CN102170899A

CN102170899A - 用于抗微生物应用的肽序列、其分枝形式以及其用途

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Publication number: CN102170899A
Application number: CN2009801390933A
Authority: CN
Inventors: L·布拉奇; C·法尔恰尼; A·皮尼
Original assignee: Universita degli Studi di Siena
Current assignee: Universita degli Studi di Siena
Priority date: 2008-10-05
Filing date: 2009-10-05
Publication date: 2011-08-31
Also published as: JP2012504597A; EP2344178B1; WO2010038220A1; PL2344178T3; EP2344178A1; JP5773271B2; US8440794B2; US20110190198A1; SI2344178T1; PT2344178E; ES2530457T3; DK2344178T3

Abstract

本发明涉及具有选自KKlRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKlRVRLSA，SEQ ID No.4的从氨基末端到羧基末端的氨基酸序列的抗菌肽或其衍生物及其用途。

Description

用于抗微生物应用的肽序列、其分枝形式以及其用途

发明领域

本发明涉及有效的抗微生物肽序列的鉴定，特别是抗蛋白酶活性并因此非常适合于在体内使用的抗微生物肽序列的鉴定，特别是当以四分枝MAP形式合成时。本发明的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4)来源于以前报道的以谷氨酰胺作为第一个氨基末端残基的肽M6。去除谷氨酰胺给予了肽稳定性和批次与批次之间均一性预料之外的且令人惊奇的改善，并因此提供了肽合成的可靠方法，其对于M6肽是特别困难的。

技术背景

多药物抗性细菌的不断出现是全球关注的事情，这些国家中的大部分都将抗生素广泛地使用于临床。许多病原体如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、一些肠球菌(enterococci)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和许多其他革兰氏阴性细菌都已经产生了对大多数常规抗生素以及对那些新一代抗生素的抗性(Wenzel和Edmond 2000)。因此，研发新的抗生素变得越来越重要。这种需求促使研究团体和药物公司考虑新的抗微生物剂。抗微生物肽被认为是对通常引起抗性细菌选择的常规抗生素的最佳替代物之一(Hancock和Sahl 2006)。大多数抗微细菌是动物包括人类、植物和真菌的天然免疫组分(Zasloff，2002)。它们通常由6-50个氨基酸残基组成，并具有净正电荷。阳离子肽选择性地与阴离子细菌膜和与其他负电荷结构例如LPS和DNA相互作用。真核细胞的膜的外层通常比细菌的膜的外层带更少的负电荷，并且与细菌的膜不同，它们也通过胆固醇分子稳定化。这些差异是阳离子肽的特异性的基础。因此，阳离子抗微生物肽的作用机制归因于它们与细菌膜的特异结合，其引起细胞通透，并且在某些情况下引起代谢途径抑制。

因而，许多研究旨在通过研究它们的作用机制、当局部地或者全身地施用时它们对真核细胞的毒性和它们的治疗有效性来鉴定和表征抗微生物肽序列。遗憾地是，迄今为止，两个主要的问题阻碍了抗微生物肽药物的研发。第一个问题是用于细菌的天然抗微生物肽的选择性通常太低并且它们对真核细胞特别是红细胞有剧毒，产生了高水平的溶血。第二个问题与肽在体内普遍的短半衰期有关。这是过去10年仅有很少的阳离子肽进入市场的主要原因(多粘菌素和达托霉素是两个成功的例子)。

几年前，研究者开始致力于鉴定在实验室中通过合理设计或者组合文库的筛选而选择的非天然来源的新肽序列。目的是根据一般毒性和对细菌的特异性以及改进的半衰期为药物研发发现具有更好的生物学特性的肽。

