ITRM20130565A1 - Composti anti tnf-alpha e loro usi - Google Patents
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Classifications
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Description
COMPOSTI ANTI TNF-ALPHA E LORO USI
Campo tecnico
La presente invenzione riguarda un peptide, i suoi derivati multimerici, relativa composizione farmaceutica e loro usi in terapia, in particolare per inibire l’attività del TNF-alpha.
Stato dell’arte
Il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alpha) è una potente citochina pro-infiammatoria che esercita effetti pleiotropici su vari tipi di cellule. TNF-alpha scatena una grande varietà di risposte, compresa la febbre, la sintesi di proteine di fase acuta, l’aumento della permeabilità vascolare, l'attivazione delle cellule B e T e la loro migrazione, la proliferazione cellulare e l'apoptosi [1-3]. TNF-alpha è generato in forma di precursore, noto come TNF-alpha transmembrana, espresso sulla superficie di macrofagi attivati, linfociti e altri tipi di cellule [4, 5]. TNF-alpha trans-membrana viene processato da alcune metallo proteasi, come l’enzima TACE, e liberato in forma solubile sotto forma di proteina composta da 157 aminoacidi. Questa forma può mediare le sue attività biologiche su tutte le cellule mediante recettori specifici detti TNFR1 e TNFR2 [6-11].
Il TNF-alpha solubile è un omotrimero di 17 kDa. Anche il TNF-alpha transmembrana può esistere come omotrimero di 26 kDa [12]. Nel sistema immunitario, TNF-alpha è coinvolto nella risposta infiammatoria indotta da stimoli come infezioni o lesioni dei tessuti, e svolge un ruolo critico nella patogenesi dell'infiammazione cronica e malattie infiammatorie croniche, come l'artrite reumatoide (RA) e morbo di Crohn [13]. TNF-alpha svolge anche un ruolo centrale nella patogenesi della psoriasi e della spondilite anchilosante [6]. Dato il suo ruolo centrale in molte malattie infiammatorie, TNF-alpha è stato proposto come un obiettivo terapeutico per una serie di malattie. Cinque agenti anti-TNF-alpha (Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Cetolizumabpegol e Golimumab) sono stati introdotti in commercio per il trattamento delle malattie infiammatorie croniche. Questi farmaci sono generalmente efficaci per RA ma non sempre mostrano effetti positivi per il la malattia di Crohn [14]. Quindi la necessità di nuovi farmaci anti-TNF è ancora pressante.
Riassunto dell’invenzione
Nella presente invenzione è stato selezionato un peptide anti-TNF-alpha da una libreria fagica. Esso è stato sintetizzato come molecola tetra-ramificata ed è stato caratterizzato in vitro per l'inibizione del legame di TNF-alpha ai suoi recettori.
La molecola peptidica, sintetizzata in forma monomerica o ramificata, è in grado di legarsi al fattore pro infiammatorio umano TNF-alpha. Il peptide dell’invenzione è capace di inibire il legame di TNF-alpha ai suoi recettori presenti sulle cellule e di bloccare l’inizio del processo infiammatorio innescato dal TNF-alpha stesso.
Pertanto il peptide dell’invenzione presenta le proprietà di un agente anti TNF-alpha e rappresenta un potenziale farmaco per terapie anti-infiammatorie.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un peptide comprendente la sequenze amminoacidica dal terminale amminico al carbossilico: HIHDDLLRYYGW (SEQ ID NO : 1), derivato ricombinante o sintetico di esso per uso medico. Preferibilmente il peptide è in forma lineare o multimerica.
Ancora preferibilmente il peptide è sintetizzato nella forma di Peptide Antigenico Multiplo (MAP), avente la seguente formula:
R
Xn
R Xm
R
Xn
R X R
Xn
R Xm
R
Xn
R
in cui R è un peptide secondo la rivendicazione 1; X è una molecola bifunzionale; m = 0 o 1; n = 0, se m = 0; n = 0 o 1, se m = 1.
