KR102162474B1

KR102162474B1 - 방부제로 인간 유래 항균펩타이드를 함유하는 화장품

Info

Publication number: KR102162474B1
Application number: KR1020180169539A
Authority: KR
Inventors: 민혜정
Original assignee: 광주여자대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2020-10-06
Also published as: KR20200079880A

Abstract

본 발명은 방부제로 인간 유래 항균펩타이드를 함유하는 화장품에 관한 것으로, 본 발명의 항균펩타이드는 인간에서 유래하여 안전하고, 여타 합성 방부제에 비하여 항균효과가 우수하다. 따라서, 합성 방부제를 포함한 다른 방부제를 대신하여, 화장품에 방부제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

방부제로 인간 유래 항균펩타이드를 함유하는 화장품 {Cosmetics with antimicrobial peptide as antiseptic agent}

본 발명은 방부제로 인간 유래 항균펩타이드를 함유하는 화장품에 관한 것이다.

과거에는 많은 소비자가 브랜드 이미지를 보고 화장품을 구매하였으나, 최근 미세먼지와 화학제품에 대한 반감이 점차 커지면서 화장품을 구매할 때, 성분을 중시하는 소비자가 늘고 있다. 시장조사기관이 발표한 지난해 여성 스킨케어 소비자 동향 보고서에 따르면 여성 소비자들의 50%가 화장품 구매 시 성분을 확인하는 것으로 조사됐다. 2008년부터는 '화장품 전 성분 표시제'에 따라 화장품에 관한 정보가 제공되고 있다. 제품 이름, 제조업자, 제조판매업자의 이름과 주소, 제조번호 등을 파악할 수 있지만 이런 표시제가 화장품에 대한 소비자들의 궁금증을 완벽히 해소해 주지 못하고 있는 현실이다.

화장품은 그야말로 화학합성물 범벅이다. 자연상태에서 생분해가 어려운 물질들로 구성되어 있어 사용자의 건강을 위협하고, 환경을 파괴하는 주범 중 하나로 작용하고 있다. 제형을 만들기 위한 계면활성제는 화장품뿐만 아니라 식품 및 각종 생활용품에도 빈번하게 사용하고 있으며, 색상을 내기 위한 합성색소, 점도를 증진하기 위한 점증제 등 많은 합성물이 혼합되어 사용된다.

특히, 세균이나 진균에 관한 방부 효과를 위하여 합성 방부제 및 천연 유래의 방부제 등이 무분별하게 사용되고 있다. 대표적인 합성방부제는 파라벤류의 물질로서 피부 알러지를 유발하며, 여성호르몬인 에스트로겐과 구조가 비슷하여 흡수되면 호르몬을 교란하는 이유로 사용을 제한하고 있는 추세다. 파라벤 이외에도 페녹시에탄올, 클로로페네신, 메칠클로로이소치아졸리논 등이 사용되고 있으나, 이 또한 많은 부작용을 야기하고 있다.

한편, 천연 방부제도 한약재나 허브 추출물에 유래한 성분이 들이 많아 화장품 및 기타 제품에 첨가될 경우, 너무 짙은 색상으로 제형에 문제를 야기하거나, 약한 효과로 인하여 지나치게 많은 사용량이 요구되고 있다. 또한, 천연 방부제 자체가 가지고 있는 냄새로 인하여 제품의 활용도가 매우 떨어지는 단점을 가지고 있어 상용되지 못하는 단점이 있다.

대한민국등록특허 제10-1678152호(2016.11.15)에는, 지질 베시클에 캡슐화된 지방산 트리펩타이드 염을 포함하는 화장료용 항균 방부제 및 이의 제조방법에 관하여 기재되어 있다.

본 발명은 피부트러블 유발, 호르몬 교란 등 많은 부작용을 보이는 합성방부제 및 약한 방부 효과로 인하여 지나치게 많은 양의 사용을 요구하는 천연물 방부제의 대체재로 이용가능한 인간 유래의 펩타이드로 사용자에게 안전하고, 항균력이 우수하며, 제품에 적용하였을 시, 변색, 이취의 문제가 없는 방부제를 개발하고자 한다.

본 발명은 방부제로 서열번호 1의 서열로 이루어진 인간 유래 항균펩타이드를 함유하는 화장품을 제공한다.

본 발명의 항균펩타이드는 인간에서 유래하여 안전하고, 여타 합성 방부제에 비하여 항균효과가 우수하다. 따라서, 합성 방부제를 포함한 다른 방부제를 대신하여, 화장품에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 대장균(Escherichia Coli)에서 본 발명의 항균펩타이드, 합성 방부제인 메틸 파라벤(methyl paraben) 및 천연물 방부제인 황금추출물(Scutellaria baicalensis extract)의 세포 사멸능을 확인한 결과이다.
도 2는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 본 발명의 항균펩타이드, 합성 방부제인 메틸 파라벤(methyl paraben) 및 천연물 방부제인 황금추출물(Scutellaria baicalensis extract)의 세포 사멸능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 항균펩타이드를 농도별(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 함유하는 로션의 대장균(Escherichia Coli) 사멸능을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 항균펩타이드를 농도별(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 함유하는 로션의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 사멸능을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 항균펩타이드의 세포독성을 확인한 결과이다.

