JP3200604B2 - 菌体内毒素誘発作用抑制方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は菌体内毒素により誘発される作用を抑制する
菌体内毒素誘発作用抑制方法に関するものである。

従来技術 非経口用途の薬剤を製造するとき、非常に重要な先行
条件の１つは薬剤に含まれる生成物が非発熱性であるこ
と、すなわち、関連の薬剤の菌体内毒素の濃度が非常に
低く、従来の試験装置（カブトガニ類試験＝LALまたは
ウサギの体温上昇）で非常に小さい生物学的作用のみが
検出され得るかまたは生物学的作用が検出されないこと
である。菌体内毒素はグラム陰性細菌（例えば、イー・
コリ、プロテウスまたはサルモネラ）の外側細胞壁と連
係する高分子複合体であり、グラム陰性細胞からリポ多
糖類（LPS）が放出され得る（菌体内毒素、Ｏ−抗原）
｛リーチエル、イー・テイー氏等著、細菌の菌体内毒素
におけるカブトガニ類属変形細胞溶菌液試験による構
造、生物学的意義および検出、1985年、アラン・アール
・リス社発行、第31〜50頁（Rietschel,E.T.,et al,in
Bacterial Endotoxins:Structure,Biomedical Signific
ance and Test,pages31−50,Alan R.Liss Inc.,198
5）｝。

菌体内毒素は敗血症、成人呼吸障害症候群（ARDS）お
よび直接脈管内凝固（DIC）に存在し且つ敗血症、成人
呼吸障害症候群及び直接脈管内凝固症における臨床的徴
候の原因となる｛ザーレン、ビー氏およびヘツドストラ
ンド、ユー氏著、1989年、ウプサラ大学発行、レプロセ
ントラーレンHSC、第63〜64頁（Zaren,B.and Hedstran
d,U,Intensirvard,pages 63−64,Uppsala Unversity,Re
procentralen HSC,1989）｝。

例えば、敗血症にかかっている患者を抗生物質で治療
した後、患者の体温が上昇するか、または菌体内毒素を
含む死んだ細菌およびその一部分が血液循環に入ること
により、他の熱ピークが発生する。いわゆるヘルクスハ
イメル反応を発生することは良く知られている。

菌体内毒素の作用の臨床的徴候（これらが示され得る
限界がウサギおよび人間の体重のほぼ5EU/キロである）
は薬剤および養分溶液が非経口で投与されるときに時折
観察され得る。例えば、人間およびウサギの場合におい
て、臨床的徴候は中枢神経系の体温調節中枢に影響を及
ぼす内因性発熱を放出するような菌体内毒素の可能性に
よる熱つぽい状態により証明される。他の証明もまた中
枢神経系において観察され得る｛ノーウオートニー、ビ
ー氏著、1971年、自然科学第58巻、第397〜409頁（Nowo
tny,B.,Naturwissenschaft 58,pages 397−409,197
1）｝。例えば、低血圧症のごとき心臓血管の変化およ
び小動物および小静脈の透過性の変化はしばしばグラム
陰性敗血症を引き起こすある重要な器官変化を説明する
ことができる｛ザーレン、ビー氏およびヘツドストラン
ド、ユー氏著、第63〜64頁;1989年、ウプサラ大学発
行、レプロセントラーレンHSC（Zaren,B.and Hedatran
d,U.,Intensivvard,pages63−64,Uppsala University,R
eprocentralen HSC,1989）；ノーウオートニー、ビー氏
著、1971年、自然科学第58巻、第397〜409頁（Nowotny,
B.,Naturwissenschaft58,pages397−409,1971）；ギル
バート、アール・ビー氏著、1960年、生理学レビユー、
第40巻、第245頁（Gilfert,R.P.,Physiol.Rev.40,245,1
960）；ビツク、ジエイ・エー氏著、1964年、エーエム
・ジエイ・フイジツク第200巻、第944頁（Vick,J.A.,A
m.J.Phys.200,944,1964）｝。