Preferibilmente X è un amminoacido avente almeno due gruppi amminici funzionali. Più preferibilmente X è lisina, ornitina, nor-lisina o aminoalanina. Preferibilmente il peptide dell’invenzione é per uso come agente anti TNF-alpha. Più preferibilmente il peptide dell’invenzione é per uso nel trattamento e/o la prevenzione di una patologia caratterizzata da una superproduzione di TNF-alpha. Più preferibilmente il peptide dell’invenzione é per uso nel trattamento e/o la prevenzione di una patologia infiammatoria.
Preferibilmente la patologia infiammatoria è acuta o cronica, più preferibilmente la patologia infiammatoria è scelta nel gruppo costituito da: artrite reumatoide, morbo di Crohn, colite ulcerosa, spondilite anchilosante, psoriasi e artrite psoriasica, dermatite atopica, lupus, artrite idiopatica giovanile e fibrosi cistica.
Forma oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente un eccipiente farmaceuticamente accettabile ed un peptide come definito sopra. Preferibilmente la composizione farmaceutica è per la somministrazione sistemica, orale o topica.
Forma anche oggetto dell’invenzione un frammento funzionale del peptide di SEQ ID NO: 1. Il frammento è un peptide avente una percentuale di identità di almeno il 45 %, preferibilmente almeno il 75 %, più preferibilmente di almeno il 85 % con la SEQ ID NO .
1. Il frammento funzionale è in grado di inibire il legame di TNF-alpha ai suoi recettori. Detto frammento è un peptide aventi una lunghezza di almeno 5 amminoacidi, preferibilmente almeno 8 amminoacidi, preferibilmente almeno 10 amminoacidi.
Forma oggetto dell’invenzione un polinucleotide codificante per il peptide HIHDDLLRYYGW (SEQ ID NO : 1), derivato ricombinante o sintetico e frammento di esso.
Forma oggetto dell’invenzione un vettore comprendente detto polinucleotide.
Forma ulteriore oggetto dell’invenzione una cellula ospite ingegnerizzata geneticamente che esprime il peptide dell’invenzione, derivato ricombinante o sintetico e frammento di esso. Preferibilmente il polinucleotide è selezionato nel gruppo costituito da RNA o DNA, preferibilmente detto polinucleotide è DNA.
Preferibilmente il vettore è un vettore di espressione selezionato nel gruppo costituito da: plasmidi, particelle virali e fagi.
Preferibilmente la cellula ospite è selezionata nel gruppo costituito da: cellula batterica, cellula fungina, cellula di insetto, cellula animale e cellula vegetale, preferibilmente detta cellula ospite è una cellula animale.
I peptidi dell’invenzione sono sotto forma di peptidi sintetici e/o ricombinanti, lineari e multimerizzati in qualsiasi forma chimica, fisica e/o biologica tale da avere un’attività anti TNF-alpha.
I peptidi dell’invenzione possono essere prodotti secondo le metodiche note agli esperti del settore, ad esempio per sintesi chimica o per via ricombinante.
I peptidi dell’invenzione sono sintetizzati e utilizzati in forma lineare, sia solubile che multimerizzata, anche legati a substrati, come ad esempio su uno scheletro di poliacrilammide, di unità di destrano o di unità di glicole etilenico.
Alternativamente i peptidi dell’invenzione sono sintetizzati e utilizzati in forma ramificata come Peptidi Antigenici Multipli (MAP), come descritto ad esempio nel brevetto US 5,229,490.
L’esperto del settore sceglierà la forma di somministrazione e i dosaggi convenienti, selezionando opportuni diluenti, coadiuvanti e/o eccipienti.
La presente invenzione verrà illustrata con esempi non limitativi in riferimento alle seguenti figure.
Figura 1. Struttura dei peptidi anti-hTNF-alpha sintetizzati in forma tetra-ramificata. Gli amminoacidi delle quattro sequenze peptidiche sono indicati con il codice ad una lettera. Figura 2. Legame di hTNF-alpha sui peptidi immobilizzati sul chip del BIAcore.
hTNF-alpha, da 250 nm a 2 µM, è stato iniettato sul peptide lineare (A) o ramificato (B) immobilizzato via biotina sul sensor chip SA.