在本发明人的实验室中，鉴定了非天然肽序列，其特别地显示出对革兰氏阴性细菌强的抗微生物活性(Pini等，2005)。通过合理地修饰鉴定自组合文库的序列获得了肽(QKKIRVRLSA，SEQ ID No.5，称为M6)，其以MAP四分枝形式合成，其中4个相同的肽序列通过赖氨酸核心连接到一起。这种分子显示出对蛋白酶和肽酶高的抗性，因而克服了短半衰期的问题(Bracci等，2003；Falciani等，2007)。已经在以下方面对分枝状的抗微生物肽M6进行了表征：其对许多细菌包括几种多药物抗性临床分离物的生物学活性，其与DNA的相互作用，其对几种真核细胞系的体外毒性，以及其溶血活性，其免疫原性，当腹膜内或静脉内注射时其在体内的毒性(Pini等，2007)。

在M6的表征中进行的所有实验期间，我们注意到具有非均一的活性的M6产生的肽的不同合成(批次与批次之间不同)(图1A)。质谱分析显示，M6的第一个氨基酸，即谷氨酰胺，转变成了焦谷氨酸(图1B)。含有焦谷氨酸而非谷氨酰胺的不同的肽的存在以不可预测的百分率随批次而改变。事实上，完全去除这种副产物是不可能的，首先，因为在HPLC纯化期间由于其与主要产物具有类似的保留时间而不容易除去它，第二，因为当在溶液中时，它会持续从亲代肽中产生。由于焦谷氨酸类似物相对于谷氨酰胺类似物显示出明显降低的抗微生物活性，所以混合物的整体活性因批次而异(图1A)。

为了最小化批次与批次之间的不同，在用于临床前实验和可能地用于工业生产的大规模肽生产方面，我们从M6中去除了第一个谷氨酰胺残基并也用精氨酸替换了前两个赖氨酸或者用赖氨酸和精氨酸更换了这前两个残基。这产生了缺失M6序列中存在的第一个谷氨酰胺的下列9聚体序列：KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，称为M33；RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，称为M34，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，称为M35，RKIRVRLSA，SEQID No.4，称为M36。这些序列是本申请的主题。

将新肽进行描述于下文实施例中中的几种表征。

事实上，去除M6肽序列N末端的单一氨基酸残基和可能地更换前两个位置中的赖氨酸和精氨酸产生了更好的抗微生物活性，并且不造成毒副作用和作用机制方面的任何不同行为。实际上，它导致合成可靠性的有力改善，使得肽M33、M34、M35和M36的序列相对于M6更适合于工业研发。由于改善的稳定性和批次与批次之间的均一性，M33、M34、M35和M36序列是用于抗微生物药物研发的理想候选物。

发明描述

本发明的目的是以单体结构或者树状聚体结构，优选地以多抗原肽(MAP)形式合成的肽序列KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，M33；RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，M34，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，M35，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4，M36，所述多抗原肽(MAP)形式具有通式：

其中R是具有选自M33、M34、M35和M36的序列的单体肽(所有R在一种MAP分子中是相同的序列)，X是三功能性分子并且Z是与X一样的三功能性分子或者是如下化学基团：

其中R和X定义如上。

本发明的进一步目的是具有选自KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4的从氨基末端到羧基末端的氨基酸序列的抗微生物肽或其衍生物，其中将一个氨基酸残基用丙氨酸残基取代或者其中将一个带正电荷的氨基酸用另一个带正电荷的氨基酸取代。优选地，肽是线性形式。更优选地，肽是在聚丙烯酰胺骨架上、在葡聚糖单位骨架上或者在乙二醇单位骨架上多聚化的。仍优选地，肽为多抗原肽(MAP)形式，其具有下列通式：

其中，R是在权利要求1中要求保护的肽；X是三功能性分子；m＝0或1；n＝0或1；当m和n为0时，肽是二聚体；当m＝1且n＝0时，肽是四聚体，当m＝1且n＝1时，肽是八聚体。

优选地，X是三功能性单位。更优选地，三功能性单位包含至少两个功能性氨基基团。还优选地，X是赖氨酸、鸟氨酸、降赖氨酸(norlysine)或者氨基丙氨酸。也优选地，X是天冬氨酸或者谷氨酸。更优选地，X是丙二醇、丁二酸、二异氰酸酯或者二胺衍生物。

