KR101291245B1

KR101291245B1 - 미세유체제어 칩 및 미세유체제어 칩에서의 단백질 검출 방법

Info

Publication number: KR101291245B1
Application number: KR1020090115740A
Authority: KR
Inventors: 정민숙
Original assignee: 한국전자통신연구원
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2013-07-30
Also published as: US20110129847A1; KR20110059104A; US8053201B2

Abstract

본 발명의 미세유체제어 칩은 혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 내인성 항체를 제거하는 항 면역글로불린 항체가 고정된 고분자 폴리머를 포함하는 멤브레인 필터부; 형광 나노입자에 고정된 탐지항체가 부착되어 있으며, 멤브레인 필터부로부터 유입된 내인성 항체가 제거된 혈액 내의 검출하고자 하는 단백질과 탐지항체가 결합하는 제1 반응부; 및 포획항체가 고정되어 있으며, 제1 반응부로부터 유입된 탐지항체와 결합된 단백질과 포획항체를 결합시켜 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출하는 제2 반응 및 검출부를 포함한다. 따라서, 면역반응의 간섭을 최소화하여 면역반응을 극대화할 수 있다.

미세유체제어 칩, 면역글로불린, 내인성 항체

Description

미세유체제어 칩 및 미세유체제어 칩에서의 단백질 검출 방법{The microfluidic chips and detection method for protein therein}

본 발명은 미세유체제어 칩에 관한 것으로, 특히 면역반응을 극대화할 수 있는 미세유체제어 칩에 관한 것이다.

최근 실험자의 개입을 최소화하면서 혈액 내에서 특정 질병의 바이오마커 검출 등의 생화학적 반응을 칩 상에서 일체형으로 해결하려는 랩온어칩 (Lab-on-a-chip) 형태의 미세유체제어 칩이 많이 연구되고 있다. 그러나 혈액 내에 존재하는 이종항원 친화성 항체(heterophile antibodies), 항 동물 항체(antianimal antibodies), 자가항체(autoantibodies), 치료용 항체(therapeutic antibodies)와 같은 내인성 항체(endogenous antibodies)들은 항원과 항체의 특이적 결합을 이용한 샌드위치형 면역반응을 방해하여 정확한 진단을 하는데 어려움이 있다.

이와 같은 혈액 내에 존재하는 내인성 항체는 면역반응을 간섭하여 위양성이나 위음성 진단 등 잘못된 결과를 가져오게 된다. 이러한 혈액 내 내인성 항체에 의한 면역반응 간섭을 줄이기 위해 실험 전 시료를 희석하거나 간섭항체(interfering antibodies)를 제거하거나, 또는 이종항원 차단제(heterophilic blocking agent)로의 전처리 등의 방법들이 사용되고 있다. 그러나 이러한 방법들의 경우에는 실험자가 여러 번의 실험 과정을 거쳐야 하는 단점이 있고, 모든 혈액을 이용한 검사에서 가능한 일이 아니며, 그러한 과정에서 혈액의 오염 등의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 혈액 내의 내인성 항체를 제거함으로써 면역반응의 간섭을 최소화하여 면역반응을 극대화할 수 있는 미세유체제어 칩 및 그러한 미세유체제어 칩에서의 혈액 내 단백질 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 실시예에 따른 미세유체제어 칩은,

혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 상기 내인성 항체를 제거하는 항 면역글로불린 항체가 고정된 고분자 폴리머를 포함하는 멤브레인 필터부;

형광 나노입자에 고정된 탐지항체가 부착되어 있으며, 상기 멤브레인 필터부로부터 유입된 내인성 항체가 제거된 혈액 내의 검출하고자 하는 단백질과 상기 탐지항체가 결합하는 제1 반응부; 및

포획항체가 고정되어 있으며, 상기 제1 반응부로부터 유입된 상기 탐지항체와 결합된 단백질과 상기 포획항체를 결합시켜 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출하는 제2 반응 및 검출부를 포함하되, 상기 멤브레인 필터부는 상기 혈액을 혈구와 혈장으로 분리하는 동시에 상기 혈액 내의 내인성 항체를 제거하는 것을 특징으로 한다.

