JP2017510577A

JP2017510577A - 抗ＴＮＦ−α抗体療法の賦活剤としてのＣＤ６４ブロック剤の使用法

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Publication number: JP2017510577A
Application number: JP2016558286A
Authority: JP
Inventors: ディミトリイフリストドロフ、; テオフィルステペン、; ステファンバース、
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2017-04-13
Also published as: EP3122778A1; CN106456750A; WO2015144842A1; US20170166638A1

Abstract

炎症を伴う疾患の治療に抗ＴＮＦ−α抗体と併用される、ＣＤ６４に対する結合親和性が少なくとも１０−９Ｍであるポリペプチド。【選択図】図１

Description

本発明は抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に応答しない患者における炎症を伴う疾患の治療に使用するためのポリペプチドに関する。

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、およびアトピー性皮膚炎（ＡＤ）をはじめとする幾つかの炎症性疾患の発病に関与する重要なサイトカインである（Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎら著、Ｃｅｌｌｓ，ｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ：ａｃｌｉｎｉｃａｌｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌＨｅｐａｔｏｌ誌、２０１１年、第５巻：７０３〜７１６頁；Ｕｐｃｈｕｒｃｈ，Ｋ．Ｓ．およびＫａｙ，Ｊ．著、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ誌（Ｏｘｆｏｒｄ）２０１２年、第５１巻；Ｎｕｍｅｒｏｆ，Ｒ．Ｐ．およびＡｓａｄｕｌｌａｈ，Ｋ．著、Ｃｙｔｏｋｉｎｅａｎｄａｎｔｉ−ｃｙｔｏｋｉｎｅｔｈｅｒａｐｉｅｓｆｏｒｐｓｏｒｉａｓｉｓａｎｄａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ誌、２００６年、第２０巻：９３〜１０３頁）。それは最初に膜貫通タンパク質（ｍＴＮＦ−α）として産生され、膜局在性プロテアーゼＡＤＡＭ１７によって切断されて可溶型を生じる（Ｂｌａｃｋ，Ｒ．Ａ．ら著、Ａｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｔｈａｔｒｅｌｅａｓｅｓｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａｆｒｏｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ誌、１９９７年、第３８５巻：７２９〜７３３頁）。

両方の型とも２つの公知のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２）のうちの一方に結合し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αそれ自体などのサイトカインをコードする遺伝子を含む炎症促進性遺伝子の調節因子であるＮＦ−κＢおよびＡＰ−１（Ｒｏｇｌｅｒ，Ｇ．およびＡｎｄｕｓ，Ｔ．著、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ．ＷｏｒｌｄＪＳｕｒｇ誌、１９９８年、第２２巻：３８２〜３８９頁）を活性化することができる（Ｌｉｕ，Ｚ．Ｇ．著、ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＴＮＦｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｂｅｙｏｎｄ．ＣｅｌｌＲｅｓ誌、２００５年、第１５巻：２４〜２７頁）。

可溶性ＴＮＦ−αを中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発により、炎症誘発事象の下流カスケードを中断する多数の有効な治療法が生まれた（Ｔｈａｌａｙａｓｉｎｇａｍ，Ｎ．およびＩｓａａｃｓ，Ｊ．Ｄ．著、Ａｎｔｉ−ＴＮＦｔｈｅｒａｐｙ．ＢｅｓｔＰｒａｃｔＲｅｓＣｌｉｎＲｈｅｕｍａｔｏｌ誌、２０１１年、第２５巻：５４９〜５６７頁）。しかしながら抗ＴＮＦ−α療法に応答しない患者もいる。非応答性ＩＢＤ患者の単球およびマクロファージ上でのＣＤ６４の発現上昇が最近報告された（Ｗｏｊｔａｌ，Ｋ．Ａ．ら著、ＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ６４ｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．ＰＬｏＳＯｎｅ誌、２０１２年、第７巻：ｅ４３３６１頁）。両方とも卓越した抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体であるインフリキシマブおよびアダリムマブはＣＤ６４によって捕捉されて炎症誘発性下流シグナル伝達カスケードを誘導し、それによってＴＮＦ−αを中和することで達成される正の効果が打ち消される。精製されたＩｇＧ１Ｆｃγドメインとのインキュベーションによりこれらのモノクローナル抗体の効力が実験室条件下で改善されることが報告されているはいる（Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．ら著、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｖａｒｉａｎｔｓｆｏｒｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ誌、２００９年、第１１３巻：３７１６〜３７２５頁）。しかしながら、このアプローチは低親和性Ｆｃγ受容体であるＣＤ３２およびＣＤ１６がブロックされ、それによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の抑制による免疫抑制が誘導されるので臨床では不適切である。ＣＤ３２およびＣＤ１６はＡＤＣＣおよびＣＤＣを含むエフェクター機能を媒介することによって侵入性病原体に対する必要不可欠な防護を提供するために必要である。３つ全てのＦｃγ受容体をブロックすると免疫系が抑制され、患者が日和見感染症に感染しやすくなる（Ｗｉｌｌｃｏｃｋｓ，Ｌ．Ｃ．ら著、Ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＭｏｌＭｅｄ誌、２００９年、第１３巻；およびＮｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．およびＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．著、Ｆｃ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｓｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＡｄｖＩｍｍｕｎｏｌ誌、２００７年、第９６巻：１７９〜２０４頁）。抗ＴＮＦ−α療法は既に中程度の免疫抑制を誘導することが可能であり、さらに免疫系を損なうことは非常に望ましくないので、このことは特に重大なことである（Ｆｏｒｄ，Ａ．Ｃ．およびＰｅｙｒｉｎ−Ｂｉｒｏｕｌｅｔ，Ｌ．著、Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａｔｈｅｒａｐｙｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｂｏｗｅｌｄｉｓｅａｓｅ：ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌｓ．ＡｍＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ誌、２０１３年、第１０８巻：１２６８〜１２７６頁；Ｘｉｅ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｆ．ら著、Ｒｉｓｋｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎａｎｔｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｈｅｒａｐｙ：Ｆｒｏｍｂｅｎｃｈｔｏｂｅｄｓｉｄｅ．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌＩｎｆｅｃｔ誌、２０１３年、第３０巻：００５頁；およびＯｒｄｏｎｅｚ，Ｍ．Ｅ．，Ｆａｒｒａｙｅ，Ｆ．Ａ．およびＤｉＰａｌｍａ，Ｊ．Ａ．著、ＥｎｄｅｍｉｃＦｕｎｇａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＢｏｗｅｌＤｉｓｅａｓｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＡｎｔｉ−ＴＮＦＡｎｔｉｂｏｄｙＴｈｅｒａｐｙ．ＩｎｆｌａｍｍＢｏｗｅｌＤｉｓ誌、２０１３年、第１９巻：２４９０〜２５００頁）。

