DD265470A1 - Spezifisches adsorbens zur bindung von anti-dna-autoantikoerpern - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikoerpern aus Koerperfluessigkeiten, so z. B. Serum, Plasma oder Blut, das auf der biospezifischen Bindung an DNA beruht. Hierzu wurde DNA unter Einsatz von biokompatiblen Brueckenverbindungen an geeignete Traeger gebunden. Das Verfahren zeichnet sich durch seine hohe Praktikabilitaet, Biokompatibilitaet und Effektivitaet aus, wobei die so hergestellten Traeger regenerierbar und autoklavierbar sind und somit einen wiederholten und reproduzierbaren Einsatz derselben gestatten. Das Verfahren findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und in der Medizin.

Description

Anwendungsgebiet de. Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die spezifische Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpern (DNA-AK) aus Körperflüssigkeiten, das sowohl in vitro als auch in vivo genutzt werden kann, unter wiederholtem und reproduzierbarem Einsatz eines beschichteten Trägers. Das Verfahren ist anwondbar in der pharmazeutischen Industrie und in der Medizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Autoantikörper gegen verschiedene nukleare Bestandteile sind für Autoimmunerkrankungen des rheumatischen Formenkreises charakteristisch. Den Prototyp dieser Autoinniunerkrankungen (AIK) mit hoher gocundheiispolitlscher Bedeutung stellt der systematische Lupus ervthematodes (SLE) dar. Autoaniikörpern gegen DNA, insbesondere gogen native DNA, kommt eine große pathogenetische und diagnostische Bedeutung für den SLE zu. Die Titer der DNA-AK woison baiin SLE eine enge Korrelation zur Krankheitsaktivität und zur Nierenmonifeelation auf. Die pathogene Wirkung dieser Auto&ntikörper entsteht vor allem durch die Bildung von DNA-Anti-DNA-Immunkomplexen, die im Blut zirkulieren und sich an den Gefäßwänden, Sasalmembranen sowia perivasculär ablagern und über verschiedene Wirkungsmochanismen entzündliche Reaktionen in den jeweiligen disponierten Organen mit den entsprechenden Symptomen (u.a. Nephritis, Vasculitis, Karditiu, Serositis, Cerebritis,

Anämie, Leukopenie, Thrombopenie, Arthritis) induzieren (Übersicht F.Hiepe, B-Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, 1S87). Deshalb erscheint es sinnvoll, den Pathomechanismus dieser Erkrankung durch Entfernung der Anti-DNA-Autoantikörper aus den Körperflüssinkeiten zu beeinflussen, um dadurch das Fortschreiten der oben erwähnten Erkrankung zu verhindern, die Krankheitsaktivität zu mindern und die damit verbundenen Symptome zu lindern bzw. zu beseitigen. Die Erfolge der Plasmapheresebehandlung beim SLE werden u. a. auf die Beseitigung bzw. Reduzierung dieser pathogenetisch bedeutsamen DNA-AK zurückgeführt (Apostoloff et al., Dt. Gesundheitsw. 34,64-67 (1979); Z.Sharon et al., Plasma Ther Transfus Technol. 3, 163-169 (1982); J.V.Jones et al., Arthritis Rheum. 24,1113-1120 (1981); J.V.Jones et al., Clinics in Immunol. Allergy S, 13-32 [1986]; E.Schmitt und H. Kiinkmann, z. Klin. Med. 40,21-25 (19851). Nachteile der Plasmapherese sind das nichtselektive und unspezifische Entfernen aller Plasmabestandteile und die dadurch erforderliche Zuführung größerer Mengen Fremdplasma oder Humanalbumin, die auch aus Kapazitäts- und ökonomischen Gründen limitierend sein können. Aus den genannten Gründen existieren seit einigen Jahren Bemühungen um die Entwicklung von Adsorbenzien, die eine selektive und/oder spezifische Entfernung von Autoentikörpern mittels extrakorporaler Immunadsorbtion aus Körperflüssigkeiten erlauben (siehe Übersicht E.Behm und H. Klinkmann, Z. Klin. Med. 41,1501-1610 (1986)). Hierbei wurden im wesentlichen folgende Wege beschritten:

