DE60319702T2 - Polymeraffinitätsmatrix, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Polymeraffinitätsmatrix zum Binden einer oder mehrerer Substanzen in einem Fluid zum Entfernen der Substanz(en) aus dem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, auf ein Verfahren zum Entfernen der Substanz(en) aus dem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid, auf ein Verfahren zum Herstellen der Matrix, auf die Verwendung der Matrix und einen die Matrix enthaltenden Kit.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Extrakorporale Behandlung
  • Die extrakorporale Behandlung eines Fluids, wie Blut oder irgendein anderes Körperfluid erfordert, dass das Fluid in Kontakt mit Material in Form von z. B. Röhren, Leitungen, Perlen oder Membranen gebracht wird. Die Einführung eines solchen Materials umfasst die Verwendung von fremdem und daher potenziell biounverträglichem (z. B. immunologisch aktivem oder prokoagulatorischem) Material. Die Verwendung von fremdem Material ist mit der Aktivierung des Wirtsimmunsystems verbunden, z. B. Komponenten in dem Blut, wie Lymphozyten, Plättchen oder verschiedene Typen von Plasmaproteinkaskaden, wie Proteine in der Komplement- oder Koagulationskaskade. Die Schädigung von Zellen, wie mechanische oder stressinduzierte Schädigung von z. B. Erythrozyten kann auch Hämolyse und anschließende lebensbedrohende Komplikationen bei dem Patienten hervorrufen. Die Behandlung eines Fluids, wie Blut oder irgendein anderes Körperfluid, erfordert daher die Verwendung von hoch bioverträglichem Material, um unerwünschte Aktivierung von Komponenten in dem Fluid, z. B. Blut, zu vermeiden.
  • Bakterielle Toxine
  • Bakterielle Endo- und Exotoxine fördern eine überwältigende entzündliche Immunreaktion in einem Wirt aufgrund einer Aktivierung, die durch vielfache Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und löslichen Proteinen in dem Wirt und dem Endotoxin hervorgerufen werden.
  • Diese Immunreaktion wird als ein wesentliches Merkmal in den klinischen Symptomen von SIRS (systemisches entzündliches Reaktionssyndrom), Sepsis oder septischem Schock beschrieben. Der Verlauf der Pathogenese ist ernst, und der Zustand führt zu einer Gewebeschädigung, multiplem Organversagen und durch Sepsis induziertem Tod. Die Suche nach neuen therapeutischen Wirkstoffen und Verfahren zur Behandlung von septischen Patienten ist wichtig, da Studien von neueren therapeutischen Interventionen (Dinarello et al. in European Cytokine Network 1997, 8:294) zeigen, dass der Schutz von Patienten mit schwerer Sepsis oder septischem Schock versagt. Bei der Herstellung therapeutischer Substanzen oder Fluiden muss auch Vorsicht walten gelassen werden, dass das Produkt nichtpyrogen ist, d. h., dass die Endotoxinkonzentration nicht vorhanden ist oder unter akzeptierten Grenzen für die Ausübung ihrer Wirkungen liegt.
  • Endotoxine
  • Endotoxine oder "Pyrogene" aus den äußeren Schichten der Zellmembran von gramnegativen Bakterien, z. B. Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa oder Proteus vulgaris, spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Sepsis, septischem Schock und systemischem inflammatorischem Reaktionssyndrom (SIRS). Endotoxine, z. B. Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli, sind aus einem Lipid A und einer Polysaccharidkette aufgebaut (Zähringer et al., Adv. Carb. Chem. Biochem., 1994). Die molekulare Struktur von LPS ist in 1 gezeigt. Die Lipid A-Komponente ist der biologisch aktivste Teil und vermittelt die toxische Wirkung von Endotoxinen auf Zellen. Lipid A ist in den verschiedenen Stämmen von gram-negativen Bakterien hoch konserviert, während der Polysaccharidteil viel variabler ist.
  • Lipid A von E. coli besteht aus zwei Glucosamin-Komponenten, die zwei negativ geladene Phosphatgruppen an gegenüberliegenden Enden der zwei Glucosamine und sechs langkettige, hoch hydrophobe Fettsäurereste enthalten, die mit den zwei Glucosaminringen verbunden sind. Die variable Polysaccharidkette des Endotoxins ist ebenfalls mit einem der Glucosamine verbunden.
  • Entfernung von Endotoxinen
  • Die Entfernung von Endotoxinen ist schwierig und beinhaltet häufig Probleme bei der Gewinnung oder Schädigung von wertvollen Proteinen, d. h. Proteine, die nicht entfernt werden sollen, oder der Bioverträglichkeitsprobleme mit dem Blut oder einem Körperfluid und den zur Entfernung des Endotoxins verwendeten Mitteln. Ein solches Bioverträglichkeitsproblem wird durch eine bloße Aktivierung der Abwehrmechanismen des Wirts hervorgerufen und umfasst eine vielfache zelluläre Aktivierung und Freisetzung von löslichen Proteinen, wie Cytokine und Proteine in der Komplementkaskade. Die zelluläre Aktivierung und die Proteinfreisetzung können zu einer schweren Entzündung, d. h. systemischer Sepsis oder septischem Schock, führen, mit einer Gewebeschädigung oder einem Organversagen als Ergebnis. Das durch Koagulation hervorgerufene Verklumpen von Blut ist ein anderes Problem, das durch Biounverträglichkeit hervorgerufen wird. Darüber hinaus kann das Pyrogen gegebenenfalls nicht vollständig entfernt werden.
  • Bekannte Verfahren zum Entfernen von Endotoxinen umfassen eine Inaktivierung durch Verwendung von Wärme, Säure oder Alkali ( US-Patentschriften Nr. 3,644,175 , 3,659, 027 und 4,070, 289 ). Solche Verfahren beeinträchtigen häufig die Qualität des Endprodukts, d. h. das inaktivierte entgiftete Fluid, da das Fluid und seine wertvollen Proteine unter Verwendung dieses Typs von Verfahren ebenfalls denaturiert oder inaktiviert werden können. Andere zu verwendende Verfahren umfassen die Adsorption an Aktivkohle oder die oxidative Zersetzung unter Verwendung eines Oxidationsmittels, z. B. Kaliumpermanganat, wässriges Wasserstoffperoxid und Natriumhypochlorit.
  • Herkömmliche Mittel zur Entfernung von Endotoxinen
  • Die extrakorporale Entfernung von Endotoxinen aus Plasma oder Gesamtblut von septischen Patienten wird als potenzielle therapeutische Strategie bei der Behandlung von Sepsis, septischem Schock und SIRS diskutiert. In menschlichem Plasma gibt es verschiedene Bindungsproteine, die eine Rolle bei der Vermittlung und Hemmung von Endotoxinwirkungen auf Zellen spielen, z. B. Lipopolysaccharid bindendes Protein (LBP), die bakterizide Permeabilität erhöhendes Protein (BPI), sCD14, CAP18 und Lactoferrin. Das Peptidantibiotikum Polymyxin B (hergestellt von Bacillus polymyxa) hemmt die Wirkung von Endotoxinen auf Zellen. Die Königskrabbe (Limulus polyphemus) enthält auch Endotoxin bindende Proteine, und ein Zelllysat aus dieser Spezies wird zum Nachweis von Endotoxinen (Limulus amebocyte-Lysat, LAL oder Limulus-Test) verwendet. Die bindenden Prinzipien solcher Endotoxin bindenden Proteine können für die extrakorporale Behandlung von Plasma oder Gesamtblut von septischen Patienten verwendet werden.
  • Ein gemeinsames Kennzeichen von zahlreichen Endotoxin bindenden Sequenzen ist die Anwesenheit von alternierend positiv geladenen und hydrophoben Aminosäuren in ihrem Bindungsteil. Es ist für ein aus der Königskrabbe stammendes Endotoxin bindendes Protein gezeigt worden, dass die Endotoxin bindende Sequenz eine amphipatische sekundäre Struktur bildet, wenn sich positiv geladene Reste und hydrophobe Reste an gegenüberliegenden Seiten einer Schleifenstruktur befinden (Hoess et al., EMBO J, 1993). Ein ähnliches Muster ist für andere Endotoxin-Bindungsstellen vorgeschlagen worden.
  • Positiv geladene Polymere, wie Polyethylenimin (Mizner et al., Artif. Organs, 1993; Weber et al., ASAIO J, 1995; Petsch et al., J Chromatogr. Biomed. Sci. Appl., 1998) oder mit Diethylaminoethyl (DEAE) modifizierte Cellulose (Weber et al., A. S. A. I. O. J., 1995) haben eine bestimmte Adsorptionskapazität für Endotoxine, die wahrscheinlich auf der Wechselwirkung der positiven Ladungen mit den negativ geladenen Phosphatresten des Lipids A beruht. Ein Nachteil von Polyethylenimin ist die hohe Absorption von Heparin und seine gut beschriebene Wechselwirkung mit Plättchen, die Biounverträglichkeitsprobleme, wie Koagulation in einer in vivo- oder ex vivo-Anwendung, hervorruft.
  • In ähnlicher Weise werden positiv geladene Membranfilter zur Reinigung von Infusionsfluiden verwendet. Die Absorption ist somit abhängig von anziehenden Ladungen und ist weniger spezifisch und kann daher ebenfalls erwünschte wertvolle Proteine entfernen.
  • Zur Entfernung von Endotoxinen aus Plasma, Blut und pharmazeutischen Lösungen ist auf Sepharose immobilisiertes Arginin vorgeschlagen worden ( EP 0 494 848 und EP 0 333 474 ).
  • WO 92/11847 beschreibt sowohl die Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Medikamentes, das oral, intravenös, intramuskulär, intrakutan oder intraperitoneal zur Behandlung von durch Endotoxin induzierten Wirkungen zu verwenden ist, als auch ein Verfahren zur Behandlung von durch Endotoxin induzierten Wirkungen. Die in WO 92/11847 beschriebene Verbindung ist nicht auf einem festen Träger immobilisiert.
  • WO 92/04384 A1 beschreibt die Verwendung von verschiedenen Abstandsgruppen zum Erhalt definierter Abstände zwischen einer festen Phase und einem Ligand in einem Verfahren zur Hemmung von durch Endotoxin induzierten Wirkungen.
  • WO 01/23413 beschreibt Liganden, die an einen festen Träger über eine Abstandsgruppe gebunden sind. Dieser Ligand besteht aus einer Mischung von linearen oder verzweigten Oligopeptiden und ist wirksam zur Adsorption einer großen Vielzahl von Endotoxinen.
  • Bioorganic & Medicinal Chemistry letters 12 (2002) 951–954, Soho Kasai et al. "Design and Synthesis of Antiangiogenic/Heparin-Einding Arginine Dendrimer..." beschreibt TX-1943 und TX-1944, bestehend aus Arginin- und Lysinresten, die an ein Wang-Harz über ein Glycin gebunden sind.
  • Hydrophobe Polymere (z. B. Polystyrol, Polyamid, Polysulfon und Polyethersulfon) können ebenfalls Endotoxine in wässrigen Lösungen adsorbieren. Diese Eigenschaft wird in Ultrafiltrationsmembranen zur Reinigung von Wasser und Dialyse/Infusions-Fluid, d. h. Lösungen mit niedrigem oder gar keinem Proteingehalt (Weber et al., Int. J. Artific. Org., 1997) verwendet. Die Entfernung von Endotoxinen aus Blut oder Plasma ergibt jedoch ein konkurrierendes Problem mit zirkulierenden Plasmaproteinen (LBP, BPI, sCD14) und von zellulären Rezeptoren (z. B. CD14) an einer Adsorbermatrix aufgrund der einfachen hydrophoben Absorption, die eine niedrige Spezifität hat.
  • Die Verwendung von positiv geladenen oder hydrophoben Polymeren zur Entfernung von Endotoxinen zeigt, dass die Spezifität der Bindung und daher auch die Selektivität zur Entfernung des Endotoxins in Plasma niedrig ist. In der Praxis ist es eine Herausforderung gewesen, ein wirksames Endotoxinadsorbens mit sowohl hoher Spezifität als auch hoher Selektivität und noch in Kombination mit hoher Bioverträglichkeit zu entwickeln.
  • Die Verwendung von Peptidsequenzen aus Endotoxin bindenden Proteinen ist für therapeutische Anwendungen unter Verwendung von z. B. die bakterizide Permeabilität erhöhenden Proteinprodukten (BPI-Proteinprodukten) ( US-Patentschriften Nr. 5,639,727 und 5,643, 875 ) vorgeschlagen worden. Ein Nachteil von immobilisierten Peptiden sind die Synthesekosten und die Notwendigkeit, dass die Peptide ohne Beeinträchtigung der Bindungsstruktur zu immobilisieren sind.
  • Affinitätsliganden, wie Histamin, Histidin und Polymyxin B, sind wirksam zur Entfernung von Endotoxinen, obwohl ihre Wirksamkeit von anderen Proteinen in dem Fluid abhängig ist und in Gegenwart von Serumproteinen, wie Serumalbumin oder andere negativ geladene Proteine drastisch abnimmt (Anspach and Hilbeck, J. Chromatogr., 1995, Petsch et al., J. Chromatogr., 1997, EP 0 129 786 ). Polymyxin B ist jedoch toxisch für das Zentralnervensystem und kann eine Nierenschädigung hervorrufen, was ein Nachteil bei der Marktzulassung ist aufgrund eines Risikos des Durchsickerns in das Blut eines Patienten. US 4,771,104 beschreibt ein Endotoxin entgiftendes Material, das einen fasrigen Träger umfasst, an welchem Polymyxin B fixiert ist.
  • Die Entfernung von Endotoxinen, insbesondere LPS, aus Wirkstoffen und Fluiden unter Verwendung von in Wasser unlöslichen Poly(-lysin)-Teilchen (PL-Teilchen) wurde von Hirayama et al. in Journal of Chromatography B, 271 (1999), 187–195 beschrieben.
  • Beschränkungen und zukünftige Perspektiven
  • Eine wirksame Endotoxinentfernung aus einem Proteinfluid ist abhängig von der Nettoladung des erwünschten wertvollen Proteins, von welchem das Endotoxin entfernt werden sollte. Die Wechselwirkung zwischen dem Endotoxin und seinem Ligand ist sowohl von hydrophobem als auch ionischem Charakter, obwohl der Beitrag von jedem von ihnen von der Ionenstärke und dem pH des Fluids abhängt. Eine wirksame Endotoxinentfernung ist auch von einer hohen Perfusion und Bioverträglichkeit der Mittel zur Entfernung des Endotoxins abhängig, um z. B. eine Zellaktivierung oder ein Verklumpen von Blut zu verhindern.
