KR102215798B1

KR102215798B1 - 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102215798B1
Application number: KR1020190138238A
Authority: KR
Inventors: 이수경
Original assignee: 이수경
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2021-02-15

Abstract

본 발명은 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 보존제는, 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 인체 무해하면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월한 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물이 제공된다.

Description

항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물{Preservative composition including peptide having antibacterial activity and cosmetic composition having the same}

본 발명은 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항균 펩타이드를 이용하여 인체 무해하면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월한 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

통상적으로 화장품에 사용하는 화학보존제로는 paraben, imidazolidinyl urea phenoxyethanol, chlorphenesin, 1,2-Hexanediol 등이 알려져 있으나 이들 화학 보존제들은 피부 알러지, 피부 자극, 환경 호르몬으로서의 가능성, 내성균 유발의 문제 등과 같은 부작용이 보고되고 있다.

특히, 상기 화학 보존제들은 에스트로겐 유사 작용으로 인한 유방암 유발과 관련된 연구결과도 보고되고 있어, 허용된 기준내의 사용에 대한 불신과 체내 축적으로 인한 급/만성 독성, 돌연변이 유발 등과 같은 새로운 문제들이 제기되고 있다.

이에 상기와 같은 화학보존제의 부작용을 해결하기 위해 천연에서 유래된 보존제 개발들이 이루어지고 있는 추세이며, 최근에는 항균활성능이 높은 펩타이드들의 다양한 활용 용도에 대해서 여러 연구가 시행되고 있다. 그러나 단순히 여러 곤충들을 대상으로 한 항균활성이나 특정 활성에 대한 효능만이 언급되어 있을뿐, 천연 물질 2종 이상의 조합에 따른 상승된 기재효과 및 부작용에 대해서는 아직까지 그 연구가 미흡한 실정이다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1740551호 '벼메뚜기에서 유래한 항균 펩타이드 옥시야신-2 및 그의 조성물' 2. 대한민국 등록특허 제10-1825952호 '벼메뚜기에서 유래한 항균 펩타이드 옥시야신-3 및 그의 조성물'

본 발명의 목적은 인체 무해하면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월한 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 보존제는, 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

또한, 상기 혼합 펩타이드는 상기 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 상기 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 상기 서열번호 3으로 표현되는 조 식물 유래 펩타이드 단편이 1 : 1~2 : 0.5 중량비로 혼합 구성되는 것이 특징이다.

또한, 상기 혼합 펩타이드는 포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 캔디다균(Candida albicans). 흑국균(Aspergillus brasiliensis)에 대한 항균활성능을 갖는 것이 특징이다.

또한, 상기 혼합 펩타이드의 함량은 조성물 총 중량 대비 0.01~99 중량%인 것이 특징이다.

또 다른 본 발명인 화장료 조성물은, 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 보존제를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에 의해, 인체 무해하면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월한 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 항균 펩타이드를 포함하는 보존제의 제조공정도를 나타낸 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.

본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이 항균 펩타이드를 포함하는 보존제 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 것으로써, 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 보존제를 이용함에 따라 항염 및 방부 효과를 나타내게되고 결과적으로 화학 방부제를 사용하지 않아 피부 부작용이 거의 없는 등 인체에 무해한 화장료 조성물을 제공할 수 있게 된다. 이에 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

<본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 보존제의 제조공정>

1. 제1공정: 항균 펩타이드들 준비(S10)

본 공정에서는 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

설명하면, 상기 펩타이드들은 연꽃(Nymphaea nelumbo), 토마토(Solanum lycopersicum), 조 식물(Setaria italica)의 각 추출물을 준비한 후 상기 연꽃 추출물에서는 메틸전달효소(Methyltrasferase)를, 상기 토마토 추출물에서는 Unchracterized protein를, 상기 조 식물에서는 단백질분해효소(Protease)를 수득한다.

이때, 수득된 각 수득물들의 서열들을 확인한 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.

