DE69223426T2 - Verfahren zur entfernung von endotoxinen - Google Patents
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Description
- Bei der Herstellung von Arzneimitteln flir parenterale Verwendung ist eine der wichtigsten Voraussetzungen, daß die in dem Arzneimittel enthaltenen Erzeugnisse nicht-pyrogen sind, d.h. daß die Endotoxin-Konzentration des betreffenden Arzneimittels so gering ist, daß nur sehr geringfligige biologische Wirkungen oder keine biologischen Wirkungen mit herkömmlichen Testsystemen nachgewiesen werden können (Limulustest = LAL oder Temperaturerhöhung bei Kaninchen). Endotoxine sind hochmolekulare Komplexe, die mit der äußeren Zellwand von Gram-negativen Bakterien (z.B. E. coli, Proteus oder Salmonella) assoziiert sind, von denen Lipopolysaccharide (LPS) freigesetzt werden können (Endotoxine, O-Antigene) (Rietschel, E.T., et al., in Bacterial Endotoxins: Structure, Biomedical Significance and Detection with Limulus Amebocyte Lysate Test, S.31-50, Alan R. Liss Inc., 1985).
- Endotoxine liegen vor bei und sind oftmals die Ursache von den klinischen Symptomen bei Sepsis und in ARDS und DIC (Schocklunge bzw. direkte intravaskuläre Koagulation) (Zaren, B. und Hedstrand, U., Intensivvård, Seiten 63-64, Uppsala University, Reprocentralen HSC, 1989).
- In Folge einer Behandlung von Patienten, die z.B. an Septikämie litten, mit Antibiotika ist es wohlbekannt, daß die Temperatur des Patienten ansteigen oder daß ein weiterer Fieber-Peak, die sogenannte Jarisch-Herxheimer-Reaktion, auftreten wird, womit tote Bakterien und Teile davon, einschließlich Endotoxine, in den Blutkreislauf eintreten.
- Klinische Anzeichen der Wirkung von Endotoxinen (der Grenzwert, bei dem diese nachgewiesen werden können, liegt bei ungefähr 5 EU pro Kilogramm Korpergewicht bei Kaninchen und Menschen) können manchmal beobachtet werden, wenn Arzneimittel und Nährstofflösungen parenteral verabreicht werden. Im Falle von Menschen und Kaninchen beispielsweise manifestieren sich die klinischen Anzeichen in einem fieberigen Zustand aufgrund der Fähigkeit der Endotoxine, endogene Pyrogene freizusetzen, die das thermoregulatorische Zentrum im Zentralnervensystem beeinflussen. Andere Manifestationen können gleichfalls im Zentralnervensystem beobachtet werden (Nowotny, B., Naturwissenschaft 58, Seiten 397-409, 1971). Kardiovaskuläre Veränderungen, wie beispielsweise Hypotonie und Permeabilitätsveränderungen in Arteriolen und Venolen, können bestimmte bedeutende Organveränderungen erklären, die oftmals bei Gram-negativer Sepsis auftreten (Zaren, B. und Hedstrand, U., Intensivvård, Seiten 63-64, Uppsala University, Reprocentralen HSC, 1989; Nowotny, B., Naturwissenschaft 58, S. 397-409, 1971; Gilbert, R.P., Physiol. Rev. 40, 245, 1960; Vick, J.A., Am. J. Phys. 200, 944, 1964).
- Jene Entpyrogenisierungsverfahren, die in vitro heute angewendet werden können, beruhen auf zwei hauptsächlichen Techniken, nämuch a) Schutzmaßnahmen gegen eine Kontamination durch Endotoxine zu treffen und b) Endotoxine während der Formulierung zu entfernen.
