JP2020517329A - 生体液から細菌毒素を除去するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
敗血症は、体の免疫系及び凝固系により引き起こされる臨床症候群である。敗血症性ショックは、適切な輸液にもかかわらず低い血圧及び臓器の機能障害又は不全を特徴とする致命的な症状である。全年齢の人々において、敗血症は重要な死因である(Perner et al, 2017)。
国際公開公報第2010038220号には、単量体、樹状構造及び多重抗原ペプチド(MAP)形態、特に以下の化合物Aの形態で提供される抗菌ペプチド配列KKIRVRLSA(M33)並びにその機能的類似体RRIRVRLSA、KRIRVRLSA及びRKIRVRLSAが開示されており、LPSを中和するM33の能力が開示されている。上記に列挙されている国際公開公報第2010038220号の4つの抗菌ペプチド配列では、全てのアミノ酸がL型である。
驚くべきことに、本発明者らは、C末端を介してM33を固体支持体に共有結合した場合、特に、以下の化合物A又は化合物Bのいずれかとの共有結合の形成によりこのような構造に結合した場合、生体液のタンパク質含有量を変化させずに生体液からのLPSの選択的除去が可能になることを決定した。
(式中、
R1−、R2−、R3−、R4−、R5−、R6−、R7−及びR8−は同じもの又は異なるものであり得、KKIRVRLSA−、RRIRVRLSA−、KRIRVRLSA−及びRKIRVRLSA−から選択され;
X1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7は同じもの又は異なるものであり、少なくとも二官能性残基であり;
n、m、p、q、t、v及びwは同じもの又は異なるものであり得、ゼロ又は1であり得、m、n、p及びqの少なくとも1つは1であり、ただし、tがゼロである場合、n及びmはゼロであり、p及びqの少なくとも1つは1であり、vがゼロである場合、p及びqはゼロであり、m及びnの少なくとも1つは1であり、wがゼロである場合、vはゼロであり、m及びnの少なくとも1つは1であり;
Yは、結合又はスペーサーである)のラジカルである。
NovaSyn TG樹脂(0.24mmol/g)(Novabiochem)100mg上で、化合物Aを合成した。
Syroマルチペプチド合成機(MultiSynTech, Witten, Germany)を用いた標準Fmoc化学による固相合成により、化合物Bを生産した。Fmoc−NH−Cys(Trt)−COOHをC末端の1番目のアミノ酸としてTentaGel S RAM樹脂上でこのペプチドを合成し、第2のカップリング工程でFmoc−NH−PEG(4)−CH2−CH2−COOHを追加し、次いで、Fmoc−Lys(Fmoc)−OHを2回追加して四量体コアを構築した。続いて、Fmocアミノ酸を9回連続で追加して、ペプチドKKIRVRLSAを完成させた。側鎖保護基は、Rの場合には2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニルであり、Kの場合にはt−ブトキシカルボニルであり、Sの場合にはt−ブチルであった。固体支持体から最終生成物を切断し、トリイソプロピルシラン、水を含有するTFA(95/2.5/2.5)による処理により脱保護し、ジエチルエーテルで沈殿させた。40分間で75%から65%Aへの直線勾配(Aは0.1%TFA/水であり、Bはアセトニトリルである)の分取カラム(XBridge peptide BEH C18 Waters)による逆相クロマトグラフィーにより、粗ペプチドを精製した(rt=22分)。上記と同じ勾配のPhenomenex Jupiter C18分析カラム(300A°、5μm、250×4.6mm)による逆相クロマトグラフィーにより、及び質量分析MALDI TOF/TOF(Ultraflex III Bruker Daltonics)により、最終ペプチド純度及び同一性を確認した(M+:実測値7723,5;計算値7724,1)。
図2に示されているように、スルフヒドリルを介して、化合物BをSulfolink(商標)樹脂(これは、架橋アガロース樹脂である)に結合した。
実施例3の化合物Bロード樹脂2mlを含む5mlカラム(5mlカラム、直径1cm、樹脂体積2ml)を使用した。E. coli O111:B4由来のLPS(Sigma, St. Louis, MO)を含有するヒト血清(5ng/ml)2mlをカートリッジに入れて、一定の振盪下で樹脂と共に室温で2時間インキュベーションした。次いで、サンプルを収集し、材料及び方法に記載されているように、Limulus Amebocyte Lysate (LAL)試験により、LPS量について測定した。
実施例1の化合物Aロード樹脂1mlを5mlカラム(5mlカラム、直径1cm)にロードした。実施例4に記載されているのと同じ手順を使用して、図5に記載されているようにそれを決定した。化合物Aロード樹脂は74%超のE.coli由来LPSを除去することができたのに対して、非ロード樹脂はLPSの43%を除去した。
実施例3の化合物Bロード樹脂2mlを含む5mlカラム(5mlカラム、直径1cm、樹脂体積2ml)を使用した。S. aureus由来のLTA(MyBiosource, San Diego, CA, US)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液(500pg/ml)1mlをカートリッジに入れて、一定の振盪下で樹脂と共に室温で2時間インキュベーションした。次いで、サンプルを収集し、材料及び方法に記載されているように、ヒトLTA(リポタイコ酸)ELISAキットにより、LTA量について測定した。
LAL試験によるLPSの測定