  • Obwohl zahlreiche Mittel zur Entfernung von Substanzen, wie Endotoxine aus Fluiden, z. B. Blut, andere Körperfluide oder therapeutische Fluide, entwickelt oder vorgeschlagen worden sind, ist jedoch keines der beschriebenen Mittel hoch bioverträglich noch hat es einen hohen Grad von Spezifität und Selektivität gegen zu entfernende Substanzen, z. B. Endotoxine, und kann gleichzeitig in einfacher Weise perfundiert werden, z. B. durch Gesamtblut oder Plasma. Es ist daher erwünscht, hoch effiziente, bioverträgliche und wirksame Verfahren und Mittel zur Entfernung von Substanzen, z. B. Endotoxine, aus einem Fluid zu entwickeln und es so möglich zu machen, die mit den Vorrichtungen des Standes der Technik verbundenen Probleme zu vermeiden. In dieser Hinsicht spricht die vorliegende Erfindung dieses Bedürfnis und Interesse an.
  • Das Bedürfnis nach einem neuen und effizienten Verfahren und Mittel zum Erniedrigen der Konzentrationen oder zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid, z. B. Endotoxine aus Blut, irgendeinem anderen Körperfluid oder einem therapeutischen Fluid, im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in einem Fluid ist aus den vorstehend beschriebenen Gründen offensichtlich, insbesondere auf dem biomedizinischen Gebiet. Ein solches Verfahren und Mittel würde auch spezifisch wertvoll bei der Behandlung von Sepsis, septischem Schock und SIRS durch extrakorporale Entfernung von Pyrogenen oder anderen aktivierenden Substanzen aus dem Plasma von septischen Patienten sein.
  • Weiter ist es bekannt, einen biospezifischen Ligand, z. B. ein Antikörper oder ein Peptid, an eine Matrix oder ein Substrat zu binden und dadurch z. B. pathophysiologisch kritische Substanzen aus dem Körper oder dem Blutkreislauf zu entfernen.
  • Verwendete bekannte Materialien sind z. B. Sepharose (Sephadex, Pharmacia), Polyacrylat oder Epoxidharze in Form von Perlen oder Teilchen.
  • Bekannte Perlen sind z. B. hergestellt aus Polymethylmethacrylat, z. B. das DALI-System (Fresenius) für die LDL-Adsorption, Sepharose, z. B. das Rheosorb-System von Plasmaselect für die Fibrinogenadsorption, die ein immobilisiertes Peptid verwendet, das Therasorb-Immunoadsorption-System, um Autoantikörper unter Verwendung eines immobilisierten Schaf-Antikörpers, der menschliche Immunoglobuline bindet, zu entfernen, die Excorim-Protein A-Säule (und ähnliche Systeme von anderen Herstellern), die ein immobilisiertes bakterielles Protein zum Binden von Immunoglobulinen verwendet.
  • Bekannte Membranen sind z. B. Polyamid (MAT/Merck) und andere gewöhnlich als Affinitätsmembranen beschriebene Produkte.
  • Bekannte Fabrikate sind z. B. Toray-Polystyrol/Polyethylen-Siebe mit einem Polymyxin B-Ligand für die LPS-Bindung.
  • Alle diese Substrate sind im Fall der Verwendung von biologischen Liganden (wie Peptide oder Antikörper) durch übliche Verfahren der Nasschemie modifiziert, d. h. zuerst wird der entsprechende spezifische Ligand gebildet oder isoliert (z. B. durch Peptidsynthese, durch biotechnologische Verfahren), dann wird er gereinigt, und anschließend wird er auf einer festen Matrix immobilisiert.
  • Diese Matrizes erlauben gewöhnlich keine Festphasesynthese eines Liganden (z. B. ein Peptid) direkt auf der Matrix aufgrund einer chemischen Unverträglichkeit gegen die Chemikalien (Lösemittel, Säuren und Basen, die zur Abspaltung von Schutzgruppen usw. verwendet werden), die in der Festphasesynthese verwendet werden.
  • Die Matrizes, die für die Festphasesynthese geeignet sind (z. B. Polystyrol) sind nicht für therapeutische Zwecke aufgrund der fehlenden Bioverträglichkeit geeignet.
  • Daher würde eine Festphasematrix, die sowohl eine Festphasesynthese als auch den Kontakt mit Blutkomponenten (z. B. Plasma oder Gesamtblut) erlaubt, aus den folgenden Gründen vorteilhaft sein:
    • (1) Die Entwicklungsschritte zum Auffinden eines geeigneten Liganden (z. B. eine optimierte Peptidstruktur) können auf der gleichen festen Matrix durchgeführt werden, die später für die therapeutische Anwendung verwendet werden kann. Dies bedeutet, dass die notwendigen biologischen Testverfahren (z. B. Messung der Affinität, der Spezifität und der Bindungskapazität) unter Bedingungen durchgeführt werden können, die sehr ähnlich zu den Bedingungen der späteren therapeutischen Anwendung sind. Dadurch ist die Information, die aus den biologischen Testverfahren stammt, sehr verlässlich und für die spätere therapeutische oder klinische Anwendung voraussagbar. Dies spart Zeit und Geld und erniedrigt das Risiko des Versagens oder von Nebenwirkungen.
    • (2) Ein (Peptid)-Ligand kann durch Festphasesynthese in einer genau definierten Weise (bezüglich Sequenz und Geometrie) aufgebaut werden. Dies bedeutet auch, dass die Verbindung (d. h. der Ort der kovalenten Verbindung) des (Peptid)-Liganden an die feste Matrix genau definiert ist.
  • Es gibt etwas widersprechende Erfordernisse für eine solche Matrix mit Bezug auf das Quellungs- oder Benetzungsverhalten: für die Festphasesynthese werden gewöhnlich nichtwässrige organische (polare, wie Dimethylformamid, oder apolare, wie Dichlormethan) Lösemittel oder Mischungen von Lösemitteln verwendet. Andererseits muss die therapeutische Anwendung in einer wässrigen Umgebung (Plasma, Blut, therapeutische Lösungen usw.) stattfinden. In beiden Umgebungen (d. h. wässrige und organische Lösemittel) muss die Polymermatrix in einfacher Weise benetzbar und quellbar sein:
    • (1) um in der Lage zu sein, ungebundenen (überschüssigen) Ligand oder Aufbaublöcke (z. B. geschützte Aminosäuren) oder Chemikalien (z. B. Kupplungsmittel, wie Carbodiimide, Schutzgruppen abspaltende Mittel, wie organische Säuren oder Basen) wirksam zu entfernen oder auszuspülen und
    • (2) um zu erlauben, dass das betreffende Toxin aus der wässrigen Umgebung entfernt wird, muss die Matrix auch in dieser Umgebung benetzbar und quellbar sein.
  • Demgemäß ist das Problem mit bekannten Polymermatrizes, dass man auf den Typ des Regenerierungsfluids beschränkt ist, das zu verwenden ist, um den gebundenen aktiven Ligand als solchen nicht zu eluieren, sondern lediglich die in dem Material eingeschlossenen, aus dem Fluid zu entfernenden Substanzen, und der Ligand wird als definiertes Peptid/Molekül oder statistisch polymerisiertes Polypeptid/Oligomer aufgebaut und muss dann an das Trägermaterial als solches gebunden werden, wobei man nicht weiß, welches Ergebnis erhalten wird.
  • Die Vorteile bei der Verwendung gemäß der Erfindung sind, dass man den Ligand direkt an den festen Träger mit dem gepfropften Polyethylenglycol binden kann und dass der feste Träger mit dem gebundenen Ligand direkt verwendet werden kann. Dies gibt eine Verlässlichkeit, die man mit Matrizes des Standes der Technik nicht erhält. Ferner ergibt sie technologische Vorteile, da der biologisch aktive/spezifische Ligand Teil der medizinischen Vorrichtung ist und die Entwicklungszeit verkürzt ist (dies erlaubt oder erleichtert eine Art der individualisierten Behandlung).
  • Während der Entwicklung des Materials gemäß der Erfindung war es weder bekannt noch erwartet, dass sie so ausgezeichnet arbeitet, wie es sich herausgestellt hat. Der erwartete Nachteil war z. B., dass die Polymermatrix quellen und den Fluss durch die Vorrichtung verstopfen würde. Weiter war zu erwarten, dass der Druckabfall zu hoch wäre, wenn eine Flüssigkeit, wie Gesamtblut, angewandt würde. Schließlich war zu erwarten, dass als Ergebnis der vorstehenden Gründe die Perfusion des Fluids durch das Festphasenmaterial ungenügend sei.
  • Die Polymermatrix gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen hat sich als ausgezeichnet für die Dampfsterilisation und für die nachfolgende Trocknung gezeigt. Nach dem Trocknen wird die Restluft in einfacher Weise durch Zugabe einer Kochsalzlösung entfernt, wobei die Polymermatrix wieder quillt und zur Verwendung bereit ist. Dies führt zu einer kurzen Präparationszeit in der Klinik, was z. B. bei Notfällen und in Zeiten hoher Arbeitsbelastung wichtig ist.
  • Weiter zeigt das Material eine sofortige Benetzung, was für die meisten verwendeten festen Träger, die für verschiedene Typen von Liganden verwendet werden, nicht der Fall ist. Dies ist ein sehr wichtiges Merkmal als Festphasenmaterial für aktive Liganden. Das Material ist auch fähig, innerhalb eines bestimmten Bereiches komprimiert und dekomprimiert zu werden, und das Material ist bioverträglich mit Bezug auf die Komplementaktivierung, die Kontaktphasenaktivierung, die Cytotoxizität und die Granulozytenaktivierung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Daher ist es die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, die mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme zu eliminieren, indem eine hoch bioverträgliche, spezifische, selektive und leicht perfundierbare Polymeraffinitätsmatrix zum Entfernen und/oder Erniedrigen der Mengen oder Konzentrationen der vorstehend genannten unerwünschten Substanzen, z. B. Endotoxine, in Fluiden, d. h. eine Polymeraffinitätsmatrix mit sämtlichen Vorteilen des Standes der Technik und ohne die Nachteile, bereitgestellt wird.
  • Diese Aufgabe ist gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung gelöst, d. h. mit einer Polymeraffinitätsmatrix zum Binden einer oder mehrerer Substanzen in einem Fluid zum Entfernen der Substanz(en) aus dem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, worin die Matrix die in dem Patentanspruch 1 definierten Komponenten a) bis c) umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Polymeraffinitätsmatrix zur Entfernung von Endotoxinen zum Erniedrigen der unerwünschten Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in einem Fluid, worin die Matrix einen Ligand mit einer dreidimensionalen Struktur bereitstellt, der komplementär zu der dreidimensionalen Struktur eines bindenden Prinzips des Endotoxins ist, wodurch eine Bindung des Endotoxins ermöglicht wird.
  • In der bevorzugten Ausführungsform zur Entfernung von Endotoxinen zum Erniedrigen der Aktivierung des Fluids ist jede Bindungseinheit in der Polymeraffinitätsmatrix Arginin. Eine solche Polymeraffinitätsmatrix erzeugt einen definierten Ausschluss von 1 × 102–1 × 106 Dalton und kann zum Binden von sowohl hydrophoben und/oder hydrophilen Substanzen verwendet werden.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Verringern ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, umfassend das Kontaktieren des Fluids mit der Polymeraffinitätsmatrix gemäß der Erfindung für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Menge oder Konzentration zu verringern und/oder die Substanz(en) von Interesse zu entfernen, bevorzugt bis zu 24 Stunden, am bevorzugtesten von 1 Sekunde bis 2 Stunden. Die Zeit hängt jedoch von der Fließrate, der Säulengröße und der Anwendungsart ab, d. h. ob die Behandlung in vivo, ex vivo oder in vitro durchgeführt wird. Bevorzugt liegt die Menge oder Konzentration der Substanz(en), nachdem sie entfernt oder verringert worden ist bzw. sind, unter der Kapazität von aktivierenden Komponenten oder Vorgängen im Blut oder verhindert die Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen im Blut.
  • In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen der Polymeraffinitätsmatrix, wie in einem der Patentansprüche 1 bis 10 definiert, gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und
    • b) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex; oder
    • c) Binden der Abstandsgruppe an den wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Ligand zum Erhalt eines zweiten Komplexes und
    • d) Binden des festen Trägers an den zweiten Komplex; oder
    • e) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und
    • f) Festphase-Synthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe; oder
    • g) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und
    • h) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex; oder
    • i) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und
    • k) Festphase-Synthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe, worin Information über die dreidimensionale Struktur, die Anwesenheit von Ladungen und von hydrophoben/hydrophilen Bereichen des Bindungsprinzips auf der bzw. den zu bindenden Substanz(en) aus Röntgenstrahl-Kristallografie, Proteinsequenzierung, Proteinmodellierung oder Hydrophobie- und Hydrophilieberechnungen gesammelt wird, und die Bindungseinheit bezüglich der Ladung und/oder der Hydrophilie/Hydrophobie zu dem Bindungsprinzip der Substanz(en) komplementär gemacht wird.
  • In einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der Polymeraffinitätsmatrix zur Entfernung einer oder mehrerer Substanzen, bevorzugt von Endotoxinen, aus einem Fluid oder auf das Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid, bevorzugt ein Körperiuid oder ein therapeutisches Fluid, am bevorzugtesten Blut.
  • In einem noch weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf einen Kit zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, wobei der Kit die Polymeraffinitätsmatrix, Probenrohre und eine Vorrichtung zur extra- und/oder intrakorporalen Behandlung des Fluids, bevorzugt Blut oder Serum, umfasst.
  • Die Verwendung einer Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung optimiert die Behandlung von Fluiden, wie Blut, irgendein anderes Körperfluid oder therapeutische Fluide zur Entfernung einer oder mehrerer Substanzen, wie Endotoxine, und/oder zum Verringern ihrer Menge oder Konzentration im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid.
  • Speziell ist die Verwendung eines hoch bioverträglichen und perfundierbaren Materials gemäß der Erfindung wichtig zur Verhinderung der Aktivierung in dem Fluid während der Verwendung der Polymeraffinitätsmatrix. Dies ist von besonderer Wichtigkeit bei extrakorporaler Entfernung von Endotoxinen aus Plasma oder Blut von septischen Patienten und wird als eine potenzielle therapeutische Strategie bei der Behandlung von Sepsis, septischem Schock und SIRS beschrieben. Als weiterer Vorteil verringert die Verwendung der Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung die Behandlungszeit für den Patienten.
  • Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich, wenn sie in Verbindung mit den Zeichnungen und den beigefügten Patentansprüchen gelesen wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine schematische Ansicht einer Lipid A-Komponente des LPS-Moleküls mit seinen strukturellen Elementen.
