JP2006505385A - ポリマーアフィニティーマトリックス、その製造方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】流体中での成分の望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び/又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるか、又は前記流体中の1若しくは複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックス、並びに、流体から前記物質を除去し及び/又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させる方法、前記マトリックスを製造する方法、前記マトリックスの使用、及び前記マトリックスを備えたキットが記載されている。前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、固相支持体と、スペーサーと、結合ユニットとしてアルギニンを含有するリガンドとを備える。
Description
血液その他あらゆる体液などの流体を体外処理するには、例えば、チューブ、ライン、ビーズまたは膜などの形態の材料に流体を接触させることが必要である。このような材料を導入することは、外来性であるために生体に適合しないことがある(例えば、免疫学的に活性であり、または凝固を促進する)材料を使用することを意味する。かかる外来性材料を使用すると、例えば、リンパ球、血小板または補体もしくは凝固カスケード中のタンパク質のような様々なタイプの血漿タンパク質カスケードなどの血中成分の宿主免疫系の活性化が付随する。また、機械的な損傷またはストレスによって生じた損傷(例えば赤血球への損傷)など、細胞への損傷は、溶血や溶血後に患者に発生する致死的な合併症を引き起こすことがある。したがって、血液やあらゆる体液など流体を処理するには、前記流体(例えば、血液)中の成分に望ましくない活性化が生じないようにするため、生体適合性が極めて高い材料を使用することが必要である。
血液細胞と宿主中の可溶性タンパク質とエンドトキシンとの間に生じる複合的な相互作用によって引き起こされる活性化のために、細菌のエンドトキシンやエキソトキシンは、過剰な炎症性免疫反応を宿主に起こさせる。この免疫反応は、SIRS(全身性炎症反応症候群)、敗血症または敗血症ショックの臨床症状における本質的な特徴として記載されている。病態は重篤であり、本症状は、敗血症によって生じる組織障害、多臓器不全、死亡にいたる。最近の治療行為に関する研究(Dinarello et al. in European Cytokine Network 1997,8:294)では、重篤な敗血症または敗血症ショックを有する患者を保護できないことが明らかとなっているため、敗血症患者を治療するための新しい治療薬と方法を探索することは重要である。また、治療用物質または流体を製造する場合には、製品が非発熱性であるように、すなわち、エンドトキシン濃度がゼロであるか、その効果を発揮するものとして受容されている限度を下回るように、注意を払わなければならない。
グラム陰性菌(例えば、Esherichia coli、Salmonella typhi、Pseudomonas aeruginosa又はProteus vulgaris)の細胞膜の外膜に由来するエンドトキシン又は「パイロジェン」は、敗血症、敗血症ショックおよび全身性炎症反応症候群(SIRS)の発症に重大な役割を果たしている。例えば、E. coliから得られるリポポリサッカライド(LPS)のようなエンドトキシンは、リピドAとポリ多糖鎖から構成されている(Zahringer et al. Adv. Carb. Chem. Biochem., 1994)。図1には、LPSの分子構造が示されている。リピドA部分は、生物学的に最も活性な部分であり、細胞に対するエンドトキシンの毒性効果を媒介する。リピドAは、グラム陰性細菌の様々な系統中で極めて保存されているのに対して、ポリ多糖部分はずっと多様性に富んでいる。
エンドトキシンを除去することは困難であり、大切なタンパク質(すなわち、除去すべきでないタンパク質)の回復に関する問題や大切なタンパク質に対する損傷に関する問題、または血液もしくは体液やエンドトキシンを除去するために用いた手段の生体適合性の問題が発生することが多い。このような生体適合性の問題は、単に宿主の防御機構が活性化されることによって引き起こされるものであって、複数の細胞の活性化や、補体カスケード中のサイトカインおよびタンパク質などの可溶性タンパク質の放出が関わっている。細胞の活性化とタンパク質の放出は、重度の炎症(すなわち、全身的な敗血症または敗血症ショック)を引き起こすことがあり、その結果、組織の損傷や臓器不全が起こる。血液凝固によって生じる凝血は、生体不適合性によって引き起こされる別の問題である。さらに、パイロジェンが完全には除去されないことがある。
敗血症患者の血漿または全血からエンドトキシンを体外除去することは、敗血症、敗血症ショックおよびSIRSの治療において採り得る療法として議論されている。ヒトの血漿中には、例えば、リポ多糖結合タンパク質(LBP)、殺菌性透過亢進タンパク質(BPI)、sCD14、CAP18、ラクトフェリンなど、エンドトキシンが細胞に及ぼす効果の媒介および阻害において役割を果たしている結合タンパク質が幾つか存在する。ペプチド抗生物質であるポリミキシンB(Bacillus polymixaによって産生される)は、細胞に対するエンドトキシンの作用を阻害する。カブトガニ(Limulus polyphemus)も、エンドトキシン結合タンパク質を含んでおり、本種から得られる細胞可溶化物はエンドトキシンの検出に用いられている(カブトガニ血球抽出物、LAL、またはLimulusテスト)。このようなエンドトキシン結合タンパク質の結合モチーフは、敗血症患者の血漿または全血の体外治療に使用できる可能性がある。
タンパク液からのエンドトキシンの効率的な除去は、エンドトキシンを除去すべき所望の大切なタンパク質の総電荷に依存している。エンドトキシンとそのリガンド間の相互作用には、疎水性のものとイオン性の両方があるが、それぞれの寄与は流体のイオン強度とpHに依存する。効率的なエンドトキシンの除去は、例えば、細胞の活性化や血液凝固を抑えるために前記エンドトキシンを除去する手段の灌流および生体適合性の高さにも依存する。
(1)未結合の(過剰な)リガンドまたは構造単位(例えば、保護されたアミノ酸)または化学物質(例えば、カルボジイミドなどのカップリング剤、有機酸または塩基などの脱保護剤)を効果的に除去または洗浄できるようにするため、また、
(2)水系環境から各トキシンが除去できるようにするために、マトリックスは、この環境中でも湿潤可能で且つ膨潤可能でなければならない。
a)固相支持体と、
b)該固相支持体に結合され且つ各スペーサーに連結された少なくとも1つのスペーサーと、