- Es ist schwierig, das erste Verfahren a) strikt auszuführen, da es erforderlich ist, daß aseptische Bedingungen während des gesamten Formulierungsverfahrens und auch während der Herstellung der Ausgangsmaterialien herrschen. Das zweite Verfahren b) führte zur Entwicklung von verschiedenen Filtrierverfahren, wobei diese Verfahren die Verwendung von Asbest-Filtern, Ionenaustauschern umfassen und an diesen Verfahren Adsorption an Aktivkohle oder an Bariumsulfat-Suspensionen, γ-Bestrahlung, Filtration von Endotoxin-Aggregaten durch Membranen mit einer Ausschlußgrenze von 100000 Dalton bis 0,1 µm, die Hinzufügung von Arnöbocytenlysat und die Entfernung des gebildeten Gels, und auch die Verwendung von Ultrafiltern mit einer Ausschlußgrenze von 10000 Dalton zum Herausfiltrieren von nicht-aggregierten Endotoxinen beteiligt sind. Gegenwärtig wird hauptsächlich Ultrafiltration industriell angewendet, wohingegen die anderen Verfahren mit Ausnahme von Asbest- Filtration aufgegeben worden sind. Zwei Entpyrogenisierungsverfahren, nämlich Autoklavieren allein oder in Kombination mit extrem niedrigen pH-Werten, haben derzeit nur begrenzten Wert aufgrund ihrer geringen Effizienz und aufgrund des Schadens, der den Produkten zugefügt wird (Mosier, L.D., et al., J. Parent. Sci. and Technol., Band 41, Nr.1, Seiten 21-25, 1987). Das Ultrafiltrationsverfahren führt jedoch zu hohen Produktionskosten aufgrund des daran beteiligten teuren Materials und der damit verbundenen hohen Betriebskosten. Darüberhinaus haben die verwendeten Ausrüstungsgegenstände oftmals einen überaus hohen Platzbedarf und sind oftmals von zweifelhafter Effizienz, was zu schwankenden Ausschlußgrenzen führt und es Endotoxinen ermöglicht, in einem gewissen Ausmaß durch die Filter hindurchzutreten.
- Ein besonderes Problem ist in diesem Zusammenhang der Nachweis von Endotoxinen in biologisch aktiven Substanzen, wie beispielsweise Koagulationsfaktor 2 (Prothrombin), oder wenn das Probenmaterial sehr begrenzt ist, aber eine sehr hohe biologische Wirksamkeit aufweist, was den Einsatz sowohl des Limulustests als auch von Versuchstieren ausschließt.
- Eine sogenannte Plasmapherese und Hämoperfusion durch Filter, die ein immobilisiertes Produkt von Polymyxin B enthalten, sind in vivo zum Zwecke einer Entfernung von Endotoxinen aus der Blutbahn getestet worden.
- Die Europäische Patentschrift Nr. EP-A-0333474 betrifft die selektive Entfernung von Endotoxinen aus durch Endotoxine kontaminierten wäßrigen Lösungen für eine Injektion oder parenterale Verabreichung, die speziell physiologisch aktive Substanzen mit hoher relativer Molekülmasse (wertvolle Proteine) enthalten. Die Lösung wird mit einem Adsorptionsmittel in Kontakt gebracht, das das Protein spezifisch adsorbieren kann. Das immobilisierte Protein wird mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine Aminoverbindung, z.B. Arginin, enthält, um die Endotoxine selektiv zu entfernen, während das Protein von dem Adsorptionsmittel eluiert wird.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entfernen von Endotoxinen aus Wasser, pharmazeutisch nützlichen Lösungen, pharmazeutischen Präparaten, Plasma oder Blut, wobei das Verfahren umfaßt, das Wasser, die pharmazeutisch nützlichen Lösungen, pharmazeutischen Präparate, das Plasma oder Blut durch ein Bett zu filtrieren, das eine immobilisierte Verbindung entsprechend Formel (I)
- enthält,
- in welcher X eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist und
- A -NH -C(=NH) - NH&sub2; oder - CH&sub2; - NH&sub2; bedeutet.
- Das pharmazeutische Präparat kann einen biologisch aktiven Bestandteil, wie beispielsweise einen Gerinnungsfaktor, enthalten.
- Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung einer immobilisierten Verbindung entsprechend Formel (I) zum Entfernen von Endotoxinen aus Wasser, pharmazeutisch nützlichen Lösungen, pharmazeutischen Präparaten, Plasma oder Blut und auch ein Verfahren zum Anreichern von Endotoxinen, wobei das Verfahren umfaßt, Endotoxine enthaltendes Wasser oder eine Endotoxine enthaltende Lösung durch ein Bett zu leiten, das eine immobilisierte Verbindung entsprechend Formel (I) enthält.
- Durch "Arginin oder strukturell vervwandte Substanzen" sind im Folgenden Verbindungen entsprechend Formel (I) gemeint.
- Andere Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich.
- Die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird jetzt mittels einer Zahl von Testbeispielen erläutert.
- Immobilisiertes Arginin in Form von Arginin-Sepharose (Kabi Pharmacia Fine Chemicals) wurde experimentell eingesetzt, um Endotoxine in wäßriger Lösung zu binden, mit der Absicht, die Bindungsfahigkeit der Endotoxine mit Hilfe von in vivo- und in vitro Techniken weiter auszuwerten. Testbeispiele 1 und 2.
- In sechs Pasteur-Pipetten wurde jeweils eine geringe Menge chemisch reine Glaswolle eingeführt, um eine Säulenfüllung zu bilden. Die resultierenden Säulen wurden dreimal mit 6 M Salzsäure und dann mit sterilisiertem Wasser und absolutem Alkohol gewaschen, um eine neutrale Reaktion zu erhalten. Die Säulen wurden dann bei 180ºC 4 h in einem Wärmeschrank getrocknet. 1 ml Arginin-Sepharose (Gel für die Affinitätschromatographie von Kabi Pharmacia Fine Chemicals) wurde zu jeder dieser Säulen gegeben. Die Säulen wurden dann mit 10 Gesamtvolumen sterilisiertem Wasser gewaschen, wonach 2000 EU Endotoxine aus E. coli auf die Säulen gegeben wurden und man diese hindurchtropfen ließ. 1 ml sterihsiertes Wasser wurde dann auf jede der Säulen aufgegeben, wobei man dieses Wasser gleichfalls durch die Säulen tropfen ließ. Das Wasser, das durch die jeweiligen Säulen hindurchgelaufen war, wurde gesammelt (insgesamt wurden 1,5 ml von den Säulen gesammelt, d.h. eine ausreichende Menge, um das Gesamtvolumen plus dem Porenvolumen zu umfassen). Physiologische Kochsalzlt sung (0,9%-ige Natriumchloridlösung) wurde dann dieser Lösung zugesetzt, um ein Volumen von 40 ml zu erhalten. Sechs Kaninchen wurden intravenös jeweils 10 ml dieser Mischung pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht und die Temperatur der Kaninchen alle dreißig Minuten mittels einer rektal eingeführten analogen Permanentaufzeichnungstemperatursonde aufgezeichnet. Sechs weiteren Kaninchen wurden intravenös je 10 ml einer physiologischen Natriumchloridlösung pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht, wobei der Natriumchloridlösung 500 EU Endotoxin pro Kilogramm Körpergewicht beigemischt war. Das Endotoxin wurde von derselben Charge, wie vorstehend erwähnt, entnommen. Es wurde die Temperatur auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Die letztgenannten Kaninchen wurden als Vergleichstiere verwendet (siehe Figur 1 und Tabellen 1a und 1b). Es wurde ein Limulustest für Endotoxine an jenen Flüssigkeiten ausgeführt, die durch die sechs Arginin-Sepharose -Säulen hindurchgelaufen waren. Die Lösung von allen sechs Betten oder Säulen zeigte ein negatives Ergebnis, d.h. die Endotoxin- Konzentration überstieg nicht die Nachweisgrenze für dieses System (0,12 EU).
- Temperaturveränderung bei Kaninchen über einen Zeitraum von 3,0 h nach Injektion einer Endotoxin-Lösung entsprechend 500 EU/kg Körpergewicht, die durch ein Arginin-Sepharose -Bett hindurchgelaufen war
- Eine Lösung einer äquivalenten Menge an Endotoxinen mit einer 0,9%-igen Kochsalzlösung wurde als Referenzsubstanz verwendet.
- Der in der Tabelle angegebene Mittelwert bezieht sich auf die Fläche zwischen der Kurve der Anfangstemperatur und der Fieberskala für n Beobachtungen
- Maximaler Anstieg der rektalen Temperatur von Kaninchen nach Injektion einer Endotoxin- Lösung entsprechend 500 EU/kg Körpergewicht, die durch ein Arginin-Sepharose -Bett hindurchgelaufen war
- Physiologische Kochsalzlösung, in der eine äquivalente Menge an Endotoxinen (500 EU) gelöst worden war, wurde als Referenzsubstanz verwendet.
- Die Tabelle zeigt den Miffelwert von n Beobachtungen.
