmol pro Liter Lösung. Das bei der Gelelektrophorese gezeigte elektrophoretische Muster weist Banden im Molekulargewichtsbereich 68 000 bis 500 000 auf. Der endgültige Hämoglobin-Gehalt kann auf 5 bis 25, vorzugsweise 9 bis 13 g/dl eingestellt werden, und der Methämoglobin-Spiegel liegt unter 20%, vorzugsweise unter 10%. Die Ionenkonzentrationen an Natrium, Chlorid und Kalium sind ungiftig für das Tier oder die Spezies, woran getestet werden soll. Die für den Phospolipid- Nachweis entwickelte Dünnschichtchromatographie zeigt nach dem Entwickeln durch Aufbringen von Iod eine saubere Platte. Phospholipide, bestimmt durch Phosphorsäure- Reduktion, sind nicht nachweisbar, wobei die Nachweisgrenze unterhalb 1 nmol/ml liegt. Als quantitati¬ ves Maß für freien Glutaraldehyd dient die GasChromatographie. Mit einer gaschromatographischen Nachweisgrenze von 1 pp kann kein Glutaraldehyd nachgewiesen werden. Außer Hämoglobin ist kein .anderes Protein vorhanden, wie durch Gelchromatographie und isoelektrische Fokussiermethoden bestimmt wird.
Die Lösung weist im allgemeinen weniger als 0,01 Endotoxin-Einheiten pro ml auf, gemessen mittels LAL (Limulus-Amöbocyten-Lysat ) -Test mit einer Empfindlichkeitsskala von 0,01 bis 0,1 und ist bei allen Prüfungen pyrogenfrei. Mit diesem Material wurden Untersuchungen an Kaninchen durchgeführt, und es zeigt die gleichen Eigenschaften, die ein p -ogenfreies Material zeigen würde, daß nämlich kein Fieber bei den Kaninchen auftritt. Dieses Material erzeugt keine ar πiale Endotoxin- Antwort und andere Faktoren bei den getes eten Kaninchen, da es mit hämorrhagischen Bedingungen korrelierte, denen eine Kaninchen-Kontrollgruppe unterworfen wurde, die dann eine reine Plasmafraktion mit 1/3 des Volumens erhielt. Es sei darauf hingewiesen, daß in allen Fällen etwas erhöhte Enzym-Spiegel auftraten sowie einige Gewebeschäden Ausdruck von Veränderungen in den Organen. Die meisten dieser Veränderungen wurden jedoch als reversibel erachtet und waren, wie bereits erwähnt, denen ähnlich, die auf hämorrhagische Bedingungen und Ersetzung durch eine reine Plasmaproteinfraktion zurückgehen. Dies läßt sich bei höheren Tieren interpretieren als Mangel an Endotoxin- Reaktion und anderen Faktoren. Die Reinheit, überwacht mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschkapazität zur Trennung, zeigt sich durch vier diskrete Peaks, die nach Quantifizierung chargenmäßig übereinstimmen, unabhängig von der durch Gelpermeationschromatoghraphie bestimmten Molekulargewichtsverteilung. Die hergestellte Substanz zeigt lebenserhaltende Fähigkeiten beim Sauerstoff- Transport, wie die P5Q-Werte von 2666 - 4798,8 Pa (20 bis 28 mmHg) zeigen. Weiterhin zeigen die erfindungsgemäßen Hämoglobin-Lösungen - was von Bedeutung ist - weniger klinisch signifikante gefäßverengende Eigenschaften als andere Lösungen vernetzten Hämoglobins nach dem Stand der Technik. Des weiteren zeigt das Material bei verschiedenen Säugerspezies Eigenschaften bezüglich vermehrten zellulären Auftretens roter Blutkörperchen und verursacht in vivo keine der folgenden anomalen und schädlichen chemischen und physiologischen Funktionen: (1) es ist nicht komplementaktivierend; (2) es verursacht keine hämorrhagischen Störungen; (3) es verursacht keine abnorme Thrombocyten-Funktion oder -Aggregation; (4) es verursacht keine abnormen Prothrombin-Zeiten (PT); (5) es verursacht keine abnormen partiellen Thromboplastin-Zeiten; (6) es beeinträchtigt Blutgruppenbestimmung oder Bluteinkreuzung nicht; (7) es ist ungiftig für die Nieren bei 3,5 g/kg Körpergewicht oder 8 g/dl Blutzirkulationsvolumen (8) es zeigt Zirkulationsbeständigkeit von wenigstens sieben Tagen; und (9) es wirkt als Stimulus für beschleunigte Erythropoese.