Figura 3. Inibizione del legame di hTNF-alpha su Adalimumab da parte del peptide anti-TNF-alpha. A) Adalimumab è stato catturato con Proteina A su un sensor chip CM5 come descritto nei metodi. hTNF-alpha è stato incubato in presenza di concentrazioni diverse (1, 10 e 25 µM) del peptide ramificato anti-TNF. B) Curva di inibizione del legame di hTNF-alpha a Adalimumab derivata dall’esperimento in A. L’asse y rappresenta la percentuale di legame tra hTNF-alpha e Adalimumab. L’asse x rappresenta la concentrazione del peptide anti-TNF-alpha ramificato. La IC50 è indicata.
Figura 4. Inibizione del legame tra hTNF-alpha e il recettore TNFR2 mediante risonanza plasmonica di superifice (SPR) tramite Biacore. A) Sensorgrammi del Biocore che illustrano il legame di hTNF-alpha 3 nM su TNFR2 immobilizzato, in presenza di diverse concentrazioni di peptide ramificato, da 10 µM a 1 µM. B) Curva di inibizione del legame di hTNF-alpha a TNFR2 derivata dall’esperimento in A. L’asse y rappresenta la percentuale di legame tra hTNF-alpha e TNFR2. L’asse x rappresenta la concentrazione del peptide anti-TNF-alpha ramificato. La IC50 è indicata.
Figura 5. Il peptide ramificato anti-hTNF-alpha inibisce il legame di TNF-alpha a cellule di melanoma umano. Il segnale rosso è dovuto al legame di hTNF-alpha (3 nM) ai recettori di membrana presenti sulle cellule A375 (A). L’incubazione di hTNF-alpha con il peptide ramificato anti-hTNF-alpha (1, 10, 20 µM) produce una riduzione dose-dipendente del segnale rosso (B-D). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu).
Descrizione dettagliata dell’invenzione
PROCEDURE SPERIMENTALI
Biotinilazione di TNF-alpha
100 µg di hTNF-alpha (Prospec N° Cat. CYT223) sono stati incubati con biotina disolfuro N-idrossisuccinimmide estere (Sigma Aldrich) a temperatura ambiente per 60 minuti. La biotina non reagita è stata rimossa mediante dialisi in PBS per la notte a 4 ° C.
Phage display
La libreria fagica di peptidi 12-mer Ph.D.12™ (New England Biolabs N° Cat. E8111L) è stata incubata con hTNF-alpha biotinilato. 1011 fagi della libreria, diluiti in PBS (137 mM NaCl , 2 mM KCl , 10 mM Na2HPO4 , 2 mM KH2PO4 , pH 7,4) contenente 0,1 % (v/v) di Tween 20 (PBST) e il 3 % di albumina bovina (BSA), sono stati incubati con 50 nM hTNF-alpha biotinilato O/N a 4°C. Successivamente, alla soluzione sono stati aggiunti 100 µl di palline magnetiche streptavidinate (Dynabeads M280, Invitrogen), precedentemente saturate con 5 % BSA in PBST, per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 10 lavaggi con PBST, i fagi legati sono stati eluiti con 5 µM Adalimumab per 60 minuti a temperatura ambiente. I fagi eluiti sono stati amplificati e titolati e quindi sottoposti ad due ulteriori cicli di biopanning seguendo la procedura sopra descritta, tranne che per la concentrazione di TNF-alpha biotinilato che veniva diminuita (20 nM e 10 nM per il secondo e il terzo round di panning, rispettivamente), e per i lavaggi eseguiti utilizzando 0.5 % (v/v) Tween 20.
In aggiunta alla selezione sopra descritta gli autori hanno effettuato il seguente panning attraverso la tecnologia del Biacore. Il TNF-alpha biotinilato è stato immobilizzato sulla superficie di un sensor chip streptavidinato, ottenendo 2000 unità di risonanza dopo l’immobilizzazione. 1011 fagi, diluiti in HBS-N, sono stati iniettati sul TNF-alpha immobilizzato ad un flusso di 10 microlitri/min. L'eluizione è stata effettuata utilizzando l’anticorpo monoclonale Adalimumab 1 µM, ed i fagi eluiti sono stati raccolti attraverso il sistema di recupero Biacore T100. Questa selezione è stata eseguita con un solo round di panning.