대상	산처리전 펩타이드 염기서열
연꽃 Nymphaea nelumbo Methyltransferase 'DN-PEP F1'	GVLGTRRLPY PSRSFEFAHC SRCRIDWLQR DGILLLELDR LLRPGGYFAY SSPEAYAQDE EDLRIWREMS ALVERMCWKI AAKRNQTVIW VKPLTNDCYM EREPGTQPPL CRSADDPDAV WNVKMEACIT PYPDQQHRAK GSGLAPWPAR LTSSPPRLAD FGYSSEIFEK DTEVWRRRVE SYWNLLSPKI KPDTLRNVMD MKANFGSFAA ALNDKNVWVM NVVPEDGPNT LKLIYDRGLI GTIHSWCEAF STYPRTYDLL HAWTVFSDLE KKECSAEDLL IEMDRILRPT GFIIVRDKKH IVEFIKKRLP ALHWEGVATG DASDSEQDED EVVFVIQKKM WLTSTSLRDT E
토마토 Solanum lycopersicum (Tomato) 'DN-PEP F2'	KMAMNSKLEM NEARDGDESE ARDDNVSKAR DGDVSEAGDG GDGDEAQDMI QKDSVELEKL QTTLRDD
조 식물 Setaria italica (Foxtail millet) (Panicum italicum) Protease 'DN-PEP F3'	MTANSDNSSG SPSPPSNTSS SPPPSSPSGP PPKSPGSNSP PSSPPTPSQS PSPPVPSLSP PTTATPQNGS ALPPPAPAAD RALPAAPSRQ SPSPPAAKRS GGESDKSGRS KSGGSSNGSP PVAAIVAGVV IGVLAFGLLM CIAACVCCTK KKKKKPPRMN MPYYTDEHGN VFYANSMPKW QNSGAMIDHG GGGWHAPFSP ASADMSGSHG PGQLPPPSPG MPSLGFTKSS YSYEELASAT SGFASANVLG QGGFGYVYKG VLPGSGKEVA VKQLKAGSGQ GEREFQAEVE IISRVHHRHL VSLVGYCVSG SSQRLLVYEF VPNNTLEHHL HGKGVPVMNW PTRLAIALGS AKGLAYLHED CHPRIIHRDI KAANILLDEN FEAKVADFGL AKLTTDTNTH

이렇게 수득된 상기 각각의 수득물에 2N 황산을 각각 처리하여 펩타이드 단편들을 수득한다.

이때, 상기 각 수득물과 상기 2N 황산는 1: 0.1~0.2 중량비로 혼합하여 펩타이드 단편을 수득하는 것이 적합하다.

이렇게 수득된 상기 펩타이드 단편의 염기서열을 분석한 결과, 하기 표 2에 나타나있듯이, 연꽃(Nymphaea nelumbo) 유래 펩타이드 단편은 서열번호 1로 표현되었고 이를 'DN-PEP 1'이라 명명하며, 토마토 유래 펩타이드 단편은 서열번호 2로 표현되었고 이를 'DN-PEP 2'라 명명하며, 상기 조식물 유래 펩타이드 단편은 서열번호 3으로 표현되었고 이를 'DN-PEP 3'이라 명명한다.

대상	산처리후 펩타이드 염기서열
연꽃 Nymphaea nelumbo Methyltransferase	IVEFIKK
토마토 Solanum lycopersicum (Tomato)	MYWKLL
조 식물 Setaria italica (Foxtail millet) (Panicum italicum) Protease	TKkkkkk

이렇게 분리된 상기 펩타이드 단편들에 대하여 황산처리전 각 수득물과 산처리 후 펩타이드 단편들을 대상으로 병원균으로 알려져 있는 포도상구균(Staphylococcu aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 캔디다균(Candida albicans), 흑국균(Aspergillus brasiliensis)을 대상으로 항균활성을 확인한 결과, 1~2mg/ml씩 저농도에서 처리한 경우에도 우수한 효능을 나타냄을 확인하였으며, 이에, 산처리 후 수득물질에 대해 보존제의 재료로 적합함을 알 수 있다.

2. 제2공정: 혼합 펩타이드 제조(S20)

본 공정에서는 상기와 같이 선별된 3종의 펩타이드 단편들을 혼합한 혼합펩타이드를 보존제의 유효성분으로 사용하되, 이러한 보존제의 재료로써 가장 중요한 것은 피부자극을 일으키지않고 인체무해하면서 화학보존제 처리 없이도 보존제로써의 역할도 할수 있도록 하는 것이 매우 중요하다.

이에 본 공정에서는 상기 선별된 3종의 펩타이드들을 먼저, 각각의 세포독성과 항염증활성을 확인하였으며, 그 결과, 상기 선별된 3종의 펩타이들은 모두 세포독성은 나타나지 않았으나, 항염증활성에서는 다소 차이가 있는 것으로 확인된다. 이에 본 공정에서는 상기 선별된 3종의 펩타이드들의 혼합비율이 매우 중요하게 작용하게 된다.