c)少なくとも1つの官能基を有する少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドであって、前記物質の結合モチーフの三次元構造に対して相補的な電荷及び/又は親水性/疎水性である所定の三次元構造を有するリガンドと、を備え、前記ポリマーアフィニティーマトリクスが前記物質を選択的に結合することができる、ポリマーアフィニティーマトリックスによって達成される。
a)固相支持体にスペーサーを付着させて第一の複合体を得る工程と、
b)少なくとも1つの官能基を有する少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
c)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
d)前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か、
又は
e)前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と
f)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は
g)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
h)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
i)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
k)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程、を備え、
三次元構造、電荷の存在、結合する物質上の結合モチーフの疎水性/親水性領域についての情報がX線結晶学、タンパク質の配列決定、タンパク質のモデリング、疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットが電荷及び/又は親水性/疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている、方法に関する。
本明細書において、「物質を除去する」という用語は、ある物質を抑制し、低減し、減少し、中和し、不活化し、分解し、修飾し、取り除き、結合し、または隠すことを意味するものとし、物質の量又は濃度がゼロであることを必ずしも意味するものではない。さらに、「物質の量又は濃度を減少させる」という用語は、その後に流体中で生じる成分の活性化及び/又は流体中での細胞及び/又は非細胞性の生物的機序を抑制又は阻害するのに十分な程度まで、前記流体中の物質の量又は濃度を低減又は減少させることを意味する。
様々な物質を結合し、吸着するのに十分な多様性を本発明のポリマーアフィニティーに与えるために、前記リガンドは、1−100個の官能基、好ましくは1−32個の官能基を含むことができる。
本発明によれば、前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、好ましい形態において、全血の体外処理などの特定の用途に用いた場合に高い生体適合性を示すはずである。生体適合性が高いということは、ある一定の特性が別の特性より重要であるように意図されていることを意味する。例えば、Deppischら(Kidney Int. 37:696-706)に従って、初期複合体の形成と終末補体複合体(TCCタンパク質)の定量によって測定した場合に、補体の活性化が存在しないことが重要である。また、血栓形成が少ないことが患者にとって望ましい。血栓形成の程度は、Deppischら(Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23,1994)に従い、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体(TAT)を定量することによって測定され、血液又は血漿処理中に増加すべきでない。さらに、処理前と処理後に白血球と赤血球の血液細胞数が一定であること、接触相活性化による細胞の活性化が存在しないことも含まれる。血液細胞数が一定であるとは、単なる圧力、活性化又は機械的な損傷によって血液細胞に生じる損傷の程度が低く、又は実質的に損傷が生じないことを意味するものとする。
エンドトキシンなどの除去すべき物質の結合モチーフと相補的なリガンドを作製できるようにするためには、三次元構造が形成されなければならない。これは、例えば、必要とされる三次元構造にとって最適な方法で容易に合成できる柔軟な又は剛直なポリペプチド構造を使用することによって行うことができる。このようなポリマーは、直鎖又は分枝状(例えば、樹状構造や櫛状構造)又は環状とすることができる。本来的に柔軟性を有するため、アミノ酸を使用することが、このような三次元構造を形成させるのに有用である。このようなポリマー(例えばポリペプチド)を結合するための化学は、本分野において周知である。本発明の好ましい実施形態では、このようなポリマーは、ペプチド結合によって互いに連結された複数のアミノ酸、一般には最大約100のアミノ酸を含有するポリマー、すなわちオリゴマーを指す。直鎖ポリマーの例は、α−カルボキシル基と隣接する残基のα−アミノ基とのアミド結合によって形成されたポリペプチド又はオリゴペプチドであり、分枝ポリマーの例は、非α−アミノ基を1つ以上含んだアミド結合によって形成されたポリペプチド又はオリゴペプチドである。
−X1 n−Ym[X2 i−Z1;X3 j−Z2]1/2(m+1)
樹状構造を表している一般式Iにおいて、様々な記号は以下の意味を有している。
m=2k−1;
k=0ないし10、k=0の場合、X2=X3かつZ1=Z2;
i=0又は1;
J=0又は1、
一般式II:
−(X1 n−Y1[Y2 m[X2 i−Z1;X3 j−Z2]1/2(m+1))r−X4 p−Z3
櫛状構造を表している一般式IIにおいて、様々な記号は以下の意味を有している。
m=2k−1;
k=0ないし10、k=0の場合、X2=X3かつZ1=Z2;
r=1−100;
i=0又は1;
J=0又は1;及び
p=0又は1。
X1、X2、X3は、それぞれ、必要に応じて使用される二官能性間隔付与分子であって、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ及びそれらの誘導体又はそれらの組み合わせからなる群から選択される2つの官能基を含有する。
物質に対して相補的な構造を得るために、構造、一定の距離に保持された正電荷の存在、帯電した基の近くに位置する疎水性領域の存在に関する関係を調べるための本分野において公知の手技(例えば、X線結晶学、タンパク質の配列決定、タンパク質モデリング、又は実施例1に記載され、図3と図11に図示されているような疎水性及び親水性の計算)から情報を収集する。
b)電荷を帯びた基の近くに疎水性領域が存在し、この領域がリピドAの脂肪酸部分との疎水的相互作用を可能にする
c)a)とb)の前記特性の組み合わせにより、リピドAに相補的な構造を与え、最適な結合を可能にする。
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスは、固相支持体の一部となるという意味で固相支持体を修飾する実質的に疎水的又は親水的なスペーサーを備えており、少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを備えたリガンドに対するアンカー部分という機能を有している。