  • 2A und 2B sind schematische Ansichten von Beispielen von Liganden, die zu der baumartigen Struktur (gemäß der vorliegenden Erfindung) (2A) und der kammartigen Struktur (2B) der Polymeraffinitätsmatrix gehören.
  • 2C zeigt Beispiele von Polymeraffinitätsmatrizes mit einer cyclischen Ligandenstruktur.
  • 3A und 3B zeigen, wie die komplementäre Struktur des Endotoxins durch Verwenden struktureller Erfordernisse und positiver Ladungen, hydrophober Bereiche und optimaler Abstände in dem Bindungsprinzip gebildet wird.
  • 4 beschreibt verschiedene Arten der Herstellung einer Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 5 zeigt Konzentrationen von Endotoxin in menschlichem Plasma nach der Inkubation mit PS-PEG-Perlen für verschiedene Zeitpunkte (1, 10 und 120 Minuten).
  • 6A bis 6G zeigen die Hemmung von Endotoxin induzierter Herstellung von intrazellulärem IL6 in Monozyten nach der Behandlung von LPS enthaltendem Blut mit PS-PEG-Arg8-Perlen im Vergleich mit Perlen ohne die Matrix, d. h. Referenzmaterial (PS-PEG-Referenzmaterial).
  • 7A bis 7D zeigen das Bioverträglichkeitsprofil von PS-PEG-Arg8-Perlen, welche die Anzahl weißer Blutzellen (WBC) und roter Blutzellen (RBC), die Anzahl von Thrombozyten (THR) und den Hämatokrit (HCT) messen.
  • 8 zeigt das Fehlen von TCC-(terminaler Komplementkomplex)-Bildung nach der Verwendung von PS-PEG-Arg8-Perlen im Gesamtblut.
  • 9 zeigt das Fehlen von Elastasefreisetzung nach der Verwendung von PS-PEG-Arg8-Perlen im Gesamtblut.
  • 10 zeigt das Fehlen von TAT-(Thrombin-Antithrombin III-Komplex)-Bildung nach der Verwendung von PS-PEG-Arg8-Perlen im Gesamtblut.
  • 11A und 11B zeigen eine dreidimensionale Struktur des Liganden, der die Bindungseinheit -Arg8 und -Arg4, optimiert für die LPS-Bindung, enthält.
  • 12A zeigt als Kurven dargestellte Langmuir-Isothermen für PS-PEG-Arg8 und PS-PEG-Arg4, bezogen auf die Masse der Perlen in Gramm.
  • 12B zeigt als Kurven dargestellte Langmuir-Isothermen für PS-PEG-Arg8 und PS-PEG-Arg4, bezogen auf Mole von Arginin.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Wie vorstehend angegeben, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Polymeraffinitätsmatrix zum Entfernen von Substanzen aus einem Fluid, wie Blut, irgendeinem anderen Körperfluid oder therapeutischen Fluiden, um die Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid zu erniedrigen, wobei gleichzeitig eine ausreichende Spezifität gegeben ist, um eine Adsorption von anderen wertvollen Substanzen in dem Fluid, z. B. physiologische Komponenten des Blutes, zu vermeiden. Diese Matrix stellt einen Ligand mit einer Struktur bereit, der komplementär zu der Struktur eines bindenden Prinzips der Substanz ist, um die Menge oder Konzentration von z. B. einem Endotoxin zu entfernen oder zu verringern.
  • Definitionen
  • In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Entfernen einer Substanz" bedeuten das Verhindern, Verringern, Erniedrigen, Neutralisieren, Inaktivieren, Abbauen, Modifizieren, Einfangen, Binden oder Maskieren einer Substanz, was nicht immer heißen soll, dass es eine Nullmenge oder -konzentration der Substanz bedeutet. Darüber hinaus soll der Ausdruck "Erniedrigen der Menge oder Konzentration einer Substanz" eine Verringerung oder Erniedrigung der Menge oder Konzentration einer Substanz in einem Fluid bedeuten, die hoch genug ist, um eine nachfolgende Aktivierung von Komponenten in dem Fluid und/oder zelluläre und/oder nicht-zelluläre biologische Mechanismen in dem Fluid zu verhindern oder zu hemmen.
  • Der Ausdruck "Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen" bedeutet, einen bestimmten chemischen, biologischen oder biochemischen Vorgang in dem Fluid, z. B. in Blut oder Gewebezellen, z. B. Plasmaproteinkaskaden, wie Signaltransduktionswege, Komplement- oder Koagulationsvorgänge und/oder die Aktivierung von in solchen Vorgängen beteiligten Komponenten in direktem oder indirektem Weg zu inaktivieren, hemmen, erniedrigen, herabsetzen, verringern, verlangsamen oder verhindern. Eine "direkte" Entfernung einer Substanz beeinflusst den Vorgang ohne irgendwelche Zwischenschritte, während eine "indirekte" Entfernung die Entfernung einer Substanz impliziert, die Teil einer langen Kette oder einer Kaskade von Reaktionen ist, wo die Entfernung einer Substanz früh ein nachgeschaltetes Ereignis von Interesse verhindert, verlangsamt oder hemmt. Dies bedeutet, dass die Entfernung einer Substanz aus z. B. Blut ein inaktiviertes oder weniger aktiviertes Blut ergeben kann. Ebenfalls umfasst ist hierin die Verhinderung einer Aktivierung des Fluids, wie Blut.
  • Der Ausdruck "Fluid" soll jedes Fluid, wie jedes Gas oder jede Flüssigkeit, wie eine Suspension oder eine Lösung, einschließlich herkömmliche Lösungen, z. B. wässrige oder organische Lösungen, oder Blut, jedes Körperfluid oder therapeutisches Fluid, Fluide für Life Science-Anwendungen, wie Fluide in biologischen, diagnostischen oder biotechnologischen Anwendungen, z. B. Pufferlösungen, Infusionsfluide oder Dialysefluide, Fluide zur Ernährung und Fluide für die industrielle Verwendung umfassen.
  • Der Ausdruck "Körperfluid" soll Blut, Plasma, zerebrospinales Fluid, Aszites und Reinfusionsfluide (z. B. nach einer Hämokonzentration), von gesunden Spendern erhaltene Blutpro dukte, wie Plasma, Plättchenkonzentrate, Erythrozytenkonzentrate, die für Transfusionen verwendet werden, umfassen.
  • Der Ausdruck "therapeutisches Fluid" soll peritoneale Dialysefluide, Hämodialysekonzentrate und Dialysewasser, Substitutionsfluide/on-line hergestellte Fluide, Infusionsfluide, parenterale Ernährungsfluide, Waschfluide in chirurgischer Umgebung und Fluide für die Blutkomponentenherstellung, Blutersatzstoffe (Sauerstoffträger, modifizierte Hämoglobinlösungen, künstliche Hämoglobinlösungen) umfassen.
  • Der Ausdruck "Fluide für die Life Science-Anwendung" soll Fluide und/oder Medien für Zellkulturgewebe-Engineering, Molekularbiologie (z. B. Lösungen von Proteinen und Enzymen, die für PCR-Techniken verwendet werden), Bakteriologie, Analytika und pharmazeutische Präparation umfassen.
  • Der Ausdruck "Fluide für die Ernährung" soll Trinkwasser, Fluide für die Anwendung im Freien und Rekonstitutionsfluide für Nahrungsmittel und Trinkkonzentrate oder -pulver umfassen.
  • Der Ausdruck "fester Träger" soll eine feste Phase oder einen festen Träger oder eine unlösliche Matrix bedeuten, wonach ein Molekül, z. B. ein Ligand in Form eines Polypeptids, mit oder ohne eine Verbindungsgruppe oder eine Abstandsgruppe dazwischen synthetisiert oder gekuppelt werden kann.
  • Der Ausdruck "funktionelle Gruppe" soll ein spezielles Atom oder eine Gruppe von Atomen bedeuten, die ein Molekül ergibt, d. h. die Bindungseinheit in der Matrix gemäß der vorliegenden Erfindung, z. B. eine Aminosäure, eine Fettsäure, ein Kohlenhydrat, ein Lektin und ein Nucleotid und Derivate davon oder Kombinationen davon, eine spezielle chemische Charakteristik oder Struktur, z. B. eine positive oder eine negative Ladung, Hydrophobie oder Hydrophilie und/oder jede andere physiochemische Kraft, z. B. van der Waals-Kräfte und π-π-Wechselwirkungen zwischen aromatischen Gruppen oder eine Fähigkeit, weitere Bindungen zu bilden, wie Wasserstoffbindungen oder kovalente Bindungen. Beispiele von funktionellen Gruppen an Aminosäuren sind -COOH, -OH, -SH, Guanidino und -NH2, können aber auch eine substituierte Aminogruppe oder irgendeine positiv geladene Gruppe oder Mischungen davon sein.
  • Der Ausdruck "Bindungseinheit" soll das vorstehend unter der Definition des Ausdrucks "funktionelle Gruppe" genannte Molekül bedeuten, worin das Molekül für die Bindung der zu entfernenden und/oder zu verringernden Substanz(en) verantwortlich ist, wenigstens eine funktionelle Gruppe enthält und in dem Ligand enthalten ist, der an eine Abstandsgruppe in der Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden ist.
  • Jede Bindungseinheit umfasst eine Aminosäure, die positiv auf oder um den physiologischen pH des Bluts herum geladen ist, wie Arginin, Lysin, Cystein oder Histidin, oder ein anderes bi- oder trifunktionelles Molekül mit wenigstens einer funktionellen Gruppe, die positiv auf oder um den physiologischen pH von Blut herum geladen ist.
  • Der Ausdruck "bindendes Prinzip" soll ein dreidimensionales strukturelles und chemisches Prinzip, einzeln oder wiederholt, auf der bzw. den zu entfernenden Substanz(en) bedeuten.
  • Der Ausdruck "Ligand" bedeutet das ganze dreidimensionale Molekül, das an die Matrix über die Abstandsgruppe gebunden ist, d. h. das wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthält. Der Ligand bildet eine dreidimensionale komplementäre Struktur mit dem bindenden Prinzip und bindet an das bindende Prinzip an der zu entfernenden Substanz. Hier soll "komplementär" eine dreidimensionale und geometrisch definierte Struktur bedeuten, die durch eine Fähigkeit zum genauen Paaren mit der dreidimensionalen komplementären Struktur eines bindenden Prinzips der zu entfernenden Substanz gekennzeichnet ist.
  • Der Ausdruck "Derivate davon", der in Verbindung mit einer bestimmten Verbindung verwendet wird, bedeutet eine oder mehrere Verbindungen, die in einer solchen Weise derivatisiert sind, dass sie die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Funktion wie die Verbindung als solche haben.
  • Ferner sollen Isomere der Verbindungen, die den Ligand bilden, ebenfalls in dem Bereich der Erfindung enthalten sein, vorausgesetzt, dass sie die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Funktion wie die Verbindungen als solche zeigen. In den Strukturformeln bezeichnen α und ε gemäß der für Aminosäuren gewöhnlich verwendeten Nomenklatur die für kovalentes Kuppeln von weiteren Molekülen verwendeten Aminogruppen.
  • Der Ausdruck "Substanz(en)" soll wenigstens eine Komponente oder ein Molekül von Interesse, löslich oder nicht löslich, bedeuten, das an die Bindungseinheit gebunden werden soll. Beispiele von Substanzen sind toxische Substanzen, die Blutzellen aktivieren können, wie Substanzen, die von Viren und Bakterien abgeleitet sind, z. B. ein Endotoxin, eine Blutzellenpopulation, wie ein Lymphozyt, ein Thrombozyt, ein Granulozyt, eine dendritische Zelle, ein Monozyt, eine endotheliale Zelle, eine Stammzelle, eine Tumorzelle; oder eine Blutkomponente oder ein Produkt aus einer Stoffwechselaktivität, wie von Glucose abgeleitete Moleküle oder Abbauprodukte davon, Blutverklumpungsproteine, prokoagulatorische Proteine, inflammatorische oder proinflammatorische Proteine, Cytokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, Chemokine, urämische Toxine und Makrophagenmigration-Hemmfaktor. Beispiele von Blutkomponenten sind sowohl infektiöse Substanzen, die z. B. eine kontagiöse Krankheit hervorrufen, einschließlich Virusteilchen, Prionen oder Parasiten, Pilze, pathogenbeladene Blutzellen als auch Wirkstoffe nach Überdosieren, pathogene Nahrungsmittelzusätze oder andere Komponenten, die nicht aus dem Körper stammen. Ebenfalls sollen sowohl Pyrogene, insbesondere bakterielle Pyrogene, bakterielle Exotoxine, Produkte von grampositiven Bakterien, wie Lipoteichonsäure, Produkte von Stoffwechselstörungen, chronisch oder akut, als Ergebnis von z. B. Diabetes mellitus, Lebererkrankung, Urämie oder Nierenerkrankungen oder Entzündung als auch Adhäsionskaskaden, z. B. lösliche Adhäsionsmoleküle umfasst sein. Bevorzugte zu entfernende Substanzen sind z. B. sowohl Endotoxine von gram-negativen Bakterien, wie LPS, als auch bakterielle DNA oder Fragmente oder Abbauprodukte davon, und Oligonucleotide, Heparin, Phosphat, Blutzellen, lösliche oder an die Zelloberfläche gebundene Proteine.
  • Der Ausdruck "Abstandsgruppe" soll ein kettenförmges Molekül, z. B. ein Polymer, bedeuten, das den festen Träger in dem Sinn modifiziert, dass es ein Teil des festen Trägers wird und den Ligand mit der wenigstens einen Bindungseinheit, die wenigstens eine funktionelle Gruppe enthält, entfernt von dem festen Träger positioniert und ihn weniger beschränkt durch sterische Hinderung von dem festen Träger und verfügbarer für die zu bindende(n) Substanz(en) macht, z. B. ein Endotoxin, eine Zellpopulation oder eine Blutkomponente. Das Molekül der Abstandsgruppe kann linear und/oder verzweigt und/oder cyclisch sein. Die Länge der Abstandsgruppe ist hierin aus strukturellen Erfordernissen der zu entfernenden Substanz(en) vordefiniert.
  • Der Ausdruck "Abstandsmolekül" soll bifunktionelle Moleküle in dem Ligand bedeuten mit der Funktion, einen strukturellen Abstand, falls erwünscht, zwischen der Bindungseinheit und dem trifunktionellen Verzweigungsmolekül, das nachstehend unter den allgemeinen Formeln I und II definiert ist, und/oder zwischen der Abstandsgruppe und dem trifunktionellen Verzweigungsmolekül herzustellen. Das Abstandsmolekül kann auch cyclisch sein.