本发明进一步的目的是如上所述的用于医学用途的肽。优选地，作为抗细菌药物。

本发明进一步的目的是包含药学上可接受的且有效量的如上所述的肽的药物组合物。优选地，组合物是以溶液剂的形式在个体中注射用于全身使用，更优选地，以溶液剂的形式作为解毒剂注射用于LPS中和，仍优选地，以洗眼剂、漱口剂、软膏剂或者溶液剂形式用于局部使用。

本发明进一步的目的是包含本发明肽的具有抗菌活性的消毒剂和/或洗涤剂制剂。

本发明此外的目的是本发明的肽作为防腐剂用于制备食物产品和/或美容产品和/或顺势疗法产品的用途。

本发明的目的是此类肽作为抗微生物剂应用于医学的、兽医的和农学的用途。

本发明序列相对于已经描述的M6肽是有优势的，因为其稳定性和在分子组合物和生物学活性两方面强的批次与批次之间的均一性。M6序列(QKKIRVRLSA，SEQ ID No.5)包含作为第一个N末端残基的谷氨酰胺氨基酸。这种氨基酸倾向于以不可预测量自发地转变成焦谷氨酸。取决于焦谷氨酸的百分率，在一批中焦谷氨酸的存在造成了总体肽活性的明显降低(图1A)。实际上，M6肽抗微生物活性并不是长期一致的，并且这对生产规模扩大产生了负面影响。简单的且看似微小的去除M6序列的第一个谷氨酰胺，和可能地用赖氨酸和精氨酸替换前两个残基产生了有力改善了稳定性和批次与批次之间均一性的新肽序列，使得大规模生产是可靠的。这种关键特性连同其非常令人鼓舞的抗微生物活性使得肽M33、M34、M35和M36成为新抗菌药物研发的最佳候选物。

现在本发明将通过非限制性实施例参考下图进行描述。

图1.A，对大肠杆菌TG1细胞的抗菌活性。比较了以下的四分枝肽：第1批合成的M6(三角形)，第2批合成的M6(正方形)，第3批合成的M6(白色圆圈)，其含有谷氨酰胺和焦谷氨酸(以未知的百分比)作为第一个氨基酸的混合物，焦-M6(星形)，其中第一个氨基酸是100％的焦谷氨酸，和M33(黑色圆圈)，其中删除了第一个谷氨酰胺。含有100％的焦谷氨酸的肽给出了最差的结果，证实将谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸降低了抗菌活性。含有谷氨酰胺和焦谷氨酸二者的M6肽显示出居中的抗微生物活性。如通过M33的曲线显示，去除M6序列的第一个残基改善了肽活性。SD通过三次不同的实验取得。许多不同的M33合成(也包括M34、M35和M36，此处未显示)给出了完全重叠的结果，没有任何摆动的结果。B，四分枝肽M6粗混合物的质谱分析。M6的经计算的分子量是5195Da。存在两个主要的峰，一个在5197Da处，对应于未修饰的M6，一个在5179Da处，对应于具有处于4个谷氨酰胺之一的位置中的第一个位置中的一个焦谷氨酸的副产物。C，在血清中温育24小时后，四分枝肽M33的质谱分析。肽在期望的分子量(4683DA)处表现为单峰。

图2.通过将四分枝M33肽用人红细胞温育3小时或24小时引起的溶血的百分率。在最高的浓度时，它仅造成了可忽略不计的溶血活性。

图3.通过中和LPS抑制TNF-α的释放。A，将Raw 264.7细胞用20ng/ml来自铜绿假单胞菌的LPS和M33温育。三角形表示用LPS和不同浓度的M33温育。正方形表示仅用M33温育。B，将Raw 264.7细胞用5ng/ml来自肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)的LPS和M33温育。三角形表示用LPS和不同浓度的M33温育巨噬细胞。正方形表示仅用M33温育巨噬细胞。SD通过三次不同的实验取得。100％表示当用LPS不用M33温育时由巨噬细胞产生的TNF-α的最大量。其他百分率表示当用LPS和M33温育时相对于100％由巨噬细胞产生的TNF-α的量。TNF-α的基本水平是可以忽略不计的，M33的MIC通过箭头标出。