다시말해, 피부자극을 일으키지않고 인체무해하면서 화학보존제 처리 없이도 보존제로써의 역할도 할수 있도록 하기 위해서는 반드시 상기 항균력을 나타내는 3종의 펩타이드들을 특정비율로 혼합한 혼합 펩타이드를 제조하고 이를 하기 보존제의 유효성분으로 적용해야 하는 것이다. 만약 상기 3종의 펩타이드들을 단순 혼합하여 적용할 경우 그 활성이 떨어져 오히려 화학보존제 대체제로써 사용이 어렵게 된다.

이에, 본 발명의 발명자들은 여러차례 연구한 결과, 여러 혼합조성비율별로 항균력 및 항염증활성을 확인하여 보다 바람직하게는 상기 DN-PEP 1, DN-PEP 2, DN-PEP 3을 1 : 1~2 : 0.5 중량비로 혼합 구성되는 것을 특징으로 이러한 상기 혼합 펩타이드는 포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 캔디다균(Candida albicans). 흑국균(Aspergillus brasiliensis)에 대한 항균활성능을 갖으면서 세포독성도 일으키지않고 항염증 활성도 갖게 되는 것이다.

실험예 3에서도 확인되듯이 상기 3종의 펩타이드들의 혼합비율을 상기 혼합비율을 벗어날 경우 항균력 및 항염활성이 떨어져 보존제로써의 활용가치가 떨어짐 화학보존제의 대체제로써 사용이 어려움을 알 수 있다.

3. 제3공정: 보존제 제조(S30)

본 공정에서는 상기 혼합 펩타이드를 유효성분으로 하여 보존제를 제조하는 것이 특징이다.

이때, 상기 혼합 펩타이드는 우수한 항균력과 항염활성 그리고 세포독성을 나타내지 않음에 따라 보존제 전체 중량을 기준으로 0.01~99 중량%까지 사용가능하게 되어 화학보존제 100% 대체제로 충분히 사용이 가능함을 알 수 있다.

이렇게 제조된 상기 보존제를 이용하여 이미 알려진 화장료 제조방법에 의해 화장료를 제조할 수도 있고, 일반적인 피부 화장료에 한정되지 않고 생활용품, 의약부외품, 외용 의약품에도 적용가능함을 알 수 있으며, 보다 바람직하게는 화장료 조성물의 보존제로 사용하는 것이 가장 좋다.

이때, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 에멀젼, 마이크로에멀젼, 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌저, 유연화장수, 수렴화장수, 마스카라, 아이라이너 등의 형태로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 보존제 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형, 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 선정하여 배합할 수 있으며, 바람직하게는 상기 화장품으로 허용 가능한 성분으로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하기도 하며 기능성 보조 성분으로 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등을 포함할 수도 있다. 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 에스테르류 등을 포함하기도 한다.

이하에서는 실험예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실험예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

<실험예 1> 3종의 펩타이드 산처리 전후 대비 항균활성 확인

1. 실험방법

1) 실험원료(각 시료들을 정제수에 녹여 1mg/ml의 저농도로 준비함)

연꽃(Nymphaea nelumbo), 토마토(Solanum lycopersicum), 조 식물(Setaria italica)의 각 추출물을 준비하였다.

다시말해, 상기 각 시료 100g씩을 물 1000mL에 침지한 다음 65도씨에서 3시간 환류추출을 시행하였다. 동일 시료로 2번 반복하여 총 2000mL의 추출물을 얻었다. 추출물은 와트만 페이퍼 NO2로 필터하고 필터한 2000 mL의 추출물을 농축하여 100mL 시료를 확보하였다. 그 다음 100mL로 농축한 추출 시료를 동량의 아세톤과 혼합하여 1시간 동안 정치하고, 정치 후 침전된 고형물만을 수득하여 건조하여 본 발명의 조단백질 추출물로 사용하였다.

그 다음 이렇게 준비된 상기 추출물로부터 단백질을 분리하였다. 구체적인 분리 방법은 다음과 같다.