1. Dio selektive Entfernung von Immunglobülin G (IgG) mittels Staphylokokken-Protein Α-Trägern (vgl. D. S.Terman et al., J. Immunol. 124,796 (1980); New England J. Med. 305,1195 [1981); E. Behm und H. Klinkmann, in: Plasma Separation and Plasma Fractionation, S. 254-265 (Karger, Basel 1983); I. M. Nilsson et al., Blood 58,38-44 [1981 ]). Diese Methode hat den Nachteil, daß ein Großteil des IgG, welches eine wichtige Rolle bei der humoralen Immunabwehr spielt, unspezifisch ε ntfernt wird. Außerdem könnnn nur vorwiegend pathogene Antikörper der IgG-Klasse gebunden werden. Die Herstellungskosten für Protein A sind sehr hoch. Die Verwendung inaktivierter Staphylokokken als „natürlichen" Träger des Protein A ermöglicht den Einsatz des Protein A ohne seine weitere Reinigung, bringt aber zusätzliche Probleme bei der Berührung der Körperflüssigkeit mit den inaktivierten Bakterien (z.B. Freisetzen von Pyrogenen) mit sich. Weiterhin sollen Protein-A-Träger das Komplementsystem aktivieren.

2. Adsorbenzien aus Polymeren (T.Kuroda et al., DE-Patent Nr. 3412616, japanisches Patent JP P58-69199 P68-59197: Maeda e.t al., Plasmapheresis, Raven Press, New York, S. 219-223 [1983]). Mit dieser Methode werdoi: Autoantikörper ebenfalls unspezifisch entfernt. Die Herstellung solcher Polymeren Ist außerdem sehr aufwendig und teuer.

3. Für die afflnitätschromatogi aphische Reinigung von DNA-AK-Seren fand z. B. Cibacronblau-Sepharose Anwendung (Ernten u. Burdick, Journal Immunol. Moth., 62,205-215 [1983]). Eigene Voruntersuchungen und Mitteilungen in der Literatur (R.Suega et al., J. Immunol. Moth. 93,131-140 (1986]) ergaben jedouh eine unzureichende Spezifität des Adsorbens für die Bindung von Anti-DNA-Autoantikörpern.

4. Eine spezifische) Bindung und Entfernung von Anti DNA-Autoantikörpern aus Körperfiössigkeitan kann durch Anwendung von Adsorbenzien, die das Autonnligsn DNA oder DNA-Analoga enthalten, erreicht werden.

Für die Affinitätschromatographle fanden bisher vorwiegend Träger Anwendung, an die DNA adsorptiv gebunden wurde (W.H.Scouten in: Affinity Chromatography (P. J. Elving, J. D.Winefordner eds.) John Wiley & Sons, New York, 1982). Wegen der hohen Instabilität dT adsorptiven Bindung (Leakage) sind solche Adsorbenzien für die in vivo-Anwendung mittels extrakorporaler Immunedsorption nicht geein.net.

Für affinitätschromatographische Zwecke kann DNA auch kovalent a,i CNBr-Sepharose (Kubota et al., CIIn. exp. Immunol. 62, 321-328 (1985)) gebunden werden. Dieses Adsorbens ist aufgrund der bekannten Instabilität der auf Cyanbromid basierenden Bindung sowie der mikrowellen Angreitbarkeit des Trägers für dio in vivo-Anwondung nicht geeignet.

DNA kann auch unter Verwendung von Carhodürniden an Sephadex G 200 (Mykoniatis, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 10.321-328 [1986]) gebunden worden. Allerdings dürfte auch dieser Träger für die in vivo-Anwendung kaum geeignet sein, da die Porosität des Sephadex G 200 nur eine e'ngeschränkte Bindung der DNA ermöglicht und zudem dieser Träger in seinem Quellverhalten stark von der lonenstärke abhängig ist.

Die ersten erfolgreichen In vivo-Elimlnationen von DNA-AK bei SLE-Patlenten erfolgten mit an kollodiumüberzogene Aktivkohle gebundener DNA (Terman et öl., Lancet 2,824 (1979]) und mit DNA, die an chemisch aktivierte Kollagenmembranen gekoppelt wurde (R. El-Habib et al., J. Clin. Lab. Immunol. 15,111-117 (1984]). Diese Verfahren sind jedoch mit Nachteilen verbunden, die einem breiten Einsatz bei der Diagnostik und Therapie dos SLE entgegenstehen: Die Bindung der DNA an Aktivkohle erfolgt adsorptiv, so daß eine Regenerierung dieser Adsorbenzien unmöglich und eine effektiva Diagnostik sowie wirksame Therapie ökonomisch nicht vertretbar ist. Außerdem besieht die Gefahr des Leakages der DNA und somit der Bildung von neuen pathogenen DNA-AntUDNA-lmmunkomplexen. Der Einsatz von an Kollegenmembrunen gebundener DNA dürfte mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden sein, da die bekanntermaßen starke Adhäsion von Thrombozyton an Kollngenetrukturen zu einer Thrombozytopenle, zur Aktivierung das Gerinnungs- und Komplementsystems und somit zur Ausbildung von Thromben führen wird.