Con i fagi selezionati da entrambi i sistemi di panning è stato effettuato un saggio ELISA in cui il TNF-alpha biotinilato 20 nM era stato immobilizzato sul fondo del pozzetto streptavidinato di una piastra ELISA.
Sintesi peptidica
La sintesi in fase solida è stata condotta su un sintetizzatore automatico di peptidi MultiSynTech Syro per sintesi multipla (Witten , Germania), impiegando la chimica Fmoc mediante attivazione con 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate/N,N-diisopropylethylamine (HBTU). I gruppi di protezione delle catene laterali degli aminoacidi erano trityl per l’Istidina, 2,2,4,6,7-pentamethyldihydro-benzofuran-5-sulfonyl (Pbf) per Arg, tert-butyl ether (tBu) per Ser e Tyr, tert-butyl ester (OtBu) per l' Asp e Glu , e tert-butyloxycarbonyl (Boc) per Trp.
I peptidi ramificati sono stati sintetizzati su resina Fmoc-4-Lys2-Lys TentaGel. Per i peptidi biotinilati, Fmoc - Lys-(Biotin)-OH (Iris Biochem GmbH ) è stato utilizzato come primo gruppo accoppiato alla fase solida e Fmoc-PEG-OH (Iris Biochem GmbH ) come secondo. I peptidi sono stati staccati dalla resina e deprotetti mediante trattamento con acido trifluoroacetico contenente acqua e triisopropilsilano (95:2.5:2.5). Dopo precipitazione con etere dietilico, tutti i peptidi sono stati purificati mediante HPLC utilizzando una colonna C18 Jupiter (Phenomenex) e analizzati mediante spettrometria di massa con UltraflexIII MALDI TOF/TOF (Bruker).
Risonanza plasmonica di superficie (Biacore)
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su uno strumento Biacore T100 (GE Healthcare), i materiali sono stati acquistati da GE Healthcare se non diversamente specificato.
I peptidi lineari e tetra-ramificati biotinilati sono stati immobilizzati su un sensor chip streptavidinato (SA). I peptidi monomerici e tetraramificati diluiti in HBS-EP+ (10 mM Hepes, 157 mM NaCl, 2,4 mM EDTA , p20 0,05 % pH 7,4) sono stati iniettati sul sensor chip per 60 secondi a una velocità di flusso di 10 µl/minuto, ottenendo rispettivamente 300 e 700 unità di risonanza (RU). Diverse concentrazioni di hTNF-alpha, da 250 nm a 2 µM in HBS-EP+, sono state iniettate per 180 sec alla velocità di flusso di 75 µl/min su i peptidi immobilizzati. La rigenerazione della matrice è stata ottenuta con un breve iniezione di 10 mM NaOH.
L’anticorpo monoclonale Adalimumab (Humira®, Abbot, 1 µg/ml in HBS-EP+ per 45 secondi a una velocità di flusso di 10 µl/min) è stato immobilizzato su un sensor chip CM5 precedentemente rivestito con proteina A (6500 RU). Gli esperimenti di competizione sono stati effettuati iniettando 10 nM hTNF-alpha per 180 sec con flusso di 30 µl/min in presenza di varie concentrazioni (1, 10 e 25 µM) del peptide tetra ramificato anti-hTNF-alpha. La rigenerazione è stata effettuata con una iniezione di 30 secondi di glicina 10 mM pH 2.2. TNFR2 umano fuso al frammento anticorpale Fc (TNFR umano, Prospec), diluito in HBS-EP+ ad una concentrazione di 10 µg/ml, è stata iniettata per 120 secondi ad un flusso di 5 µl/min su un chip CM5 precedentemente rivestito con proteina A (6500 RU). Gli esperimenti di competizione sono stati effettuati iniettando 3 nM hTNF-alpha per 180 sec con flusso di 20 µl/min a varie concentrazioni (da 1 µM a 10 µM) del peptide tetra ramificato anti-hTNF-alpha. La rigenerazione è stata ottenuta con una iniezione di 30 secondi di glicina 10 mM pH 2.2.