固相支持体は、様々な多孔性とサイズ排除特性を与えるべきである。また、好ましい実施形態において、ポリペプチドを合成するための固相合成の支持体となるべきである。本発明において使用し得る様々な固相支持体、すなわちポリマーが、EP 0,187,391号、WO 99/17120号、米国特許第4,908,405号に記載されている。ここで、前記固相支持体は、0.05−10%の架橋度を有する直鎖及び/又は分岐状の生体適合性グラフトコポリマーであり、ポリニビルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレンとエチレングリコールとから製造されるポリマー、式H−(OCH2CH2)n−OH(式中、nは約2−250である)のポリ又はオリゴエチレングリコール、水酸基により官能性をもたせたポリアクリレート又はポリメタクリレート、及びそれらの誘導体から選択される。本発明において、上述した架橋度は最大50%とすることができる。
ポリマーアフィニティーマトリックスが水和されると、ヒドロゲル様の構造が形成され、水和のために、膨潤する。膨潤能は、ポリマーが乾燥状態から水和して膨潤し、水和されたゲル様のマトリックスを形成することと定義される。このような膨潤は、水和された際の単位容積当たりの重量の増加として定義することができ、乾燥型のポリマーアフィニティーマトリックスと水和された型のポリマーアフィニティーマトリックスとを比較した場合、本発明においては、約1.5−10倍、好ましくは3−5倍の増加倍数であり得る。この膨潤能によって、血液細胞と数を損なわずに、マトリックス全体にわたって全血を完全に灌流することが可能となる。
本発明は、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制し、除去し又は軽減する目的で、流体から1又は複数の物質を除去し及び/又は前記流体中におけるそれらの量又は濃度を減少させる方法であって、前記物質の量又は濃度を減少させ及び/又は前記物質を除去するのに十分な時間、前記流体を本発明のポリマーアフィニティーマトリックスに接触させることを備えた、方法にも関する。本方法を用いた好ましい実施形態では、血液又は他の任意の体液から物質(例えば、エンドトキシン)を除去することによって、上記「物質」の定義に列記されている望ましくない物質に結合されることによって、例えば血液細胞の活性化が直接又は間接に抑制されるであろう。好ましくは、これは、前記流体を上述したポリマーアフィニティーマトリックスに最大24時間、最も好ましくは1秒ないし2時間接触させて、血液やその成分の活性化を低下させ又は活性化を抑制することによって行うことができる。
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを作製する方法には、以下の工程が含まれる。
b)少なくとも1つの官能基を有する少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か
又は、
c)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
d)前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か
又は、
e)前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と、
f)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は、
g)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
h)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
i)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
k)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程、を備え、
結合する物質上の三次元構造、電荷の存在、結合モチーフの疎水性/親水性領域についての情報がX線結晶学、タンパク質のモデリング、疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットを含有するリガンドが電荷及び/又は親水性/疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている。
上記c)とd)の場合、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、スペーサー分子をリガンドに連結させ、固相支持体を活性化し、スペーサー−リガンド複合体を活性化された前記固相支持体に部位特異的に連結させるか、又は
上記e)とf)の場合、固相支持体を活性化し、活性化された固相支持体にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを該支持体上で固相合成する。
c)とd)の場合、リガンドの合成と、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサー分子へのリガンドの部位特異的連結と、固相支持体へのスペーサー−リガンド複合体の連結、又は、
e)とf)の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結、固相支持体に結合されたスペーサー上でのリガンドの固相合成という具体的な工程も備える。
本発明は、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスの使用、好ましくは、とりわけ、活性化の程度が低い血液を製造するため又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するために、1又は複数の物質、好ましくはエンドトキシンを、流体、好ましくは体液若しくは治療用の流体、最も好ましくは血液から除去するための又は前記流体中の前記物質の量若しくは濃度を減少させるための前記ポリマーアフィニティーマトリックスの使用にも関する。前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、体外での血液精製プロセスの一部として使用するか、又は血液若しくは血流と接触させて、例えば、血液若しくは任意の体液に接触させるために、身体(例えば、血管系、血管又は腹腔中)に埋め込むインプラントとして、使用するのが好ましい。
1つの実施形態において、本発明は、流体中での成分の望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で前記流体から1又は複数の物質を除去し及び/又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるためのキットであって、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスと、試料管と、前記流体、好ましくは血液又は血清を体外及び/又は体内処理するための器具と、を備えたキットに関する。