삭제

실시예에 있어서, 상기 고분자 폴리머는

상기 멤브레인 필터부에 고정되기 위한 고정화 부분, 상기 단백질의 비 특이적인 흡착을 막기 위한 흡착 방지 부분, 및 상기 항 면역글로불린 항체를 선택적으로 고정화하기 위한 기능기 부분으로 구성될 수 있다.

실시예에 있어서, 상기 항 면역글로불린 항체의 고정 농도는 100μg/ml일 수 있다.

실시예에 있어서, 상기 검출하고자 하는 단백질은 cTnI(cardiac troponin I)일 수 있다.

또한, 상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 실시예에 따른 미세유체제어 칩에서의 단백질 검출 방법은,

미세유체제어 칩의 필터에 혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 상기 내인성 항체를 제거하는 항 면역글로불린 항체를 고정시키는 단계;

상기 내인성 항체가 제거된 혈액이 유입되면 검출하고자 하는 단백질과 결합하는, 형광 나노입자에 고정된 탐지항체를 상기 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 부착시키는 단계;

상기 탐지항체와 결합된 단백질이 유입되면 상기 탐지항체와 결합된 단백질 과 결합하는, 포획항체를 상기 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 고정시키는 단계;

혈액을 상기 미세유체제어 칩에 주입시킴으로써, 상기 내인성 항체가 제거된 혈액 내의 단백질, 상기 형광 나노입자에 고정된 탐지항체, 및 상기 포획항체의 순차적인 면역 반응에 의해 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출하는 단계를 포함하되, 상기 필터는 상기 혈액을 혈구와 혈장으로 분리할 수 있는 멤브레인 필터이고, 상기 멤브레인 필터에서 상기 내인성 항체의 제거 및 상기 혈구와 혈장의 분리가 동시에 일어난다.

삭제

실시예에 있어서, 상기 항 면역 글로불린 항체는 상기 멤브레인 필터에 포함되는 고분자 폴리머에 고정될 수 있다.

이 실시예에 있어서, 상기 고분자 폴리머는

상기 멤브레인 필터에 고정되기 위한 고정화 부분, 상기 단백질의 비 특이적인 흡착을 막기 위한 흡착 방지 부분, 및 상기 항 면역글로불린 항체를 선택적으로 고정화하기 위한 기능기 부분으로 구성될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 미세유체제어 칩에 의하면, 혈액 내 단백질 검출을 위한 미세유체제어 칩(또는 바이오칩)에 항 면역글로불린 항체가 고정된 멤브레인 필터를 이용하여 면역반응을 극대화할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 미세유체제어 칩은 멤브레인 필터에 항 면역글로불린 항체를 고정하는 방법으로 간단히 제작될 수 있으며 단백질 칩, 미세 생화학 분석시스템, 미세 생화학 반응기 등의 다양한 랩온어칩에 응용될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 미세유체제어 칩에서의 단백질 검출방법에 의하면, 실험자의 개입 없이 일정 양의 혈액을 미세유체제어 칩 상에 주입하기만 함으로써, 내인성 항체의 간섭 없이 자동으로 정확하게 혈액 내 단백질을 검출할 수 있다.

아래에서는 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에 기재된 "…부" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 제어 칩을 설명하는 도면이다.

본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 제어 칩(100)은 멤브레인 필터부(110), 제1 반응부(120), 제2 반응 및 검출부(130)를 포함한다.

멤브레인 필터부(110)는 항 면역글로불린 항체가 고정된 멤브레인 필터를 포함한다. 멤브레인 필터는 전혈(whole blood)을 혈구와 혈장(또는 혈청)으로 분리할 수 있다. 항 면역글로불린 항체는 혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 내인성 항체를 제거한다.