Typischerweise ist das Material beschaffen wie in nachstehender Tabelle charakterisiert:
STERILITÄT Steril gemäß standardmäßiger Kultur¬ technik
NICHT NACHWEISBARER ENDOTOXIN-SPIEGEL < 0,01 EU/ml Probe beim LAL-Test und bei Vergleich gegen Standardkurve, die bezüglich Empfindlichkeit im Bereich 0,01 EU/ml bis 0,125 EU/ml liegt
BEUTELINHALT Na 120 ± 20 Milliäquiv., Cl 115 ± 20
Milliäquiv., k 4,0 + 1 Milliäquiv.;
Hämoglobin 11 ± 2 g/dl;
Lysin < 1 g/1;
Glutaraldehyd - nicht nachweisbar
Tris < 1,5 g/1
Volumen pyrogenfreies H„0: 450 - 500 ml
Methämoglobin < 10%
Phospholipid < 1 nmol/ml
H ä m o g l o b i n - Molekulargewichts Verteilung :
% größer als 68 000 - wenigstens 50% % größer als 500 000 - 8 ± 2% Osmolarität mittels Gefrierpunktser¬ niedrigung: 220 - 320 Milliosmol pro Liter Lösung
STABILITÄT bei -20 °C über mehr als 8 Monate keine Veränderung; 5 Tage bei 4°C wobei Methämoglobin-Spiegel unter 10% Die Lösung des vernetzten Hämoglobins kann zur Behe iung des Endotoxinschocks bei Säugetieren und insbesondere beim Menschen eingesetzt werden.
Bevorzugt kann die Lösung des vernetzten Hämoglobins zur Behandlung der lang anhaltenden Hypotension, wie sie beim Endotoxinschock auftritt und zum multiplen Organversagen führt, verwendet werden.
Tritt als Folge des Endotoxinschocks ein Nierenversagen, insbesondere ein akutes Nierenversagen auf so kann die Lösung des vernetzten Hämoglobins ebenfalls zur schnellen Therapie verwendet werden.
In allen Fällen kann eine isotone Natriumchloridlösung mit einem Gehalt an vernetztem Hämoglobin von 5-25 g/dl, vorzugsweise 9-13 g/dl und besonders bevorzugt 9-11 g/dl in einer Dosis von 0,5-10 ml/kg, vorzugsweise 0,5-7 ml/kg und besonders bevorzugt 0,5-6 ml/kg Körpergewicht intravenös infundiert werden.
Die Lösung des vernetzten Hämoglobins eignet sich also ausgezeichnet für die Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von septischen und hämorrhagischen Schockzuständen, insbesondere zur Behandlung langanhaltender Hypotension und des daraus resultierenden multiplen Organversagens, wie beispielsweise des akuten Nierenversagens.
Weiter von Vorteil ist, daß eine derartige Lösung von vernetztem Hämoglobin in vivo keine der folgenden anomalen und schädlichen chemischen und physiologischen Funktionen verursacht: (1) sie ist nicht komplementaktivierend; (2) sie verursacht keine hämorrhagischen Störungen; (3) sie verursacht keine abnorme Thrombocyten-Funktion oder Aggregation; (4) sie verursacht keine abnormen Prothrombin-Zeiten (PT); (5) sie verursacht keine abnormen partiellen Thromboplastin-Zeiten; (6) sie beeinträchtigt Blutgruppenbestimmung oder Bluteinkreuzung nicht; (7) sie ist ungiftig für die Nieren bei 3,5 g/kg Körpergewicht oder 8 g/dl Blutzirkulationsvolumen (8) sie zeigt Zir¬ kulationsbeständigkeit von wenigstens sieben Tagen; und (9) sie wirkt als Stimulus für beschleunigte Erythropoese. Die Lösung kann mit Hilfe von im Stand der Technik herkömmlichen Verabreichungsmethoden verabreicht werden.