国際公開第２０１４／０２９８９０（Ａ１）号は、患者がＴＮＦ−α抗体による治療に対して応答しない可能性を予測するための方法であって、病変組織を代表する試料においてＣＤ６４および／またはＣＤ１６の発現レベルを決定し、標準物に対して比較する前記方法を開示している。同様に、ＴＮＦ−α抗体とＣＤ６４および／またはＣＤ１６に対する抗体または非特異的抗体調製物を含む自己免疫疾患を治療するための医薬組成物が開示されている。

国際公開第２００５／０５２００７（Ａ１）号は少なくとも１つの細胞傷害性ドメインと少なくとも１つのＣＤ６４特異的結合ドメイン、特にヒト起源のＣＤ６４特異的結合ドメインを含む組換え技術で調製された異種性の複合体、ならびにそのような複合体をコードする核酸およびベクターに関する。前記国際公開はさらに、当該発明に従う複合体を用いて、またはその複合体をコードする核酸を含有するベクターを用いてＣＤ６４陽性細胞の細胞増殖および生理に影響を与えるための方法に関する。当該発明はさらに、その発明に従う複合体を生産するためのベクターおよび宿主に関する。前記国際公開はさらに、当該発明に従う複合体またはその複合体をコードするベクターに基づく医薬であって、構造的に限定された細胞集団の異常増殖および／または活性上昇を基礎とする疾患の治療用の前記医薬の調製および分配に関する。これは特に腫瘍疾患、アレルギー、自己免疫疾患、感染症、慢性炎症または移植（免疫抑制）に適用される。

国際公開第２００６／００２４３８（Ａ２）号は高い親和性でＣＤ６４に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にヒト抗体を開示している。その発明の抗体をコードする核酸分子、その発明の抗体を発現させるための発現ベクター、宿主細胞および方法、ならびにその発明の抗体を含む免疫複合体、二特異性分子および医薬組成物も開示されている。その開示は自己免疫障害、移植拒絶、移植片対宿主病、または癌を治療するための方法、および抗原と抗ＣＤ６４抗体の複合体を使用して抗原提示を増強するための方法も提供している。

ＲａｎｄａｌｌＴ．ＣｕｒｎｏｗはＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ誌、１９９７年１１月、第４５巻、第３〜４号、２１０〜２１５頁の概論においてＣＤ６４指向性免疫療法による臨床経験について報告している。その概論は単球ＣＤ６４のインビボでの調節に二特異性抗体ＭＤＸ−４４７［ヒト化Ｆａｂ抗ＣＤ６４×ヒト化Ｆａｂ抗（上皮成長因子受容体、ＥＧＦＲ）］およびＭＤＸ−Ｈ２１０（ヒト化Ｆａｂ抗ＤＣ６４×Ｆａｂ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、および抗ＣＤ６４モノクローナル抗体（ｍＡＢ）ＭＤＸ−３３（Ｈ２２）を用いての、癌患者におけるＣＤ６４指向性免疫療法の臨床経験をまとめている。

本発明の目的は、抗ＴＮＦ−α抗体を用いる治療を強化するための方法を提供することである。

別の目的は、抗ＴＮＦ−α抗体による炎症性疾患の治療の非応答者である患者を治療するための方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、抗ＴＮＦ−α抗体を用いる治療の強化に使用される化合物を提供することである。

驚くべきことに、これらの目的はＣＤ６４に対する結合親和性が少なくとも１０−９Ｍであるポリペプチドによって達成される。本発明によるとこのポリペプチドは炎症を伴う疾患の治療に抗ＴＮＦ−α抗体と併用され得る。

本発明のポリペプチドは抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に応答しない患者、または治療がまだ始まっておらず、それまでに抗ＴＮＦ−α抗体に曝露されなかった患者に対して投与され得る。

本発明の特定の実施形態では炎症を伴う前記疾患が炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、全身性強皮症（sclerodoma）、乾癬、胃腸部の例えば移植片対宿主病、クローン病、糖尿病、潰瘍性大腸炎、急性移植拒絶および慢性移植拒絶、大腸炎、肺胞炎、閉塞性細気管支炎、回腸炎、膵臓炎、糸球体腎炎、ぶどう膜炎、関節炎、肝炎、皮膚炎、動脈硬化症（artherosclerosis）、リウマチ性関節炎のみではないがリウマチ性関節炎を含むあらゆる形の関節炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、化膿性汗腺炎およびアトピー性皮膚炎からなる群より選択される、本発明に従って使用されるポリペプチド。

特定の実施形態では前記ポリペプチドは配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのアミノ酸配列からなるポリペプチドによって代表される抗体またはｓｃＦｖ断片などの抗体断片、特に断片Ｈ２２（ｓｃＦｖ）である。

本発明の追加の実施形態では前記Ｈ２２（ｓｃＦｖ）化合物は配列番号２：
ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＳＧＨＩＤＤＤＤＫＨＭＫＬＭＡＱＰＡＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＳＳＳＧＦＩＦＳＤＮＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＴＩＳＤＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＧＹＹＲＹＥＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＨＱＹＬＳＳＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
を有する組換えポリペプチドである。