Hinzu kommt, d U Fibrcn&ktin und Kollagen starke Wechselwirkungen eingehen, in deren Folge Blutzellen (Leukozyten, Erythrozyten) geuunden werden, die zur Auslösung von Entzünd'jiigsreaktionen und zu einer Hämolyse führen können.

Vor kurzem wurden von uns Verfahren zur chemischen Aktivierung von Hydroxyemylmethacrylat-Ethylenglykoldimethacrylat-Copolymere (Separons*) von zellulosehaltigen Festkörperobarflächen und von polymeren Festkörperflächen entwickelt, die »ich auch zur kcvalenten Bindung von DNA eignen.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, Anti-DNA-Auloantikörper spezifisch, einfach und schonend eus Körperflüssigkeiten in vitro und/oder in vivo unter Verwendung von an einer festen Phase (Träger) gebundenen DNA zu entfernen. Die Träger sollen sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecke Wiederverwendung regenerieren und sterilisieren lassen, mikrobiell schwer angreifbar sowie biokompatibel sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, Anti-Dh A-Autoantikörpar aus Körperflüssigkeiten in vitro und/oder in vivo an eine feste Phase (Träger) spezifisch zu binden, wobei die feste Phase wiederverwendbar, sterilisierbar, biokompatibel, miktobiell schwer angreifbar und stabil sein soll. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß DNA — als natürliches Antigen — an Polyhydroxymethacrylate (Sepiiron*) oder an zellulosehaltige Träger über Silanhaftmiicel kovalent gebunden wnü und diese trägergebundene DNA zur Bindung und Entfernung von zirkulierenden Anti-DNA-Aui oantikörpern aus Körperflüssigkeiten eingesetzt wird, wobei die an dio DNA gebundenen DNA-AK aus den Körperflüssigkeiten durch Abtrennung der festen Phase sbpariert werden und din feste Phase durch Behandlung mit nichtdenaturierenden Medien funktionell regeneriert wird. Das erfinciungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die im menschlichen Organismus vorkommende und für dio Bildung von pathogenetisch bedeutsamen Immunkomplexen mitverantwortliche DNA als physiologisches Antigen der DNA-AK an zelluiosehaliige Träger oder Separor a* mit hinreichend großer Oberfläche und Porosität auf an sich bekannte vorherige chemische Oberfläctanmodifizierunp des Trägers mit Silanhaftmitteln und gegebenenfalls hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien gebunden wird und diese trägergebundene DNA für di J i.~. vivo- und in vitro-Entfernung der zirkulierenden DNA-AK aus Körperflüssigkeiten oingesotrt wird und danach die so gebundenen DNA-AK durch nichtdenaturierende Medien wieder abgespalten werden, so daß die mit DNA beladene Matrix nach Sterilisation erneut eingesetzt werden kann. Der Trager hat eine unterschiedliche geometrische Form, wobei kugel- oder faserförmige Träger mit oder ohne Zusätze, die auch durch Packung, Sinterung: 1er Verwendung eines Bindemittels zu übergeordneten Strukturen (wie z. B. zu Filtern, Fritten, Kolonnen und dergleichen) mit definierter Durchlässigkeit angeordnet sein können, besonders geeignet sind. Die nichtdenaturierenden Medien für die Abspaltung der gebundenen DNA-AK setzen sich aus gepufferten Lösungen hoher lonenstärko zusammen, wobei insbesondere 3mol/l KSCN-Lösungen geeignet sind. Auf Haltbarkeit, Handhabung und Wiederverwendung des DNA-belailenen Trägers wirkt sich besonders vorteilhaft aus, daß die genannten Träger keine Quell- oder Schrumpferscheinungen bei Änderung des lcnenmilieus zeigen.