本発明は、極めて効率的且つ時間のかからない方法で、流体から物質を除去するための手段を提供する。これは、生体適合性が高く、膨潤能に優れているために全血を貫流させることが可能な本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを使用することによって実現される。効率的な手段は、除去すべき物質の結合モチーフに相補的な結合ユニットを備えたリガンドの生成によるものでもある。従って、本発明は、例えば、治療的用途のための透析及び輸液医療などの体外的な血液処理、幹細胞治療及び/又は治療的な細胞療法、診断用途に使用することができ、バイオテクノロジー、生物工学、遺伝子技術、食品化学、水の調製及び/又は精製にも使用できる。
本実施例では、LPSを除去するための結合ユニットを含有するリガンドの設計について説明するが、本発明を限定するものではない。
トキシン、例えばLPSを効率的に除去するには、除去すべき物質の結合モチーフに相補的な結合ユニットを備えたリガンドが必要とされる。これには、相補的な電荷、疎水性及び親水性のような特徴による生物特異的な認識を最適化するために、除去すべき物質の三次元的な形状と分子の正確な配置とが含まれる。これにより、上述した特徴の適切な距離と相俟って、結合ユニットを有するリガンドが完成されるであろう。また、ポリマーマトリックス内にこのようなリガンドの全体を三次元的に提示することは、高い灌流、リガンドの提示、リガンドの柔軟性にとって、空間的に最適なはずである。また、生体適合性が高いことは、患者でインビボ又はエキソビボ血液精製を行うために必須である。前記のマトリックスでは、到達性が非固相の水性溶液と同等又は同一である。LPSの構造は図1に示されている。推定されるLPSへの相補的な結合が図3A−Dに示されており、LPSのリン酸基と疎水性尾部が相補的な結合モチーフを形成すると考えられている。図2には、Arg4とArg8についてこの推定構造が示されており、図11には三次元的な形式でそれらが記されている。Arg8は、左側の図においてアルギニン位置の半分を示し、右側の図11Bにおいてアルギニン位置の半分を示している。スペーサー(ここでは、PEG)への連結も示されている。
さらに分子シミュレーションを用いて、前記結合部位の三次元の幾何学的な構造と化学的な構造を同定、確認した。シミュレーションは、Insight II−Package(Molecular Simulations Inc.(MSI),San Diego,CA)と同梱の最適化アリゴリズム(例えば、AMBER−forcefields)を使用して、Silicon Graphics Octane2 Workstationで行った。Arg4とArg8の三次元配置の結果は、それぞれ、図11AとBに示されている。ここで、この模式図では、PEGスペーサー又は固相支持体を省略して、マトリックスの三次元末端部分の原理を示している。
結合ユニットを有するリガンドは、図4に従って合成され、図には、3つの異なる方法が記されている。前記3つの方法のうち好ましい方法は、固相支持体に付着されたPEGスペーサー上に直接固相合成する方法である。以下の実施例では、結合ユニットが使用されている。
本実施例では、ヒト血漿からエンドトキシンLPSを吸着することについて説明する。本実施例には、エンドトキシンを吸着するための直鎖リガンドと分岐リガンドの比較についても示されている。
ヘパリン処理を施したヒト血漿とともにビーズを2時間インキュベートする。2時間のインキュベーション後に、LALアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
ビーズとのインキュベーション後のエンドトキシンのレベルを定量するために、LALアッセイを行う。本アッセイは、LALによって生じる色素産生性物質の反応により行われる(Chromogenics, Molndal, Sweden)。ヘパリン処理したヒト血漿中に存在する所定の濃度のエンドトキシンを用いて得た標準曲線により、レベルを計算する。
LALアッセイを用いて、2時間のインキュベーション後に、以下のエンドトキシン濃度が測定された。
PS−PEG−LBP 94−108 10
PS−PEG−BPI 85−99 9
PS−PEG−Arg8 2
PS−PEG−NH−Ac 10
ビーズなし 8
初期値 10
考察
本実験は、PS−PEGビーズ上に分岐した三次元マトリックスを使用することにより、エンドトキシンのレベルが5分の1に減少することを示している。直鎖リガンドを有するビーズは効率性が劣り、それらの試料中のエンドトキシンレベルは、エンドトキシンの初発レベルと同じか又は初発レベルに近かった。
本実施例では、LPS結合について最適化された三次元マトリックスを有するビーズを血漿とともにインキュベートし、様々な時点で分析したときのエンドトキシン結合の速度論を示している。
吸収の速度論は、ポリマーマトリックスの構造と架橋度に依存する。ヘパリン処理したヒト血漿とともにビーズをインキュベートする。1、10、120分後に、試料を採取する。LALアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
以下のビーズを使用する。
ヘパリン処理した血漿中のビーズのインキュベーションを37℃で行う。試料をゆっくり撹拌し、1、10、120分のインキュベーション期間後に、被検試料を採取する。ビーズは、遠心によって除去する。
実施例2と同様に、エンドトキシンレベルを定量するためにLALアッセイを行う。
図5は、様々な時点で測定されたエンドトキシンレベルの結果を示している。図は、効率的な除去を行うためには、すなわち、試料中の初発レベルの20−30%のエンドトキシンが残存するようにするためには、2時間の期間が必要とされることを示している。アルギニンを含有する直鎖リガンド(PS−PEG−Arg)は、エンドトキシンの量を半分除去するにすぎない、すなわち120分後に60%のレベルが残存している。同様に、対照ビーズ(PS−PEG−NH−Ac)を添加した場合、ビーズとともにインキュベーションを行った後のエンドトキシンの量はなお不変である、すなわち、120分後にも初期値のままであった。
本実施例では、末端アミノ酸(アルギニンvsリジン)の影響とリガンドの分岐の影響(非分岐vs4倍分岐vs8倍分岐)とを示している。
エンドトキシンを加え又は加えずに、ヘパリン処理したヒト血漿とともにビーズをインキュベートする。2時間後に、LALアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
エンドトキシン(IU)/ml
PS−PEG−Arg8 0.4
PS−PEG−Lys8 1.8
PS−PEG−Arg4 0.01
PS−PEG−Lys4 2.7
PS−PEG−NH−Ac 7.8
PS−PEG−Arg 3.5
ビーズなし 11
インキュベーション前、すなわち初期値 13
考察