Colture cellulari
Cellule di melanoma umano A375 (ATCC) sono state coltivate in DMEM, supplementato con 10 % siero fetale bovino, 200 mg/mL glutammina, 100 mg/mL streptomicina, e 60 mg/mL di penicillina. Le cellule sono state mantenute a 37°C in 5 % CO2.
Microscopia confocale
Le cellule A375 sono state piastrate ad una densità di 3x104/pozzetto in piastre da 24 pozzetti. I campioni cellulari sono stati fissati tramite incubazione con paraformaldeide PBS-4 % (PFA) per 15 min, saturati per 30 min a 37°C con PBS-BSA 1% e incubati con hTNF-alpha biotinilato (500 nM) e varie concentrazioni di peptide anti-TNF-alpha (20, 10 e 1 µM) per 30 min a temperatura ambiente, poi con 0,5 µg/ml di streptavidina - Atto 550 (Sigma-Aldrich) per 15 min a temperatura ambiente. I nuclei sono stati colorati con DAPI.
Il legame di hTNF-alpha ai suoi recettori è stato analizzato mediante microscopio confocale (Leica TCS SP5) con filtri 364/555 nm di eccitazione e 458/570 nm di emissione per DAPI e Atto 550. Tutte le immagini sono state elaborate utilizzando il software ImageJ (NIH).
RISULTATI
Phage display e sintesi
Una libreria fagica commerciale (Ph.D.12 , NEB) è stata utilizzata per identificare peptidi 12-mer anti-TNF-alpha umano (hTNF-alpha). Tre cicli di biopanning sono stati effettuati contro TNF-alpha solubile biotinilato. L’eluizione dei peptidi specifici anti-TNF-alpha solubile è stata ottenuta per aggiunta dell’anticorpo monoclonale Adalimumab. Un biopanning parallelo è stato effettuato mediante risonanza plasmonica di superficie (SPR ) utilizzando lo strumento Biacore T100. Per questa selezione, la stessa libreria fagica è stata fatta fluire su TNF-alpha biotinilato precedentemente immobilizzato su sensorchip streptavidinato del sensore Biacore T100. I fagi legati sono stati eluiti mediante competizione con l'anticorpo monoclonale Adalimumab.
Un saggio ELISA eseguito per rilevare peptidi specifici per TNF-alpha, selezionati da biopanning convenzionale o dalla selezione con il Biacore, ha rivelato diversi cloni positivi, la cui analisi del DNA ha mostrato possedere la stessa sequenza aminoacidica: HIHDDLLRYYGW (SEQ ID NO.1).
Il peptide selezionato è stato sintetizzato in una forma tetramerica (Fig. 1) attraverso la sintesi in fase solida Fmoc, costruendo il tetramero su un nucleo di tre lisine [15]. La struttura peptidica tetra-ramificata è stata scelta perché aumenta fortemente la stabilità del peptide alle proteasi circolanti, migliorando pertanto l'emivita rispetto alle corrispondenti sequenze monomeriche [16-18]. Inoltre, la struttura ramificata costruita con corti peptidi è generalmente non immunogenica [19]. La stabilità e la bassa immunogenicità sono di grande importanza per il possibile uso in vivo [20-25]. Al fine di consentire la loro immobilizzazione su un chip del Biacore rivestito con streptavidina, il peptide tetraramificato e la corrispondente sequenza monomerica sono stati sintetizzati con una molecola di biotina al C-terminale biotina .
Esperimenti di legame in Biacore
hTNF-alpha è stato iniettato sul peptide lineare o su quello tetra-ramificato precedentemente immobilizzati su un sensor chip streptavidinato del sensore Biacore. hTNF-alpha è stato incubato a concentrazioni che variavano da 250 nM a 2 µM. Per valutare qualsiasi legame non specifico, hTNF-alpha è stato anche iniettato in una cella di sensor chip vuota. I peptidi lineari (Fig.2A) e tetra-ramificati (Figura 2B) hanno mostrato di legare hTNF-alpha in modo dose-dipendente. Inoltre i peptidi (lineare e tetra-ramificato) hanno dimostrato un legame specifico per la forma umana di TNF-alpha in quanto non hanno mostrato alcun legame per il hTNF-alpha murino (non mostrato). Il peptide, sia sintetizzato in forma lineare che tetra ramificata, ha mostrato praticamente la stessa cinetica di affinità per il hTNF-alpha (rispettivamente KD 3x10e-6 M e 6x10e-6 M) .