本発明の対象は、本発明のポリペプチドと、膜貫通型ＴＮＦ−αのブロック剤、例えば、抗体またはそれらの誘導体、膜型ＴＮＦ−αの発現レベルを低下させるｓｉＲＮＡ／アンチセンスＲＮＡと、を含む混合物でもある。

本発明の対象は、炎症を伴う疾患の治療を必要とする患者に本発明のポリペプチドを抗ＴＮＦ−α抗体と併用投与することによって前記疾患を治療する方法でもある。

本発明の実施形態では、前記患者は抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に対して応答しない患者である。

本発明の追加の実施形態は、抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法において患者の治療を強化するための方法、特に抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に対して応答しない患者の治療を強化するための方法である。

本発明の方法のさらに別の実施形態では、本発明のポリペプチドは膜貫通型ＴＮＦ−αのブロック剤と併用投与される。

ＩｇＧ４は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉を減少させるが、これにはＣＤ１６のブロックが介在することを示す。血清はＩｇＧ４および非グリコシル化ＩｇＧ１のＣＤ６４への結合に対して影響を有しないことを示す。ＣＤ６４特異的抗体断片Ｈ２２（ｓｃＦｖ）の作製および分析を示す。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉の減少はＨ２２（ｓｃＦｖ）によるＣＤ６４の特異的ブロックと量的に相関することを示す。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉の減少はＨ２２（ｓｃＦｖ）によるＣＤ６４の特異的ブロックと量的に相関することを示す。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）の結合は炎症誘発性下流シグナル伝達を誘導しないことを示す。ｍＴＮＦ−αの発現はＩＦＮ−γ刺激ＨＬ−６０細胞において上方制御されることを示す。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉にはＣＤ６４およびｍＴＮＦ−αが介在することを示す。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉する刺激済みＨＬ−６０細胞の能力は、ＣＤ６４とｍＴＮＦ−αの両方のブロックによって完全に消失することを示す。

本発明の根底にある技術的課題を解決するためにＦｃγドメインの捕捉を防ぐことがＣＤ６４特異的治療薬候補の開発の狙いとされた。

ＩｇＧ４はＣＤ３２またはＣＤ１６に結合するよりも１００倍超高い親和性でＣＤ６４に結合するので（Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．，Ｉａｎｎａｓｃｏｌｉ，Ｂ．，Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｐ．，Ｍａｎｃａｒｄｉ，Ｄ．Ａ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．，Ｊｏｒｉｅｕｘ，Ｓ．およびＤａｅｒｏｎ，Ｍ．著、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｖａｒｉａｎｔｓｆｏｒｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ誌、２００９年、第１１３巻：３７１６〜３７２５頁）ヒトＩｇＧ１のＦｃγドメインをそのＩｇＧ４の対応物と交換することが一つの選択肢であったが、この交換により、ＩｇＧ４は刺激済みＨＬ−６０細胞による抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉を低下させることができるが、驚くべきことにその効果は最初に予期されたＣＤ６４よりもむしろＣＤ１６のブロックによって媒介されることが発見された。この発見は刺激済みＨＬ−６０細胞の表面上にＣＤ６４と比べてＣＤ１６が大量にあることを反映している可能性がある。これらのインビトロでの結果は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉におけるＣＤ１６の関与を確認し、且つ、以前の観察結果と一致しているが、それにもかかわらずＩｇＧ４はＣＤ６４の選択的ブロックに不適切であることがわかった。

遺伝的および酵素的に非グリコシル化型のＩｇＧ１−ＦｃγドメインはＣＤ１６およびＣＤ３２に結合するそれらの能力を失っているが、ＣＤ６４に対する残存結合親和性を保持していることが知られている（Ｊｕｎｇ、Ｓ．Ｔ．、Ｋａｎｇ、Ｔ．Ｈ．、Ｋｅｌｔｏｎ，Ｗ．およびＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ｇ．著、Ｂｙｐａｓｓｉｎｇｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｈｕｍａｎｔｈｅｒａｐｙ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ誌、２０１１年、第２２巻：８５８〜８６７頁）。しかしながら以前の報告と正反対に非グリコシル化ＩｇＧ１はＣＤ３２をブロックするが、ＣＤ６４またはＣＤ１６をブロックしないことがわかった。ＣＤ３２のブロックが抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉するＨＬ−６０細胞の能力を低下させることはなかった。このことは患者が抗ＴＮＦ−α療法に応答できないことにＣＤ３２が影響していないことを示している。