結果は、エンドトキシンの除去には、分岐リガンドが直鎖型より効率的であること、アルギニンがリジンより数倍(それぞれ、Arg8とArg4で4倍及び200倍)効率的であることを示している。また、2時間後にエンドトキシンを除去するのにPS−PEG−Arg4が最も効率的である。
本実施例では、PS−PEG−Arg8を用いることによって、ヒト単球中でのエンドトキシン依存性IL6誘導が減少することを記載する。
全血から得たヒト単核球を使用する。エンドトキシンを除去するために、PS−PEG−Arg8を使用し、PS−PEG−NH−Acを対照として加える。インビトロでMNCを刺激するために、リポ多糖(Biowittaker Co.から入手したE.coli 菌株 055:B5)を使用する。FACS分析は、FACSCAN Calibur(Beckton Dickinson(R))を用いて行う。
単球は、細胞懸濁液中のCD14+細胞として定義される。細胞内IL6(icIL6)を内部標準に対して較正し、10又は30IU/mlのLPSとともに30分間インキュベートした後に、FACS分析を使用して、CD14+細胞集団中で定量する。計算は、CellQuest Software Package(Beckton Dickinson(R))を用いて行う。
FACSデータ及び該データから行った計算を用いて、当業者がCD14+単球集団の分析を行うことによって、図6に示されている以下のデータが得られる。対照ビーズ((PS−PEG−NH−Ac)及びビーズを加えていない試料と比べて、PS−PEG−Arg8ビーズを用いたときに、エンドトキシンレベルが70%減少することが、グラフに示されている。IL6の細胞内レベルが、ヒストグラムで示されている。右側には、PS−PEG−Arg8ビーズとともにインキュベーションを行った後に、IL6レベルが減少する様子が示されている。左下の列は、新鮮な細胞中に細胞内IL6が存在しないことを示している。
本実験は、単球内におけるLPS依存性のIL6アップレギュレーションの阻害によって測定される、ヒトCD14+単球集団中でのLPS刺激の阻害が迅速且つ完全に行われることを示している。
本実施例では、ビーズ上のポリマーアフィニティーマトリックスを通して貫流した後の血液細胞の透過処理について説明するが、本発明を限定するものではない。
血液精製では、細胞への損傷も細胞の活性化も生じてはいけない。特に赤血球に対する物理的な損傷により、溶血が生じ、その後、生命に脅かす合併症を引き起こす可能性がある。本発明のポリマーマトリックスのようなハイドロゲルは、驚くべきことに、全血細胞によって灌流することができる。
膨潤性の高いポリマーマトリックスPS−PEG−Arg8ビーズを使用する。内径20mmのカラムに、マトリックスの1gを充填し、4−5mlの水を吸収させた後、使用前に生理的食塩水溶液で予め洗浄する。次いで、全血の灌流を行うためにカラムを使用する。
層流の滅菌装置を用いて、クエン酸とLPS(30IU/ml)を加えた新鮮な全血をカラムに灌流する。LPSを加えた全血を、5ml/分の流速にて、37℃で灌流する。灌流の前後に血液試料を採取し、分析した。分析した細胞は、赤血球(RBC)、ヘマトクリット(HTC)、遊離のヘモグロビン、白血球(WBC)、血小板、血小板数(TRC)である。
細胞数とHCTを測定し、結果を図7A(血小板)、7B(HCT)、7C(RBC)、7D(WBC)に示してある。さらに、遊離ヘモグロビンの増加は全く見られない。すなわち、溶血は誘導されない(データは示さず)。本実験で得られたデータは、初期の希釈効果に起因する初期の一過性保持時間を過ぎると、細胞数は、カラムを通す前の値に安定することを示している。前カラム細胞数が後カラム細胞数と同じなので、データは、約100%のマトリックス材料が透過処理されたことを示している。また、生きた細胞数と赤血球細胞の溶血を測定したところによれば、細胞は無傷のままである。
本実施例では、PS−PEG−Arg8マトリックスの生体適合性プロファイルの一部について説明する。
本実施例において、生体適合性又は非生体適合性は、補体活性化、エラスターゼ放出、トロンビン−アンチトロンビンIII複合体形成による血栓形成として測定される。
実施例6と同様に、セルロース系材料を対照材料として使用する。
特異的な酵素結合免疫吸着検定法(ELISA;Diagnostic Product Co.)を用いて、全血灌流から得られた血漿中でエラスターゼを測定する。
図8には、TCCの形成が経時的に示されている。対照ビーズPS−PEG−NH−Ac(TG−基本又は対照材料)では、TTC形成が4−5倍の増加を示す。PS−PEG−Arg8の場合、最初10−15分にわたって上昇した後、TCCの形成は灌流前のレベルに落ち着く。
生体適合特性は、エキソビボ及びインビボ血液処理(例えば透析)において重要である。前述のマトリックスは、補体系の活性化、凝固系の活性化を全く示さず、使用した対照材料に比べて、エラスターゼを全く放出しない、すなわち、生体適合性が高い。実施例6に示されている全血の高い灌流能と総合すれば、このことは、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスが、全血を含む血液の体外処理に極めて適していることを示している。
エンドトキシンを結合するためのリガンドを構築する官能基(すなわち、アルギニン残基)の幾何学的に確定された特定の配置を見出すことの重要性を示すために、エンドトキシン吸着実験を行った。エンドトキシン結合は、アルギニン(すなわち、正電荷)の量のみに依存するのではなく、所定の幾何学的配置がさらに重要であることが示されている。
ヒト血清(血液、血漿等のヒトの体液の代表として)に、所定量のエンドトキシン(すなわち、3IU/mlと10IU/ml)を添加し、リガンドとして、Arg8配置又はArg4配置の何れかを含有する40mgのPS−PEG−Beadsとともにインキュベートした。前記二種類のビーズ/リガンド配置には、異なる量のアルギニンが含有されている。Arg4は0.72mmol/gを含有しており、Arg8は1.89mmol/gを含有している。Arg8ビーズのアルギニン含量が高いのは、リジンの分岐によって分岐が追加されることによるものである。30分のインキュベーションを行った後、上清血清中のエンドトキシンの遊離(すなわち、表面又はマトリックスに結合していない)濃度を(LAL試験によって)測定する。
親和定数は、あるリガンドが、存在するリガンドの量とは無関係に、トキシンをどの程度強く結合できるかを記載し、特徴付ける。驚くべきことに、Arg8リガンドの親和定数は、Arg4リガンドの親和定数より10倍超(すなわち、12.3倍)高かった。
Claims (46)
- 流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び/又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させて前記流体中の1又は複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、
a)固相支持体と、
b)該固相支持体に結合され且つ各スペーサーに連結された少なくとも1つのスペーサーと、
