JP2012504597A - 抗菌適用のためのペプチド配列、それらの分岐形態、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
多剤耐性細菌の増大する緊急事態は、抗生物質が臨床において広く使用されるそれらの国々の大半における世界的な懸念である。多くの病原菌(黄色ブドウ球菌、結核菌、一部の腸球菌、緑膿菌、及び多くの他のグラム陰性菌など)が、大半の従来の抗生物質に対して、ならびに新世代の抗生物質に対して耐性を発生している(Wenzel and Edmond 2000)。従って、新たな抗生物質を開発することがますます重要になっている。この要求のため、研究者のコミュニティー及び製薬会社が新たな抗菌薬剤を考えることが急務となる。抗菌ペプチドが、一般的に耐性細菌の選択を起こす従来の抗生物質に対する最良の代用物の1つであると考えられる(Hancock and Sahl 2006)。大半の抗菌ペプチドが、動物(ヒト、植物、及び真菌を含む)の先天免疫の成分である(Zasloff, 2002)。それらは、通常、6〜50のアミノ酸残基からなり、正味の正電荷を有する。カチオン性ペプチドが、選択的に、アニオン性細菌膜と、及び他の負電荷を帯びた構造(例えばLPS及びDNAなど)と相互作用する。真核生物膜が、それらの外層において、通常、細菌膜より低く、異なって負電荷を帯びており、それらは、また、コレステロール分子により安定化される。これらの違いは、カチオン性ペプチドの特異性の基礎である。カチオン性抗菌ペプチドの作用機構は、結果的に、細菌膜に対するそれらの特異的結合に起因し、それによって細胞浸透及び、一部の場合において、代謝経路阻害が惹起される。
本発明の対象は、ペプチド配列KKIRVRLSA、配列番号1、M33、RRIRVRLSA、配列番号2、M34、KRIRVRLSA、配列番号3、M35、RKIRVRLSA、配列番号4、M36であって、単量体構造又はデンドリマー構造で、好ましくは以下の一般式:
(式中、Rは、M33、M34、M35、及びM36の群において選ばれる配列を伴う単量体ペプチドであり(全てのRが、1つのMAP分子において同じ配列である)、Xは三官能性分子であり、ZはX又は以下の化学基:
(式中、R及びXは上に定義される)としての三官能性分子である)
に従う多抗原性ペプチド(MAP)形態で合成される。
(式中、Rは、請求項1において主張されるペプチドであり;Xは三官能性分子であり;m=0又は1;n=0又は1;m及びnが0の場合、ペプチドは二量体であり;m=1及びn=0の場合、ペプチドは四量体であり、m=1及びn=1の場合、ペプチドは八量体である)を有する多抗原性ペプチド(MAP)の形態である。
ペプチド合成
単量体ペプチドを、自動シンセサイザー(MultiSynTech, Witten, Germany)により、Rink Amide MBHA樹脂(Nova Biochem)上で、9フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学及びO−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/1,3ジイソプロピルエチルアミン活性化を使用してペプチドアミドとして合成した。分岐ペプチド分子(MAP)をFmoc4−Lys2−Lys−βAla Wang樹脂上で合成した。側鎖保護基は、Glnについてはトリチル、Lysについてはtert−ブトキシカルボニル、Argについて2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル、及びSerについてtert−ブチルエーテルであった。ペプチドを次に樹脂から切断し、水及びトリイソプロピルシランを含むトリフルオロ酢酸(95/2.5/2.5)を用いて脱保護した。粗ペプチドを、逆相クロマトグラフィーにより、Vydac C18コラム上で精製した。最終産物の同一性及び純度を、Ettan(商標)MALDI-TOFマススペクトロメトリー(MS)(Amersham Biosciences)により確認した。