  • Der Ausdruck "Pyrogen" und insbesondere "bakterielles Pyrogen" definiert eine Fieber hervorrufende Substanz, gewöhnlich bakteriellen Ursprungs, z. B. ein Endotoxin.
  • Der Ausdruck "Bioverträglichkeit" soll hier das Fehlen einer aktivierenden Fähigkeit bedeuten, z. B. eine Aktivierung von Zellen, eine Koagulation, Komplementkaskaden oder ähnliche Vorgänge, in dem Sinn, dass die Verwendung der Matrix nicht zu einer Aktivierung des Immunsystems des Patienten führt oder wenigstens, falls eine solche Aktivierung eintritt, sie nur von untergeordnetem Grad ist. Dies bedeutet, dass die Verwendung einer bioverträglichen Verbindung oder Substanz weder zu einer unerwünschten Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in z. B. Blut oder anderen Körperfluiden noch zu mechanischem oder stressinduziertem Zelltod oder Zelllyse führt.
  • Die Polymeraffinitätsmatrix
  • Um eine Vielseitigkeit in einer Polymeraffinitätsmatrix zu schaffen, die hoch genug ist, dass eine große Vielzahl von Substanzen gebunden und adsorbiert werden kann, kann der Ligand 1 bis 100 funktionelle Gruppen, bevorzugt 1 bis 32 funktionelle Gruppen enthalten; der Ligand in der Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung hat aber die in dem Patentanspruch 1 definierte Struktur.
  • Die Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Form einer Perle, einer gelartigen Struktur, einer Membran oder als Teil einer Membran, eines Filmes oder eines Netzes oder einer Kombination davon vorliegen.
  • Wenn die Matrix gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist, ergibt sie spezifisch einen definierten Ausschluss von etwa 1 × 102 bis 1 × 106 Dalton und kann sowohl hydrophobe als auch hydrophile Substanzen ohne jede Beschränkung binden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Polymeraffinitätsmatrix in Form einer PS-PEG-Perle (z. B. TentaGel®, erhältlich von Rapp Polymere Tübingen) unter Verwendung von PEG als Abstandsgruppe vor. Als Abstandsgruppe verwendetes PEG hat den Vorteil einer guten Quellung der Perlen in sowohl organischen als auch wässrigen Lösemitteln und er laubt aufgrund seiner quasi-fluiden Eigenschaften ähnliche Diffusionsvorgänge wie in einem Fluid, bevorzugt ein Diffusionskoeffizient nahe zu Wasser, d. h. 40%.
  • Die Bioverträglichkeit
  • Gemäß der Erfindung sollte die Polymeraffinitätsmatrix in einer bevorzugten Form eine hohe Bioverträglichkeit zeigen, wenn sie in einer speziellen Anwendung, wie extrakorporale Behandlung von Gesamtblut, verwendet wird. Eine hohe Bioverträglichkeit impliziert, dass bestimmte Charakteristiken wichtiger sein sollen als andere. So ist z. B. keine Komplementaktivierung, gemessen durch frühe Komplexbildung und Quantifizierung von terminalem Komplementkomplex (TCC-Protein) gemäß Deppisch et al. (Kidney Int. 37: 696–706) wichtig. Ebenfalls ist eine niedrige Thrombogenizität für den Patient erwünscht. Der Grad der Thrombogenizität wird durch Quantifizierung von Thrombin-Antithrombin III-Komplex (TAT) gemäß Deppisch et al. (Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3: 17–23, 1994) gemessen und sollte während der Blut- oder Plasmabehandlung nicht ansteigen. Weiter ist sowohl eine konstante Blutzellenanzahl von weißen und roten Blutzellen vor und nach der Behandlung umfasst als auch die Abwesenheit von Zellaktivierung aufgrund von Kontaktphasenaktivierung. Eine konstante Blutzellenzählung soll einen niedrigen Grad oder virtuell keine Schädigung von Blutzellen aufgrund von bloßem Stress, Aktivierung oder mechanischer Schädigung bedeuten.
  • Proteasen, wie Elastase, die z. B. durch Granulozyten oder Neutrophile bei der Aktivierung gebildet werden, steigen in Patienten mit bakterieller Sepsis und septischem Schock an (Heiden et al., Sem. Thromb. Hemost. 1996). Neutrophile Elastase wird auch als ein früher und wirksamer Marker einer Infektion vorgeschlagen (Jensen et al., Scand. J Clin. Lab. Invest, 1996; Groenenveld et al, Cytokine, 1995). Messungen von Elastase können zusätzliche Information über die Bioverträglichkeit geben, und die Werte sollten sich während der Blutbehandlung nicht ändern.
  • Der Ligand
  • Um fähig zu sein, einen Ligand komplementär zu dem bindenden Prinzip der zu entfernenden Substanz, wie ein Endotoxin, zu schaffen, muss eine dreidimensionale Struktur gebildet werden. Dies kann durch die Verwendung von z. B. einer flexiblen oder starren Polypeptidstruktur erreicht werden, die leicht in einer optimalen Weise für die erforderliche dreidimensionale Struktur zu synthetisieren ist. Ein solches Polymer kann linear oder verzweigt, z. B. in einer baum- oder kammartigen Struktur, oder cyclisch sein. Vorteilhaft für die Bildung solcher dreidimensionaler Strukturen ist die Verwendung von Aminosäuren, da sie natürlicherweise Flexibilität ergeben. Die Chemie zum Kuppeln eines solchen Polymers, z. B. ein Polypeptid, ist in der Technik bekannt. Ein solches Polymer bezieht sich auf ein Polymer, das mehr als eine Aminosäure, gewöhnlich bis zu etwa 100, enthält, d. h. ein Oligomer, das durch Peptidbindungen gebunden ist. Beispiele von linearen Polymeren sind Poly- oder Oligopeptide, die durch Amidbindungen zwischen den α-Carboxyl- und α-Aminogruppen von benachbarten Resten gebildet sind, und Beispiele von verzweigten Polymeren sind Poly- oder Oligopeptide, die durch Amidbindungen gebildet sind, die eine oder mehrere Nicht-α-aminogruppen enthalten.
  • Wie vorstehend genannt, kann das Ligandmolekül cyclisch sein. Die cyclische Struktur kann durch ein kovalentes Kuppeln zwischen zwei geeigneten funktionellen Gruppen in der Ligandstruktur, z. B. eine Disulfidbindung (-S-S-) zwischen zwei SH-Gruppen von Cystein durch Oxidation (eine gewöhnliche Cyclisierungsreaktion, die auch in natürlichen Proteinstrukturen abläuft) gebildet werden.
  • Die 2A und 2B zeigen Beispiele von verschiedenen verzweigten, baumartigen und kammartigen Strukturen des Liganden, der an eine Abstandsgruppe gekuppelt ist, die an einen festen Träger gebunden ist, aber die vorliegende Erfindung bezieht sich nur auf die baumartigen Strukturen in 2A. In diesen Strukturen sind die Liganden grundsätzlich aus Lysinresten aufgebaut, und die Bindungseinheiten in jedem Ligand sind Argininreste. Der in der Polymeraffinitätsmatrix enthaltene Ligand kann durch die zwei folgenden Formeln wiedergegeben werden:
    Allgemeine Formel I: -X1 n-Ym[X2 i-Z1; X3 j-Z2]½(m+1)
  • In der allgemeinen Formel I, die eine baumartige Struktur wiedergibt, haben die verschiedenen Symbole die folgenden Bedeutungen:
    n = 0 oder 1;
    m = 2k-1;
    k = 0 bis 10, worin, wenn k = 0 ist, X2 = X3 und Z1 = Z2 ist;
    i = 0 oder 1; und
    j = 0 oder 1.
    Allgemeine Formel II: - (x1 n-Y1[Y2 m[X2 i-Z1; X3 j-Z2]½(m+1))r-X4 p-Z3
  • In der allgemeinen Formel II, die eine kammartige Struktur wiedergibt, haben die verschiedenen Symbole die folgenden Bedeutungen:
    n = 0 oder 1;
    m = 2k-1;
    k = 0 bis 10, worin, wenn k = 0 ist, X2 = X3 und Z1 = Z2 ist;
    r = 1 bis 100;
    i = 0 oder 1;
    j = 0 oder 1; und
    p = 0 oder 1.
    Z1, Z2 und Z3 bedeuten jeweils die Bindungseinheit, und jede ist ein organisches Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid, einer Fettsäure, einem Kohlenhydrat, einem Lektin und einem Nucleotid und Derivate davon oder Kombinationen davon, worin Y, Y1 und Y2 jeweils ein trifunktionelles Verzweigungsmolekül sind, das funktionelle Gruppen enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus jAmino, Hydroxy, Aldehyd, Isocyanat, Isothiocyanat, Thiol, Maleimido, Epoxy und Derivaten davon oder Kombinationen davon, und worin X1, X2 und X3 jeweils ein optionales bifunktionelles Abstandsmolekül sind, das zwei funktionelle Gruppen enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino, Carboxy, Hydroxy, Aldehyd, Isocyanat, Isothiocyanat, Thiol, Maleimido, Epoxy und Derivaten davon oder Kombinationen davon.
  • In der 2C sind Beispiele von Polymeraffinitätsmatrizes mit einer cyclischen Ligandstruktur gezeigt. In den Strukturformeln bedeutet R -Lysm[Arg)(m+1), worin m = 2k-1 ist, und Beispiele, worin k = 0, 1 und 2 ist, gezeigt sind.
  • Somit enthält wenigstens eine Bindungseinheit des Liganden in der Polymeraffinitätsmatrix wenigstens eine funktionelle Gruppe, bevorzugt eine Aminogruppe oder eine Guanidin gruppe oder eine substituierte Aminogruppe oder wenigstens eine dieser funktionellen Gruppen.
  • Bevorzugt werden die Aminosäuren bezüglich ihrer Charakteristik, positiv oder um den physiologischen pH herum geladen zu werden, speziell von Blut ≥ 7,2, d. h. auf einen pK von etwa ≥ 6,0, ausgewählt. Beispiele solcher bevorzugter Aminosäuren sind Arginin (Arg), Lysin (Lys) und Histidin (His). In dem Ligand der Matrix können auch Mischungen dieser Aminosäuren verwendet werden, um eine noch weitere Variabilität zu schaffen.
  • Am bevorzugtesten umfasst der Ligand Arginin als Bindungseinheit(en) und stellt ≤ 3 mmol/g Matrix dar. Im Allgemeinen kann die Menge von Aminosäuren wenigstens etwa 0,01 bis 5 mmol/g Matrix betragen.
  • In der Ausführungsform, wenn die Bindungseinheit eines verzweigten Liganden die Aminosäure Arginin enthält, beträgt die Anzahl von Argininmolekülen pro Ligand 2 bis 100 Argininmoleküle und bevorzugt 4 bis 8 Moleküle, bekannt als Arg4-8. Unter Verwendung einer trifunktionellen Aminosäure, d. h. die drei funktionelle Gruppen enthält, hier zwei Aminogruppen und eine Carboxygruppe, wie Lysin, kann auch eine verzweigte Struktur geschaffen werden. Dieses Herangehen der Verwendung sog. mehrfach antigener Peptide, MAP, ist von Tam et al. eingeführt worden und ist in der US-Patentschrift Nr. 5,229,490 beschrieben. Durch Variation der Anzahl von Verzweigungen können die Clusterbildung und die Abstände der Endgruppen, z. B. positiv geladenes Arginin, das terminale positive funktionelle Gruppen enthält, variiert werden, wie vorstehend in Verbindung mit 2 diskutiert.
  • In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, wo Endotoxine die durch die Polymeraffinitätsmatrix zu entfernenden Substanzen sind, werden die positiven Ladungen der funktionellen Gruppen der Aminosäuren auf einem Abstand gehalten, der durch den Abstand zwischen zwei einzelnen negativ geladenen Phosphatgruppen in einem Endotoxin definiert ist, wie in 3 gezeigt.
  • Wie vorstehend diskutiert, schaffen die Menge und die Konfiguration der Aminosäuren die Variabilität des komplementären Liganden in der Polymeraffinitätsmatrix und können daher variieren, um eine ausreichende Variabilität zum Absorbieren einer großen Vielzahl von Substanzen zu schaffen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung beträgt die Menge der Aminosäure wenigstens etwa 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4 oder 5 mmol/g Matrix.
  • Konstruktion des Liganden, der die Bindungseinheit(en) enthält
  • Um eine komplementäre Struktur zu einer Substanz zu erreichen, wird Information aus in der Technik bekannten Vorgängen gesammelt zum Studieren der Beziehungen betreffend sowohl die Struktur, das Vorliegen von positiven Ladungen, die in einem bestimmten Abstand gehalten sind, als auch das Vorliegen eines hydrophoben Bereichs in der Nachbarschaft zu den geladenen Gruppen, z. B. Röntgenstrahl-Kristallografie, Proteinsequenzierung, Proteinmodellierung oder Hydrophobie- und Hydrophilieberechnungen, wie in Beispiel 1 beschrieben und in den 3 und 11 gezeigt.
  • In der bevorzugten Ausführungsform ist die zu entfernende Substanz ein Endotoxin, wie LPS enthaltendes Lipid A, und dem Fachmann bekannte Information über das Molekül betreffend z. B. die Struktur und die Abstände zwischen geladenen Phosphatgruppen in dem Molekül wird verwendet, um einen Ligand mit wenigstens einer Bindungseinheit in der Polymeraffinitätsmatrix zu bilden. Das Polymer, welches den Ligand bildet, wird in dieser Ausführungsform aus Aminosäuren, z. B. Arginin und/oder Lysin, synthetisiert.
  • In der Ausführungsform Arg4-8 der Erfindung als komplementärer Teil zu dem Bindungsprinzip der zu entfernenden Substanz, z. B. ein Endotoxin, besitzt dieses Arginin als Bindungseinheiten die folgenden Eigenschaften für die Entfernung der Endotoxine, wie in 3 gezeigt:
    • a) Vorliegen positiver Ladungen, die in einem Abstand gehalten werden, der optimal auf den Abstand der negativ geladenen Phosphatgruppe in dem Lipid A passt,
    • b) Vorliegen eines hydrophoben Bereiches in der Nachbarschaft zu den geladenen Gruppen, was hydrophobe Wechselwirkungen mit den Fettsäurekomponenten des Lipids A erlaubt, und
    • c) eine Kombination dieser Eigenschaften in a) und b), um eine komplementäre Struktur zu dem Lipid A zu ergeben, die eine optimale Bindung erlaubt.