Die Lösung kann ferner mit wasserlöslichen, physiologisch annehmbaren, polymeren Plasmaersatzstoffen wie etwa Polyethylenoxid, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und Ethylenoxid/Propylenglycol-Kondensat vermischt werden. Das Material kann auch vermischt werden mit kolloidalen Plasma-ähnlichen Ersatzstoffen und Blutplasmaexpandern wie etwa linearen Polysacchariden, darunter Dextrane mit Molekulargewichten von 40 000 bis 70 000, Gummiarabicum-Pektinen, ausgewogener Flüssiggelatine und Hydroxyethylstärke.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.
Beispiele:
Als Lösung des vernetzten Hämoglobins wurde beispielhaft ein Material eingesetzt, wie es in der vorstehenden Beschreibung charakterisiert wurde. Zu näheren Einzelheiten zu diesem Material wird auf die EP-A-0 277 289 verwiesen.
An 7 narkotisierten Ratten wurde ein septischer Schock durch intravenöse Kurzinfusion (3 min) von 20 mg/kg Körpergewicht Lipopolysaccharid (Escherischia coli, Serotyp 0127:B8) ausgelöst. Die Kreislaufreaktion der Tiere ist charakterisiert durch eine deutliche Zunahme der Herzfrequenz und einen starken Abfall des arteriellen Blutdrucks, gemessen über einen Katheter, der in die Arteria carotis eingebunden wurde. Eine Stunde nach Injektion des Lipopolysaccharids wurde eine Lösung des vernetzten Hämoglobins (10 g/10 ml isotoner NaCl-Lösung) , mit einer Dosis von 5,2 ml/kg Körpergewicht über 6,5 min intravenös infundiert. Nach der Gabe der Hämoglobin-Lösung normalisierten sich Blutdruck und Herzfrequenz. An weiteren 6 narkotisierten Ratten wurde ein identisches Versuchsprotokoll, wie bei den mit der Hämoglobin-Lösung behandelten Tieren durchgeführt mit dem Unterschied, daß jetzt Hydroxyethylstärke, 10 g/100 ml isotoner NaCl- Lösung, 5,2 ml/kg Körpergewicht über 6,5 min 60 min nach Gabe von Lipopolysaccharid intravenös appliziert wurde. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit der Hämoglobin-Lösung konnte die Hydroxyethylstärke-Lösung die pathologischen Kreislaufparameter nicht normalisieren. Eine weitere Gruppe von 4 narkotisierten Tieren erhielt statt der Hämoglobin Lösung oder Hydroxyethylstärke nur isotone NaCl-Lösung und diente damit zum Vergleich als Zeit- Vehikel-Kontrolle. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1: Arterieller Blutdruck (MAP) und Herzfrequenz (HF) an narkotisierten Sprague-Dawley-Ratten vor und nach Gabe von Lipopolysaccharid (LPS, Serotyp 0127:B8), sowie nach Gabe von NaCl, von Hämoglobin-Lösung (HP) und Hydroxyethylstärke (HES) 60 min nach LPS- Gabe. (Mittelwert ± SEM)
MAP HF MAP HF MAP HF ir-mHg (Pa) pro min mmHg (Pa) pro min mmHg (Pa) pro min vor LPS 60 min nach LPS 60 min nach NaCl/HP/HES
NaCl Vehikel-Kontrolle, n - 4
117 ± 5,5 403 ± 6,3 74 ± 6,1 448 ± 22 79 ± 8,6 473 ± 25 (15,6kPa±733Pa) (9,86kPa±813Pa) (10,53kPa±1143Pa)
HP II (10 %ig) Kurzinfusion, n = 7
96 ± 4,1 386 ± 22 68 ± 4,1 433 ± 29 29 ± 6,3 413 ± 22 (12,79kPa±546Pa) (9,06kPa±546Pa) (12,26kPa±839Pa)
HES (10 %ig) Kurzinfusion, n ■ = 6
108 ± 6,7 397 ± 13 68 ± 2,7 445 ± 9,6 78 ± 4,4 477 ± 15 (14,39kPa±893Pa) (9,06kPa±359Pa) (10,39kPa±586Pa)
Figure imgf000039_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verwendung einer wassrigen Lösung von vernetztem Hämoglobin zur Behandlung des septischen und hämorrhagischen Schocks bei Säugetieren.