ＣＤ６４特異的ブロックは、元はマウス全長型ｍＡｂ２２に由来する組換えＣＤ６４特異的抗体断片を設計し、発現させることで最終的に達成された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｕｙｒｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｗｈｉｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｙａｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｌｏｏｎｅｙ，Ｒ．Ｊ．およびＦａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．著、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｒＩｇＧｏｎｈｕｍａｎｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｙｔｅｃｅｌｌｌｉｎｅ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ誌、１９８６年、第２６１巻：１２８５６〜１２８６４頁）。開発の過程で全長型ｍＡｂＨ２２を産生するためにｍＡｂ２２がヒト化され（Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら著、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉ−ｇａｍｍａ−ＩｇｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＩ（ＦｃｇａｍｍａＲＩ）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ誌、１９９５年、第１５５巻：４９９６〜５００２頁）、その後で単鎖断片として再フォーマット化されてＨ２２（ｓｃＦｖ）が生じた。我々は我々の研究室において充分に確立されているストレス誘導性ペリプラズムタンパク質発現プロトコル（Ｂａｒｔｈ，Ｓ．ら著、Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ−ｓｏｌｕｔｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、２０００年、第６６巻：１５７２〜１５７９頁）を用いて大腸菌内で組換えＨ２２（ｓｃＦｖ）を生産した。刺激済みＨＬ−６０細胞への組換えＨ２２（ｓｃＦｖ）の添加によりＣＤ６４の強力で特異的なブロックを生じさせ、そうして抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉するそれらの細胞の能力を強力に低下させた。全長型ｍＡｂ２２およびＨ２２はＦｃγドメイン結合部位の外側にあるＣＤ６４上のエピトープに結合することが示されているので（Ｇｕｙｒｅ，Ｐ．Ｍ．ら著、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｈａｔｂｉｎｄｔｏｄｉｓｔｉｎｃｔｅｐｉｔｏｐｅｓｏｎＦｃｇａｍｍａＲＩａｒｅａｂｌｅｔｏｔｒｉｇｇｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ誌、１９８９年、第１４３巻：１６５０〜１６５５頁）この結果は予期せぬものであった。しかしながらＦｃγドメイン結合部位の外側での結合にもかかわらず、Ｈ２２結合はヒト血清中の他のＩｇＧ分子の存在と無関係であることが示されている（Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら著、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉ−ｇａｍｍａ−ＩｇｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅＩ（ＦｃｇａｍｍａＲＩ）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ誌、１９９５年、第１５５巻：４９９６〜５００２頁）。加えて、Ｈ２２はオプソニン化赤血球のＣＤ６４介在性貪食を効果的に妨害し、且つ、生理的条件下でＣＤ６４の発現を強力に下方制御する（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｐ．Ｋ．ら著、ＨｕｍａｎｉｚｅｄｍＡｂＨ２２ｂｉｎｄｓｔｈｅｈｕｍａｎｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＦｃｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒＩｇＧ（ＦｃｇａｍｍａＲＩ），ｂｌｏｃｋｓｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＪＬｅｕｋｏｃＢｉｏｌ誌、１９９７年、第６２巻：４６９〜４７９頁）。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）のブロック効果を立体障害によって説明することができるかどうかは不明のままである。しかしながら、この独特の抗ＣＤ６４抗体の上述した全ての特徴が、血清条件下であってもＣＤ６４に結合し、ＣＤ６４をブロックし、且つ、その表面レベルを低下させるその抗体の能力の基になっている。このことがＨ２２（ｓｃＦｖ）を慢性炎症性疾患の特定の興味深い治療薬候補にしている。

加えて、本発明に従う治療は本発明のポリペプチドと膜貫通型ＴＮＦ−αのブロック剤の併用投与によってさらに改善される。

興味深いことにサイトカインＴＮＦ−αは可溶型と膜結合型の両方の型で存在する。その可溶型は慢性炎症条件下では病的であり、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の治療標的であるが、ｍＴＮＦ−αの役割はあまり理解されていない。本発明者らは刺激済み（炎症誘発性）ＨＬ−６０細胞上でのｍＴＮＦ−α単独の表面発現を検討した。抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉する刺激済みＨＬ−６０細胞の能力は、ＣＤ６４とｍＴＮＦ−αの両方のブロックによって完全に消失することがわかった。このことはＣＤ６４とｍＴＮＦ−αの両方が抗ＴＮＦ−α療法の成功に対して重大な影響を有することを示している（図９）。

結論として、ＣＤ６４ブロック抗体、特にＣＤ６４ブロック抗体断片Ｈ２２（ｓｃＦｖ）は、炎症性単球およびマクロファージの表面上での過剰発現が抗ＴＮＦ−α療法に対する幾人かの患者の応答不良と関連しているＣＤ６４による抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉を妨げる。ＣＤ６４ブロック抗体、特にＣＤ６４ブロック抗体断片Ｈ２２（ｓｃＦｖ）は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の活性を増強することによりそれらのモノクローナル抗体の治療効力を促進する。本発明は、ｍＴＮＦ−αの発現上昇が抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体のＦａｂドメインを介しての捕捉に寄与するという発見にも基づいている。したがって、ｍＴＮＦ−αを特異的にブロックする抗体と組み合わされたＣＤ６４ブロック抗体は抗ＴＮＦ−α療法の効力をさらにずっと高め、且つ、それに応じて非応答者の集団を減少させる。

本発明のポリペプチドは特にＮ末端において、Ｃ末端において、および／またはペプチド鎖の中で、誘導体化され得る。Ｎ末端の誘導体化は部分的または完全な、アルキル化、アシル化または別のＮ修飾を含み得る。Ｃ末端の誘導体化はアミド化、エステル化または末端カルボキシ基の別の修飾を含み得る。ポリペプチド鎖の誘導体化は特に本発明に従うポリペプチドの特性を改善するための修飾、例えば、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化またはそのようなものを含み得る。所望により、本発明に従うポリペプチドは本発明に従うポリペプチドが用いられる予定の生物の細胞構造体に対する結合親和性を有する構造単位に連結されてもよい。ポリペプチドの改変された特性を達成するために適切な誘導体化は当業者に知られている。言及した活性を有する本発明に従うポリペプチドの誘導体も本発明に従って請求される。

本発明のポリペプチドは本発明のポリペプチドのポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を特に示す。

したがって、本発明によるとポリペプチドはその配列の短縮化またはさらなるアミノ酸残基の付加または欠失から生じる本発明の実施形態である。さらに、例えば組換え型の調製時により高い収率を達成するため、または精製を容易にするために付加された追加の配列要素を有する前記ポリペプチドの変異体を使用することが可能である。

個々のアミノ酸残基を除去すること、または個々のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることが有利である場合があり得る。追加のアミノ酸残基の挿入も可能である。前記ポリペプチドの短縮変異体または延長変異体から始まって、そのような変更をすることも可能である。特に、同様の物理化学的特性を有するアミノ酸で個々のアミノ酸残基を置き換えることが有利である場合があり得る。したがって、主に前記アミノ酸残基は次のグループ内で相互に交換可能である：
アルギニンおよびリシン、
グルタミン酸およびアスパラギン酸、
グルタミン、アスパラギンおよびトレオニン、
グリシン、アラニンおよびプロリン、
ロイシン、イソロイシンおよびバリン、
チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン、
セリンおよびトレオニン。