먼저, 조단백질 추출물로부터 단백질 분리를 하기위해 이온교환 크로마토그래피를 통한 단백질 분획을 시행하였다. 다시말해 각각의 조단백질은 CM-sepharose 및 C18- RP-HPLC를 통하여 분획하였다. CM-sepharose에서의 분획 조건은10 ~ 100mM Ammonium acetate, pH 5.0 ~ 9.0 및 280nm 검출 조건이며, 각 조단백질 추출물 당 총 7개의 분획을 획득하였다.

각각의 분획물을 본 명세서에 기재된 항균활성 검정법을 통해 확인하였으며, 활성 분획은 C18- RP-HPLC을 통해 2차 정제하였다.

정제조건은 용매 A (분석용 정제수)와 용매 B(0.1% TFA가 포함된 아세토나이트릴)를 순차적으로 혼합하여 280nm 검출 조건으로 분리하였다.

순차적 분리 조건은 용매전체 100% 중 B 용매의 비율이 5% ~ 90%에 이르기까지 70분 동안 분리 및 분획 하였다. 각 분획물은 시료당 10개로 하여 2차 정제시료를 확보하였다.

2차 정제 시료는 본 명세서에 기재된 항균 활성 검정법을 통하여 시험하였으며, 최종 항균활성이 있는 시료는 아미노산 분석을 통하여 활성 펩타이드를 확인하였다.

그 다음 각각의 활성이 있는 조단백질 분획물을 SDS-PAGE 전기영동하여 단백질을 분자량별로 분리한 다음 Coomassie Brilliant BLUE 염색방법을 통하여 단백질을 염색하였다.

염색한 겔에서 단백질을 절단하여 분리하고 아미노산 분석을 통하여 활성 펩타이드를 확인하였다.

그 결과, 상기 표 1과 같이 연꽃 추출물에서는 메틸전달효소(Methyltrasferase)를, 상기 토마토 추출물에서는 Unchracterized protein를, 상기 조 식물에서는 단백질분해효소(Protease)를 수득되었다.

그 다음 각각의 수득물에 2N 황산(1:0.2 중량비)을 각각 처리하여 펩타이드 단편들을 수득하였다.

① 서열번호 1로 표현되는 DN-PEP 1 펩타이드 단편

(서열번호 1: IVEFIKK)

② 서열번호 2로 표현되는 DN-PEP 2 펩타이드 단편

(서열번호 2: MYWKLL)

③ 서열번호 3으로 표현되는 DN-PEP 3 펩타이드 단편

(서열번호 1: TKkkkkk)

2) 희석액 제조(0.85% NaCl)

1 L 정제수에 NaCl 약 8.5 g을 넣고 충분히 녹을 때까지 교반한 후 테스트 튜브에 10 ㎖씩 분주하여 고압증기멸균기(Autoclave)로 121 ℃, 15분 조건으로 멸균하였다.

3) CTFA에서 선정한 병원균 5가지

① 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC 1916-세균

② 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1636-세균

③ 대장균(Escherichia coli) KCTC 1039-세균

④ 캔디다균(Candida albicans) KCTC 7965-진균

⑤ 흑국균(Aspergillus brasiliensis) KCTC 6196-진균

4) 균주 배양

세균은 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에서 진균은 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 시험균주 1 colony를 접종하여 쉐이킹 인큐베이터(Shaking incubator)에서 세균은 32℃, 진균은 26℃로 150rpm 조건하에 24시간동안 진탕 배양하였다.

5) MIC test를 통한 항균력 실험

상기 병원균 5종을 각각 세균류는 약 1×10⁷ cfu/㎖, 진균류는 약 1×10⁶ cfu/㎖로 되도록 상기 희석액에 가한 후 상기 실험원료인 3가지의 펩타이드들에 각각 100 ㎕ 넣고 Shacking incubator에서 32 ℃와 26 ℃로 각각 온도에 맞추어 150 rpm으로 24시간 동안 배양한 후, 배지의 탁도(Turbidity)를 통하여 항균력을 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 하기 표 3과 같이 나타났다.

시료	Peptide name	처리 농도 (mg/ml)	Staphylococcus aureus	Pseudomonas aeruginosa	Escherichia coli	Candida albicans	Aspergillus brasiliensis
황산		2N	-	-	-	-	-
1	DN-PEP F1	1	+++	+++	+++	++++	++
2	DN-PEP 1	1	+++	++++	++++	++++	+++
3	DN-PEP F2	1	-	-	+	+	-
4	DN-PEP 2	1	-	-	++	++	-
5	DN-PEP F3	1	++	++	++	+	+
6	DN-PEP 3	1	+++	+++	++	++	+

상기 표 3에 나타나 있듯이, 병원균으로 알려져 있는 포도상구균(Staphylococcu aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 캔디다균(Candida albicans), 흑국균(Aspergillus brasiliensis)를 대상으로 항균력을 확인한 결과, 각 펩타이드들의 산처리 전후의 항균력이 달리 나타남을 확인하였다.