피부트러블 유발, 호르몬 교란 등 많은 부작용을 보이는 합성방부제 및 약한 방부 효과로 인하여 지나치게 많은 양의 사용을 요구하는 천연물 방부제의 대체재로써, 사용자에게 안전하고, 항균력이 우수하며, 제품에 적용하였을 시, 변색, 이취의 문제가 없는 방부제의 개발 필요성이 지속적으로 언급되어 왔다.

이에 본 발명은 서열번호 1(KRIVKRIKKWLR-NH2)의 서열로 이루어진 인간 유래 항균펩타이드를 방부제로 함유하는 화장품을 개발하여 제공하고자 한다. 이때, 상기 항균펩타이드는 C-말단에 NH₂가 결합되어 있는데, C-말단 카르복시기(-COOH)의 H 대신 NH₂가 결합하여 -COONH2 형태를 띄게 된다. 이를 통해 본 발명 항균펩타이드의 안정성을 높일 수 있고, 화장품 제형에 첨가하여 사용하더라도 그 활성을 유지하게 할 수 있는 것이다. 즉, 펩타이드를 화장료에 적용할 경우, 안정성 문제로 인해 펩타이드가 보유한 효능을 상실하거나, 효능이 저감되는 문제가 있어왔는데, 본 발명의 항균 펩타이드는 화장료에 적용시, 효능을 상실하지 않고, 여타 화장료 방부제에 비해서도 뛰어난 항균능을 보유함을 하기 실시예에서 확인할 수 있었던 것이다.

피부로 병원균이 침투하면본 발명의 서열번호 1의 서열로 이루어진 인간 유래 항균펩타이드는 화장품, 의약품, 식품, 생활용품 등 다양한 제품에 포함될 수 있고, 특히, 화장품, 의약품 등으로 사용이 바람직하다. 더 구체적으로 피부에 사용되는 것으로서, 크림, 에센스, 세럼, 마스크팩, 비누, 샴푸, 바디클린저, 폼클린저의 천연 방부제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

다만, 하기에 기재된 본 발명의 항균펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드 서열, 'KRIVKRIKKWLR-NH2'로 이루어진 펩타이드를 지칭한다. 또한, 본 발명의 항균펩타이드를 LL-37-12라 명명하여 하기에서 이용하고자 한다.

[ 실시예 1: 본 발명 항균펩타이드의 최소발육저지농도(Minimal Inhibitory Concentration) 확인]

본 발명 항균펩타이드의 최소발육저지농도를 확인하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 그람 음성균과 그람 양성균을 LB 배지에서 37℃ 조건으로 OD₆₀₀에서 흡광도 0.5까지 배양하였다. 효모균은 GPYB(Glucose Peptone Yeast extract broth) 배지에서 25℃ 조건으로 OD₆₀₀에서 흡광도 0.5까지 배양하였다.

이후, 96웰 플레이트에 1% 펩톤 100㎕를 첨가한 후, 각각의 방부제 샘플(409.6㎍/㎖) 100㎕를 첨가하여 연속 희석하였다. 그 후, 상기에서 배양한 각각의 균주를 1% 펩톤(peptone)에 4×10⁶ cfu/㎖가 되도록 희석하여, 상기 방부제 샘플이 첨가된 96웰 플레이트 각각에 100㎕를 로딩(loading)하였다. 16시간 동안 37℃에서 배양한 뒤, 최소발육저지농도를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

Strain	MIC (㎍/㎖)
Strain	LL -37-12	methyl paraben	황금 추출물	Melittin
Gram-negative
Escherichia coli (KCTC 1682)	1.6	> 204.8	> 204.8	5.7
Salmonella typhimurium (KCTC 1926)	1.6	> 204.8	> 204.8	5.7
Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637)	3.2	> 204.8	> 204.8	5.7
Gram-positive
Staphylococcus aureus (KCTC 1621)	3.2	> 204.8	> 204.8	2.8
Bacillus subtilis (KCTC 3068)	3.2	> 204.8	> 204.8	5.7
Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917)	3.2	> 204.8	> 204.8	5.7
Yeast
Candida glabrata (KTCT 7219)	12.8	> 204.8	> 204.8	22.4

실험 결과, 본 발명의 항균펩타이드는 합성 방부제인 메틸파라벤, 천연물 방부제인 황금 추출물 및 천연 방부제인 멜라틴에 비하여, 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모균 전반에 걸친 항균능이 우수한 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 2: 본 발명 항균펩타이드의 세포 사멸능 확인]

본 발명 항균펩타이드의 세포 사멸능을 확인하기 위하여, 5㎖의 LB 배지에서 대장균과 스타필로코커스 아우레우스를 37℃ 조건으로 OD₆₀₀에서 흡광도 0.5까지 배양하였다. 이후, 1% 펩톤으로 1/2의 농도로 희석하였다. 이후, 각 균주와 방부제 각각 0,25, 50, 100, 200㎍/㎖를 혼합하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 생리식염수를 첨가하여 최종 농도가 1×10⁷ cfu/㎖가 되도록 희석한 뒤, LBA 플레이트에 100㎕를 접종하여, 37℃에서 16시간 배양하였고, 세포 수를 확인하였다.