삭제

멤브레인 필터는 본래 혈구와 혈장을 분리하는 목적으로 이용하나, 본 발명의 실시예에서는 내인성 항체를 제거하는 것이 목적이므로, 혈구와 혈장을 분리하기 위한 전처리는 하지 않고, 고정된 항 면역글로불린 항체가 내인성 항체를 포획 및 제거하는지를 확인하기 위하여 전혈로부터 이미 분리된 혈장을 이용한다.

그러나 혈구와 혈장을 분리하기 위한 전처리를 수행함으로써 전혈을 혈구와 혈장으로 분리하는 동시에 전혈 내의 내인성 항체를 제거할 수도 있다.

멤브레인 필터는 항 면역글로불린 항체를 고정하기 위해 고분자 폴리머를 포함한다.

이 고분자 폴리머는 공유결합을 통하여 소수성 표면에 고정화되며, 항체와 같은 생체물질도 고정화할 수 있다.

또한 이 고분자 폴리머는 멤브레인 필터에 고정되기 위한 고정화 부분(anchoring part), 생체물질의 비 특이적인 흡착을 막기 위한 흡착 방지 부분, 그리고 선택적인 생체물질의 고정화를 하기 위한(또는 혈액 내의 검출하고자 하는 단백질에 대한 특이적 항체 예를 들면, 항 면역글로불린 항체를 선택적으로 고정화하기 위한) 기능기 부분(functional group)으로 구성된다. 흡착 방지 부분은 PEG(Poly Ethylene Glycol)로 이루어질 수 있다.

항 면역 글로불린 항체는 이 고분자 폴리머에 고정된다.

제1 반응부(120)는 형광 나노입자에 고정된 탐지항체가 부착(adsorption)되어 있다(즉, 탐지항체의 경우 공유결합에 의해 화학적으로 고정(immobilization)되어 있는 것이 아니라 물리적으로 부착(adsorption)되어 있다). 멤브레인 필터부(110)로부터 내인성 항체가 제거된 혈액이 유입되면, 혈액 내의 검출하고자 하는 단백질(즉, 혈액 내 바이오마커 또는 항원)과 탐지 항체가 결합한다(1차 항원-항체 반응).

제2 반응 및 검출부(130)는 포획항체가 고정되어 있으며, 제1 반응부로부터 탐지항체와 결합된 혈액 내 단백질(바이오마커 또는 항원)이 유입되면, 이 단백질(항원)-탐지항체 복합체와 포획항체를 결합(2차 항원-항체 반응)시켜 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출한다.

이하에, 상기의 구성을 가지는 미세유체제어 칩에서의 혈액 내 단백질 검출 방법에 대해 설명한다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 제어 칩에서의 혈액 내 단백질 검출 방법을 나타내는 흐름도이다.

도 2를 참조하면, 먼저 멤브레인 필터에 항 면역글로불린을 고정시킨다(S210).

멤브레인 필터에 고분자 폴리머를 1시간 동안 전처리하고, 50mM 시트레이트 버퍼(citrate buffer)(pH3.3)로 세척한다. 고분자 폴리머가 전처리된 멤브레인 필 터에 100ug/ml의 항 면역글로불린 항체 용액을 2시간 동안 처리하여 고정시킨 후, PBS (phosphate buffered saline, pH7.4)으로 수회 세척하여 오븐에서 충분히 말려 항 면역글로불린 항체가 고정된 멤브레인 필터를 준비한다.

다음으로, 형광 나노입자에 고정된 탐지항체를 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 부착시키고, 포획항체를 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 고정시킨다(S220).

고분자 폴리머를 위에서 설명한 방법으로 플라스틱 칩 표면 위에 전처리하고, 포획항체를 그 위에 고정시킨다.

본 발명에서는 혈중 cTnI(cardiac troponin I)를 검출하기 위하여 Biodesign사의 1 mg/ml 농도의 cTnI 항체를 포획항체로 고정하였다.