  • Die Abstandsgruppe
  • Die Polymeraffinitätsmatrix gemäß der Erfindung umfasst eine Abstandsgruppe, die im Wesentlichen hydrophob oder hydrophil ist und den festen Träger in dem Sinn modifiziert, dass sie ein Teil des festen Trägers wird, und die Funktion eines Ankerteils für den Ligand hat, der die wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthält.
  • Bevorzugt wird Polyethylenglycol (PEG) als Abstandsmolekül in einer linearen oder verzweigten Konfiguration bei dem bevorzugten mittleren Molekulargewicht von 400 bis 10000 Dalton verwendet und wird durch die Formel H-(OCH2CH2)n-OH wiedergegeben, worin n etwa 2 bis 250 beträgt. Die Flexibilität von PEG-Ketten erlaubt einen guten Zugang von Toxinmolekülen in der dreidimensionalen Struktur des Ligandpolymers.
  • Darüber hinaus kann in einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der feste Träger mit zwei oder mehr Abstandsgruppen der gleichen oder verschiedenen Art vorgesehen sein, z. B. Polyethylenglycole, Polypropylenoxide, Polyvinylalkohole, Polyvinylamine, Polyglycidole oder Polyethylenimine und Derivate davon.
  • Der feste Träger
  • Der feste Träger sollte eine Variabilität in den Porositäts- und Größenausschlusscharakteristiken ergeben. Er sollte auch einen Träger für die Festphasesynthese für die Polypeptidsynthese in der bevorzugten Ausführungsform ergeben. Verschiedene feste Träger, d. h. Polymere, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in EP 0 187 391 , WO 99/17120 und in der US-Patentschrift Nr. 4,908,405 beschrieben. Hier ist der feste Träger ein lineares und/oder verzweigtes bioverträgliches Pfropfcopolymer mit einem Vernetzungsgrad von 0,05 bis 10% und ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkoholen, Polyhydroxystyrolen, aus chlormethylierten Polystyrolen und Ethylenglycolen hergestellten Polymeren, Poly- oder Oligoethylenglycolen der Formel H-(OCH2CH2)n-OH, worin n 2 bis 250 bedeutet, Polyacrylaten oder mit Hydroxygruppen funktionalisierten Polymethacrylaten und Derivaten davon. In der vorliegenden Erfindung kann der vorstehend genannte Vernetzungsgrad bis zu 50% betragen.
  • Das feste Trägermaterial ist ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus – neben den vorstehend genannten Verbindungen – Polystyrol, Hydroxyalkylpolystyrolen, Hydroxyarylpolystyrolen, Hydroxyalkylarylpolystyrolen, polyhydroxyalkylierten Polystyrolen, polyhydroxyarylierten Polystyrolen, Isocyanatoalkylpolystyrolen, Isocyanatoarylpolystyrolen, Carboxyalkylpolystyrolen, Carboxyarylpolystyrolen, Aminoalkylpolystyrolen, Aminoarylpolystyrolen, vernetzten Polyethylenglycolen, Polyacrylaten, Polymethacrylaten, Cellulose, Siliciumdioxid, Kohlenhydraten, Latex, Cycloolefincopolymeren, Glas, anderen geeigneten Polymeren oder Kombinationen davon. Die Form des festen Trägers kann eine Perle, eine Membran, ein Teilchen, z. B. ein Nanoteilchen, ein Netz, ein Gewebe oder ein Faservlies, eine Fasermatte, ein Rohr, ein Film, eine Folie oder Kombinationen davon oder vernetzte interpenetrierende Netzwerke sein. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die vorstehend beschriebene Affinitätsmatrix aus vernetztem Polystyrol, auf welches PEG als Abstandsgruppe gepfropft ist.
  • Ein bevorzugtes festes Trägermaterial in der vorliegenden Erfindung ist eine Perle mit einer Größe, die ausreichend ist, um einen hoch perfundierbaren und bioverträglichen Träger zu ergeben, z. B. Polystyrol, bevorzugt in Kombination mit PEG als Abstandsgruppe, an welche Lysin und/oder Arginin gebunden ist, der keine Beschränkungen für hydrophile oder hydrophobe Substanzen haben sollte. Eine Liste von geeigneten im Handel erhältlichen Perlen ist in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    im Handel erhältliche aktivierte Perlena
    Toyo Pear HW70EC® (TosoHaas)
    Toyo Pear HW65EC® (TosoHaas)
    Toyo Pear AF650M® (TosoHaas)
    TentaGel® (Rapp Polymer)
    Eupergit C250L® (Röhm)
    Eupergit 250® (Röhm)
    Fractogel EMD Epoxy® (M) (Merck)
    Fractogel EMD Azlactone® (S) (Merck)
    Poros EP® (Perkin Elmer-Biosystems)
    • a Die vorstehenden im Handel erhältlichen aktivierten Perlen können für die Immobilisierung eines Liganden konditioniert werden.
  • Perfundierbarkeit der Polymeraffinitätsmatrix
  • Wenn die Polymeraffinitätsmatrix hydratisiert wird, wird eine hydrogelartige Struktur gebildet und diese quillt aufgrund der Hydratation. Die Quellbarkeit ist definiert als das Quellen auf grund der Hydratation des Polymers aus dem trockenen Zustand unter Bildung der hydratisierten und gelartigen Matrix. Ein solches Quellen kann als Gewichtsanstieg pro Volumeneinheit bei der Hydratation definiert werden und kann gemäß der Erfindung einen Faktor von etwa dem 1,5- bis 10-fachen, bevorzugt dem 3- bis 5-fachen, betragen, wenn trockene und hydratisierte Formen der Polymeraffinitätsmatrix verglichen werden. Diese Quellbarkeit erlaubt, dass Gesamtblut vollständig durch die Matrix durchströmt, wobei die Blutzellen und die Anzahl intakt bleiben.
  • Wie vorstehend genannt, bildet in der bevorzugten Ausführungsform die Polymeraffinitätsmatrix als solche eine Matrix mit einem definierten Ausschluss von etwa 1 × 102 bis 1 × 106 Dalton, was es erlaubt, dass Blutzellen durchströmen und fast keine Diffusionsbeschränkung für hydrophile und/oder hydrophobe Substanzen auftritt.
  • Verfahren zum Entfernen einer Substanz
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Verringern ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, umfassend das Kontaktieren des Fluids mit der Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die Menge oder Konzentration der Substanz(en) zu verringern und/oder zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung dieses Verfahrens verhindert die Entfernung einer Substanz, z. B. ein Endotoxin aus Blut oder irgendeinem anderen Körperfluid, dadurch direkt oder indirekt die Aktivierung von z. B. Blutzellen durch Binden der unerwünschten Substanzen, die unter der Definition von "Substanz(en)" vorstehend aufgeführt sind. Bevorzugt kann dies durch Kontaktieren des Fluids mit der vorstehend definierten Polymeraffinitätsmatrix für eine Zeit von bis zu 24 Stunden, am bevorzugtesten von 1 Sekunde bis 2 Stunden, erreicht werden, was eine geringer aktivierte oder verhinderte Aktivierung von Blut und seinen Komponenten ergibt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gemäß dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren zu entfernende Substanz ein Endotoxin. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Entfernung eines definierten Blutzelltyps oder einer Population, ausgewählt aus Leukozyten, z. B. T- und B-Zellen, Monozyten, Thrombozyten, Granulozyten und/oder Neutrophilen. Durch die vorstehend beschriebene Polymermatrix sollen auch Komponenten in einem extra- oder intrazellulären Signaltransduktionsweg entfernt werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose und ihren Abbauprodukten, Carbonylverbindungen, inflammatorischen und proinflammatorischen Proteinen und/oder Proteinen, die bei der Thrombogenese oder in der Komplementkaskade beteiligt sind, von Bakterien abgeleiteten Bestandteilen, Endotoxinen, Zellen, Blutzellen, Bakterien und Viren oder pathogenbeladenen Blutzellen oder wenigstens Teilen oder Abbauprodukten davon, DNA oder Fragmenten davon, oder Phosphat, durch Bereitstellen eines Liganden, der wenigstens eine Bindungseinheit enthält, und eine Struktur hat, die komplementär zu der Struktur eines bindenden Prinzips der Substanz ist.
  • In dieser bevorzugten Ausführungsform wird ein Endotoxin, z. B. LPS, auf < 50% während zwei Stunden während z. B. einer statischen Inkubation oder während einer Durchströmung einer Festphasesäule entfernt.
  • In dieser bevorzugten Ausführungsform wird das Endotoxin während einer definierten Zeitdauer von etwa 1 Sekunde bis etwa und einschließlich 2 Stunden auf eine Menge oder Konzentration entfernt, die das Blut inaktiviert oder die Aktivierung des Blutes verhindert, wie gemäß einem LAL-Assay gemessen, der nachstehend beschrieben wird. Die Verwendung des LAL-Assays ist in der Technik bekannt und ergibt eine Information über die Endotoxinwerte. Das Verfahren gemäß der Erfindung, das schnell und wirksam ist, ergibt Werte des Endotoxins gemäß dem LAL-Assay innerhalb der vorstehend genannten Zeitdauer von 1 Sekunde bis 2 Stunden unterhalb der Fähigkeit zum Aktivieren von Blut oder mit lediglich Aktivieren von Blutzellen und Komponenten in geringem Grad.
  • Verfahren zum Herstellen einer Polymeraffinitätsmatrix
  • Das Verfahren zum Herstellen einer Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:
    • a) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und
    • b) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex; oder
    • c) Binden der Abstandsgruppe an den wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Ligand zum Erhalt eines zweiten Kom plexes und
    • d) Binden des festen Trägers an den zweiten Komplex; oder
    • e) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und
    • f) Festphasesynthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe; oder
    • g) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und
    • h) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex; oder
    • i) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und
    • k) Festphasesynthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe;
    worin Information über die dreidimensionale Struktur, die Anwesenheit von Ladungen und von hydrophoben/hydrophilen Bereichen des Bindungsprinzips auf der bzw. den zu bindenden Substanz(en) aus Röntgenstrahl-Kristallografie, Proteinmodellierung oder Hydrophobieund Hydrophilieberechnungen gesammelt wird, und der die Bindungseinheit enthaltende Ligand bezüglich der Ladung und/oder der Hydrophilie/Hydrophobie zu dem Bindungsprinzip der Substanz(en) komplementär gemacht wird.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren umfasst auch in einer Ausführungsform die Herstellung einer Matrix mit einem Abstandsmolekül, das einen auf einem festen Träger immobilisierten Ligand umfasst gemäß einem der folgenden Wege, wie im Einzelnen in 4 gezeigt;
    für a) und b) vorstehend: Aktivierung des festen Trägers, Kuppeln des Abstandsmoleküls an den festen Träger, Synthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden und stellungsspezifisches Kuppeln des Liganden an das Abstandsmolekül oder
    für c) und d) vorstehend: Synthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden, Kuppeln des Abstandsmoleküls an den Liganden, Aktivierung des festen Trägers und stellungsspezifisches Kuppeln des Abstandsgruppe-Liganden-Komplexes an den aktivierten festen Träger oder
    für e) und f) vorstehend: Aktivierung des festen Trägers, Kuppeln des Abstandsmoleküls an den aktivierten festen Träger und Festphasesynthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden auf diesem Träger.
  • Das die Schritte a) bis f) enthaltende vorstehend beschriebene Verfahren umfasst auch in einer zweiten Ausführungsform die spezifischen Schritte für a) und b), Aktivierung der Abstandsgruppe, Kuppeln der aktivierten Abstandsgruppe an den festen Träger und Kuppeln des Liganden an die aktivierte Abstandsgruppe oder für c) und d): Synthese des Liganden, Aktivierung der Abstandsgruppe, stellungsspezifisches Kuppeln des Liganden an das aktivierte Abstandsmolekül und Kuppeln des Abstandsgruppe-Liganden-Komplexes an den festen Träger oder für e) und f): Aktivierung der Abstandsgruppe, Kuppeln der aktivierten Abstandsgruppe an den festen Träger und feste Synthese des Liganden an die an den festen Träger gebundene Abstandsgruppe.
  • Wie vorstehend genannt, ist durch die vorliegende Erfindung das vorstehende Verfahren bevorzugt, worin der feste Träger, die Abstandsgruppe und der Ligand immobilisiert werden durch Aktivierung eines festen Trägers, Kuppeln des Abstandsmoleküls und Festphasesynthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden direkt auf dem festen Träger.
  • Verwendung der Polymeraffinitätsmatrix
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung, bevorzugt zur Verwendung zur Entfernung einer oder mehrerer Substanzen, bevorzugt Endotoxine aus einem Fluid, oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid, bevorzugt ein Körperfluid oder ein therapeutisches Fluid, am bevorzugtesten Blut, insbesondere zur Herstellung von gering aktiviertem Blut oder zur Verhinderung von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in Blut. Die Polymeraffinitätsmatrix wird bevorzugt verwendet als Teil in einem extrakorporalen Blutreinigungsverfahren oder in Kontakt mit Blut oder einem Blutstrom, z. B. als Implantat im Körper, um Blut oder irgendein Körperfluid zu kontaktieren, z. B. das vaskuläre System, Blutgefäße oder in der Peritonealhöhle.
  • Die Polymeraffinitätsmatrix enthaltender Kit
  • In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten in dem Fluid, wobei der Kit eine Polymeraffinitätsmatrix gemäß der vorliegenden Erfindung, Proberöhren und eine Vorrichtung für extra- und/oder intrakorporale Behandlung des Fluids, bevorzugt Blut oder Serum, umfasst.