图4.四分枝M33肽的体内抗菌活性。A，将Balb-c小鼠(20g)用致死量的大肠杆菌TG1细胞(1.5×10⁹CFU)腹膜内注射。实线(Ctr)表示仅用细菌且无M33腹膜内注射小鼠。虚线表示用细菌腹膜内注射小鼠，并在30分钟后单次注射10mg/Kg的M33肽。B，将Balb-c小鼠(20g)用致死量的铜绿假单胞菌细胞(ATCC 278531×10⁷CFU)腹膜内注射。实线(Ctr)表示仅接受了细菌的小鼠；其他组接受了细菌并在30分钟后接受单次剂量的M33(对于M33的剂量参见附图)。C，将Balb-c小鼠(20g)用致死量的铜绿假单胞菌(多药物抗性VR 147临床分离物，1.5×10⁷CFU)腹膜内注射。实线(Ctr)表示仅接受了细菌的小鼠；虚线表示接受了细菌和25mg/Kg单次剂量的M33的小鼠。D，将Balb-c小鼠(20g)用致死量的铜绿假单胞菌(ATCC 278531×10⁷CFU)腹膜内注射。实线(Ctr)表示仅接受了细菌的小鼠；长虚线表示接受了细菌和在接受了细菌后30分钟和12小时两次注射M33(5mg/Kg×2)的小鼠；短虚线，接受了细菌和在接受了细菌后30分钟、12小时和24小时三次注射M33(5mg/Kg×3)的小鼠。P＜0.05。

发明详述

肽合成

通过自动合成仪(MultiSynTech，Witten，Germany)在Rink AmideMBHA树脂(Nova Biochem)上使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学方法和O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲

六氟磷酸盐/1，3-二异丙基乙胺活化作用将单体肽合称为肽酰胺。分枝肽分子(MAP)在Fmoc4-Lys2-Lys-βAla Wang树脂上合成。谷氨酰胺的侧链保护基团是三苯甲基，赖氨酸的侧链保护基团是叔丁氧羰基，精氨酸的侧链保护基团是2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，Ser的侧链保护基团是叔丁基。然后将肽从树脂中切除并用含有水和三异丙基硅烷的三氟乙酸(95/2.5/2.5)去保护。通过反相层析在Vydac C18柱上纯化粗肽。终产物的身份和纯化通过Ettan^TM MALDI-TOF质谱(MS)(Amersham Biosciences)确认。

四分枝M33、M34、M35和M36的蛋白酶抗性

将总共10μl的10nM肽溶液在37℃用10μl人血清温育。温育24小时后收集样品，用150μl甲醇沉淀，并在10,000×g离心2分钟。然后通过高效液相色谱(HPLC)和MS分析粗溶液。HPLC用Vydac C18柱进行，并将粗溶液在注射前用0.1％三氟乙酸稀释5倍并在280nm处监测。肽M33、M34、M35和M36的稳定性

将大肠杆菌TG1菌株的单个菌落培养在2×TY培养基中直到0.2OD⁶⁰⁰。如图1中所述稀释25μl的肽，并将25μl取自以前培养物的大肠杆菌在96孔板中37℃轻微搅拌温育75分钟。作为对照，我们使用一个孔用仅25μl的大肠杆菌和25μl的培养基温育(100％存活率)。温育后，将每孔的溶液1∶1000稀释，并接种在琼脂2×TY平板上。将平板在30℃温育过夜。第二天计数平板上生长的菌落(CFU/ml)。