실험 결과, 본 발명의 항균펩타이드는 합성 방부제인 메틸파라벤 및 천연물 방부제인 황금 추출물에 비하여, 대장균 및 스타필로코커스 아루레우스 사멸능이 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다 (도 1 내지 2). 도 1은 대장균(Escherichia Coli)에서 본 발명의 항균펩타이드, 합성 방부제인 메틸 파라벤(methyl paraben) 및 천연물 방부제인 황금추출물(Scutellaria baicalensis extract)의 세포 사멸능을 확인한 결과이고, 도 2는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 본 발명의 항균펩타이드, 합성 방부제인 메틸 파라벤(methyl paraben) 및 천연물 방부제인 황금추출물(Scutellaria baicalensis extract)의 세포 사멸능을 확인한 결과이다.

[ 실시예 3: 본 발명 항균펩타이드를 함유한 로션의 세포 사멸능 확인]

본 발명 항균펩타이드를 화장료에 적용하여도 항균능이 유지되는지 확인하기 위하여, 5㎖의 LB 배지에서 대장균과 스타필로코커스 아우레우스를 37℃ 조건으로 OD₆₀₀에서 흡광도 0.5까지 배양하였다. 이후, 1% 펩톤으로 1/2의 농도로 희석하였다. 이후, 각 균주와 본 발명 항균펩타이드를 각각 0,25, 50, 100, 200㎍/㎖ 함유하는 로션을 혼합하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 그 후, 생리식염수를 첨가하여 최종 농도가 1×10⁷ cfu/㎖가 되도록 희석한 뒤, LBA 플레이트에 100㎕를 접종하여, 37℃에서 16시간 배양하였고, 세포 수를 확인하였다.

본 실험에 사용된 화장품은 0.05% 잔탄검(Xanthan gum)과 보습제로 Glycereth-26을 3% 함유한 스킨로션제형으로, 본 발명 항균펩타이드를 각각 0,25, 50, 100, 200㎍/㎖ 첨가하여 제조하였으며, 잔탄검, Glycereth-26 및 본 발명 항균펩타이드를 제외하고 나머지는 정제수로 구성된다. 실험에는 상기 스킨로션을 1/3의 농도로 희석하여 이용하였다.

실험 결과, 본 발명의 항균펩타이드를 포함한 로션은 전체 농도에서 대장균을 사멸하였으며, 스타필로코커스 아우레우스는 농도 의존적으로 사멸하였고, 100㎍/㎖ 이상의 농도에서 모두 사멸된 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명의 항균펩타이드를 화장료에 적용하여도, 항균능이 저감되지 않음을 확인할 수 있었다 (도 3 내지 4). 도 3은 본 발명의 항균펩타이드를 농도별(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 함유하는 로션의 대장균(Escherichia Coli) 사멸능을 확인한 결과이고, 도 4는 본 발명의 항균펩타이드를 농도별(0, 25, 50, 100, 200㎍/㎖)로 함유하는 로션의 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 사멸능을 확인한 결과이다.

[ 실시예 3: 본 발명 항균펩타이드의 세포독성 확인]

본 발명 항균펩타이드의 세포독성을 확인하기 위하여, 웰 당 RAW 264.7 세포의 수가 6×10⁴가 되도록 96웰 플레이트에 150㎕ 씨딩(seeding)한 뒤, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 본 발명 항균펩타이드 농도별 (0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128μM)로 첨가한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 4℃에서 1,200 rpm으로 3분동안 원심분리한 뒤, 상등액을 제거하고 550㎚에서 MTT분석을 수행하였다. 세포 생존율은 하기 수학식1에 따라 계산하였다(BNK: MTT, Neg: Cell+MTT). 실험 결과, 본 발명의 항균펩타이드는 세포의 사멸없이 안전한 것을 확인할 수 있있다 (도 5). 도 5는 본 발명의 항균펩타이드의 세포독성을 확인한 결과이다.

<110> KWANGJU Women's University I.A.C.F <120> Cosmetics with antimicrobial peptide as antiseptic agent <130> YP-18-262 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> NON_TER <222> (1) <223> An amino group has been binded to C-terminal of Arginine. <400> 1 Lys Arg Ile Val Lys Arg Ile Lys Lys Trp Leu Arg 1 5 10

Claims

방부제로 서열번호 1의 서열로 이루어진 인간 유래 항균펩타이드를 함유하며, 상기 항균펩타이드는 아르기닌의 C-말단에 아미노기(-NH₂)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 화장품.