  • Schlussfolgerung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Entfernung von Substanzen aus einem Fluid in hoch wirksamer und zeitsparender Weise bereit. Dies wird erreicht durch die Verwendung einer Polymeraffinitätsmatrix gemäß der Erfindung, die hoch bioverträglich ist und es erlaubt, dass Gesamtblut aufgrund der guten Quellungsfähigkeit durchfließt. Die wirksamen Mittel beruhen auch auf der Bildung eines Liganden, der eine Bindungseinheit umfasst, die komplementär zu dem bindenden Prinzip der zu entfernenden Substanz ist. Daher kann die vorliegende Erfindung z. B. in der extrakorporalen Blutbehandlung, wie Dialyse und Transfusionsmedizin für therapeutische Anwendungen, Stammzelltherapie und/oder therapeutischen Zelltherapie, diagnostischen Anwendungen und auch in der Biotechnologie, im Bioengineering, in der Gentechnologie, in der Nahrungsmittelchemie und in der Wasseraufbereitung und/oder -reinigung angewandt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Polymermatrix zur Herstellung einer Polymeraffinitätsmatrix zur Entfernung einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid, worin die spezifische Affinität von einem Ligand abhängig ist, der auf die Polymermatrix aufgebracht ist, worin die Polymermatrix einen festen Träger und eine Abstandsgruppe umfasst, worin der feste Träger aus einem Material hergestellt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polyvinylalkoholen, Polyhydroxystyrolen, aus chlormethylierten Polystyrolen hergestellten Polymeren oder Polyacrylaten, mit Hydroxygruppen funktionalisierten Polymethacrylaten, Hydroxyalkylpolystyrolen, Hydroxyarylpolystyrolen, Hydroxyalkylarylpolystyrolen, polyhydroxyalkylierten Polystyrolen, polyhydroxyarylierten Polystyrolen, Isocyanatoalkylpolystyrolen, Isocyanatoarylpolystyrolen, Carboxyalkylpolystyrolen, Carboxyarylpolystyrolen, Ami noalkylpolystyrolen, Aminoarylpolystyrolen, Polymethacrylaten, vernetzten Polyethylenglycolen, Cellulose, Siliciumdioxid, Kohlenhydraten, Latex, Cycloolefincopolymeren, Glas oder Kombinationen davon, bevorzugt einem vernetzten Polystyrol, und worin die Abstandsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly- oder Oligoethylenglycolen der Formel H-(OCH2CH2)n-OH, worin n 2 bis 250 bedeutet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der feste Träger die Form einer Perle, eines Gels, einer Membran, eines Teilchens, eines Netzes, eines Gewebes oder eines Faservlieses, einer Fasermatte, eines Rohrs, eines Films, einer Folie oder Kombinationen davon oder vernetzten interpenetrierenden Netzwerken.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Abstandsgruppe ein Polyethylenglycol (PEG) in einer linearen und/oder verzweigten Konfiguration und hat ein mittleres Molekulargewicht von 400 bis 10000 Dalton oder Derivate davon.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Polymermatrix ein Quellungsvermögen, das hoch genug ist, um das Durchströmen von Plasma oder Gesamtblut zu erlauben.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt das Quellungsvermögen der Polymermatrix das etwa 1,5- bis 20-fache, bevorzugt das 2- bis 6-fache, vom trockenen Zustand zu der hydratisierten Form.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Polymermatrix die Form von Perlen vom Geltyp.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Fluid eine wässrige oder organische Lösung, ein Körperfluid, bevorzugt Blut, therapeutische Fluide, Fluide für Life Science-Anwendungen, bevorzugt Pufferlösungen, Infusionsfluide oder Dialysefluide in biologischen, diagnostischen oder biotechnologischen Anwendungen, von gesunden Spendern erhaltene Blutprodukte, wie Plasma, Plättchenkonzentrate, Erythrozytenkonzentrate, bevorzugt Sauerstoffträger, modifizierte Hämoglobinlösungen und künstliche Hämoglobulinlösungen, Fluide für die Ernährung oder Fluide für die industrielle Verwendung.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat die Polymeraffinitätsmatrix einen Ausschlusswert von etwa 1 × 102 bis etwa 1 × 106 Dalton und bindet hydrophobe und/oder hydrophile Substanzen.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der feste Träger ein vernetztes Polystyrol, und die Abstandsgruppe ist ein Polyethylenglycol.
  • Die rationale Entwicklung einer spezifischen Bindungsstruktur, die auf extrakorporale Blutbehandlung anwendbar ist, erfordert: (i) eine flexible Technologie zum Aufbau von Liganden und (ii) grundlegende Erfordernisse der Bioverträglichkeit, Toxikologie und Verarbeitbarkeit. Die Festphase-Peptidsynthese wird angewandt, um gut definierte Ligandenstrukturen, angeordnet auf bioverträglichen Polymersubstanzen, zu erhalten, die gemäß einer der bevorzugten Ausführungsformen gepfropfte Polystyrol-Polyethylenglycol-Copolymere spezifisch für biologische Substanzen sind.
  • Durch systematische Variation der geometrischen Struktur der Ligandenprinzipien konnten wir zeigen, dass ein Anstieg der Ligandenaffinität um einen Faktor 10 bis 100, bezogen auf die molare Konzentration der Aufbaublöcke, erhalten wird. Diese Untersuchungen wurden an menschlichem Serum, d. h. in Gegenwart von kompetitiven Proteinen, durchgeführt.
  • Die Bewertung der Blutverträglichkeit wurde in vitro-Assays in menschlichem Plasma und/oder Gesamtblut durchgeführt. Das PS-PEG-Grundmaterial mit oder ohne den Ligand ist bezüglich der Komplementaktivierung, der Kontaktphasenaktivierung, der Cytotoxizität und der Granulozytenaktivierung bioverträglich.
  • Die Grundpolymerstruktur zeigt ein vorteilhaftes Bioverträglichkeitsprofil insbesondere für die extrakorporale Anwendung. Die angewandte Technologie für die Ligandensynthese erlaubt die Verarbeitung von spezifischen Polymermaterialien ohne die Bildung von toxischen Resten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des eine Bindungseinheit für LPS enthaltenden Liganden Dieses Beispiel beschreibt, ohne die Erfindung zu beschränken, die Konstruktion eines Liganden, der eine Bindungseinheit für die Entfernung von LPS enthält.
  • Prinzip
  • Eine wirksame Entfernung von Toxinen, z. B. LPS, erfordert einen Ligand mit einer Bindungseinheit, die komplementär ist zu dem Bindungsprinzip der zu entfernenden Substanz. Dies umfasst einen dreidimensionalen Aspekt der zu entfernenden Substanz und eine genaue Anordnung von Molekülen, um eine biospezifische Erkennung mit Charakteristiken, wie komplementäre Ladungen, Hydrophobie und Hydrophilie, zu optimieren. Zusammen mit geeigneten Abständen der vorstehend genannten Charakteristiken vervollständigt dies den Ligand mit seiner Bindungseinheit. Die gesamte dreidimensionale Wiedergabe eines solchen Liganden in einer Polymermatrix sollte auch optimal im Raum für eine hohe Durchströmung, Ligandenwiedergabe und Flexibilität des Liganden sein. Eine hohe Bioverträglichkeit ist auch eine Vorbedingung für eine in oder ex vivo-Blutreinigung in Patienten. In der beschriebenen Matrix ist die Zugänglichkeit vergleichbar mit oder sogar identisch mit einer wässrigen Nicht-Festphaselösung. Die Struktur von LPS ist in 1 gezeigt. Die vorgeschlagene komplementäre Bindung zu LPS ist in den 3A bis 3D gezeigt, worin die Phosphatgruppen und der hydrophobe Schwanz von LPS für die Bildung eines komplementären Bindungsprinzips in Betracht gezogen sind. Die vorgeschlagene Struktur ist sowohl für Arg4 und Arg8 in 2 als auch in einem dreidimensionalen Format in 11 gezeigt. Arg8 zeigt die Hälfte der Argininstellungen auf der linken Seite der Figur und die Hälfte der Argininstellungen auf der rechten Seite von 11B. Ebenfalls ist die Verbindung zu der Abstandsgruppe, hier zu PEG, gezeigt.
  • Molekulare Simulation
  • Molekulare Simulationen wurden weiter angewandt, um die dreidimensionale geometrische und chemische Struktur der beschriebenen Bindungsstelle zu identifizieren und zu verifizieren. Die Simulationen wurden auf einer Silicon Graphics Octane2 Workstation unter Ver wendung der Insight II-Package (Molecular Simulations Inc. (MSI), San Diego, CA) und der darin enthaltenen Optimierungsalgorithmen, z. B. AMBER-forcefields, durchgeführt. Die Ergebnisse der dreidimensionalen Anordnungen für Arg4 und Arg8 sind in den 11A und 11B gezeigt. Hier zeigt die Erläuterung das Prinzip des dreidimensionalen terminalen Teils der Matrix, ohne die PEG-Abstandsgruppe oder den festen Träger.
  • Synthese des Liganden
  • Der Ligand mit seiner Bindungseinheit wird gemäß 4 synthetisiert, worin drei verschiedene Wege erläutert sind. Ein bevorzugtes Verfahren unter den drei Wegen ist die Festphasesynthese direkt auf der PEG-Abstandsgruppe, die an den festen Träger gebunden ist. Die Bindungseinheit wird hierin in weiteren Beispielen verwendet.
  • Beispiel 2
  • Vergleich von verzweigten und linearen Liganden
  • Dieses Beispiel beschreibt die Adsorption des Endotoxins LPS aus menschlichem Plasma. Das Beispiel zeigt auch einen Vergleich zwischen linearen und verzweigten Liganden für die Adsorption des Endotoxins.
  • Prinzip
  • Perlen werden mit heparinisiertem menschlichem Plasma für eine Zeitdauer von zwei Stunden inkubiert. Die Endotoxinwerte werden nach zweistündiger Inkubation unter Verwendung eines LAL-Assays bestimmt.
  • Material
  • Es werden die folgenden Perlen verwendet:
    PS-PEG-LBP 94-108 Endotoxinbindungssequenz von LBP, linear
    PS-PEG-BPI 85-99 Endotoxinbindungssequenz von BPI, linear
    PS-PEG-Arg8 8-fach verzweigt, Arginin enthaltend
    PS-PEG-NH-Ac acetyliertes Grundmaterial als Kontrolle
    keine Perlen Kontrolle
  • Verfahren
  • Die Inkubation von Perlen in heparinisiertem Plasma wird bei 37°C durchgeführt. Die Proben werden langsam bewegt, und Perlen werden nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden durch Zentrifugation entfernt.
  • Analyse
  • Ein LAL-Assay wird durchgeführt, um die Konzentrationen von Endotoxinen nach der Inkubation mit Perlen zu quantifizieren. Der Assay wird mit einer LAL-induzierten chromogenen Substanzreaktion (Chromogenics, Mölndal, Schweden). Die Konzentrationen werden aus einer Standardkurve berechnet, die mit definierten Konzentrationen von Endotoxin in heparinisiertem menschlichem Plasma erhalten wurden.
  • Ergebnisse
  • Unter Verwendung des LAL-Assays wurden die folgenden Endotoxinkonzentrationen nach zweistündiger Inkubationszeit festgestellt.
    Endotoxin (IU/ml)
    PS-PEG-LBP 94-108 10
    PS-PEG-BPI 85-99 9
    PS-PEG-Arg8 2
    PS-PEG-NH-Ac 10
    keine Perlen 8
    Ausgangswert 10
  • Diskussion
  • Dieses Experiment zeigt, dass die Endotoxinkonzentrationen durch Verwendung der verzweigten dreidimensionalen Matrix auf den PS-PEG-Perlen 5-fach erniedrigt werden konnten. Perlen mit einem linearen Liganden waren nicht so wirksam, und Endotoxinkonzentrationen in diesen Proben waren noch bei oder nahe den Ausgangskonzentrationen des Endotoxins.
  • Beispiel 3
  • Kinetik der Endotoxinbindunq
  • Dieses Beispiel zeigt die Kinetik der Endotoxinbindung, wenn Perlen mit einer dreidimensionalen Matrix, optimiert für die LPS-Bindung, mit Plasma inkubiert und bei verschiedenen Zeitpunkten analysiert werden.
  • Prinzip
  • Die Kinetik der Absorption ist abhängig von der Struktur und dem Vernetzungsgrad der Polymermatrix. Perlen werden mit heparinisiertem menschlichem Plasma inkubiert. Nach 1, 10 und 120 Minuten werden Proben entnommen. Die Endotoxinkonzentrationen werden unter Verwendung eines LAL-Assays bestimmt.
  • Material
  • Es werden die folgenden Perlen verwendet:
    PS-PEG-Arg8 8-fach verzweigt, Arginin enthaltend
    PS-PEG-Arg4 4-fach verzweigt, Arginin enthaltend
    PS-PEG-Arg linear, Arginin enthaltend
    PS-PEG-NH-Ac acetyliertes Grundmaterial (Ref)
  • Verfahren
  • Die Inkubation von Perlen in heparinisiertem Plasma wird bei 37°C durchgeführt. Die Proben werden langsam bewegt und Prüfproben werden nach einer Inkubationszeit von 1, 10 und 120 Minuten entnommen. Die Perlen werden durch Zentrifugation entfernt.
  • Analyse
  • Ein LAL-Assay wird für die Quantifizierung der Endotoxinkonzentrationen wie in Beispiel 2 durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • 5 zeigt die Ergebnisse der Endotoxinkonzentrationen, die zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen wurden. Die Figur zeigt, dass eine Zeitdauer von zwei Stunden für eine wirksame Entfernung benötigt wird, d. h. die 20 bis 30% zurückbleibendes Endotoxin von den Ausgangskonzentrationen in den Proben ergibt. Der Arginin enthaltende lineare Ligand (PS-PEG-Arg) entfernt nur die Hälfte der Endotoxine, d. h. eine Konzentration von 60% bleibt nach 120 Minuten zurück. Wo die Referenzperlen (PS-PEG-NH-Ac) zugesetzt wurden, blieb in ähnlicher Weise die Endotoxinmenge nach der Inkubation mit den Perlen unverändert, d. h. nach 120 Minuten bei den Ausgangswerten.
  • Beispiel 4
  • Einfluss der terminalen Aminosäure und der Verzweigung des Polymers
  • Dieses Experiment zeigt den Einfluss der terminalen Aminosäure und (Arginin gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber Lysin) und den Einfluss von Verzweigung und Nicht-Verzweigung gegenüber 4-facher und gegenüber 8-facher Verzweigung des Liganden.
  • Prinzip
  • Perlen werden mit heparinisiertem menschlichem Plasma mit oder ohne Endotoxin inkubiert.
  • Die Endotoxinkonzentrationen werden unter Verwendung eines LAL-Assays nach zwei Stunden bestimmt.
  • Material
  • Es werden die folgenden Perlen verwendet:
    PS-PEG-Arg8 8-fach verzweigt, Arginin enthaltend
    PS-PEG-Lys8 8-fach verzweigt, Lysin enthaltend
    PS-PEG-Arg4 4-fach verzweigt, Arginin enthaltend
    PS-PEG-Lys4 4-fach verzweigt, Lysin enthaltend
    PS-PEG-NH-Ac acetyliertes Grundmaterial
    PS-PEG-Arg linear, Arginin enthaltend
    keine Perlen Kontrolle
  • Analyse
  • Ein LAL-Assay wird wie in Beispiel 2 durchgeführt. Ergebnisse
    Endotoxin (IU/ml)
    PS-PEG-Arg8 0,4
    PS-PEG-Lys5 1,8
    PS-PEG-Arg4 0,01
    PS-PEG-Lys4 2,7
    PS-PEG-NH-Ac 7,8
    PS-PEG-Arg 3,5
    keine Perlen 11
    vor der Inkubation, d. h. Ausgangswerte 13
  • Diskussion
  • Die Ergebnisse zeigen, dass ein verzweigter Ligand wirksamer ist als lineare Formen, und dass Arginin mehrfach (4-fach und 200-fach für Arg8 und Arg4) wirksamer ist als Lysin bei der Entfernung von Endotoxinen. PS-PEG-Arg4 ist am wirksamsten bei der Entfernung von Endotoxinen nach zwei Stunden.