当在相同的实验中平行分析时，不同批次的四分枝肽M6(QKKIRVRLSA，SEQ ID NO.5)提供了对大肠杆菌不同的结果(图1A的M6批次1、M6批次2和M6批次3)。为此，通过质谱分析四分枝M6，其显示出两个主要的峰，一个峰对应于M6的正常分子量，且另一个峰对应于含有焦谷氨酸作为第一个残基的四分枝肽的分子量(图1B)。通过相同的方法获得的M6的不同制备物给出了具有总是以不同比例存在的两个峰的MS谱，证实第一个谷氨酰胺转变成焦谷氨酸以不可预测的百分率发生。如通过在第一个氨基酸为100％的焦谷氨酸的四分枝肽中所显示，焦谷氨酸而不是谷氨酰胺的存在削弱了M6的抗微生物活性(图1A的焦-M6)。因此，不应当把肽M6看作为研发新药物的真正候选物。

从肽M6序列(QKKIRVRLSA，SEQ ID No.5)中去除第一个氨基酸，并用精氨酸可能地替换开始的两个赖氨酸，或者交替这两个氨基酸，产生了4种新的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ IDNo.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4)，其具有来源于不同时期进行合成的肽的高度稳定的活性。具体而言，将称为M33的肽：KKIRVRLSA，SEQ ID No.1在许多不同的批次中合成，所有的肽给出了具有对应于四分枝M33的分子量的单峰的相同MS谱(图1C)。如预期，当在血清中温育24小时时，四分枝M33对蛋白酶解降解也非常稳定(图1C)。事实上，去除M6序列的第一个残基不仅稳定了批次与批次之间的均一性也改善了肽抗菌活性(图1A中的M33)。

M33、M34、M35和M36的许多不同合成给出了完全重叠的结果，没有任何结果的波动。

以上阐明的稳定性使得肽M33、M34、M35和M36成为产生新的抗菌药物的非常有吸引力的候选物。

四分枝肽M33、M34、M35和M36的抗菌活性

通过由National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)推荐的标准微量稀释测定，使用阳离子补充的Mueller-Hinton(MH)培养液(Oxoid公司，Basingstoke，英国)和每孔5×10⁴CFU的细菌接种物在100μl的终体积中测定最小抑制浓度(MIC)。在37℃温育24小时后，通过视觉检查记录结果。对包括革兰氏阴性病原体和金黄色葡萄球菌的几种细菌物种的菌株测定M33、M34、M35和M36的MIC(表1)。对几种革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和除了奇异变形菌(Proteus mirabilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)外的大多数肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌观察到微摩尔范围的MIC。保留了针对具有多种抗性机制(例如广谱β内酰胺酶和碳青霉烯酶)的MDR菌株的肽活性，所述MDR菌株包括来自CF患者的MDR铜绿假单胞菌菌株。虽然M33、M34、M35和M36也表现出具有抗金黄色葡萄球菌的一定活性，但是M33、M34、M35和M36的抗菌谱和能力大体上与多粘菌素B类似(表1)。

表1.M33与多粘菌素B比较针对代表几种病原体物种，包括临床来源的MDR菌株的细菌菌株的MIC(μM)。

^a测试的菌株包括参考菌株(指定的)或者临床分离物(大多数显示出MDR表型)；相关的抗性性状和抗性机制表示如下：_FQ^r，抗氟喹诺酮类；AG^r，抗氨基糖苷类(庆大霉素、阿米卡星和/或妥布霉素)；ESC^r，抗广谱头孢菌素类；NEM^r，抗碳青霉烯类(亚胺培南和/或美罗培南)；ERT^r，抗厄他培南；COL^NS，对粘菌素不敏感的；ESBL，广谱β内酰胺酶；MBL，金属-β-内酰胺酶；OXA，苯唑西林酶；MR，二甲氧西林抗性的；VANⁱ，万古霉素中间体(vancomycin-intermediate)