今日生体外で適用され得るそれらの脱発熱方法は２つ
の主要な技術、すなわちａ）菌体内毒素の汚染に対して
保護することおよびｂ）調合中に菌体内毒素を除去する
ことに基礎を置いている。

無菌状態は調合過程の全体中かつまた出発材料の調合
中に行うことが必要であるため、第１の方法ａ）を正確
に実施することは困難である。第２の方法ｂ）は種々の
濾過方法の開発を生じ、これらの方法はアスベストフイ
ルタ、イオン交換器の使用を含み、そして活性炭または
硫酸バリウム懸濁液の吸着、ガンマ放射線、菌体内毒素
集合体の100,000ドルトンから0.1ミクロンの範囲にある
排除限界を有する薄膜を通る濾過、変形細胞溶菌液の供
給および形成されたゲルの除去を包含し、かつまた非集
合菌体内毒素を濾過するために10,000ドルトンの排除限
界を有する限外濾過器の使用を伴った。現時点におい
て、主に限外濾過が工業的に適用されており、アスベス
ト濾過を除き他の方法は中止された。２つの脱発熱方
法、すなわち、オートクレーブで処理するのみの方法ま
たは非常に低いpH値と組み合わせる方法はそれらの効率
が低いためかつ製品に損傷が発生するため現在その有用
性が制限されている｛モジエール、エル・デイー氏等
著、1987年、科学及び技術根源ジヤーナル第41巻、第１
号、第21〜25頁（Mosier,L.D.,et al.J.Parent.Sci.and
Technol.,Vol.41,No.1,pages21−25,1987）｝。しかし
ながら、限外濾過方法は、高価な材料および高い作業コ
ストを伴うため、高い製造コストを生じる。更に、使用
される装置は大きな空間を使用しかつ効率が疑わしく、
その結果として排除限界が一定せずかつ菌体内毒素があ
る程度フイルタを通過してしまうことがある。

この点における１つの特別な問題は凝固係数２（プロ
トロンピン）のごとき生物学的活性物質中の菌体内毒素
の分析であるか、またはサンプル材料が非常に制限され
ているが非常に高い生物学的潜在力を有するとき、カブ
トガニ類試験および実験動物両方の使用を除去すること
にある。

ポリミキシンＢの固定化生成物を含有するフイルタを
通るいわゆる血漿搬出およびヘモ灌流が血液通路から菌
体内毒素を除去するために生体内で試験された。

メチルアルギニンは菌体内毒素およびコレラ菌毒素が
効力を生じかつ下痢を起こさせるのに必要であるアデノ
シン二燐酸（ADP）のリボース化（ribosylation）の拮
抗的抑制剤として使用されている｛モス・ジエイ氏、ガ
リツソン・エス氏、オツペンハイマー・エヌ・ジエイ
氏、リチヤードソン・エス・エツチ氏著、1979年、生化
学ジャーナル、第254巻、第14号、第6270〜6272頁（Mos
s.J.,Garrisson,S.,Oppenheimer,N.J.,Richardsson,S.
H.,J.Biol.Chem.,Vol.254,No.14,pages 6270−6272,197
9）｝。

外傷、シヨツクまたは手術により発生される肝臓病の
場合において、とくにＬ−アルギニン、マレイン酸、リ
ンゴ酸、Ｌ−アスパラギン酸、グルコースおよびカルチ
ニンを含有する養分溶液がクエン酸および尿素循環を刺
激する結果として血清中のアンモニアイオン濃度および
フエノール濃度を低減することにより肝臓についての保
護作用を有することがヨーロツパ特許第0059775号明細
書に記載されている。

スウェーデン国特許出願第8009103−６号明細書に
は、コルチコステロイドを、例えばメチルアルギニンま
たはエチルアルギニンのエステルと結合させることによ
り、コルチコステロイドの特異性かつコルチコステロイ
ドの作用を増大し、それにより相乗作用を得る方法が開
示されている。アルギニンエステルはラツトについての
実験において体重の6.3mg/キロまでの量で使用された。