  • Beispiel 5
  • Verringerung von endotoxinabhängiger IL6-Induktion in CD14+-Monozyten
  • Dieses Beispiel beschreibt die Verringerung von endotoxinabhängiger IL6-Induktion in menschlichen Monozyten unter Verwendung von PS-PEG-ArgB.
  • Prinzip
  • Als Reaktion auf LPS beginnen Monozyten IL6 zu transskribieren und zu exprimieren. Die Konzentrationen von aufgeregeltem IL6 können bereits nach 4 Stunden durch intrazelluläre Fließzytometrieanalyse (FACS) gemessen werden.
  • Material
  • Es werden menschliche einkernige Zellen aus Gesamtblut verwendet. PS-PEG-Arg8 wird für die Entfernung von Endotoxin verwendet und PS-PEG-NH-Ac ist als Kontrolle enthalten. Lipopolysaccharid (E. coli-Stamm 055:B5 von Biowittaker Co.) wird in vitro für die Stimulation der MNC verwendet. Eine FACS-Analyse wird unter Verwendung eines FACSCAN Calibur (Beckton Dickinson®) durchgeführt.
  • Verfahren
  • Gesamtblut wird bei 37°C (5% CO2) 30 Minuten mit 10 oder 30 IU/ml LPS inkubiert. Die Proben werden sowohl parallel mit und ohne PS-PEG-Arg8-Perlen als auch mit Kontrollperlen PS-PEG-NH-Ac inkubiert. Die Zellen werden in PermFix (Reckton Dickinson®) fixiert, und eine Doppelfärbung wird mit Anti-CD14-FITC und Anti-IL6-PE durchgeführt. 20000 Zellen werden pro Zellprobe für die FACS-Analyse gezählt. Als CD14+-Zellen definierte Monozyten bilden normalerweise etwa 5% der gesamten Zellpopulation.
  • Analyse
  • Monozyten sind in der Zellsuspension als CD14+-Zellen definiert. Intrazelluläres IL6 (icIL6) wird gegenüber einem internen Standard kalibriert und in der CD14+-Zellpopulation unter Verwendung einer FACS-Analyse nach der Inkubation mit 10 oder 30 IU/ml LPS für 30 Minuten quantifiziert. Die Berechnungen werden unter Verwendung einer CellQuest Software Package (Reckton Dickinson®) durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Unter Verwendung der FACS-Daten und der daraus durchgeführten Berechnungen generiert eine Analyse der CD14+-Monozytenpopulation durch den Fachmann die folgenden Daten, die in 6 gezeigt sind. In der grafischen Darstellung ist eine 70%ige Verringerung der Endotoxinkonzentrationen gezeigt, wenn PS-PEG-Arg8-Perlen im Vergleich zu den Kontrollperlen (PS-PEG-NH-Ac) und Proben, die keine Perlen enthalten, verwendet werden. Die intrazellulären Werte von IL6 sind in Histogrammen gezeigt. Auf der rechten Seite kann eine Abnahme der IL6-Werte nach der Inkubation mit PS-PEG-Arg8-Perlen ersehen werden. Die untere linke Reihe zeigt die Abwesenheit von intrazellulärem IL6 in frischen Zellen.
  • Diskussion
  • Dieses Experiment zeigt eine rasche und vollständige Hemmung der LPS-Stimulation in einer menschlichen CD14+-Monozytenpopulation, gemessen durch eine Hemmung der LPS-abhängigen IL6-Aufregelung in Monozyten.
  • Beispiel 6
  • Zellzählungen nach Durchströmung mit Gesamtblut
  • Dieses Beispiel beschreibt, ohne die Erfindung zu beschränken, die Permeabilisierung von Blutzellen nach Durchströmung durch die Polymeraffinitätsmatrix auf Perlen.
  • Prinzip
  • Die Blutreinigung erfordert keine Schädigung oder Aktivierung von Zellen. Eine mechanische Schädigung, insbesondere von Erythrozyten, könnte zu Hämolyse und nachfolgenden lebensbedrohlichen Komplikationen führen. Eine hydrogelartige Polymermatrix gemäß der Erfindung kann überraschenderweise von Gesamtblutzellen durchströmt werden.
  • Material
  • Es wird eine hoch quellbare Polymeraffinitätsmatrix, PS-PEG-Arg8-Perlen, verwendet. Säulen mit einem Innendurchmesser von 20 mm werden mit 1 g der Matrix befüllt, die 4 bis 5 ml Wasser absorbiert, und anschließend mit physiologischer Kochsalzlösung vor der Verwendung vorgespült. Die Säulen werden dann zur Durchströmung von Gesamtblut verwendet.
  • Verfahren
  • Frisches Gesamtblut mit Citrat und LPS (30 IU/ml) wird durch Säulen unter Verwendung von steriler Ausrüstung in einem laminaren Fluss durchströmen gelassen. LPS-enthaltendes Gesamtblut wird bei einem Fluss von 5 ml/min bei 37°C durchströmen gelassen. Blutproben wurden vor und nach der Durchströmung entnommen und analysiert. Analysierte Zellen sind rote Blutzellen (RBC), Hämatokrit (HTC) und freies Hämoglobin, weiße Blutzellen (WBC), Plättchen und Thrombozytenzahlen (TRC).
  • Die Anzahl der Zellen wird vor und nach der Durchströmung der Säule mittels eines Coulter Counter® (Becton Dickinson) gezählt.
  • Freies Hämoglobin wird als Gesamthämoglobinkonzentration nach der vollständigen Lyse von Erythrozyten, gefolgt von einer fotometrischen Quantifizierung bei 405 nm, gemessen. Die Integrität von Erythrozyten nach der Durchströmung des Gesamtblutes wird durch Messungen des freien Hämoglobins im Plasma mittels einer fotometrischen Quantifizierung bei 405 nm gezeigt.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Die Anzahl der Zellen und HCT werden gemessen, und die Ergebnisse sind in den 7A (Thrombozyten), 76 (HCT), 7C (RBC) und 7D (WBC) gezeigt. Darüber hinaus wird kein Anstieg des freien Hämoglobins festgestellt, d. h. es wird keine Hämolyse indiziert (Daten nicht gezeigt). Daten aus diesem Experiment zeigen, dass nach der anfänglichen Übergangsretentionszeit aufgrund einer anfänglichen Verdünnungswirkung die Anzahl der Zellen sich auf Werte vor der Säule stabilisiert. Die Daten zeigen eine Permeabilisierung des Matrixmaterials von etwa 100%, da die Zählung der Zellen vor der Säule die gleiche ist wie die Zählung der Zellen nach der Säule. Die Zellen bleiben auch intakt, wie durch Zählung der lebenden Zellen und Lyse von roten Blutzellen gemessen.
  • Beispiel 7
  • Bioverträglichkeitsmerkmale
  • Dieses Beispiel beschreibt Teile des Bioverträglichkeitsprofils der PS-PEG-Arg8-Matrix.
  • Prinzip
  • Die Bioverträglichkeit oder Nicht-Verträglichkeit wird hierin als Komplementaktivierung, Elastasefreisetzung und Thrombogenizität durch Thrombin-Antithrombin III-Komplexbildung gemessen.
  • Material
  • Wie in Beispiel 6 wird cellulosisches Material als Referenz verwendet.
  • Verfahren
  • Elastase wird in Plasma aus der Durchströmung mit Gesamtblut unter Verwendung eines spezifischen enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISA; Diagnostic Product Co.) gemessen.
  • Die Komplementaktivierung wird durch Quantifizierung des terminalen Komplementkomplexes (TCC-Protein) gemäß Deppisch et al. (Kidney Int. 37: 696–706) gemessen.
  • TAT, der Grad der Thrombogenizität, wird gemäß Deppisch et al. (Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3: 17–23, 1994) gemessen.
  • Ergebnisse
  • In 8 ist die Bildung von TCC über die Zeit gezeigt. Referenzperlen, PS-PEG-NH-Ac (TG-Grundmaterial oder -Referenzmaterial) zeigt einen 4- bis 5-fachen Anstieg der TCC-Bildung. Nach einem Anfangsanstieg während 10 bis 15 min für PS-PEG-Arg8 stabilisiert sich die TCC-Bildung auf Werte vor der Durchströmung.
  • In 9 wird der Wert von Elastase über die Zeit gemessen. Die Werte ändern sich nicht im Vergleich mit den Werten vor der Säule. Es sind Messungen über 35 Minuten gezeigt. Für das Referenzmaterial steigen die Elastasewerte 8- bis 9-fach über 35 Minuten an.
  • In 10 ist die Bildung von TAT gezeigt. Es wird kein Anstieg der TAT-Bindung festgestellt.
  • Diskussion
  • Bioverträglichkeitsmerkmale sind wichtig bei der ex vivo- und in vivo-Blutbehandlung, z. B. Dialyse. Die beschriebene Matrix zeigt keine Aktivierung des Komplementsystems, keine Aktivierung des Koagulationssystems und keine Elastasefreisetzung im Vergleich mit dem enthaltenen Referenzmaterial, d. h. eine hohe Bioverträglichkeit. Zusammen mit dem hohen Durchströmungsvermögen für Gesamtblut, wie in Beispiel 6 gezeigt, zeigt dies, dass die Polymeraffinitätsmatrix gemäß der Erfindung in hohem Maße für die extrakorporale Behandlung von Blut, Gesamtblut eingeschlossen, geeignet ist.
  • Beispiel 8
  • Weitere Endotoxin-Adsorptionsexperimente
  • Endotoxin-Adsorptionsexperimente sind durchgeführt worden, um die Wichtigkeit des Auffindens einer spezifischen geometrisch definierten Anordnung von funktionellen Gruppen (d. h. Argininreste) zu zeigen, die einen Ligand für die Endotoxinbindung aufbauen. Es wird gezeigt, dass die Endotoxinbindung nicht unmittelbar von der Argininmenge (d. h. den positiven Ladungen) abhängt, sondern dass die definierte geometrische Anordnung wichtiger ist.
  • Verfahren
  • Menschliches Serum (repräsentativ für menschliche Körperfluide, wie Blut, Plasma usw.) wurde mit definierten Endotoxinmengen (d. h. 3 IU/ml und 10 EU/ml) beaufschlagt und mit 40 mg PS-PEG-Perlen inkubiert, die entweder die Arg8-Anordnung oder die Arg4-Anordnung als Ligand enthielten. Die zwei Arten von Perlen/Ligand-Anordnungen enthalten verschiedene Argininmengen: Arg4 enthält 0,72 mmol/g, und Arg8 enthält 1,89 mmol/g. Der höhere Arginingehalt der Arg8-Perlen ist eine Folge der zusätzlichen Verzweigung, hervorgerufen durch die Lysin-Bifurkationen. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die freie (nicht an die Oberfläche oder die Matrix gebundene) Konzentration von Endotoxin (durch den LAL-Test) in dem überstehenden Serum gemessen.
  • Analyse
  • Tabelle 2: Ergebnisse des Inkubationsexperiments mit menschlichem Serum
    Beaufschlagtes Serum vor der Inkubation 0 3 10 EU/ml
    Serum keine Perlen 0 3 9,1 EU/ml
    nach 30 min PS-PEG-Arg4 0 1,5 5,5 EU/ml
    Inkubation PS-PEG-Arg8 0 0,2 1,6 EU/ml
  • Diese Daten wurden unter Verwendung der Langmuir-Annäherung analysiert, die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und Gleichgewichte auf festen Oberflächen (z. B. Proteinadsorption) (Ref: JD Andrade: Principles of Protein adsorption. in: JD Andrade (Hrsg.) Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers. Band 2, Protein Adsorption, Plenum Press New York 1985, Seiten 1–80) beschreibt. Diese Analyse wird durch Auftragen der Toxin menge (d. h. Endotoxin), gebunden an die Ligand-Matrix (berechnet aus dem Unterschied zwischen der zugesetzten Menge und der in dem Überstand nach der Inkubation zurückbleibenden Menge), dividiert durch die Gesamtzahl von an der Matrix vorhandenen Liganden gegenüber der Gleichgewichtskonzentration des Toxins (d. h. die Endotoxinkonzentration nach der Inkubation) in dem Überstand durchgeführt. Diese Kurven werden dann an den mathematischen Ausdruck der Langmuir-Isotherme angepasst, welche die Affinitäts- oder Assoziationskonstanten für die verschiedenen an die Matrix gebundenen Liganden gegenüber dem Toxin ergibt. In den 12A und 12B sind Beispiele der Langmuir-Annäherung gezeigt.
  • Zwei Arten von Langmuir-Kurven wurden durchgeführt, die sich durch die Art unterscheiden, wie die Gesamtzahl von an der Matrix vorhandenen Liganden definiert ist:
    • (1) Vernachlässigen des verschiedenen Arginingehalts der Perlen, d. h. indem nur die Masse der Perlen in Gramm als Maß für die Gesamtzahl von Liganden genommen wird (12A); diese Annäherung ist gerechtfertigt, da in der praktischen Anwendung der Ligand-Polymer-Matrix, z. B. in einer Adsorbervorrichtung, die mit einem menschlichen Körperfluid, wie Blut oder Plasma, in einem extrakorporalen Kreislauf zu durchströmen ist, es bis zu einem bestimmten Ausmaß durch die Gesamtmasse oder das Volumen von Perlen, die in die Vorrichtung zu füllen sind, beschränkt ist, um eine therapeutisch wirksame Verringerung der Konzentration eines Toxins in dem Patienten zu erreichen. Die Beschränkung steht z. B. in Beziehung mit der Druckabnahme über die Vorrichtung, nicht-spezifischen Wirkungen auf Blutkomponenten (Proteine und Zellen) oder sogar dem Lagerraum für die Vorrichtung.
    • (2) Inbetrachtziehen der verschiedenen Arginingehalte der Perlen, d. h. indem die Masse der Perlen in Gramm genommen wird, dividiert durch die Argininbeladung in mmol/Gramm als Maß für die Gesamtzahl von Liganden (12B); diese Annäherung ist gerechtfertigt durch die Tatsache, dass der Arginingehalt ein Hauptkostenfaktor bei der Herstellung der Ligand-Polymer-Matrix ist; das Ergebnis beschreibt die Wirksamkeit der Liganden unter einem wirtschaftlichen Gesichtspunkt.