合計10μlの10mMペプチド溶液を、37℃で、10μlのヒト血清とインキュベートした。サンプルを24時間のインキュベーション後に回収し、150μlメタノールを用いて沈殿し、2分間にわたり10,000×gで遠心した。粗溶液を次に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及びMSにより分析した。HPLCをVydac C18カラムを用いて実施し、粗溶液を注入前に0.1%トリフルオロ酢酸を用いて5倍希釈し、280nmでモニターした。
大腸菌TG1株の単一コロニーを2×TY培地中で0.2OD600まで培養した。図1に表わす通りに希釈した25μlのペプチド及び先の培養に由来する25μlの大腸菌を、96ウェルプレート中で75分間にわたり37℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。コントロールとして、本発明者らは、25μlの大腸菌及び25μlの培地だけ(100%生存率)を用いてインキュベートした1つのウェルを使用した。インキュベーション後、全てのウェルの溶液を1:1000希釈し、寒天2×TYプレート上にプレーティングした。プレートを一晩30℃でインキュベートした。次の日、プレート上に増殖したコロニー(CFU/ml)をカウントした。
最小阻止濃度(MIC)を、臨床研究所規格委員会(NCCLS)により推奨される標準的な微量希釈アッセイにより、カチオン添加ミューラー・ヒントン(MH)ブロス(Oxoid Ltd. Basingstoke, UK)及び5×104CFU/ウェルの細菌接種材料を最終容積100μl中で使用して決定した。結果を、37℃で24時間のインキュベーション後に目視検査により記録した。
aテストされた株は(示した)参照株又は臨床分離株(大半がMDR表現型を示している)のいずれかを含んだ;関連する耐性形質及び耐性機構が示される:_FQr、フルオロキノロンに耐性;AGr、アミノグリコシド(ゲンタマイシン、アミカシン、及び/又はトブラマイシン)に耐性;ESCr、広域スペクトルのセファロスポリンに耐性;NEMr、カルバペネム(イミペネム及び/又はメロペネム)に耐性、ERTr、エルタペネムに耐性;COLNS、コリスチンに非感受性;ESBL、広域スペクトルのβラクタマーゼ;MBL、メタロ−β−ラクタマーゼ;OXA、オキサシリナーゼ;MR、メチシリン耐性;VANi、バンコマイシン中間体
b嚢胞性線維症患者からの臨床分離株
cムコイド表現型
新鮮ヒト赤血球の溶血を、Parpartの方法(以下にまとめる)を使用して決定した。較正曲線を、種々の濃度のNaClを伴うリン酸緩衝液(pH7.4、110mMリン酸ナトリウム)中に新鮮ヒト赤血球を浮遊させ、室温で30分間インキュベートすることにより構築した。サンプルを500×gで5分間遠心し、ヘモグロビン放出を、540nmで上清の吸光度を測定することによりモニターした。0.1% NaClを用いて得られた吸光度は100%溶解に、1% NaClを用いた吸光度は0%溶解に対応する。PBS中に溶解されたペプチドを、いくつかの濃度でヒト赤血球溶液に加えた。結果として得られた浮遊液を別々に37℃で2時間及び24時間にわたりインキュベートした。ヘモグロビンの放出を、遠心後に540nmで上清の吸光度を測定することによりモニターし、溶血パーセンテージを、較正曲線を使用して算出した。非常に重要な特性は、今までに記載された大半の抗菌ペプチドに反して、M33、M34、M35、及びM36ペプチドが実際的には無視できる溶血悪性度を示し(図2)、全身投与を通じたそれらの可能な使用も示唆する。