スウェーデン国特許出願第8009102−８号明細書には
菌体内毒素により誘発された肺浮腫に対する薬剤として
アルギニンエステルの使用が提案されている。この臨床
像は前述した成人呼吸障害症候群（ARDS）の状態と非常
に似ている。この出願の特許請求の範囲にはラツトの体
重の0.25mgから100mg/キログラムまでのメチルアルギニ
ンの投与量を列挙している。

発明の開示 本発明は、菌体内毒素誘発作用を治療する薬剤の製造
のために、とくに菌体内毒素誘発の発熱を抑制するため
に、式Ｉ、 （式中、Ｘが２ないし５の整数そしてＡが−NH−（Ｃ＝
NH）−NH₂,−CH−NH₂,または−CO−NH₂を意味する）に
よる化合物またはアグマチンを使用する方法に関するも
のである。

薬剤は好ましくは、10〜800mg/kg体重および時間の量
で経口、静脈内、筋内、皮内または腹腔内に投与され
る。

本発明はまた医薬的に有用な溶液、医薬製剤、血漿ま
たは血液から菌体内毒素を除去する方法に関し、該方法
は式（Ｉ）による固定化合物または固定アグマチンを含
有するベツドを介して医薬的に有用な溶液、医薬製剤、
血漿または血液を濾過することからなっている。

医薬製剤は例えば凝固因子のごとき生物学的に活性の
成分を含有している。

本発明はまた医薬的に有用な溶液、医薬製剤、血漿ま
たは血液から菌体内毒素を除去するために式（Ｉ）によ
る固定化合物を使用するかまたは固定アグマチンを使用
する方法を含み、かつまた式（Ｉ）による固定化合物ま
たは固定アグマチンを含むベツドを介して菌体内毒素を
含有する溶液を通すことからなる菌体内毒素を濃縮する
方法をも包含している。

「アルギニンまたは構造的に関連の物質」は以下にお
いて式（Ｉ）による化合物またはアグマチンを意味して
いる。

本発明の実施例を以下に詳細に説明する。

本発明の化合物を使用する方法は次に多数の試験例に
より例示されているが、これらの例は本発明の範囲を限
定するものではない。

試験例１ 種々のアミノ酸とともにイー・コリからの5ng/mlの菌
体内毒素（25EU/mlの菌棚井毒素に対応する）を３羽の
生きたままのウサギに注入した。ウサギの直腸温度を記
録することにより発熱反応を分析した。温度上昇の合計
を表１に列挙してある。その結果、アルギニンは試験シ
リーズ（表１）に使用された他のアミノ酸から明らかな
ように、動物の温度上昇を生じないことを明瞭に示して
いる。

試験例２ 菌体内毒素の巨丸薬投与量（500EU/キロ体重）で先行
させた８および５羽のウサギに約６時間の間にわたつて
塩化オルニチン溶液（1000mg/kgおよび時間）とアルギ
ニン溶液（1600mg/kgおよび時間）をそれぞれ一定の点
滴で投与するとき、これらの動物の温度発生は、500EU/
キロ体重に対応する菌体内毒素の巨丸薬投与量に加えて
生理塩化ナトリウム溶液、および５％グリコース溶液を
それぞれ約６時間の間にわたつて一定に点滴した２つの
基準グループ（それぞれ６および５羽のウサギ）の温度
発生より著しく低いことが認められた（図１および表２
参照）。

表２ 500EU/kg体重に対応する量で菌体内毒素に続いての20
ml/kg体重に対応するアルギニン、塩化オルニチン、0.9
％塩化ナトリウム溶液および５％グルコース溶液を一定
の点滴で注入した後3.5時間のウサギの体温変化。表に
列挙した平均値は初期温度と熱チヤートとの間の範囲に
関する。