ペプチドは当業者に知られている様々な方法で医薬として製剤される。薬学的に許容可能な賦形剤がそのような医薬の中に存在し得る。担体または希釈剤としての使用に適切な薬学的に許容可能な賦形剤が当技術分野においてよく知られており、様々な製剤に使用され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９９０年）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００年）、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ編、ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（２０００年）、およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｄｄｉｔｉｖｅｓ、ＭｉｃｈａｅｌおよびＩｒｅｎｅＡｓｈ編、Ｇｏｗｅｒ（１９９５年）を参照されたい。

本医薬中の本発明のポリペプチドの治療有効量は公開されている材料と方法を用いて当業者によって容易に確認され得る。例えば、前記ポリペプチドのその量は約０．１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの間の量で前記製剤中に存在し得る。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約２５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約３０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約７５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約８５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約９０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。幾つかの実施形態では本発明のポリペプチドは約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。

本開示の様々な実施形態では前記医薬製剤はそれらの製剤の中和によって得られるｐＨを有する。本明細書において使用される場合、「中和」という用語は組成物がより中性のｐＨを有するようにすること（すなわち、組成物のｐＨを約６．８〜約７．５のｐＨに変えること）を意味する。例えば、塩基性組成物への酸性物質の添加によってより中性のｐＨ（すなわち、約６．８〜７．５）をその塩基性組成物に持たせることができる。同様に、酸性組成物への塩基性物質の添加によってより中性のｐＨ（すなわち、約６．８〜７．５）をその酸性組成物に持たせることができる。

本開示の幾つかの実施形態では前記医薬製剤のｐＨは、本発明のポリペプチドと１種類以上の賦形剤を混合した後にその製剤を中和することによって得られる。１つの実施形態ではその中和は本発明のポリペプチドの添加によって達成される。別の実施形態ではその中和は薬学的に許容可能な酸または塩基の添加によって達成される。１つの実施形態ではその薬学的に許容可能な酸または塩基は水酸化ナトリウムである。別の実施形態ではその薬学的に許容可能な酸または塩基は酢酸ナトリウムである。さらに別の実施形態ではその薬学的に許容可能な酸または塩基はクエン酸ナトリウムである。別の実施形態ではその薬学的に許容可能な酸または塩基は安息香酸ナトリウムである。

本開示の様々な実施形態では本発明のポリペプチドは凍結乾燥を介して調製される。フリーズドライとしても知られる「凍結乾燥」という用語は、目的のタンパク質調製物からの水の除去に役立つタンパク質の提供用に一般的に用いられる技術である。凍結乾燥は乾燥予定の物質を最初に凍結し、次に真空環境中での昇華によって氷または凍結溶媒を除去する処理である。

本開示の他の実施形態では本発明のポリペプチド製剤を調製するための方法が記載される。その方法は本発明のポリペプチドと１種類以上の賦形剤を混合し、６．８〜８．０の範囲が許容可能であるが約６．８を超えるｐＨにまでその製剤をその混合の後に中和する工程を含む。賦形剤、ｐＨ範囲および特定のｐＨ値、および中和技術をはじめとする前記医薬製剤のこれまでに記載された実施形態がそれらの製剤の調製方法に適用可能である。

本開示の他の実施形態では本発明のポリペプチド製剤を調製するための方法によって作製された製品が記載される。その製品は本発明のポリペプチドと１種類以上の賦形剤を混合し、６．８〜８．０の範囲が許容可能であるが約６．８を超えるｐＨにまでその製剤をその混合の後に中和する工程を含む方法によって作製され得る。賦形剤、ｐＨ範囲および特定のｐＨ、および中和技術を含む前記医薬製剤のこれまでに記載された実施形態がそれらの製剤の調製方法によって作製される製品に適用可能である。

本開示によると、本発明のポリペプチドを含有する製剤は、限定されないが、非経口的投与をはじめとしてタンパク質またはペプチドに適切なあらゆる従来の経路によって投与されてよく、例えば、限定されないが、皮下または静脈内、または他のあらゆる形態の注射または注入をはじめとする注射によって投与されてよい。本発明のポリペプチドを含有する製剤は、限定されないが、経口手段、静脈内手段、腹膜内手段、筋肉内手段、経皮手段、皮下手段、局所手段、舌下手段、血管内手段、乳腺内手段、または直腸手段をはじめとする多数の経路によって投与され得る。本発明のポリペプチドを含有する製剤はリポソームを介しても投与され得る。そのような投与経路および適切な製剤は当業者に一般的に知られている。吸入による投与のため、本発明のポリペプチドを含有する製剤を単独で、または他の適切な成分と組み合わせてエアロゾル製剤にすることもできる（すなわち、それらは「噴霧」され得る）。エアロゾル製剤はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような許容可能な加圧噴射剤中に投入され得る。

非経口投与（例えば、関節内経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹膜内経路、および皮下経路を介した投与）に適切な本発明のポリペプチドを含有する製剤には水性および非水性の等張性無菌注射液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図される受容者の血液と前記製剤を等張にする溶質を含み得る）、および水性および非水性の無菌懸濁剤（懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る）が含まれる。本発明のポリペプチドを含有するそれらの製剤をアンプルおよびバイアルのような単回投与用容器または多数回投与用容器の中に提供することができる。本発明のポリペプチドを含有するそれらの製剤を充填済み注射器のような注射器の中に提供することもできる。