- Es wurde in vitro ein getrenntes Experiment ausgeführt, indem fünf verschiedene Säulen verwendet wurden, die Endotoxine gebunden an immobilisiertes Arginin in Form von Arginin- Sepharose (Kabi Pharmacia Fine Chemicals) enthielten. Diese Säulen wurden entsprechend dem vorstehend beschriebenen Beispiel 1 hergestellt. Die Säulen wurden mit sterilisiertem Wasser gewaschen, wonach man 1400 EU Endotoxine, erhalten aus E. coli, durch die Säulen tropfen ließ. Die Säulen wurden dann mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung (0,9%) eluiert, wonach die Konzentration an Endotoxinen im Eluat mittels eines Limulustests bestimmt wurde. Dieser Test wurde gewählt, da es ein akzeptiertes Verfahren ist (Ph. Eur., V. 2.1.9) und da das Verfahren die Gegenwart von Endotoxinen in der Lösung deutlich anzeigt. Die Konzentration an aktiven Endotoxinen wurde in dem Eluat, das von allen fünf Säulen erhalten wurde, gemessen und zu> 110 EU/ml ermittelt. Es wurde eine weitere Elution mit 2 ml einer 1,8 %-igen Natriumchloridlösung ausgeführt und die Endotoxin-Konzentration des Eluats aus allen fünf Säulen bestimmt, und es wurde ermittelt, daß sie im Bereich von 110 - 220 EU/ml lag.
- Das Experiment zeigte, daß Endotoxine an die Arginin-Sepharose in der Säule banden und daß diese Bindungen durch Eluieren mit einer Kochsalzlösung (0,9 oder 1,8%-ig) aufgelöst werden konnten.
- Aus den in den Test-Beispielen angegebenen Experimenten ist ersichtlich, daß
- - Arginin in einer immobilisierten Form in vitro eine Affinität zu Endotoxinen hat und diese effektiv bindet (siehe Tabellen 1a und 1b);
- - Endotoxine an Arginin-Sepharose gebunden werden und davon eluiert werden können.
- Die Temperaturinhibition entspricht einer allgemeinen Endotoxininhibition, wie das Immobilisierungsexperiment mit Arginin-Sepharose sehr deutlich zeigt.
- Unter den vorstehend angegebenen Bedingungen können Endotoxine auch durch Hämoflitration unter Verwendung eines Filters, der immobilisiertes Arginin oder strukturell verwandte Substanzen enthält, entfernt werden. Derartige Filter können auch verwendet werden, um Pyrogene aus destilliertem Wasser bei der Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, die für intravenöse, intramuskuläre, intrakutane oder intraperitoneale Anwendung bestimmt sind, zu entfernen, und Pyrogene können auch aus den pharmazeutischen Präparaten selbst entfernt werden. Immobilisiertes Arginin oder strukturell verwandte Substanzen können auch verwendet werden, um Endotoxine für eine weitere quantitative Bestimmung aus Lösungen anzureichern, wie solchen, die biologisch hochaktiv sind, beispielsweise Koagulationsfaktor 2 (Prothrombin) und die Faktoren 8, 9 und 10. Das gleiche Verfahren kann auch verwendet werden, um Endotoxine aus Lösungen zu entfernen, die für parenterale Anwendung bestimmt sind.
- Urämie-Patienten, die sich einer Hämodialyse unterziehen, stellen einen großen Bereich dar, in dem immobilisiertes Arginin oder strukturell verwandte Substanzen verwendet werden können. Diese Patienten leiden relativ oft unter Endotoxin-Wirkungen aufgrund von Endotoxinen, die die Dialysefilter durchdringen.
Claims (5)
1. Verfahren zum Entfernen von Endotoxinen aus Wasser,
pharmazeutisch geeigneten Lösungen, pharmazeutischen Zubereitungen,
Plasma oder Blut,
gekennzeichnet durch Filtrieren des Wassers der pharmazeutisch
geeigneten Lösungen, pharmazeutischen Zubereitungen, von Plasma
oder Blut durch ein Bett, enhaltend eine immobilisierten
Verbindung der Formel (I)
in der x eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist und A -NH-C(= NH)-NH&sub2;
oder -CH&sub2; -NH&sub2; bedeutet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutischen Zubereitungen
eine biologisch aktive Komponente enthalten.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Komponente
ein Koagulationsfaktor ist.
4. Verwendung einer immobilisierten Verbindung der Formel (I),
zur Entfernung von
Endotoxinen aus Wasser, Lösungen zur pharmazeutischen
Verwendung, pharmazeutischen Zubereitungen, Plasma oder Blut.
5. Verfahren zur Anreichung von Endotoxinen,
dadurch gekennzeichnet, daß man Wasser oder eine
pharmazeutische Lösung, enthaltend Endotoxine, durch eine Säule leitet mit
einer immobilisierten Verbindung der Formel (I).
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