グループ 平均値±SEM ｎ a.アルギニン 1.15±0.35 ８ b.塩化オルニチン 0.58±0.24 ５ c.0.9％NaCl 2.15±0.24 ６ d.5％グルコース 2.22±0.17 ５ a/c ｐ＜0.05 a/d ｐ＜0.05 a/c ｐ＜0.05 b/d ｐ＜0.05 アルギニン−セフアロース（商標）（カビ・フアーマ
シア・フアイン・ケミカルズ社製）の形態の固定アルギ
ニンが生体内および生体外技術により菌体内毒素の結合
可能性をさらに評価する目的で水溶液中の菌体内毒素を
実験的に結合するのに使用された（試験例３および
４）。

試験例３ 少量の化学的に純粋なガラスウールがコラムパツキン
を形成するために６個のパスツールピペツトの各々に挿
入された。その結果として生じたコラムは6M塩酸で３回
洗浄され、その後中和反応を得るために殺菌水および無
水アルコールで洗浄された。コラムは次いで加熱キヤビ
ネツト内で４時間180℃で乾燥された。これらのコラム
の各々に1mlのアルギニン−セフアロース（商標）（カ
ビ・フアーマシア・フアイン・ケミカルズ社製親和力ク
ロマトグラフイ用のゲル）が導入された。コラムは次い
で10の全体容量の殺菌水で洗浄され、その後イー・コリ
からの菌体内毒素2000EUがコラムに導入されかつそれを
通して滴下された。1mlの殺菌水が次いで前記コラムの
各々に導入され、この水はまたコラムを通して滴下され
た。それぞれのコラムを通過した水が集められた（合計
で1.5mlがコラムから集められた、すなわち無効の量を
加えた合計量をカバーするのに十分な量である）。次い
で、40mlの容量を得るためにこの液体に生理塩性溶液
（0.9％塩化ナトリウム溶液）が加えられた。６羽のウ
サギの各々が体重の各キロ当たり10mlでこの混合物を静
脈内に投与されかつウサギの体温が30分毎に直腸に適用
された一定記録アナログ温度プローブにより記録され
た。さらに他の６羽のウサギの各々が体重の各キロ当た
り10mlの生理塩化ナトリウム溶液を静脈内に投与され、
前記塩化ナトリウム溶液は体重のキロ当たり500EU菌体
内毒素と混合された。菌体内毒素は上記したものと同一
のバツチから取られた。温度は上述したのと同一の方法
において測定された。これらの後者のウサギは基準動物
として使用された（図２および表3aおよび3b参照）。菌
体内毒素のカブトガニ類試験は６個のアルギニン−セフ
アロース（商標）コラムを通過したそれらの液体につい
て実施された。６個のベツドまたはコラムすべてからの
溶液は負の結果を示した。すなわち菌体内毒素濃度はこ
の装置に関する検出限界（0.12EU）を超えなかった。

表3a アルギニン−セフアロース（商標）を通過した500EU/
kg体重に対応する菌体内毒素溶液注入に続く3.0時間の
周期にわたるウサギの体温変化。

0.9％塩性溶液を有する菌体内毒素の等価量の溶液が
基準物質として使用された。

表に示された平均値はｎ羽の観察数に関する初期体温
の線と熱チヤートとの間の範囲に関する。

グループ 平均値±SEM ｎ a.アルギニン−セフア ロース（商標） 0.34±0.12 ６ b.基準 2.61±0.24 ６ a/b ｐ＜0.05 表3b アルギニン−セフアロース（商標）を通過した500EU/
kg体重に対応する菌体内毒素溶液注入に続くウサギの直
腸温度の最大上昇。