<실험예 2> 3종의 펩타이드별 세포 독성 및 항염활성 확인

1. 실험방법

1) 세포독성 측정방법(MTT assay)

in vitro 실험을 위해 본 발명의 보존제의 세포독성을 확인하여 효능평가를 위한 농도 범위를 정하여 실험에 적용하였다.

각각의 펩타이드들은 세포에 보존제 효과가 확인된 농도를 처리하여 일정시간 각각 처치한 후 MTT를 이용한 반응 및 ELISA Leader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존효과 (cell viability, %)는 DMSO만 처리된 대조군의 흡광도를 기준으로 생장률은 아래 식으로 계산하여 결과를 확인하였다.

2) 항염증 활성 측정방법

본 실험에서 항염활성을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 생성된 NO의 양을 Griess reagent로 측정하여 나타내었다. 다시말해 세포수를 1.5 x 10⁵ cells/ml로 조절한 후 24-well plate에 넣고 18시간 전배양하였다. 그 다음 배지를 제거하고，시료농도 100 μg/ml과 LPS 1 μg/mL을 동시에 처리하여 24시간동안 배양하였다.

생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 N0^2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100ul와 Griess시 약[1 % (w/v) sulfanilarnide, 0.1% (w/v) N-(I-naphthyl) ethylenediamine, 2.5% (v/v) phosphoric acid]100 μl를 혼합하여 96-well plates에서 10분 동안 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며，sodium nitrite(NaN0₂)를 표준용액으로 비교하였다.

실험구는 상기 실험방법과 동일하게 진행하며 LPS 1ug/mL과 함께 각 3종 펩타이드들을 각각 처리하여 LPS만 처리한 대조구와 비교하였다.

LPS 처리후 세포는 염증반응이 시작되며 그 결과로 NO가 생성되며, 이때 처리한 펩타이드에 항염증 효과가 있을 경우 LPS만 처리한 대조구에서 생성된NO보다 낮은 농도의 NO가 생성되며, 그 수치를 비교하여 항염활성을 나타내었다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 하기 표 4와 같이 나타났다.

시료	Peptide name	처리농도 (mg/ml)	세포독성	항염증 활성(%)
황산		2N	-	-
1	DN-PEP F1	2	-	55.3
2	DN-PEP 1	2	-	73.7
3	DN-PEP F2	2	-	68.5
4	DN-PEP 2	2	-	80.3
5	DN-PEP F3	2	-	55.3
6	DN-PEP 3	2	-	65.2

상기 표 4에 나타나 있듯이, 각 펩타이드들의 산처리 전후를 비교해보면 세포독성은 나타나지 않았으나, 항염활성이 다르게 나타남을 확인하였다. 이와 같이 상기 펩타이드들은 상기 항균력과, 항염활성이 각기 다르게 나타나는 바, 보존제의 소재로 적용시 특정 혼합비율에 따라 혼합하여 사용해야만 피부자극없이 우수한 항염, 항균활성을 갖는 보존제를 제조할 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 3> 3종의 펩타이드의 혼합비율에 따른 항균력, 항염활성, 세포독성 확인

1. 실험방법

상기 실험예 1의 결과를 토대로 항균 펩타이드들을 하기 표 3의 적정비율로 혼합하여 혼합비율에 따른 항균력, 항염활성, 세포독성을 확인하였다. 이때, 상기 실험예 1 및 실험예 2에 제시된 방법과 동일하게 적용하여 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 하기 표 5, 표 6과 같이 나타났다.