c)少なくとも1つの官能基を有する少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドと、を備え、前記ポリマーアフィニティーマトリクスが前記物質を選択的に結合することができる、ポリマーアフィニティーマトリックス。 - 前記リガンドが電荷及び/又は疎水性/親水性について前記物質の結合モチーフの三次元構造と相補的である所定の三次元構造を有する、請求項1に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記リガンドが、以下の式で表され、
−X1 n−Ym[X2 i−Z1;X3 j−Z2]1/2(m+1)、(一般式I)
式中、
n=0又は1;
m=2k−1;
k=0ないし10、k=0の場合、X2=X3かつZ1=Z2;
i=0又は1;
J=0又は1、
又は、
−(X1 n−Y1[Y2 m[X2 i−Z1;X3 j−Z2]1/2(m+1))r−X4 p−Z3、(一般式II)
式中、
n=0又は1;
m=2k−1;
k=0ないし10、k=0の場合、X2=X3かつZ1=Z2;
r=1−100;
i=0又は1;
J=0又は1;及び
p=0又は1、
ここで、Z1、Z2及びZ3は、各々が結合ユニットを表しており、それぞれ、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、炭水化物、レクチン、ヌクレオチド、及びそれらの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される有機分子であって、Y、Y1、Y2は、それぞれ、アミノ、ヒロドキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ、及びそれらの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含有する三官能性分岐分子であり、X1、X2、X3は、それぞれ、必要に応じて使用される二官能性間隔付与分子であって、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ、及びそれらの誘導体又はそれらの組み合わせからなる群から選択される2つの官能基を含有する;
及び/又は前記リガンドが環状である、請求項1及び2の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。 - 前記リガンドが1−100個の官能基、好ましくは1−32個の官能基を含む、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 各結合ユニットがアミノ酸であり、少なくともその一部が血液の生理的pH付近で正に帯電している、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記アミノ酸が6.0以上のpKAを有する、請求項5に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記アミノ酸がアルギニン、リジン、ヒスチジン、又はシステイン、好ましくはアルギニンである、請求項6に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記アミノ酸の量又は濃度が0.01−5mmol/gマトリックスである、請求項7に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記アミノ酸の量又は濃度が約0.01、0.1、1、2、3、4又は5mmol/gマトリックスである、請求項8に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- リガンド当たりのアミノ酸分子の数が2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又は16、好ましくは4−8である、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記アミノ酸がアルギニンであり、アルギニンの量又は濃度が3mmol/gマトリックス以下である、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記少なくとも1つの官能基がアミノ基若しくは置換されたアミノ基、カルボキシ基、水酸基、チオール基、グアニジノ基、又はそれらの組み合わせ、好ましくはアミノ基若しくはグアニジノ基である、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記リガンドが、以下の式で示される樹状又は櫛状構造を有し、
一般式I、即ち、−X1 n−Ym[X2 i−Z1;X3 j−Z2]1/2(m+1)を有するリガンドの例、ここで、
−Lysm[Arg](m+1)、すなわち
n=i=j=0;
m=2k−1;
Z1=Z2=Arg;
すべてのY=Lys;
X1、X2、X3は存在しない:
−(Lys[Lysm[Arg](m+1)r−H、すなわち、
n=i=j=p=0;
m=2k−1;
Z1=Z2=Arg;
Z3=H;
すべてのY=Lys;
X1、X2、X3及びX4は、存在しない:
- 前記官能基のうち少なくとも2つの正電荷が、結合すべき物質の結合モチーフ中に存在する各々負に帯電した基、好ましくはエンドトキシン中のリン酸基との各々の距離によって規定される距離だけ、互いに離れている、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記スペーサーが実質的に疎水性又は親水性であり、前記リガンドに対する固着部分の機能を有している、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記スペーサーが、式H−(OCH2CH2)n−OH(式中、nは2−250である)のポリ若しくはオリゴエチレングリコール、又はポリビニルアルコール、ポリビニルアミン、ポリグリシドール、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンオキシド、又はそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項15に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記スペーサーが、直鎖及び/又は分岐状の立体配置であり、400−10000ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)又はそれらの誘導体である、請求項16に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記固相支持体が、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレン若しくはポリアクリレートから製造されるポリマー、水酸基により官能性をもたせたポリメタクリレート、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリールポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリールポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリールポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリールポリスチレン、ポリメタクリレート、架橋されたポリエチレングリコール、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィン共重合体、ガラス又はそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から構成され、好ましくは架橋されたポリスチレンから構成される、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記固相支持体が、ビーズ、膜、粒子、網、織布若しくは不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合うネットワークの形態、好ましくはポリスチレン−PEGビーズの形態を有する、請求項18に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記マトリックスが生体適合性であり、全血の灌流を可能とするのに十分な膨潤能を有する、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーマトリックス。
- 乾燥状態から水和された形態への膨潤能が約1.5−20倍、好ましくは2−6倍である、請求項20に記載のポリマーマトリックス。
- 前記マトリックスが、細菌若しくはウイルス由来の構成成分、エンドトキシン、エキソトキシン、細菌のDNA又はその断片、オリゴヌクレオチド、細胞、特に、内皮細胞、幹細胞、腫瘍細胞、血液細胞、特に、リンパ球、血小板、顆粒球、樹状細胞、単球、プリオン、寄生生物、真菌、過剰投与後の薬物、発熱性食品添加物、糖尿病、肝疾患、尿毒症、腎疾患若しくは炎症によって生じる急性若しくは慢性の代謝的かく乱から得られる産物、ヘパリン、細菌及びウイルス、病原体を有する血液細胞、又はそれらの少なくとも一部若しくは分解産物、DNA、ホスフェート、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ケモカイン、尿毒性トキシン、血液凝固タンパク質、凝固促進タンパク質、炎症若しくは炎症促進タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子、可溶性タンパク質若しくは細胞表面に結合したタンパク質、可溶性接着分子、及びグルコース若しくはグルコースの分解産物、発熱物質、細菌性エキソトキシン、グラム陽性細菌から得られる産物、好ましくはリポタイコ酸、特に細菌性発熱物質、好ましくはエンドトキシン、特にリポ多糖(LPS)のリピドA成分からなる群から選択される少なくとも1つの物質を結合するための三次元の相補的構造を与える、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記マトリックスが約1×102ないし1×106ダルトンのカットオフ値を有し、疎水性物質及び/又は親水性物質をともに結合する、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記物質を除去し又は減少させるべき前記流体が、水性又は有機溶液、体液、好ましくは血液、治療用流体、生命科学に用いるための流体、好ましくは生物学、診断又はバイオテクノロジーに用いるための緩衝溶液、注入液又は透析液、輸液に使用される健康なドナーから得られる血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物などの血液製品、血液代替物、好ましくは酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液及び人工ヘモグロビン溶液、栄養を補給するための流体及び産業で使用するための流体である、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 前記固相支持体が架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーがポリエチレングリコールであり、各結合ユニットがアルギニンである、先行する全請求項の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
- 流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で前記流体から1又は複数の物質を除去し及び/又は前記物質の量又は濃度を減少させる方法であって、前記物質の量又は濃度を減少させ及び/又は前記物質を除去するのに十分な時間、好ましくは最大24時間、請求項1−24の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスに前記流体を接触させることを備えた方法。
- 前記時間が1秒ないし2時間である、請求項26に記載の方法。
- 前記物質がエンドトキシンであり、前記流体が血液であり、除去又は減少された後のエンドトキシンの量又は濃度が血中成分を活性化させることができず、又は血中成分若しくはプロセスの活性化を抑制する量又は濃度である、請求項26及び27の何れか1項に記載の方法。
- 請求項1ないし25の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスを製造する方法であって、
a)固相支持体にスペーサーを付着させて第一の複合体を得る工程と、
b)少なくとも1つの官能基を有する少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か
又は、
c)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
d)前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か
又は、
e)前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と、
f)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は、
g)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
h)少なくとも1つの官能基を有する前記少なくとも1つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
i)グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
k)前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程と、を備え、