^b来自囊性纤维化患者的临床分离物

^c黏液型表型

本发明所述的肽似乎特别选择性地用于革兰氏阴性细菌，可能因为它们与LPS强烈地结合，LPS仅组成性存在于革兰氏阴性细菌中。Amphypatic谱和肽的过量正电荷表明，它们也可以与细菌膜相互作用，从而通过对具有类似结构的抗微生物肽描述的作用机制之一进入细胞。四分枝肽M33、M34、M35和M36的溶血活性

新鲜的人红细胞的溶血使用如下概述的Parpart的方法测定。通过在具有多种浓度的NaCl磷酸盐缓冲液(pH7.4，110mM磷酸钠)中悬浮新鲜的人红细胞并在室温温育30分钟来构建校正曲线。将样品在500×g离心5分钟，并通过测量上清液在540nm处的吸光度来监测血红蛋白的释放。用0.1％的NaCl获得的吸光度对应于100％裂解，并且用1％的NaCl获得的吸光度对应于0％裂解。按几种浓度将溶解在PBS中的肽加入到人红细胞溶液中。将得到的悬浮液分别在37℃温育2小时和24小时。通过测量离心后上清液在540nm处的吸光度来监测血红蛋白的释放并使用校正曲线计算溶血百分率。

非常重要的特性是，与大多数到目前所描述的抗微生物肽相反，M33、M34、M35和M36肽显示出几乎可忽略不计的溶血等级(图2)，表明了其也可以经全身施用的可能用途。

脂多糖(LPS)的中和

在革兰氏阴性细菌感染中，已知LPS的释放涉及败血症和败血性休克的病理生理学。能有效中和LPS的抗微生物肽在抗败血症中是相当重要的。

首先，将四分枝M33在鲎(Limulus)阿米巴样细胞裂解物测试(E-toxate)中分析，表明其能中和LPS引起的样品凝胶化的能力(未显示)。然后，通过Raw 264.7巨噬细胞检查了它抑制LPS诱导的TNF-α的分泌方面。结果，当用来自分别具有4e-8M和2.6e-7M的EC50的铜绿假单胞菌血清型10 ATCC27316(图3A)和肺炎克雷伯氏菌ATCC15380(图3B)的LPS刺激巨噬细胞时，M33能以剂量依赖性方式阻断TNF-α的分泌。值得注意地，在相当于MIC的浓度下(对于铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌，在1.5μM和3μM之间)，当用来自铜绿假单胞菌的LPS刺激巨噬细胞时M33使TNF-α的产生降低了90％以上，和当用来自肺炎克雷伯氏菌的LPS刺激时，TNF-α的产生降低了80％以上。当用3倍MIC浓度的巨噬细胞温育时，M33仅刺激了可以计量的量的TNF-α。

体内抗菌活性

在用致命量的细菌感染的小鼠中分析了四分枝M33肽的抗菌活性。使用了两种不同的细菌物种，大肠杆菌和铜绿假单胞菌。腹膜内(ip)注射后造成100％致命感染(LD100)的最小量细菌对于大肠杆菌TG1、铜绿假单胞菌ATCC 27853和MDR临床分离物铜绿假单胞菌VR143/97分别为1.5×10⁹、1×10⁷和1.5×10⁷。细菌的LD100在20-24小时内杀死了小鼠。将Balb-c小鼠用LD100的细菌感染并处理30分钟后用肽腹膜内施用。