  • Die Gleichgewichtsparameter für die verschiedenen Langmuir-Kurven sind in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Gleichgewichtsparameter, aus den angepassten Kurven entnommen
    PS-PEG-Arg8 PS-PEG-Arg4 Einheit
    Analyse 1 Affinitätskonstante 1,81 0,15 ml/EU
    Sättigungskonzentration 253,9 200,7 EU/g
    Analyse 2 Affinitätskonstante 1,81 0,15 ml/EU
    Sättigungskonzentration 479,9 168,6 EU/mmol
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Die Affinitätskonstante beschreibt und charakterisiert, wie fest ein bestimmter Ligand an ein Toxin binden kann, unabhängig von der vorhandenen Ligandmenge. Überraschenderweise war die Affinitätskonstante des Arg8-Liganden mehr als 10-fach höher (d. h. um einen Faktor von 12,3) als die Affinitätskonstante des Arg4-Liganden.
  • Die Sättigungskonzentration beschreibt die maximale Toxinmenge, die von der jeweiligen Ligand-Matrix gebunden werden kann, unter der Annahme, dass unbegrenzte Mengen von Toxinen vorliegen. Überraschenderweise war die Sättigungskonzentration der Arg8-Ligand-Matrix mehr als 2-fach höher (d. h. um einen Faktor von 2,8) als die Sättigungskonzentration der Arg4-Ligand-Matrix. Da gemäß dem Langmuir-Adsorptionsmodell die Sättigungskonzentration vollständig unabhängig von der Affinitätskonstante ist, kann dies in einer Weise interpretiert werden, dass die spezifische geometrische Anordnung des Arg8-Liganden die Zugänglichkeit der Ligand-Matrix für die Toxine beeinflusst, z. B. durch Beeinflussen der Morphologie (z. B. kristallartig gegenüber fluidartig) des PEG-Teils der Ligand-Matrix.
  • Das folgende Beispiel zeigt die Wichtigkeit und Relevanz der verbesserten Affinität des Arg8-Ligand-Matrix-Endotoxins bezüglich der Matrixmenge, die notwendig ist, um eine therapeutisch relevante Verringerung der Toxinkonzentration zu erreichen:
    Endotoxinkonzentrationen in dem Bereich von 0,1 bis 1 EU/ml finden sich in septischen Patienten (z. B. Nakamura et al., Renal Failure 2000; 22: 225–234). Unter der Annahme einer Plasmakonzentration von 0,3 EU/ml zu Beginn der Behandlung und einer Plasmakonzentration von 0,03 EU/ml nach der Behandlung und einem Plasmavolumen von 4000 ml bedeutet dies, dass 1080 EU Endotoxin während der Behandlung an die Ligand-Matrix gebunden werden müssen. Die Matrixmenge, die notwendig ist, um diese Endotoxinmenge zu binden, kann aus dem Langmuir-Ausdruck unter Verwendung der Affinitätskonstanten und der Sättigungskonzentrationen für die jeweiligen Liganden berechnet werden. Die Konzentration am Ende der Behandlung ist dann die Gleichgewichtskonzentration. Unter Verwendung der Gleichgewichtsdaten aus der Tabelle 3 zeigt diese Berechnung, dass für die Arg8-Ligand-Matrix nur 83 g notwendig sind, während für die Arg4-Ligand-Matrix 1201 g notwendig sind, um das therapeutische Ziel zu erreichen. Da beide Ligand-Matrizes eine ähnliche Dichte (Masse pro Volumen) haben, bedeutet dies, dass das Volumen und die Größe einer Adsorbervorrichtung für den Arg8-Ligand viel kleiner ist, was eine Durchströmung mit Plasma oder Blut erleichtert.

Claims (22)

  1. Polymeraffinitätsmatrix zum Binden einer oder mehrerer Substanzen in einem Fluid zum Entfernen der Substanz(en) aus dem Fluid und/oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, worin die Matrix umfasst a) einen festen Träger, b) wenigstens eine an den festen Träger gebundene Abstandsgruppe, worin die Abstandsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Poly- oder Oligoethylenglycolen der Formel H-(OCH2CH2)- OH, worin n 2 bis 250 bedeutet, oder Polyvinylalkoholen, Polyvinylaminen, Polyglycidolen, Polyethyleniminen, Polypropylenoxiden oder Derivaten davon, und, gekuppelt an jede Abstandsgruppe, c) einen Ligand mit einer definierten dreidimensionalen Struktur, die, was die Ladung und/oder Hydrophobie/Hydrophilie betrifft, zu der dreidimensionalen Struktur eines bindenden Prinzips der Substanz(en) komplementär ist, worin der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00480001
    und
    Figure 00490001
  2. Polymeraffinitätsmatrix gemäß Anspruch 1, worin die Abstandsgruppe ein Polyethylenglycol (PEG) in einer linearen und/oder verzweigten Konfiguration ist und ein mittleres Molekulargewicht von 400 bis 10000 Dalton hat, oder Derivate davon.
  3. Polymeraffinitätsmatrix gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der feste Träger aus einem Material hergestellt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polyvinylalkoholen, Polyhydroxystyrolen, aus chlormethylierten Polystyrolen oder Polyacrylaten hergestellten Polymeren, mit Hydroxygruppen funktionalisierten Polymethacrylaten, Hydroxyalkylpolystyrolen, Hydroxyarylpolystyrolen, Hydroxyalkylarylpolystyrolen, polyhydroxyalkylierten Polystyrolen, polyhydroxyarylierten Polystyrolen, Isocyanatoalkylpolystyrolen, Isocyanatoarylpolystyrolen, Carboxyalkylpolystyrolen, Carboxyarylpolystyrolen, Aminoalkylpolystyrolen, Aminoarylpolystyrolen, Polymethacrylaten, vernetzten Polyethylenglycolen, Cellulose, Siliciumdioxid, Kohlenhydraten, Latex, Cycloolefin-Copolymeren, Glas oder Kombinationen davon, bevorzugt einem vernetzten Polystyrol.
  4. Polymeraffinitätsmatrix gemäß Anspruch 3, worin der feste Träger die Form einer Perle, eines Gels, einer Membran, eines Teilchens, eines Netzes, eines Gewebes oder eines Faservlieses, einer Fasermatte, eines Rohrs, eines Films, einer Folie oder Kombinationen davon oder vernetzter interpenetrierender Netzwerke, bevorzugt einer Polystyrol-PEG-Perle, hat.
  5. Polymermatrix gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Matrix biokompatibel ist und eine Quellfähigkeit hat, die hoch genug ist, um eine Durchströmung von Vollblut zu erlauben.
  6. Polymermatrix gemäß Anspruch 5, worin die Quellfähigkeit das etwa 1, 5- bis 20-fache, bevorzugt das 2- bis 6-fache, vom trockenen Zustand zu der hydratisierten Form beträgt.
  7. Polymeraffinitätsmatrix gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Matrix eine dreidimensionale komplementäre Struktur zum Binden an wenigstens eine Substanz bereitstellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus von Bakterien oder Viren abgeleiteten Bestandteilen, Endotoxinen, Exotoxinen, bakterieller DNA oder Fragmenten davon, Oligonukleotiden; Zellen, insbesondere Endothelzellen, Stammzellen und Tumorzellen; Blutzellen, insbesondere Lymphozyten, Thrombozyten, Granulozyten, dendritischen Zellen und Monozyten; Prionen, Parasiten, Pilzen, Wirkstoffen nach Überdosierung, pathogenen Nahrungsmittelzusätzen, Produkten aus akuten oder chronischen Stoffwechselstörungen, die von Diabetes mellitus, Lebererkrankung, Urämie, Nierenerkrankungen oder Entzündung, Heparin, Bakterien und Viren, pathogenbeladenen Blutzellen oder wenigstens Teilen oder Abbauprodukten davon, DNA, Phosphat, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Chemokinen, urämischen Toxinen, Blutgerinnungsproteinen, prokoagulierenden Proteinen, Entzündungs- oder Proentzündungsproteinen, Makrophagenmigration-Hemmfaktor, löslichen oder zelloberflächengebundenen Proteinen, löslichen Adhäsionsmolekülen und Glucose oder Zersetzungsprodukten davon, Pyrogenen, bakteriellen Exotoxinen, Produkten von grampositiven Bakterien, bevorzugt Lipoteichonsäure, insbesondere bakteriellen Pyrogenen, bevorzugt Endotoxinen, insbesondere die Lipid A-Komponente von Lipopolysacchariden (LPS).
  8. Polymeraffinitätsmatrix gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Matrix einen Ausschlusswert von etwa 1 × 102 bis etwa 1 × 106 Dalton hat und hydrophobe und/oder hydrophile Substanzen bindet.
  9. Polymeraffinitätsmatrix gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Fluid, aus welchem die Substanz(en) zu entfernen oder in welchem sie zu verringern ist/sind, eine wässrige oder organische Lösung, ein Körperfluid, bevorzugt Blut, therapeutische Fluide, Fluide für life science-Anwendungen, bevorzugt Pufferlösungen, Infusionsfluide oder Dialysefluide in biologischen, diagnostischen oder biotechnologischen Anwendungen, von gesunden Spendern erhaltene Blutprodukte, wie Plasma, Plättchenkonzentrate, Erythrozytenkonzentrate, die für Transfusionen verwendet werden, Blutersatzprodukte, bevorzugt Sauerstoffträger, modifizierte Hämoglobinlösungen und künstliche Hämoglobinlösungen ist; Fluide für Nahrungszwecke und Fluide für industrielle Verwendung ist.
  10. Polymeraffinitätsmatrix gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der feste Träger ein vernetztes Polystyrol ist und die Abstandsgruppe ein Polyethylenglycol ist.
  11. Verfahren zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Verringern ihrer Menge oder Konzentration im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern einer unerwünschten Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, umfassend das Inberührungbringen des Fluids mit der Polymeraffinitätsmatrix, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Menge oder Konzentration der Substanz(en) zu verringern und/oder um sie zu entfernen, bevorzugt bis zu 24 Stunden.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Zeit 1 Sekunde bis 2 Stunden beträgt.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 und 12, worin die Substanz ein Endotoxin ist, und das Fluid Blut ist, worin die Menge oder Konzentration von Endotoxin nach dem Entfernen oder Verringern unter der Fähigkeit liegt, Komponenten im Blut zu aktivieren, oder die Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen im Blut zu verhindern.
  14. Verwendung der Polymeraffinitätsmatrix, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, zur Entfernung einer oder mehrerer Substanzen, bevorzugt von Endotoxinen, aus einem Fluid, oder zum Erniedrigen ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid, bevorzugt ein Körperfluid oder ein therapeutisches Fluid, am bevorzugtesten Blut oder Serum.
  15. Verwendung gemäß Anspruch 14 zur Herstellung von weniger aktiviertem Blut oder zur Verhinderung von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen im Blut.
  16. Verwendung gemäß Anspruch 14 als Teil eines extrakorporalen Blutreinigungsverfahrens oder als ein Implantat in dem Körper, um Blut oder irgendein Körperfluid zu kontaktieren, bevorzugt in dem Gefäßsystem, in Blutgefäßen oder in der Bauchfellhöhle.
  17. Verwendung gemäß Anspruch 16 zur Herstellung von weniger aktiviertem Blut oder zur Verhinderung von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen im Blut.
  18. Kit zum Entfernen einer oder mehrerer Substanzen aus einem Fluid und/oder zum Verringern ihrer Menge oder Konzentration in dem Fluid im Hinblick auf das Verhindern, Eliminieren oder Verringern von unerwünschter Aktivierung von Komponenten oder Vorgängen in dem Fluid, wobei der Kit eine Polymeraffinitätsmatrix, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, umfasst.
  19. Kit gemäß Anspruch 18, worin er weiterhin Probeschläuche und eine Vorrichtung für extra- und/oder intrakorporale Behandlung des Fluids, bevorzugt Blut oder Serum, umfasst.
  20. Verfahren zum Herstellen einer Polymeraffinitätsmatrix, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert, umfassend a) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und b) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex; oder c) Binden der Abstandsgruppe an den wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Ligand zum Erhalt eines zweiten Komplexes und d) Binden des festen Trägers an den zweiten Komplex; oder e) Binden der Abstandsgruppe an den festen Träger zum Erhalt eines ersten Komplexes und f) Festphase-Synthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe oder g) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und h) Binden des wenigstens eine Bindungseinheit mit wenigstens einer funktionellen Gruppe enthaltenden Liganden an den ersten Komplex, oder i) Aufbauen oder Synthetisieren der Abstandsgruppe aus Monomeren direkt auf dem festen Träger durch Pfropfen und k) Festphase-Synthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe, worin Information über die dreidimensionale Struktur, die Anwesenheit von Ladungen und von hydrophoben/hydrophilen Bereichen des Bindungsprinzips auf der bzw. den zu bindenden Substanz(en) aus Röntgenstrahl-Kristallografie, Proteinsequenzierung, Proteinmodellierung oder Hydrophobie- und Hydrophilieberechnungen gesammelt wird, und der die Bindungseinheit enthaltende Ligand bezüglich der Ladung und/oder der Hydrophilie/Hydrophobie zu dem Bindungsprinzip der Substanz(en) komplementär gemacht wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, umfassend die Schritte: für a) und b), Aktivierung des festen Trägers, Kuppeln des Abstandsgruppemoleküls an den festen Träger, Synthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden und stellenspezifisches Kuppeln des Liganden an das Abstandsgruppemolekül, oder für c) und d), Synthese des die Bindungseinheit enthaltenden Liganden, Kuppeln des Abstandsgruppemoleküls an den Ligand, Aktivierung des festen Trägers und stellenspezifisches Kuppeln des Abstandsgruppe-Ligand-Komplexes an den festen Träger, oder für e) und f), Aktivierung des festen Trägers, Kuppeln des Abstandsgruppemoleküls an den aktivierten festen Träger, und Festphase-Synthese des Liganden auf der an den Träger gebundenen Abstandsgruppe.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, umfassend die Schritte: für a) und b), Aktivierung der Abstandsgruppe, Kuppeln der aktivierten Abstandsgruppe an den festen Träger und Kuppeln des Liganden an die aktivierte Abstandsgruppe, oder für c) und d), Synthese des Liganden, Aktivierung der Abstandsgruppe, stellenspezifisches Kuppeln des Liganden an das aktivierte Abstandsgruppemolekül und Kuppeln des Abstandsgruppe-Ligand-Komplexes an den festen Träger oder für e) und f), Aktivierung der Abstandsgruppe, Kuppeln der aktivierten Abstandsgruppe an den festen Träger und Festphase-Synthese des Liganden auf der an den festen Träger gebundenen Abstandsgruppe.
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