Inibizione del legame tra hTNF-alpha e l’anticorpo commerciale Adalimumab
L' anticorpo monoclonale Adalimumab, usato in clinica per inibire gli effetti di hTNF-alpha, è stato catturato su un sensor chip rivestito di proteina-A. 10 nM di hTNF-alpha è stato iniettato sopra l'anticorpo immobilizzato in presenza di diverse concentrazioni (25, 10 e 1 µM) del peptide tetra-ramificato anti-hTNF-alpha (Fig. 3A). La concentrazione 25 µM del peptide anti-hTNF-alpha è risultata capace di inibire l’80% del legame tra hTNF-alpha e Adalimumab con una IC50 di 13x10e-6M (Fig. 3B). Questo test ha confermato che il peptide anti-hTNF-alpha e Adalimumab si legano alla proteina bersaglio nello stesso sito.
Inibizione del legame tra hTNF-alpha e il recettore TNFR2
Gli autori hanno testato la capacità del peptide anti-hTNF-alpha di inibire il legame tra hTNF-alpha e il recettore TNFR2 mediante esperimenti in Biacore. Una forma del recettore TNFR2 ricombinante chimerica (TNRF2-Fc) è stata immobilizzata su un sensor chip rivestito di proteina A (CM5) del Biacore. hTNF-alpha è stato poi incubato su TNFR2 chimerico in presenza di diverse concentrazioni del peptide ramificato anti-hTNF-alpha. Il peptide è risultato capace di inibire completamente il legame di hTNF-alpha al suo recettore (Fig. 4A) con una IC50 di 4.3x10e- 6 M (Fig.4B).
Inibizione del legame tra hTNF-alpha e i suoi recettori espressi su cellule
La linea cellulare di melanoma umano A375, che esprime TNFR1 e TNFR2 [26], è stata utilizzata in microscopia confocale per valutare il legame di hTNF-alpha sulla superficie cellulare e la possibile inibizione da parte del peptide ramificato. Le visualizzazioni di microscopia confocale hanno dimostrato che il peptide anti-hTNF-alpha inibiva il legame del hTNF-alpha alla superficie cellulare in modo concentrazione-dipendente (Fig. 5), confermando i risultati ottenuti con l’inibizione ottenuta in Biacore con il solo recettore TNFR2 (Figura 4).
DISCUSSIONE
Il TNF-alpha è un importante marcatore patologico per lo sviluppo di farmaci antiinfiammatori. E’ un mediatore cruciale nella patogenesi di varie malattie infiammatorie, tra cui RA, morbo di Crohn e spondilite anchilosante. I più gravi sintomi di queste malattie sono già trattati con farmaci biotecnologici anti-TNF-alpha sotto forma di anticorpi ricombinanti o recettori ricombinanti, che agiscono sequestrando il TNF-alpha solubile prevenendo il suo legame con i recettori. Cinque agenti anti-TNF-alpha sono stati introdotti con successo nella pratica clinica per le malattie infiammatorie croniche [14], ma tutti mostrano diversi effetti collaterali importanti [27]. Poiché sono anche molto costosi, è importante identificare nuovi principi anti- TNF-alpha per allargare il pannello di possibili composti terapeutici per le malattie infiammatorie.
Nella presente invenzione gli autori hanno identificato un nuovo peptide anti-TNF-alpha utilizzando una libreria combinatoriale di sequenze aminoacidiche completamente casuali. Essi hanno usato un sistema di eluizione competitivo per recuperare ligandi peptidici ad alta specificità, una procedura sperimentata con successo in nostre diverse applicazioni precedenti [21, 28]. Qui è stato usato come agente eluente competitivo l'anticorpo monoclonale umano Adalimumab (Humira®). Adalimumab è una molecola ad alta affinità rivolta contro il ligando solubile hTNF-alpha, risultando nella presente invenzione un forte competitore dei peptidi eventualmente legati al hTNF-alpha.