Die Oberflächenmodifizierung der !Separone* und zellulosehaitigen Materialien zum Zwecke der Schaffung von Bindungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit der DNA erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel wie

wobei η den Wert zwischen 2 und 20 annehmen kann und R Alkvireste und χ ζ. B. Amino-, Epoxy-, f/iaro-, Sulfhydryl- oder Nltroso-Gruppen sind, die auf an sich bekannte Art und Weise mit homo- oder heterobifunktionellen Reagenzion oder direkt mit den reaktiven Gruppen der DNA umgesetzt werden können. Die so mit DNA beladene Matrix wird dann zur Bindung und Entfernung dt; zirkulierenden DNA-AK eingesetzt, wobei die Matrix, insbesondere im Durchflußverfahren, in üblicher Weise (Hämoperfusion, Plasma perfusion), über auch im Batch-Verfahren (bei der Isolierung von DNA-AK für in vitro-Untersuchungen) genutzt werden kann. Nach Ablauf der Reaktion werden die gebundenen DNA-AK durch geeignete nichtdenaturierende Medien, wie 3mol/i KSCN, abgespalten, so daß die kovalent gebundene DNA zum erneuten Einsatz zur Verfügung steht. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die hohe Affinität der DNA-AK zur DNA für die spezifisch» Bindung und damit Entfernung von zirkulierenden Anti-DNA-Autoantikörpern aus Körperflüssigkeiten

Im folgenden wird die Elimination von DNA-AK an einem Beispiel erläutert.

Beispiel 1

Separon* der Korngröße 500-1000pm wurde mit eiern Silanhaftmittel NB1114 (5VoI.-% in 50% Ethanol reinst) 6 St nden bei 6O⁰C versetzt. Nach anschließendem zweimaligen Waschen mit 50% Ethanollösung und fünfmaligem Waschen mi 0,1 M Phosphatpuffer PBS pH 7,2 wurde zum Separon* bis zum Bedecken 5% Glutaraldehydlösung zugegeben und 2 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit PBS pH 7,2 war das Separon* auf die DNA-Bindung vorbereitet. An den so aktivierten Träger wurde Kalbsthymus-DNA nach 24stündigem Löschen in isotoner NaCI-Lösung, Ultraschallbehandlung (4 χ 20sec) und Hitzedenatuiierung (15min bei 100⁰C, anschließend Abschrecken in Eiswasser) in einer Konzentration von 1,6mg/ml im Verhältnis 1 Volumen fieparon* zu 2 Volumen DNA-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gebunden. Anschließend wurde nach dreimaligem Waschen mit PBS pH 7,2 mit einer 1M Ethanolaminlösung geblockt, um noch eventuell vorhandene reaktive Gruppen am Träger abzusättigen. Der Umfang der DNA-Bindung an dac Separon® sowie die Stabilität der Bindung bei der weiteren Verarbeitung wurde mit P-3'2-markierter mitochondrialer DNA, welche der Kalbsthymus-DNA zugegeben wurde, bestimmt. Unter Verwendung von DNA-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen wurden die in Tab. 1 aufgeführten Worte erreicht (Tab. 1). Die o. g. Versuchsanordnung führt zu einer optimalen DNA-Beladung des Separons*. Purch eine weitere Steigerung der angebotenen DNA-Menge kann nur noch unwesentlich mehr DNA gekoppelt werden. (Bindungskiirve Abb. 1).

Separon* 1114	DNA-Angebot	DNA-Konzentration	gebundene Menge
	(mg)	(mg/ml)	(mg/ml Ti äger)
	0,66	0.33	0,72"
	2,00	1,00	1,«2
	3,20	1,60	3,20
	13,40	1,60	3,45

1 Dieses Heeultat liegt irrt Meßfehler begtundet.

DNA-Bindung (mg/ml Träger)

DNA-Angebot

(»ng)

Beispiel 2:

Das nach Beispiel 1 hergestellte Adsorbens wurde bei 124⁰C autoklaviert. Dadurch wurde Sterilität (t = 30min) und Pyrogenf reiheit (t = 120 min) des Adsorbens erreicht. Nachdem durch Absaugen die restliche Waschlösung vom DNA-Separon* ontfernt wurde, wurde 1 Volumen Adsorbens mit 2 Volumen eines DNA-AK-reichen Serums (eines Patienten mit hochaktivem SLE) versetzt (Reaktion 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren). Das Serum wurde danach abgesaugt, das Trägermaterial 3x mit PBS pH 7,2 gewaschen, und mit 3 Volumen 3M KSCN (t = 15min) wurden unter leichtem Schütteln die gebundenen Antikörper abgetrennt. Nach 3x Waschen mit PBS pH 7,2 und erneutem Autoklavieren wurde der Prozeß der Antikörpergowinnung noch zweimal wiederholt. Die Aktivität der DNA-AK der Seren vor und nach der Behandlung wurde bestimmt. Ein typisches Beispiel zeigt Tab. 2.