本発明を以下の実施例によってさらに説明する。

臨床で使用されている完全ヒト抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（アダリムマブ）またはキメラ抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体（インフリキシマブ）とは対照的に、入手可能性の問題からマウス由来抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体を使用した。マウスＩｇＧ１−ＦｃγはヒトＣＤ６４に対して低い親和性を有することが報告されており、それは実験準備に重大な影響を与える。しかしながら文献中に見られるデータと対照的に、ヒトＣＤ６４は（およびＣＤ１６とＣＤ３２も）細胞ベースのインビトロ実験系においてここで使用されるマウス抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体を強力に捕捉することができ、それによって抗ＴＮＦ−αの捕捉に対するＣＤ６４ブロック分子の効果を研究することが可能になった。

材料と方法
抗体およびサイトカイン
ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、およびＴＮＦ−αに対する抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（フランクフルト、ドイツ）から購入した。ヒト抗ＩｇＧ４をＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ社（デュッセルドルフ、ドイツ）から得た。ヒト非グリコシル化ＩｇＧ１を自製した。抗ｍＴＮＦ−α（Ｇｅｒｓｐａｃｈ，Ｊ．ら著、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）：ａｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴＮＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ．ＭｉｃｒｏｓｃＲｅｓＴｅｃｈ誌、２０００年、第５０巻：２４３〜２５０頁）をＨｙｃｕｌｔｅｃＧｍｂＨ社（ボイテルスバッハ、ドイツ）から購入した。マウス抗Ｈｉｓ_５およびマウス抗Ｈｉｓ_５−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８をＱｉａｇｅｎ社（ヒルデン、ドイツ）から得た。アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧをＳｉｇｍａ社（シュタインハイム、ドイツ）から得た。ヤギ抗マウスフィコエリスリン（ＧＡＭ−ＰＥ）はＤｉａｎｏｖａ社（ハンブルク、ドイツ）に由来した。ヒトＩＦＮ−γおよびヒトＴＮＦ−αをそれぞれＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社（ハンブルク、ドイツ）およびｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から得た。

Ｈ２２（ｓｃＦｖ）の作製
Ｈ２２（ｓｃＦｖ）のオープン・リーディング・フレームをｐｅｌＢリーダーペプチド配列および精製検出用タグＨｉｓ_１０（Ｈｒｉｓｔｏｄｏｒｏｖら著、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｔａｕｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｋｉｌｌｉｎｇｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎａｘｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｕｓｅｔｕｍｏｕｒｍｏｄｅｌｉｎｖｉｖｏ．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ誌、２０１３年：１〜９頁）とインフレームで細菌発現ベクターｐＭＴ（Ｍａｔｔｈｅｙ，Ｂ．ら著、ＡｎｅｗｓｅｒｉｅｓｏｆｐＥＴ−ｄｅｒｉｖｅｄｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｘｏｔｏｘｉｎ−ｂａｓｅｄｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｅ誌、１９９９年、２２９巻：１４５〜１５３頁）に挿入した。クローニングの成功を試験的消化およびシーケンシングにより確認した。発現、精製、およびタンパク質分析をこれまでに記載されたように実施した（Ｈｒｉｓｔｏｄｏｒｏｖら著、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｔａｕｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｔｈｅｔａｒｇｅｔｅｄｋｉｌｌｉｎｇｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎａｘｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｕｓｅｔｕｍｏｕｒｍｏｄｅｌｉｎｖｉｖｏ．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ誌、２０１３年：１〜９頁；Ｂａｒｔｈ，Ｓ．ら著、Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ−ｓｏｌｕｔｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、２０００年、第６６巻：１５７２〜１５７９頁）。

細胞培養
ヒト前骨髄球性ＨＬ−６０細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４０）およびヒトホジキンリンパ腫細胞株Ｌ５４０ｃｙ（ＤＳＭＺ：ＡＣＣ７２）を１０％（体積／体積）のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中において３７℃、１００％の湿度、および５％のＣＯ_２で培養した。ＨＬ−６０細胞を各実験の２４時間前に５０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで刺激した。

フローサイトメトリーによる細胞結合分析
各抗体の細胞結合活性をフローサイトメトリーにより分析した。我々は２ｍＭのＥＤＴＡと０．５％（重量／体積）のＢＳＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）の中で４×１０^５細胞を既知量の抗体と氷上で３０分間にわたってインキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄した。暗所において氷上で抗Ｈｉｓ_５−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（１：１００）またはＧＡＭ−ＰＥ（１：１００）を３０分間にわたって使用して非標識一次抗体を検出した。その後、それらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ハイデルベルク、ドイツ）上で分析した。

ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ分析
ＳＶトータルＲＮＡアイソレーションシステム（プロメガ社、マンハイム、ドイツ）を使用してＲＮＡを単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔリバーストランスクリプションキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。ＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。サイクル条件は、ステージ１（５０℃、２分）、ステージ２（９５℃、１０分）、ステージ３：３５反復の（９５℃、１５秒；６０℃、１分）であった。比較閾値サイクル法を用いて標的遺伝子の発現レベルをＧＡＰＤＨの発現レベルに対して正規化した。次のプライマーを使用した：ＩＬ−１β＿ｆ：ＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡ、ＩＬ−１β＿ｒ：ＧＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴ、ＩＬ−６＿ｆ：ＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＴ、ＩＬ−６＿ｒ：ＧＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣ、ＩＬ−８＿ｆ：ＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣ、ＩＬ−８＿ｒ：ＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＴＴＴＣ、ＧＭ−ＣＳＦ＿ｆ：ＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡ、ＧＭ−ＣＳＦ＿ｒ：ＧＴＣＴＧＴＡＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＣＴＣ、ＴＮＦ−α＿ｆ：ＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡ、ＴＮＦ−α＿ｒ：ＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡ、ＧＡＰＤＨ＿ｆ：ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ、およびＧＡＰＤＨ＿ｒ：ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を使用してデータを分析した。全ての実験を三回実施した。