遊離LPSの存在のインジケーターであるLAL発色エンドトキシン定量キット(ThermoFisher Scientific, Waltham, US)を使用して、LPS除去の分析を実施した。
その趣旨で市販のキットを使用することにより、サンプルのLTA含有量を容易に決定することができる。このようなキットの一例は、Antibody Research Corporation (St.Charles, Missouri) LTA ELISAキットである。リポタイコ酸抗体でプレコーティングしたマイクロプレートウェルにサンプルを追加する。インキュベーション及び洗浄後、ビオチンで標識したリポタイコ酸検出抗体を追加する。適切なインキュベーション後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートを追加し、続いて、インキュベーションし、洗浄して非複合化酵素を除去する。発色性3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)溶液の追加後、サンプルを5分間インキュベーションする。硫酸溶液の追加により、HRP酵素反応を停止する。発色の強度は、サンプル中に存在するリポタイコ酸の濃度に比例し、プレートリーダーを使用して450nMで読み取る。標準曲線の吸光度値を補間することにより、サンプル中のリポタイコ酸の濃度を決定する。
化合物A又はBロード樹脂への通過の前後に、製作者の指示にしたがって、臨床デバイスCapillarys (4.51ソフトウェア; Sebia)により、ヒト血清を分析した。機器は、サンプル中に存在するタンパク質の量をg/L単位で提供し、曲線上面積から計算した相対含有量により、電気泳動曲線のプロファイルも示した。
Claims (15)
- LPS及びLTAのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための方法であって、前記生体液を、KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA及びRKIRVRLSAのリストから選択されるペプチドであって、場合によりリンカーの介在を伴って、そのC末端を介して固体支持体に共有結合されたペプチドと接触させることを含み、前記リンカーの介在を伴うことにより、リンカー−ペプチド部分を形成し、前記ペプチドの全てのアミノ酸がL型又はD型のいずれかである、方法。
- 前記ペプチド−リンカー部分が以下の式
(式中、
R1−、R2−、R3−、R4−、R5−、R6−、R7−及びR8−は同じもの又は異なるものであり得、KKIRVRLSA−、RRIRVRLSA−、KRIRVRLSA−及びRKIRVRLSA−から選択され;
X1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7は同じもの又は異なるものであり、少なくとも二官能性残基であり;
n、m、p、q、t、v及びwは同じもの又は異なるものであり得、ゼロ又は1であり得、m、n、p及びqの少なくとも1つは1であり、ただし、tがゼロである場合、n及びmはゼロであり、p及びqの少なくとも1つは1であり、vがゼロである場合、p及びqはゼロであり、m及びnの少なくとも1つは1であり、wがゼロである場合、vはゼロであり、m及びnの少なくとも1つは1であり;
Yは、結合又はスペーサーである)のラジカルである、請求項1に記載の方法。 - X1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7が同じもの又は異なるものであり、少なくとも2つの官能性アミノ基をそれぞれ含む、請求項2に記載の方法。
- X1、X2、X3、X4、X5、X6及びX7が同じもの又は異なるものであり、リジン残基、オルニチン残基、ノルリジン残基、アミノアラニン残基及びジアミノプロピオン酸残基から選択される、請求項3に記載の方法。
- R1−、R2−、R3−、R4−、R5−、R6−、R7−及びR8−の少なくとも1つがKKIRVRLSA−である、請求項2〜4に記載の方法。
- Yがアミノ酸残基又はペプチドである、請求項2〜5に記載の方法。
- Yが、β−アラニン残基、N−(PEG)y−CH2−CH2−C(O)−残基(1≦y≦11)、システイン残基及びこのような残基を含むペプチドのリストから選択される、請求項6に記載の方法。
- wがゼロであり、vがゼロであり、tが1であり、mが1であり、nが1である、請求項2〜7に記載の方法。
- X1、X2及びX5がそれぞれリジン残基である、請求項8に記載の方法。
- R1−、R2−、R3−及びR4−の少なくとも1つがKKIRVRLSA−である、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記固体支持体が、架橋アガロース樹脂及び架橋ヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールとの複合樹脂のリストから選択される、請求項1〜10に記載の方法。
- 固体支持体であって、場合によりリンカーの介在を伴って、KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA及びRKIRVRLSAのリストから選択されるペプチドのC末端に共有結合され、それにより、ペプチド−リンカー部分が形成される、固体支持体。
- 前記ペプチド−リンカー部分が請求項2〜11で定義されるとおりである、請求項12に記載の固体支持体。
- LPS及びLTAのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための医療器具、例えば、請求項12又は13に記載の固体支持体を含む医療器具。
- LPS及びLTAから選択される細菌毒素を生体液から除去するための、請求項12又は13に記載の固体支持体を含む医療器具の使用。
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