グラム陰性細菌感染において、LPSの放出が、敗血症及び敗血性ショックの病態生理に関与することが公知である。同じく効果的にLPSを中和する抗菌ペプチドが、敗血症と戦う際にかなり重要である。最初に、テトラ分岐M33をリムルス・アメボサイト・ライセートテスト(E-toxate)において分析し、LPSに起因するサンプルゲル化を中和するその能力を実証した(示さず)。次に、それを、Raw 264.7マクロファージによるLPS誘導性TNF−α分泌の阻害について検証した。M33は、マクロファージが緑膿菌血清型10 ATCC27316(図3A)及び肺炎桿菌ATCC15380(図3B)からのLPS(EC50がそれぞれ4e−8M及び2.6e−7M)を用いて刺激された場合、用量依存的な様式でTNF−α分泌を遮断できた。顕著に、MICに対応する濃度(緑膿菌及び肺炎桿菌について1.5〜3μM)で、M33はTNF−α産生を90%超(マクロファージが緑膿菌からのLPSを用いて刺激された場合)及び80%超(マクロファージが肺炎桿菌からのLPSを用いて刺激された場合)減少させた。M33は、マクロファージを3倍のMIC濃度でインキュベートした場合、定量可能な量のTNF−αを刺激した。
テトラ分岐M33ペプチドを、致死量の細菌を用いて感染させたマウスにおけるその抗菌活性について分析した。2つの異なる細菌種を使用した(大腸菌及び緑膿菌)。腹腔内(ip)注射後に100%致死感染(LD100)を起こす最小数の細菌は、大腸菌TG1、緑膿菌ATCC 27853、及びMDR臨床分離株緑膿菌VR143/97についてそれぞれ1.5×109、1×107、及び1.5×107であった。細菌LD100はマウスを20〜24時間で殺す。Balb−cマウスをLD100の細菌を用いて感染させ、30分後にペプチドを用いて腹腔内投与により処置した。
a緑膿菌1×107CFU/マウスを用いて腹腔内注射された瀕死の動物(感染から18時間後に屠殺された)
b緑膿菌1×107CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、M33(25mg/Kg)を用いて処置され、感染から18時間後に屠殺された動物
c緑膿菌1×107CFU/マウスを用いて腹腔内注射され、M33(25mg/Kg)を用いて処置され、感染から40時間後に屠殺された動物
Claims (17)
- アミノ末端からカルボキシ末端に、KKIRVRLSA、配列番号1、RRIRVRLSA、配列番号2、KRIRVRLSA、配列番号3、RKIRVRLSA、配列番号4又はその機能的誘導体の群より選択されるアミノ酸配列を有し、ここで1つのアミノ酸残基がアラニン残基により置換され、又はここで1つの正電荷アミノ酸が別の正電荷アミノ酸により置換される、抗菌ペプチド。
- 線形形態である、請求項1記載のペプチド。
- ポリアクリルアミドの骨格上で、デキストラン単位の骨格上で、又はエチレングリコール単位の骨格上で多量体化される、請求項2記載のペプチド。
- Xが三官能性単位である、請求項4記載のMAPペプチド。
- 三官能性単位が少なくとも2つの機能性アミノ基を含む、請求項5記載のMAPペプチド。
- Xがリジン、オルニチン、ノルリジン、又はアミノアラニンである、請求項6記載のMAPペプチド。
- Xがアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項4記載のMAPペプチド。
- Xがプロピレングリコール、コハク酸、ジイソシアネート、又はジアミン誘導体である、請求項4記載のMAPペプチド。
- 医学的使用のための請求項1〜9のいずれか一項記載のペプチド。
- 抗菌薬物としての請求項1〜10のいずれか一項記載のペプチド。
- 医薬的に許容可能な有効量の請求項10又は11記載のペプチドを含む医薬的組成物。
- 全身使用のために個人において注射される溶液の形態である、請求項12記載の医薬的組成物。
- LPS中和のための解毒剤として注射される溶液の形態である、請求項12記載の医薬的組成物。
- 洗眼液、洗口剤、軟膏、又は局所使用のための溶液の形態である、請求項12記載の医薬的組成物。
- 請求項1〜11記載のペプチドを含む抗菌活性を伴う殺菌剤及び/又は界面活性剤。
- 食品産物及び/又は化粧品産物及び/又はホメオパシー産物の調製のための保存剤としての請求項1〜11記載のペプチドの使用。
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