実施例１
ＩｇＧ４は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉を減少させるが、これにはＣＤ１６のブロックが介在する
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃγ断片はＣＤ６４をブロックし、そうして抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の阻害活性を回復させることが示されている（Ｗｏｊｔａｌ，Ｋ．Ａ．ら著、ＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ６４ｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．ＰＬｏＳＯｎｅ誌、２０１２年、第７巻：ｅ４３３６１頁）。しかしながらこれらの断片は一次免疫応答の重要な要素を仲介するＣＤ１６とＣＤ３２もブロックする。ヒトＩｇＧ１と対照的に、ヒトＩｇＧ４のＣＤ１６とＣＤ３２に対する親和性は、ＣＤ６４に対する親和性よりも低い（Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．ら著、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｖａｒｉａｎｔｓｆｏｒｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ誌、２００９年、第１１３巻：３７１６〜３７２５頁）。ヒト非関連ＩｇＧ４モノクローナル抗体を使用してＣＤ６４を優先的にブロックし、一方でＣＤ１６およびＣＤ３２の活性のほとんどを維持した。ＩｇＧ４は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉をかなり減少させることができたが、我々の予想と対照的にこの効果はＣＤ６４またはＣＤ３２よりもむしろＣＤ１６によって媒介された（図１上のパネル）。

グリカンの消失によってＣＤ１６およびＣＤ３２の結合が失われるが、ＣＤ６４に対する残存親和性が保持されることが以前に示されているので（Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｔ．ら著、Ｂｙｐａｓｓｉｎｇｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｈｕｍａｎｔｈｅｒａｐｙ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ誌、２０１１年、第２２巻：８５８〜８６７頁）、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体を使用してＣＤ６４を特異的にブロックした。興味深いことにＩＦＮ−γ刺激ＨＬ−６０細胞の非グリコシル化ＩｇＧ１との事前インキュベーションによってＣＤ３２のブロックが生じたが、ＣＤ６４またはＣＤ１６のブロックは生じなかった。しかしながら、これによって抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉は減少せず、ＣＤ６４およびＣＤ１６だけがこの過程に関与することが示唆された（図１下のパネル）。

実施例２
血清はＩｇＧ４および非グリコシル化ＩｇＧ１のＣＤ６４への結合に対して影響を有しない
ＣＤ６４はＩｇＧ分子のＦｃγ部分に高い親和性（１０^−７〜１０^−８Ｍ）を有する（Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．ら著、ＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｖａｒｉａｎｔｓｆｏｒｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ誌、２００９年、第１１３巻：３７１６〜３７２５頁）。したがって、血清の存在下ではＣＤ６４およびそのリガンドの結合解離速度は短時間であり、それによってＩｇＧによるその受容体のほぼ恒久的な結合が生じる。ＣＤ６４が（上で示したように）ＩｇＧ４および非グリコシル化ＩｇＧ１に結合できないことの１つの可能な説明は、ＨＬ−６０細胞の培養に使用される血清含有培地中のＩｇＧの存在である。したがって、ＨＬ−６０細胞を無血清培地中で２週間にわたって培養し、フローサイトメトリー実験を繰り返した。しかしながら、血清が存在しなくてもＩｇＧ４も非グリコシル化ＩｇＧ１もＣＤ６４に結合しなかった（図２）。

実施例３
ＣＤ６４特異的抗体断片Ｈ２２（ｓｃＦｖ）の作製および分析
ＣＤ６４に特異的に結合するＨ２２（ｓｃＦｖ）という名前の単鎖抗体断片を作製した。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）コード配列をＮ末端ｐｅｌＢリーダーペプチドおよびＨｉｓ_１０タグとインフレームで融合した（図３ａ）。ペリプラズムストレス発現プロトコル（Ｂａｒｔｈ，Ｓ．ら著、Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ−ｓｏｌｕｔｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、２０００年、第６６巻：１５７２〜１５７９頁）を用いて大腸菌内でそのタンパク質を発現させることに成功した。精製タンパク質の収率は細菌ペレットｇ当たり０．１４ｍｇであった。精製されたＨ２２（ｓｃＦｖ）の同一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクマシーブリリアントブルーによるゲルの染色、およびポリヒスチジン特異的抗体を使用するウエスタンブロットによって確認した（図３ｂ）。加えて、Ｈ２２（ｓｃＦｖ）がＣＤ６４^＋標的細胞に特異的に結合し（図３ｂ）、ＣＤ６４⁻ Ｌ５４０ｃｙ細胞に結合しない（データを示さず）ことがフローサイトメトリーによって示された。

実施例４
抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉の減少はＨ２２（ｓｃＦｖ）によるＣＤ６４の特異的ブロックと量的に相関する
組換えＨ２２（ｓｃＦｖ）を使用して抗ＴＮＦ−α抗体の添加前にＨＬ−６０細胞の表面上のＣＤ６４を特異的にブロックした。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）がＣＤ６４をブロックし（図４ａ）、そうして抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉を減少させること、およびその効果が全長型抗ＣＤ６４抗体の効果と同等であること（図４ｂ）がフローサイトメトリーによって示された。

細胞表面上の全てのＣＤ６４分子を飽和するために必要な抗ＣＤ６４モノクローナル抗体の濃度を測定することでＣＤ６４ブロックを定量化し、最小の飽和濃度が５０ｎＭ以上であることが明らかになった（図５ａ）。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）は一価であり、一方で全長型抗ＣＤ６４モノクローナル抗体は二価であるので、１００ｎＭのＨ２２（ｓｃＦｖ）は理論的には全てのＣＤ６４分子をブロックするためには充分であるにちがいない。このことは培養ＨＬ−６０細胞に対してＨ２２（ｓｃＦｖ）を直接的に滴定することによって確認され（図５ｂ）、我々はＨ２２（ｓｃＦｖ）によるＣＤ６４のブロックが抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉の減少と量的に相関することを見出した（図５ｃ）。