시료	DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3 = 혼합비율(w/w/w)	처리농도 (mg/ml)	Staphylococcus aureus	Pseudomonas aeruginosa	Escherichia coli	Candida albicans	Aspergillus brasiliensis
1	1:1:1	1	++	+++	++	+++	++
2	0.5:1:1	1	++	++	+++	++	++
3	2:1:1	1	++++	++++	++++	++++	++++
4	1:1:0.5	1	+++	+++	++++	++++	+++
5	1:2:0.5	1	++++	+++	+++	+++	+++

시료	DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 2 = 혼합비율(w/w/w)	처리농도 (mg/ml)	세포독성	항염증활성 (%)
1	1:1:1	2	-	80.1
2	0.5:1:1	2	+	75.8
3	2:1:1	2	-	80.8
4	1:1:0.5	2	-	93.1
5	1:2:0.5	2	-	97.5

상기 표 5 및 표 6에 나타나 있듯이, 3종의 펩타이드들의 혼합비율별로도 항균력, 항염활성이 다르게 나타남을 확인하였다. 다시 말해 상기 항균활성에서는 DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3 펩타이드를 2:1:1 중량비 또는 1:1:1 중량비로 혼합할 경우에 높게 나타났으나 항염증 활성도는 80% 정도로 나타나는 바, 화학보존제의 100% 대체제로 사용은 어려운 것으로 확인되었다.

또한, DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3 펩타이드를 0.5:1:1 중량비로 혼합한 경우에는 항염증활성도 가장 낮게 나타났으며 세포독성 또한 있는 것으로 나타나나, 이 역시 보존제로써의 사용은 어려운 것으로 확인되었다.

이에 반면, DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3 펩타이드를 1 : 1~2 : 0.5 중량비로 혼합한 경우에는 세포독성도 없고 항염증 활성도 90% 이상으로 나타났으며, 항균력 역시 높게 나타내고 있는 바, 인체 무해하여 피부자극도가 없으면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월한 펩타이드를 포함하는 보존제를 제조하기 위해서는 혼합 펩타이드의 혼합비율이 DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3 펩타이드가 1 : 1~2 : 0.5 중량비로 이루어지는 것이 가장 적합함을 알 수 있었다.

<실험예 4> 보존제로서의 효과 확인

1. 시험용 조성물 제조

하기 표 7에 나타낸 조성 성분과 함량을 사용하여 통상적인 방법으로 액상 타입의 조성물을 제조하였으며, 본 발명에 따른 조성물은 실시예 1 내지 3으로, 이와 비교 대상의 조성물은 비교예 1 내지 2로 명명하였다.

구분(중량%)	실시예			비교예
	1	2	3	1	2
정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
DN-PEP 1 : DN-PEP 2 : DN-PEP 3= 1 : 2 : 0.5 중량비로 혼합된 혼합 펩타이드	0.01	0.4	5	-	-
글리세린	3	3	3	3	3
왁스	3	3	3	3	3
버터	2	2	2	2	2
고급지방산	3	3	3	3	3
폴리스테아레이트	3	3	3	3	3
잔탄검	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03
향	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.	q.s.
메틸파라벤				0.2	-
에틸파라벤				0.1	-
프로필파라벤				0.1	-

2. 실험방법

1) 항균 및 방부효과 확인

상기 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 항균 및 방부 효과를 실험하기 위하 세균 또는 진균을 시료에 첨가하고 접종 균수의 변화를 확인하였으며, 진균 또는 세균의 수가 20 CFU/g 이하가 되기 시작한 날을 기록하여 하기 표 8에 나타내었으며, 최대 28일까지 측정하였다. 시험 과정을 구체적으로 나타내면 다음과 같다.

먼저, 시료를 40g씩을 담은 후, 세균, 즉, 포도상구균(Staphylococcu aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli)의 혼합 균액을 시료 1 g 당 10⁶마리 수가 되도록 시료에 첨가 혼합한 후 4주간 보관하였다. 그런 다음, 접종한 날로부터 1일, 7일, 14일, 21일, 28일이 경과 할 때마다 접종 균수의 변화를 확인하였다.

그리고 진균을 이용한 시험 과정은 세균을 이용한 시험 과정과 동일하며, 다만, 세균 대신 진균인 캔디다균(Candida albicans), 흑국균(Aspergillus brasiliensis)을 사용하였다.

2) 피부 자극 평가시험

상기 실시예 2 및 비교예 1의 조성물의 피부 자극을 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 인체 첩포 시험(Human patch test)을 통하여 인체에 대한 1차 자극시험을 시행하였다.