結合する物質上の三次元構造、電荷の存在、結合モチーフの疎水性/親水性領域についての情報がX線結晶学、タンパク質配列決定、タンパク質のモデリング又は疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットを含有するリガンドが電荷及び/又は親水性/疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている方法。 - a)とb)の場合、固相支持体を活性化し、固相支持体上にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、該リガンドを前記スペーサー分子に部位特異的に連結させるか、又は
c)とd)の場合、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、スペーサー分子をリガンドに連結させ、固相支持体を活性化し、スペーサー−リガンド複合体を固相支持体に部位特異的に連結させるか、又は
e)とf)の場合、固相支持体を活性化し、活性化された固相支持体にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを支持体に結合されたスペーサー上で固相合成する、工程を備えた、請求項29に記載の方法。 - a)とb)の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結と、活性化されたスペーサーへのリガンドの連結、又は
c)とd)の場合、リガンドの合成と、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサー分子へのリガンドの部位特異的連結と、固相支持体へのスペーサー−リガンド複合体の連結、又は
e)とf)の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結、固相支持体に結合されたスペーサー上でのリガンドの固相合成、という工程を備えた、請求項29に記載の方法。 - 1又は複数の物質、好ましくはエンドトキシンを、流体、好ましくは体液若しくは治療用の流体、最も好ましくは血液若しくは血清から除去するための又は前記流体中の前記物質の量若しくは濃度を減少させるための、請求項1ないし25の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスの使用。
- 活性化が減少した血液又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するための請求項32に記載の使用。
- 体外での血液精製プロセスの一部としての又は血液若しくは任意の体液と身体中、好ましくは血管系、血管若しくは腹腔中で接触させるためのインプラントとしての、請求項33に記載の使用。
- 活性化が減少した血液を製造するための又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するための請求項34に記載の使用。
- 流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で、前記流体から1又は複数の物質を除去し及び/又は前記流体中の前記物質の量又は濃度を減少させるためのキットであって、請求項1ないし25の何れか1項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスを備えた、キット。
- 試料管と、前記流体、好ましくは血液又は血清を体外及び/又は体内処理するための器具と、をさらに備えた請求項36に記載のキット。
- 流体から1又は複数の物質を除去し又は前記流体中に存在する前記物質の量若しくは濃度を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスを製造するためのポリマーマトリックスの使用であって、
特異的なアフィニティーが前記ポリマーマトリックス上に付与される任意のリガンドに依存し、
前記ポリマーマトリックスが固相支持体とスペーサーとを含み、
該固相支持体が、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレン若しくはポリアクリレートから製造されるポリマー、水酸基により官能性をもたせたポリメタクリレート、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリールポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリールポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリールポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリールポリスチレン、ポリメタクリレート、架橋されたポリエチレングリコール、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィン共重合体、ガラス又はそれらの組み合わせからなる群から選択される材料、好ましくは架橋されたポリスチレンから構成され、
前記スペーサーが式H−(OCH2CH2)n−OH(式中、nは2−250である)のポリ又はオリゴエチレングリコールからなる群から選択される、ポリマーマトリックスの使用。 - 前記固相支持体が、ビーズ、ゲル、膜、粒子、網、織布若しくは不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合うネットワークの形態を有する、請求項38に記載の使用。
- 前記スペーサーが、直鎖及び/又は分岐状の立体配置のポリエチレングリコール(PEG)であり、400−10000ダルトンの平均分子量を有し、又はそれらの誘導体である、請求項38又は39に記載の使用。
- 前記ポリマーマトリックスが血漿又は全血の灌流を可能とするのに十分な膨潤能を有する、請求項38ないし40の何れか1項に記載の使用。
- 乾燥状態から水和された形態への膨潤能が約1.5−20倍、好ましくは2−6倍である、請求項41に記載の使用。
- 前記ポリマーマトリックスがゲル型ビーズの形態を有する、請求項38ないし42の何れか1項に記載の使用。
- 前記流体が水性又は有機溶液、体液、好ましくは血液、治療用流体、生命科学に用いるための流体、好ましくは生物学、診断又はバイオテクノロジーに用いるための緩衝溶液、注入液又は透析液、健康なドナーから得られる血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物などの血液製品、好ましくは酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液及び人工ヘモグロビン溶液、栄養を補給するための流体及び産業で使用するための流体である、請求項38ないし43の何れか1項に記載の使用。
- 前記ポリマーマトリックスが約1×102ないし約106ダルトンのカットオフ値を有し、疎水性及び/又は親水性物質を結合する、請求項38ないし44の何れか1項に記載の使用。
- 前記固相支持体が架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーがポリエチレングリコールである、請求項38ないし45の何れか1項に記載の使用。
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