Tab. 2

Anwendung	IgG	Serum vor Behandlung	Serum danach	Senkung der
	IgM	(E/l)	(E/l)	Aktivität auf:
1	IgA	40000	8170	20,5%
	IgG	7000	2250	32.0%
	IgM	9270	3470	37,6%
2	IgA	760000	158000	21,0%
	IgG	2300	1300	56,5%
	IgM	11000	2400	21,8%
3	IgA	500000	40000	8,0%
	14000	3460	24,7%
	29000	10750	37,0%

Die Clearance der verwendeten Seren lag sowohl bei der Erstanwandung als auch beim Zweit- und Drittelnsalz der Adsorbenxien deutlich über 60%. Ein signifikanter Verlust an DNA während der Anwendung und dem Autoklavieren sowie ein Wirkungsverlust durch Mehrfachautoklavieren oder durch Mehrfachvorwendung konnte nicht festgestellt werden.Biokompatibilität: Die Biokompatibilität wurde anhand des Komplementsystems für DNA-Separon* und DNA-freies Separon* bestimmt. Bei keiner der untersuchten Kapazitäten und Einzeikompononten gab es Hinweise auf Unverträglichkeitsreaktionen.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpem aus Körperflüssigkeiten, das sowohl in vitro als auch in vivo genutzt werden kann, auf der Grundlage biospezifischer Wechselwirkungen an feste Phasen, dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phasen Träger, vorzugsweise Copolymere von Hydroxyathylmethaorylat und Eihylenglycoldimethacrylat oder zeliulosehaltige Materialien verwendet werden, die über eine biokompatible Brückenverbindung DNA kovalent gebunden enthalten, und daß nach spezifischer Bindung der Anti-DNA-Autoantikörper an DNA der festen Phase durch in vivo- oder in vitro-Behandlung mit der Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Plasma, Serum und Abtrennung der festen Phase eine Regenerierung der festen Phase durch Behandlung mir nichtdenaturierenden Medien und Wiederverwendung derselben erfolgt.

2. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpern aus Körperflüssigksiten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nichtdenaturierenden Medien gepufferte Lösungen hoher lonenstärke sind, chaotropische Ionen oder aber stark saure oder alkalische Lösungen sind.

3. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpem aus Körperflüssigkeiten nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten festen Phasen aus sphärischen, flächenförmigen oder faserförmigen Festkörpern bestehen oder aber als dünne Schichten, Filme oder Lacke auf anderen Trägern aufgebracht sind.

4. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpern aus Körperflüssigkeiten nach Anspruch 1 bis 3, dndurch gekennzeichnet, daß die Festkörper durch Packung, Verweben, Sinterung oder durch Bindemittel zu vorzugsweise flächenförmigen Trägerschichten oder Kolonnenpackungen zusammengestellt sind, oder aber als dünne Schichten, Filme oder Lacke auf anderen Trägern aufgebrachter Poly- (Hydroxyethylmethacrylat)-Copolymere zum Einsatz gelangen.

5. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpern aus Körperflüssigkeiten nach Anspruch 1,2,3 und 4, dadurch gekonnzeichnet, daß als Trägermaterial sphärische ?oly-(Hydroxyethylmethacrylat-) Copolymere zum Einsatz gelangen, deren Partikelgröße 10 bis 3000 μιτι beträgt und deren Porosität über 10nm liegt.

6. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpern aus Körperflüssigkeiten nach Anspruch 1,2,3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte zeliulosehaltige Material Perlzellulose ist, deren Partikelgröße 10 bis 3000μηι beträgt und deron Porosität über lOnm liegt.

7. Verfahren zur Bindung und Entfernung von Anti-DNA-Autoantikörpem aus Körperflüssigkeiten nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß als biokompatible Brückenverbindung Organosilane vorzugsweise unter Zusatz homo- oder heterobifunktioneller Reagenzien eingesetzt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß als Brückenverbindung Epichlorhydrin, CNBr, Carbodiimide, Glutaraldehyd, und andere Verbindungen eingesetzt werden.