菌体内毒素の等価量（500EU）が溶解されている生理
塩性溶液が基準物質として使用された。

表はｎ羽の観察数の平均値を示す。

グループ 平均値±SEM ｎ a.アルギニン−セフア ロース（商標） 0.24±0.05 ６ b.基準 1.33±0.06 ６ a/b ｐ＜0.05 試験例４ 別の実験がアルギニン−セフアロース（商標）（カビ
・フアーマシア・フアイン・ケミカルズ社製）の形態の
固定アルギニンに結合された菌体内毒素を収容した５個
のコラムを使用して生体外で実施された。これらのコラ
ムは上述の試験例３にしたがって調製された。コラムは
殺菌水で洗浄され、その後イー・コリから得られた1400
EUの菌体内毒素がコラムを通して滴下された。コラムは
次いで2mlの生理塩性溶液（0.9％）I9Lにより溶離さ
れ、その後溶離物中の菌体内毒素濃度がカブトガニ類試
験により決定された。この試験はそれが認可された方法
｛ヨーロッパ薬学、第2.1.9巻（Ph.Eur.,V.2.1.9）｝で
あるためおよび該方法が溶液中の菌体内毒素の存在を明
らかに示すため選ばれた。活性菌体内毒素の濃度は５個
のすべてのコラムから得られた溶離物において測定され
かつ＞110EU/mlであることが認められた。さらに他の溶
離が2mlの1.8％塩化ナトリウム溶液により実施されかつ
５個のコラムすべてからの溶離物の菌体内毒素濃度が決
定されかつ110〜120EU/mlの範囲内にあることが認めら
れた。

実験は菌体内毒素がコラム中のアルギニン−セフアロ
ース（商標）に結合しかつこれらの結合が塩性溶液（0.
9または1.8％）により溶離することにより破壊され得る
ことを示した。

試験例において開示された実験から明らかなことは以
下の通りである。

表１において試験されたアミノ酸中で、アルギニンは
生体内で菌体内毒素の温度上昇作用を除去する。

一定の点滴の場合において、生体内でアルギニンおよ
びオルニチンが菌体内毒素の温度上昇作用を除去するこ
とができる（表２）。

固定形態におけるのアルギニンが菌体内毒素に対して
親和力を有しかつ生体外で菌体内毒素を有効に結合する
（表3a,3bおよび４参照）。

菌体内毒素はアルギニン−セフアロース（商標）に結
合されかつ溶離される。

アルギニン−セフアロース（商標）での固定化実験が
非常に明瞭に示すように、温度抑制は一般的な菌体内毒
素抑制に合致する。かくして、構造的に関連した物質と
ともに、自由に溶解し得るアルギニンおよびオルニチン
が菌体内毒素シヨツクおよび成人呼吸障害症候群（ARD
S）および直接脈管内凝固症（DIC）の発生によるグラム
陰性敗血症の状態において菌体内毒素を除去するのに使
用され得る。50mg/キログラム体重および時間の投与量
がウサギに効果を生じることが認められた。人間に使用
するには非常に高い投与量、例えば、適切には連続点滴
（10〜800mg/kg/時間）下で、５〜280グラム／日の間の
投与量が要求されている。アルギニン塩酸のネズミに関
してLD₅₀は単一投与量として3.1g/kg体重である。｛ミ
ルネ、エム・デイー氏著、アミノ酸の薬理学。臨床薬理
学および治療学、第９巻、第484〜516頁、1968年（Miln
e,M.D.,Pharmacology of Amino Acids,Clinical Pharma
cology and Therapeutics,Vol.9,pages 484−516,196
8）｝。シヨツク状態はバクテリアそれ自体ではなく、
バクテリアにより発生される菌体内毒素により生じる。
菌体内毒素はバクテリアの除去後も同様に身体の固有の
抗バクテリア系によるかまたは外因的に投与された抗バ
クテリア物質により血液通路中に存在する。高投与量に
おいて静脈中又は経口でアルギニンまたは構造的に関連
した物質との組み合わされた治療および適切な抗生物質
との抗バクテリア治療がかくして明瞭に示された。