건강한 성인 남녀 30명을 대상으로 CTFA가이드라인[참고문헌 : The Cosmetic, Toility and Fragrance Association Inc Washington, DC, 2003619941]에 따라 실시하였다. 핀 챔버(Finn Chamber)에 시료 및 용액 15 mL를 적하시킨 후, 이것을 시험 부위인 인체의 등에 얹어 테이프로 고정시켰다. 이어서 24시간 동안 첩포한 후, 첩포를 제거하고 다시 4시간이 경과한 다음 시험 부위의 피부 반응을 다음 기준에 따라 판정하여 그 결과를 하기 표 9에 나타냈다.

< 판정 기준>

- : 홍반이나 특이나 현상 없음 +/- : 주위보다 약간 붉어짐

+ : 주위보다 현저히 붉어짐 ++ : 주위보다 심하게 붉어지고 부풀어 오름

자극도 = [{(+/-)수 x 1} + {(+)수 x 2} + {(++)수 x 3}]/피시험자 수

3. 실험결과

상기 실험결과, 하기 표 8 및 표 9와 같이 나타났다.

평가항목	실시예			비교예
평가항목	1	2	3	1	2
세균	6일	4일	1일	14일	28일이상
진균	7일	4일	1일	14일	28일이상

평가항목	판정결과				자극도
평가항목	++	+	+/-	-	자극도
실시예2	0	0	0	30	0.01
비교예1	0	1	4	25	0.2

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 비교예 2의 경우 보존제 또는 화학적 방부제를 사용하지 않아 항균, 항진균 및 방부 효과가 없는 것으로 나타났으며, 비교예 1은 파라벤류를 총 0.04중량%나 사용하였으나 14일 후부터 20 CFU/g 이하의 진균 또는 세균의 수를 나타내어 항균 및 방부 효과가 낮게 나타남을 확인하였으며 표 9에 나타나있듯이 화학보존제 사용으로 인해 피부자극도가 있는 것으로 확인되었다. 이에 반면, 본 발명의 실시예 1은 종래의 화학적 방부제를 사용하지 않았고 혼합 펩타이드 소재를 0.01 중량%만을 사용하였음에도 불구하고 세균과 진균에 대해 각각 6일, 7일 후부터 20 CFU/g 이하의 세균 및 진균 수를 각각 나타내어 화학적 방부제를 사용한 비교예 1 보다 항균, 항진균과 방부 효과가 높은 것을 알 수 있었다.

특히, 혼합 펩타이드를 0.4 중량 및 5 중량%를 함유한 실시예 2 및 3의 경우 진균과 세균의 수가 급격하게 줄어들어 각각 7일, 1일 차부터 20 CFU/g 이하의 진균 또는 세균의 수를 나타내어 화학적 방부제를 함유한 비교예1보다 훨씬 뛰어난 항균, 항진균 및 방부 효과를 나타냈음을 알 수 있었으며, 실시예2의 경우에는 피부자극도도 없음을 확인하였다.

이와 같이 본 발명의 보존제는 인체 무해하면서 방부 효과 및 항염효과가 탁월하여 화장료 조성물의 소재로 매우 적합하게 적용가능하며, 화학방부제 없이도 화장료 제조가 가능함을 알 수 있다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> LEE, SOO KYONG <120> Preservative composition including peptide having antibacterial activity and cosmetic composition having the same <130> 01 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Nymphaea nelumbo <400> 1 Ile Val Glu Phe Ile Lys Lys 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 2 Met Tyr Trp Lys Leu Leu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Setaria italica <400> 3 Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5

Claims

서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는,
항균 펩타이드를 포함하는 보존제.
제1항에 있어서,
상기 혼합 펩타이드는 상기 서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 상기 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 상기 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편이 1 : 1~2 : 0.5 중량비로 혼합 구성되는 것이 특징인,
항균 펩타이드를 포함하는 보존제.
제1항에 있어서,
상기 혼합 펩타이드는 포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 캔디다균(Candida albicans). 흑국균(Aspergillus brasiliensis)에 대한 항균활성능을 갖는 것이 특징인,
항균 펩타이드를 포함하는 보존제.
제1항에 있어서,
상기 혼합 펩타이드의 함량은 조성물 총 중량 대비 0.01~99 중량%인 것을 특징으로 하는,
항균 펩타이드를 포함하는 보존제.
서열번호 1로 표현되는 연꽃 유래 펩타이드 단편, 서열번호 2로 표현되는 토마토 유래 펩타이드 단편 및 서열번호 3으로 표현되는 조식물 유래 펩타이드 단편으로 구성된 혼합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
화장료 조성물.