実施例５
Ｈ２２（ｓｃＦｖ）の結合は炎症誘発性下流シグナル伝達を誘導しない
抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体のＦｃγ部分は、ＣＤ６４に結合すると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む炎症促進性遺伝子の発現を誘導することができる（Ｗｏｊｔａｌ，Ｋ．Ａ．ら著、ＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ６４ｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．ＰＬｏＳＯｎｅ誌、２０１２年、第７巻：ｅ４３３６１頁）。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）によって下流サイトカイン産生も誘導されるか検査するため、未刺激またはＩＦＮ−γ刺激されたＨＬ−６０細胞を１００ｎＭのＨ２２（ｓｃＦｖ）または抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体とインキュベートし、またはＨ２２（ｓｃＦｖ）と事前インキュベートした後に抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を添加した。追加の試薬を含まないＩＦＮ−γ刺激ＨＬ−６０細胞を対照として使用した。遺伝子特異的プライマーを使用するリアルタイムＰＣＲによってサイトカイン遺伝子発現の誘導を測定した。それらの細胞が抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体のみとインキュベートされるとサイトカイン遺伝子が誘導されたが、Ｈ２２（ｓｃＦｖ）のみが存在するときには誘導は無く、炎症誘発性サイトカインを誘導する抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の能力はＨ２２（ｓｃＦｖ）との事前インキュベーションによって強力に減弱化された（図６）。幾人かの患者における抗ＴＮＦ−α療法に対する応答不良はＣＤ６４の過剰発現に付随しており、その過剰発現は抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉および炎症誘発性応答の誘導を引き起こす（Ｗｏｊｔａｌ，Ｋ．Ａ．ら著、ＦｃｇａｍｍａｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ６４ｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ．ＰＬｏＳＯｎｅ誌、２０１２年、第７巻：ｅ４３３６１頁）。Ｈ２２（ｓｃＦｖ）によるＣＤ６４のブロックによって抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉が減少し、そうして下流の炎症誘発性作用も制限される。

実施例６
ｍＴＮＦ−αの発現はＩＦＮ−γ刺激ＨＬ−６０細胞において上方制御される
ＴＮＦ−αは可溶性サイトカインとしても膜貫通タンパク質としても存在し、後者はその可溶性対応物の全身炎症性作用を失っている。炎症性ＣＤ６４^ｈｉｇｈ単球／マクロファージは高レベルのｍＴＮＦ−αを発現する可能性があるので、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉がそれらの抗原結合Ｆａｂドメインを介して増加するであろう。膜貫通型を選択的に認識するモノクローナル抗体（Ｇｅｒｓｐａｃｈ，Ｊ．ら、Ｍ．著、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）：ａｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴＮＦ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｇｅｎｔｓ．ＭｉｃｒｏｓｃＲｅｓＴｅｃｈ誌、２０００年、第５０巻：２４３〜２５０頁）を使用してＩＦＮ−γ刺激（炎症誘発性）および未刺激ＨＬ−６０細胞をｍＴＮＦ−αの発現について検査した。刺激済みＨＬ−６０細胞だけがｍＴＮＦ−αを発現することがわかった（図７）。このことは抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉する追加的機構の存在を示している。

実施例７
抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉にはＣＤ６４およびｍＴＮＦ−αが介在する
ｍＴＮＦ−αが抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉に関与しているか判定するため、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉する刺激済みＨＬ−６０細胞の能力を測定する前に、上記載ｍＴＮＦ−α特異的抗体を使用して、当該細胞の表面上でｍＴＮＦ−αを事前ブロックした。ｍＴＮＦ−αのブロックによって抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉するそれらの細胞の能力が予想通り低下し（図８ａ〜ｃ）、Ｈ２２（ｓｃＦｖ）と抗ｍＴＮＦ−αによるブロックの相加的効果が抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を捕捉する刺激済みＨＬ−６０細胞の能力の総計と一致することがわかった（図８ｄ）。この結果から、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の捕捉はＣＤ６４とｍＴＮＦ−αの両方の発現に依存することが確認される。

Claims

炎症を伴う疾患の治療に抗ＴＮＦ−α抗体と併用される、ＣＤ６４に対する結合親和性が少なくとも１０^−９Ｍであるポリペプチド。
前記炎症を伴う疾患が炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、全身性強皮症（sclerodoma）、乾癬、胃腸部の病、例えば移植片対宿主病、クローン病、糖尿病、潰瘍性大腸炎、急性の移植拒絶または慢性の移植拒絶、大腸炎、肺胞炎、閉塞性細気管支炎、回腸炎、膵臓炎、糸球体腎炎、ぶどう膜炎、関節炎、肝炎、皮膚炎、動脈硬化症（artherosclerosis）、リウマチ性関節炎のみではないがリウマチ性関節炎を含むあらゆる形の関節炎、多発性硬化症、強直性脊椎炎、化膿性汗腺炎およびアトピー性皮膚炎からなる群より選択される、請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１に記載の使用のための請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが抗体断片、特にｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１に記載の使用のための請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
前記Ｈ２２（ｓｃＦｖ）抗体断片が配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の使用のための請求項４に記載のポリペプチド。
前記Ｈ２２（ｓｃＦｖ）化合物が組換えポリペプチドである、請求項１に記載の使用のための請求項４または請求項５に記載のポリペプチド。
配列番号２のアミノ酸配列を含む、または配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の使用のための請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法に対して応答しない患者における請求項１に記載の使用のための請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項１に記載の使用のための請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のポリペプチドと、膜貫通型ＴＮＦ−αおよび／または可溶性ＴＮＦ−αのブロック剤と、を含む混合物。
炎症を伴う疾患の治療を必要とする患者に請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のポリペプチドを抗ＴＮＦ−α抗体と併用投与することによって前記疾患を治療する方法。
前記患者が、抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に対して応答しない患者である、請求項１０に記載の方法。
抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法において患者の治療を強化するための方法。
前記患者が、抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療法による炎症の治療に対して応答しない患者である、請求項１２に記載の方法。
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のポリペプチドが膜貫通型ＴＮＦ−αのブロック剤と併用投与される、請求項１０〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。