Il distacco competitivo dei peptidi fagici in fase di panning ha consentito di selezionare un peptide che lega il TNF-alpha in un sito della proteina incluso nell’epitopo dell'antigene riconosciuto da Adalimumab ottenendo così un mimotopo del sito di legame Adalimumab per TNF-alpha.
Sorprendentemente, sebbene sia stata usata una libreria costituita da miliardi di cloni differenti, è stato trovato solo una singola sequenza peptidica capace di legare il TNF-alpha. Questo risultato è stato ottenuto nonostante siano state utilizzate due diverse strategie di selezione: una incubando i fagi della libreria con il target solubile in una provetta, l'altra facendo fluire la libreria fagica direttamente su un sensor chip del biosensore Biacore, in cui il bersaglio TNF-alpha era stato precedentemente immobilizzato.
Il peptide identificato dalla selezione della libreria ha mostrato di competere efficacemente con l’anticorpo Adalimumab e, in maniera significativa, anche con i recettori naturali di TNF-alpha. Questa inibizione è stata dimostrata a livello molecolare in Biacore (Figura 4) e direttamente su cellule vive esprimenti i recettori di TNF-alpha (Figura 5). Quest'ultimo risultato è importante perché dimostra che il peptide inibisce veramente l'insorgenza di infiammazioni che sono innescate dal legame di TNF-alpha sui recettori cellulari.
Il peptide utilizzato in questi esperimenti è stato sintetizzato nella forma tetra-ramificata, che è considerata particolarmente adatta per uso in vivo in virtù della sua stabilità a peptidasi e proteasi di fluidi biologici e presenti nei vari organi. La prolungata emivita di peptidi ramificati è stata ampiamente dimostrata in precedenza con diversi peptidi ramificati utilizzati in applicazioni diverse [20-25]. La produzione di peptidi in forma ramificata è una procedura consolidata che permette la fabbricazione di lotti molto uniformi di peptidi a costi compatibili con l'applicazione industriale. La sintesi in forma ramificata può essere considerata una prima fase di ottimizzazione prima delle ulteriori caratterizzazioni nei test preclinici.
La presente invenzione porta all’identificazione e ottimizzazione di un nuovo principio attivo anti-TNF-alpha, per lo sviluppo di un nuovo farmaco per uso umano o animale.
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Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1-Un peptide comprendente la sequenze amminoacidica dal terminale amminico al carbossilico: HIHDDLLRYYGW (SEQ ID NO : 1), derivato ricombinante o sintetico di esso per uso medico. 2-Il peptide secondo la rivendicazione 1 in cui il peptide è in forma lineare o multimerica. 3-Il peptide secondo la rivendicazione 2 in cui il peptide è sintetizzato nella forma di Peptide Antigenico Multiplo (MAP), avente la seguente formula: R Xn R Xm R Xn R X R Xn R Xm R Xn R in cui R è un peptide secondo la rivendicazione 1; X è una molecola bifunzionale; m = 0 o 1; n = 0, se m = 0; n = 0 o 1, se m = 1. 4-Il peptide secondo la rivendicazione 3 in cui X è un amminoacido avente almeno due gruppi amminici funzionali. 5-Il peptide secondo la rivendicazione 4 in cui X è lisina, ornitina, nor-lisina o aminoalanina. 6-Il peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedente per uso come agente anti TNF-alpha. 7-Il peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedente per uso nel trattamento e/o la prevenzione di una patologia caratterizzata da una superproduzione di TNF-alpha. 8-Il peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedente per uso nel trattamento e/o la prevenzione di una patologia infiammatoria. 9-Il peptide secondo la rivendicazione 8 in cui la patologia infiammatoria è acuta o cronica. 10-Il peptide secondo la rivendicazione 8 o 9 in cui la patologia infiammatoria è scelta nel gruppo costituito da: artrite reumatoide, morbo di Crohn, colite ulcerosa, spodilite anchilosante, psoriasi e artrite psoriasica, dermatite atopica, lupus, artrite idiopatica giovanile, fibrosi cistica. 11-Composizione farmaceutica comprendente un eccipiente farmaceuticamente accettabile ed un peptide come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 10. 12-La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 per la somministrazione sistemica, orale o topica.
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