上述した状態において、菌体内毒素はまた固定アルギ
ニンまたは構造的に関連した物質を含むフイルタを使用
するヘモ濾過により除去され得る。かかるフイルタはま
た静脈内、筋肉、皮内または腹腔内の使用に向けられた
医薬製剤を製造するために蒸留水から発熱を除去するの
に使用することもでき、かつまた医療製剤それ自体から
除去され得る。固定アルギニンまたは構造的に関連した
物質はまた生物学的に非常に活性であるもの、例えば、
凝固因子２（プロトロンビン）、および因子8,9および1
0のような溶液から量決定のために菌体内毒素を濃縮す
るのに使用可能である。同一の方法は非経口使用に向け
られる溶液から菌体内毒素を除去するのに使用され得
る。

血液透析を受ける尿毒症患者は固定アルギニンまたは
構造的に関連した物質が使用され得る大きな範囲を示
す。これらの患者は、血液透析フイルタを貫通する菌体
内毒素により、菌体内毒素作用を比較的頻繁に受ける。

図面の簡単な説明 図１は本発明の試験例２によるウサギの体温上昇を示
すグラフ図である。

図２は本発明の試験例３によるウサギの体温上昇を示
すグラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サンドバーグ ゴラン スウェーデン国，エス−762 00 リン ボ，ボルクスコ (72)発明者 ワーレン レイモンド スウェーデン国，エス−194 53 ウプ ランド バスビー，ペパルボダバーゲン 37 (72)発明者 ウエストバーグ ボヨーン スウェーデン国，エス−172 65 スパ ンガ，ロトスジョバーゲン 73 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/198 A61K 31/155 A61L 33/00 A61P 31/04 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】菌体内毒素誘発作用を治療するための10〜
   800mg/kg体重および時間の量で点滴され得る薬剤を製造
   するために、式Ｉ、 （式中、Ｘが２ないし５の整数そしてＡが−NH−（Ｃ＝
   NH）−NH₂,−CH−NH₂,または−CO−NH₂を意味する）に
   よる化合物またはアグマチンを使用することを特徴とす
   る化合物またはアグマチンの使用方法。
2. 【請求項２】菌体内毒素誘発熱を減少させるための薬剤
   を製造するのに式（Ｉ）による化合物またはアグマチン
   を使用することを特徴とする化合物またはアグマチンの
   使用方法。
3. 【請求項３】前記薬剤を10〜400mg/kg体重および時間の
   量で投与することを特徴とする特許請求の範囲第１項ま
   たは第２項に記載の化合物またはアグマチンの使用方
   法。
4. 【請求項４】前記薬剤を静脈内、筋内、皮内または腹腔
   内に投与することを特徴とする特許請求の範囲第１項な
   いし第３項のいずれか１項に記載の化合物またはアグマ
   チンの使用方法。
5. 【請求項５】前記薬剤を経口で投与することを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項に記載の化合物またはアグマチ
   ンの使用方法。
6. 【請求項６】医薬的に有用な溶液、医薬製剤、血漿また
   は血液から菌体内毒素を除去する菌体内毒素除去方法に
   おいて、式（Ｉ）による固定化合物または固定アグマチ
   ンを含有するベツドを介して医薬的に有用な溶液、医薬
   製剤、血漿または血液を濾過することからなることを特
   徴とする菌体内毒素除去方法。
7. 【請求項７】前記医薬製剤が生物学的に活性の成分を含
   有することを特徴とする請求の範囲第６項に記載の菌体
   内毒素除去方法。
8. 【請求項８】前記生物学的に活性の成分が凝固因子であ
   ることを特徴とする請求項７に記載の菌体内毒素除去方
   法。
9. 【請求項９】水、医薬的使用の溶液、医薬製剤、血漿ま
   たは血液から菌体内毒素を除去するために式（Ｉ）によ
   る固定化合物または固定アグマチンを使用することを特
   徴とする固定化合物または固定アグマチンの使用方法。
10. 【請求項１０】式（Ｉ）による固定化合物または固定ア
    グマチンを有するコラムを介して水または菌体内毒素を
    含有する溶液を通すことからなることを特徴とする菌体
    内毒素を濃縮する方法。