感染大肠杆菌TG1后，当以10mg/Kg的浓度单剂量地施用时，M33保护了100％的动物免于败血症的病征和死亡(存活7天)(图4A)。用铜绿假单胞菌ATCC 27853攻击小鼠后，以25mg/Kg和12.5mg/Kg的浓度单剂量施用的M33保护了75％和25％的动物，然而，以6.5mg/Kg的浓度单剂量施用的M33没有保护它们免于死亡，尽管与未处理对照相比延迟了死亡(图4B)。最后，将铜绿假单胞菌VR143/97，一种仅对多粘菌素B(19)敏感并代表了目前在意大利传播的克隆的MDR菌株(Cornaglia等，2000)用于攻击小鼠。以25mg/Kg的浓度单剂量施用的M33保护了100％的动物(图4C)。然后，在用铜绿假单胞菌ATCC 27853感染后，以多剂量施用来分析M33的活性。当每12小时(感染后30分钟和12小时)用两次剂量的5mg/Kg M33处理小鼠时，延迟了死亡。当每12小时(感染后30分钟、12小时和24小时)用3次剂量的5mg/Kg M33处理小鼠时，感染后7天以后，获得了免于败血症病征的完全保护和100％的存活(图4D)。

M33并没有在用100mg/Kg的肽剂量腹膜内处理的动物中产生明显的毒性病征(未显示)，本文中报道了4倍剂量。

也在用LD100的铜绿假单胞菌ATCC 27853感染并用25mg/Kg单剂量的M33处理后，通过在不同时间计数在血液、腹膜液、脾和肝中细菌来评价M33在体内的抗微生物活性。感染后18小时，明显清除了血液的细菌，并且在腹膜液、脾和肝中的细菌数目显著地低于对照中的细菌数目。40个小时后，所有样品的身体位点都明显清除了细菌(表2)。

表2.M33在小鼠败血症模型中降低铜绿假单胞菌的细菌负载中的功效

^a用1×10⁷CFU/小鼠的铜绿假单胞菌腹膜内注射的濒死动物(注射后18小时处死)

^b用1×10⁷CFU/小鼠的铜绿假单胞菌腹膜内注射，用M33(25mg/Kg)处理并在注射后18小时处死的动物

^c用1×10⁷CFU/小鼠的铜绿假单胞菌腹膜内注射，用M33(25mg/Kg)处理并在注射后40小时处死的动物

参考文献

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Zaslofr M，2002，Nature，415：389-95。

Claims

1.抗菌肽，其具有选自KKIRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKIRVRLSA，SEQ ID No.4的从氨基末端到羧基末端的氨基酸序列或其功能性衍生物，其中一个氨基酸残基由丙氨酸残基取代或者其中一个带正电荷的氨基酸由另一个带正电荷的氨基酸取代。

2.根据权利要求1所述的肽，其是线性形式。

3.根据权利要求2所述的肽，其在聚丙烯酰胺骨架上、在葡聚糖单位骨架上或者在乙二醇单位骨架上多聚化。

4.根据权利要求1所述的肽，其是多抗原肽(MAP)形式，具有下列通式：

其中，R是如在权利要求1中所要求保护的肽；X是三功能性分子；m＝0或1；n＝0或1；当m和n是0时，所述肽是二聚体；当m＝1且n＝0时，所述肽是四聚体，当m＝1且n＝1时，所述肽是八聚体。

5.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是三功能性单位。

6.根据权利要求5所述的MAP肽，其中所述三功能性单位包含至少两个功能性氨基基团。

7.根据权利要求6所述的MAP肽，其中X是赖氨酸、鸟氨酸、降赖氨酸或者氨基丙氨酸。

8.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是天冬氨酸或者谷氨酸。

9.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是丙二醇、丁二酸、二异氰酸酯或者二胺衍生物。

10.根据前述权利要求中任一项所述的肽，用于药物用途。

11.根据前述权利要求中任一项所述的肽，作为抗菌药物。

12.药物组合物，其包含药学上可接受的且有效量的根据权利要求10或者11的肽。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其以溶液剂形式在个体中注射用于全身使用。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其以溶液剂形式作为解毒剂注射用于LPS中和。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其以洗眼剂、漱口剂、软膏剂或者溶液剂形式用于局部使用。

16.具有抗菌活性的消毒剂和/或洗涤剂制剂，其包含根据权利要求1至11的肽。

17.根据权利要求1至11所述的肽的用途，用作防腐剂用于制备食物产品和/或美容产品和/或顺势疗法产品。