2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von als Folge von septischem Schock auftretenden lang anhaltender Hypotension und akutem Nierenversagen.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie wässrige Lösung des vernetzten Hämoglobins erhältlich ist aus Hämoglobin, das aus den roten Blutkörperchen eines Säugers isoliert und in einem wäßrigen Medium suspendiert wird, wobei die Hämoglobin-Lösung frei ist von Stroma roter Blutkörperchen und einen Endotoxin-Spiegel von weniger als 0,5 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter (EU/ml) aufweist, bestimmt mit Hilfe eines chromogenen Limulus-Amöbocyten-Lysat(LAL)-Tests gegen eine Endpunktreaktion, erreicht durch eine Verdünnungsreihe einer Endotoxin-Vergleichslösung und anschließende Interpolation mittels einer Standard-Regressionskurve, erhalten aus kolorimetrischen Ablesungen aus diesen Verdünnungen.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin Rinder-Hämoglobin ist.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung von vernetztem Hämoglobin im wesentlichen frei ist von Zell-Stroma, Nicht-Hämoglobin-Proteinen und Pyrogenen und einen Endotoxin-Spiegel aufweist, der bei Verabreichung in vivo keine Komplementaktivierung verursacht.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin vernetztes Rinder-Hämoglobin ist.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, da der Ei.dotoxin- Spiegel in der wässrigen Lösung des vernetzten Hämoglobins geringer als 0,5 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter (EU/ml) ist, bestimmt mit Hilfe eines chromogenen Limulus-Amöbocyten-Lysat(LAL)-Tests gegen eine Endpunktreaktion, erreicht durch eine Verdünnungsreihe einer Endotoxin-Vergleichslösung und anschließende Interpolation mittels einer Standard- Regressionskurve, erhalten aus kolorimetrischen Ablesungen aus diesen Verdünnungen.
8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung des vernetzten Hämoglobins erhältlich ist aus Hämoglobin, das aus roten Blutkörperchen von Rindern stammt, wobei das Hämoglobin in ausreichendem Maße vernetzt ist, um Polyhämoglobin zu ergeben mit wenigstens 50% des Polyhämoglobins in einer höheren als der tetrameren Form, wobei die wässrige Lösung
a) einen Pen/ gemessen unter humanphysiologischen Bedingungen, im Bereich von 2399,4 bis 4798,8 Pa (18 bis 36 mmHg) aufweist; b) frei ist von Stroma roter Blutkörperchen und Nicht-Hämoglobin-Proteinen; und c) einen Endotoxin-Spiegel von weniger als 0,5 Endo¬ toxin-Einheiten pro Milliliter (EU/ml) aufweist, bestimmt mit Hilfe eines chromogenen Limulus- Amöbocyten-Lysat(LAL)-Tests gegen eine End¬ punktreaktion, erreicht durch eine Verdünnungsreihe einer Endotoxin-Vergleichslösung und anschließende Interpolation mittels einer Standard-Regressionskurve, erhalten aus kolorimetrischen Ablesungen aus diesen Ver¬ dünnungen.
9. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die einen Endotoxin-Spiegel wässrige Lösung des vernetzten Hämoglobins von weniger als 0,02 EU/ml aufweist.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung des vernetzten Hämoglobins gekennzeich¬ net ist durch
a) eine Endotoxin-Konzentration von weniger als 0,02 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter (EU/ml), be¬ stimmt mit Hilfe eines chromogenen Limulus-Amöbo¬ cyten-Lysat(LAL)-Tests gegen eine End¬ punktreaktion, erreicht durch eine Verdünnungsreihe einer Endotoxin-Vergleichslösung und anschließende Interpolation mittels einer Standard-Regressionskurve, erhalten aus kolorimetrischen Ablesungen aus diesen Verdünnungen. b) eine Phospholipid-Konzentration von weniger als 1 ng/ml; c) eine Hämoglobin-MolekulargewichtsVerteilung mit mehr als 90% im Bereich von 68 000 - 500 000 Dalton; d) eine Osmolarität, gemessen durch Gefrierpunktser- niedrigung, im Bereich von 180 - 320 Milliosmol pro Liter; e) einen Hämoglobin-Gehalt von 5 bis 25 g/dl; f) einen Methämoglobin-Gehalt von weniger als 20 Gew.-%; g) einen P5Q im Bereich von 2399,4 bis 4798,8 Pa (d.h., 18 bis 36 mmHg); h) eine intravaskuläre Halbwertszeit von wenigstens vier Tagen; i) den Umstand, daß er im wesentlichen frei ist von Stroma roter Blutkörperchen, Nicht-Hämoglobin- Proteinen und Pyrogenen.
11. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung des vernetzten Hämoglobins, erhältlich ist aus Hämoglobin aus Säuger- Blutkörperchen stammt und aufweist: vernetztes Hämoglobin mit einer Molekulargewichtsverteilung von mehr als 90% im Bereich von 68 000 - 500 000 Dalton; eine Osmolarität, gemessen durch Gefrierpunktser¬ niedrigung, im Bereich von 180 - 320 Milliosmol pro Liter Lösung; einen End-Hämoglobin-Gehalt von 9 bis 13 g/dl; einen Methämoglobin-Gehalt von weniger als 10 Gew.-%; physiologische Konzentrationen an Natriumchlorid und Kaliumchlorid; weniger als ein Nanomol Phospholipid pro Milliliter; weniger als 1 ppm Vernetzungsmittel; einen P5Q im Bereich von 2399,4 bis 4798,8 Pa (d.h., 18 bis 36 mmHg); eine intravaskuläre Halbwertszeit von wenigstens vier Tagen; und einen Endotoxin-Spiegel von weniger als 0,5 Endotoxin- Einheiten pro Milliliter (EU/ml), bestimmt mit Hilfe eines chromogenen Limulus-Amöbocyten-Lysat(LAL)-Tests gegen eine Endpunktreaktion, erreicht durch eine Verdünnungsreihe einer Endotoxin-Vergleichslösung und anschließende Interpolation mittels einer Standard- Regressionskurve, erhalten aus kolorimetrischen Ablesungen aus diesen Verdünnungen.
12. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung des vernetzten Hämoglobins in einer Dosis von 0,5 bis 10 ml/kg Körpergewicht einsetzt wird.
PCT/EP1994/003762 1993-11-15 1994-11-12 Verwendung von lösungen von vernetztem hämoglobin zur bekämpfung des septischen und hämorrhagischen schocks bei säugetieren WO1995013829A1 (de)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1449535A1 (de) * 2003-02-18 2004-08-25 Clinique La Prairie Research SA Zusammensetzungen enthaltend fötales Hämoglobin und bakterielles Endotoxin und fakultativ zusätzliche fötale Leberkomponenten

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996032130A1 (en) * 1995-04-10 1996-10-17 Baxter International Inc. The use of cross-linked hemoglobin in treating subarachnoid hemorrhage
ZA979540B (en) * 1996-11-12 1998-05-12 Baxter Int Prophylactic use of hemoglobin to prevent sepsis.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988003408A1 (en) * 1986-11-10 1988-05-19 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
CA2087504A1 (en) * 1992-01-30 1993-07-31 Robert J. Przybelski Administration of low dose hemoglobin to increase perfusion
WO1993016721A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of nitric oxide-mediated hypotension and septic shock with iron-containing hemoprotein

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988003408A1 (en) * 1986-11-10 1988-05-19 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
CA2087504A1 (en) * 1992-01-30 1993-07-31 Robert J. Przybelski Administration of low dose hemoglobin to increase perfusion
WO1993016721A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of nitric oxide-mediated hypotension and septic shock with iron-containing hemoprotein

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1449535A1 (de) * 2003-02-18 2004-08-25 Clinique La Prairie Research SA Zusammensetzungen enthaltend fötales Hämoglobin und bakterielles Endotoxin und fakultativ zusätzliche fötale Leberkomponenten
WO2004073728A2 (en) * 2003-02-18 2004-09-02 Clinique La Prairie Research Sa Compositions comprising fetal hemoglobin and bacterial endotoxin and optionally additional fetal liver components
WO2004073728A3 (en) * 2003-02-18 2004-10-07 Clinique La Prairie Res Sa Compositions comprising fetal hemoglobin and bacterial endotoxin and optionally additional fetal liver components
US7968103B2 (en) 2003-02-18 2011-06-28 Josette Westphal, legal representative Compositions comprising fetal hemoglobin and bacterial endotoxin and optionally additional fetal liver components
NO334003B1 (no) * 2003-02-18 2013-11-11 Clinique La Prairie Franchising Sa Farmasøytisk preparat omfattende ikke-humant føtalt hemoglobin og bakterielt endotoksin, samt anvendelsen av dette

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