형광 나노입자 표면에 탐지항체의 고정은 Invitrogen사에서 제공하는 프로토콜에 따라 형광 나노입자에 sulfo-NHS와 EDC의 반응에 의해 아민기를 도입함으로써 이루어졌다. 현재 면역반응에 사용하는 형광 나노입자는 Invitrogen사의 카르복시기가 도입된 200nm dark red fluorescent(660/680)이며, 이는 탐지항체의 양과 형광의 세기를 증가시키기 위함이다.

그 후, 미세유체제어 칩에 혈액을 주입하고, 포획항체와 탐지항체를 이용하여 샌드위치 면역반응을 통해 미세유체제어 칩 상에서 검출하고자 하는 혈액 내의 단백질을 검출한다(S230).

본 발명의 실시예에서는 미세유체제어 칩 상에서 급성심근경색의 바이오마커인 cTnI 검출을 위해 포획항체와 형광물질을 부착한 탐지항체를 이용하여 샌드위치 면역반응을 통해 혈중 cTnI의 농도를 형광의 세기로 감지한다.

그러나 본 발명의 실시예에서 사용한 바이오마커인 cTnI는 예시적인 것이며, 검출하고자 하는 혈액 내의 단백질이 이에 한정되는 것은 아니다.

미세유체제어 칩은, 준비된 멤브레인 필터를 칩에 끼우고, 탐지항체와 포획항체를 각각 지정 위치에 고정시킨 후, 상하판 초음파 용착을 하여 준비한다. 이렇게 미세유체제어 칩이 준비되면 실험을 위해 cTnI 항원이 농도 별로 희석되어있는 80ul의 혈장 용액을 미세 유체 제어 칩 상에 주입한다.

혈장 용액은 멤브레인 필터를 통과하는 동안 내인성 항체가 제거된다. 그 후, 형광 나노입자(또는 형광물질)에 고정된 탐지항체와 먼저 만나 제1 항원-항체 반응을 한다(즉, 혈액이 주입되어 미세유체제어 칩의 탐지항체가 부착된 부분을 녹이면 내인성 항체가 제거된 혈액 내 항원과 형광 나노입자에 고정된 탐지항체가 항원-항체 반응을 일으킨다).

그 후, 포획항체가 고정된 부분에서 다시 포획항체와 항원-탐지항체 복합체가 샌드위치 면역반응으로 제2 항원-항체 반응을 한다. 이 반응을 통해 cTnI의 농도별 강도(intensity)를 형광의 세기로 검출한다(즉, 포획항체는 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 고정되어 있기 때문에 유입되는 항원-탐지항체 복합체와 포획항체가 결합하는 정도를 형광의 세기로 검출할 수 있다).

도 3a는 내인성 항체가 제거된 시료의 cTnI의 농도별 형광 신호를 나타내는 도면이고, 도 3b는 내인성 항체가 제거되지 않은 시료의 cTnI의 형광 신호를 나타내는 도면이다.

도 3a 및 도 3b를 참조하면, 내인성 항체가 제거된 시료의 형광신호가 내인 성 항체가 제거되지 않은 시료의 형광신호보다 훨씬 더 뚜렷한 것을 볼 수 있다.

또한, 음성대조군(negative control)의 경우 형광 신호가 거의 나타나지 않은 것을 볼 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 cTnI의 농도별 형광 신호는 양성대조군(positive control)과 유사하며 오히려 양성대조군(positive control)보다 더 뚜렷한 형광신호를 나타내는 것을 통해, 본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 제어 칩에서의 혈액 내 단백질 검출 방법이 cTnI를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 실시예는 장치 및 방법을 통해서만 구현이 되는 것은 아니며, 본 발명의 실시예의 구성에 대응하는 기능을 실현하는 프로그램 또는 그 프로그램이 기록된 기록 매체를 통해 구현될 수도 있으며, 이러한 구현은 앞서 설명한 실시예의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가라면 쉽게 구현할 수 있는 것이다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

도 3a는 내인성 항체가 제거된 시료의 cTnI의 농도별 형광 신호를 나타내는 도면이다.

도 3b는 내인성 항체가 제거되지 않은 시료의 cTnI의 형광 신호를 나타내는 도면이다.

Claims

혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 상기 내인성 항체를 제거하는 항 면역글로불린 항체가 고정된 고분자 폴리머를 포함하는 멤브레인 필터부;

형광 나노입자에 고정된 탐지항체가 부착되어 있으며, 상기 멤브레인 필터부로부터 유입된 내인성 항체가 제거된 혈액 내의 검출하고자 하는 단백질과 상기 탐지항체가 결합하는 제1 반응부; 및

포획항체가 고정되어 있으며, 상기 제1 반응부로부터 유입된 상기 탐지항체와 결합된 단백질과 상기 포획항체를 결합시켜 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출하는 제2 반응 및 검출부를 포함하되,

상기 멤브레인 필터부는 상기 혈액을 혈구와 혈장으로 분리하는 동시에 상기 혈액 내의 내인성 항체를 제거하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 제어 칩.
삭제
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제1항에 있어서,

상기 고분자 폴리머는

상기 멤브레인 필터부에 고정되기 위한 고정화 부분, 상기 단백질의 비 특이적인 흡착을 막기 위한 흡착 방지 부분, 및 상기 항 면역글로불린 항체를 선택적으로 고정화하기 위한 기능기 부분으로 구성되는 미세 유체 제어 칩.
제1항에 있어서,

상기 항 면역글로불린 항체의 고정 농도는 100μg/ml인 미세 유체 제어 칩.
제1항에 있어서,

상기 검출하고자 하는 단백질은 cTnI(cardiac troponin I)인 미세 유체 제어 칩.
미세유체제어 칩의 필터에 혈액 내의 내인성 항체와 결합하여 상기 내인성 항체를 제거하는 항 면역글로불린 항체를 고정시키는 단계;

상기 내인성 항체가 제거된 혈액이 유입되면 검출하고자 하는 단백질과 결합하는, 형광 나노입자에 고정된 탐지항체를 상기 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 부착시키는 단계;

상기 탐지항체와 결합된 단백질이 유입되면 상기 탐지항체와 결합된 단백질과 결합하는, 포획항체를 상기 미세유체제어 칩의 지정된 위치에 고정시키는 단계;

혈액을 상기 미세유체제어 칩에 주입시킴으로써, 상기 내인성 항체가 제거된 혈액 내의 단백질, 상기 형광 나노입자에 고정된 탐지항체, 및 상기 포획항체의 순차적인 면역 반응에 의해 단백질의 농도를 형광의 세기로 검출하는 단계를 포함하되,

상기 필터는 상기 혈액을 혈구와 혈장으로 분리할 수 있는 멤브레인 필터이고,

상기 멤브레인 필터에서 상기 내인성 항체의 제거 및 상기 혈구와 혈장의 분리가 동시에 일어나는 미세유체제어 칩에서의 단백질 검출 방법.
삭제
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제7항에 있어서,

상기 항 면역 글로불린 항체는 상기 멤브레인 필터에 포함되는 고분자 폴리머에 고정되는 미세 유체 제어 칩에서의 단백질 검출 방법.
제10항에 있어서,

상기 고분자 폴리머는

상기 멤브레인 필터에 고정되기 위한 고정화 부분, 상기 단백질의 비 특이적인 흡착을 막기 위한 흡착 방지 부분, 및 상기 항 면역글로불린 항체를 선택적으로 고정화하기 위한 기능기 부분으로 구성되는 미세 유체 제어 칩에서의 단백질 검출 방법.
제7항에 있어서,

상기 항 면역글로불린 항체의 고정 농도는 100μg/ml인 미세 유체 제어 칩에서의 단백질 검출 방법.
제7항에 있어서,

상기 검출하고자 하는 단백질은 cTnI(cardiac troponin I)인 미세 유체 제어 칩에서의 단백질 검출 방법.