JP6997710B2 - Myrsine africanaの抽出物を含む局所スキンケア組成物 - Google Patents
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Description
ブタ膵臓のエラスターゼIV型[E.C.3.4.21.36](E0258,Sigma,USA),N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド(S4760,Sigma,USA)及び陽性対照ウルソール酸(U001,Natural Remedies Pvt.Ltd.,インド)。Trizma(商標)塩基:T1503(Sigma、USA)及び塩酸(H0090、Rankem、インド)。エタノール、Tris-HCl緩衝液、基本培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、マウスメラノサイト細胞株B16-F10、3-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸ヒドラート ナトリウム塩(XTT)、コウジ酸、アルブチン、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N-メチルジベンゾピラジンメチルスルファート(PMS)、デキストロース、硫酸マグネシウム(MgSO4・H2O)、クエン酸一水和物、無水(第二)リン酸カリウム(K2HPO4)、リン酸アンモニウムナトリウム(Na2NH2PO4.4H2O)、寒天(Difco agar)、XVB塩溶液、40%グルコース、D-ビオチン、L-ヒスチジン、塩化ナトリウム(NaCl)、ニュートリエントブロスナンバー2(oxoid nutrient broth number 2)、ナトリウム一塩基酸(NaH2PO4.H2O)、ナトリウム二塩基酸(Na2HPO4.H2O)、ニュートリエントブロス(Oxoid Nutrient broth)、4-ニトロキノリン-1-酸化物(4-NQO)及びEuxyl PE 9010
植物採集及びエタノール抽出物の調製
Myrsine africanaの葉は、南アフリカのプレトリアにあるManie van der Schijff Botanical Gardenで、2011年に採集された。植物材料(葉及び小枝)を2週間陰干しし、次いで粉砕して微粉にした。乾燥粉末を蒸留エタノールに浸漬し、48時間抽出した。ブフナー漏斗で濾過した後、植物の濾液を回収した。濾液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下に置いた後、抽出物を回収した。抽出物は、その後の使用まで涼しい場所で保存した。この抽出物を用いて、エラスターゼ阻害、細胞毒性及び変異原性について試験した。乾燥した葉のエタノール抽出物(300mg)を70%エタノールに溶解し、刺激性、微生物性、金属性及び生理化学的ならびにin vivo有効性試験に使用した。
風乾し、粉末化した芽(2.3kg)をエタノールに浸漬し、ロータリーシェーカー上で3日間連続的に攪拌して抽出物を得た。芽の乾燥エタノール抽出物(88g)をエタノールに再溶解し、800mlの蒸留水に懸濁した。水懸濁液を、石油エーテル、クロロホルム、酢酸エチル及びn-ブタノールを用いて連続的に分配した。有機層をロータリーエバポレーターを用いてエバポレートし、40℃で乾燥させ、別々の画分を得た。EtOAc画分(18.7g)をn-ヘキサン-酢酸エチル-メタノール-水の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。同様の画分をTLCプロファイルに基づいてプールし、合計7つの主な画分(MF-1~MF-7)を得た。MF-2(1.25g)を、極性増加勾配のジクロロメタン:メタノール(0%~100%)の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。副画分2-4(0.5g)を、DCM:MeOH(7:1)を用いるシリカゲル上で再度クロマトグラフィーにかけた。化合物ミルシノシドB(MA-NR-01;257mg、乾燥植物材料の0.0111%)を得た。
エラスターゼ阻害アッセイ
サンプル調製
M. africanaの葉抽出物と化合物から、500μg/mL及び1120μg/mLのサンプル保存液をそれぞれ調製した。簡潔には、2.5mgの抽出物及び2.24mgの化合物を秤量し、100μLのメタノールに溶解した。次に、100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を用いて、抽出物については5mLの量、化合物については2mLの量とした。アッセイ用に必要に応じて次の希釈を行った。化合物MA-NR-01(ミルシノシド B)を、実施例1に記載の標準手順を用いて単離した。
エラスターゼ阻害アッセイは、変更を加えたBieth et al.(1974)の方法により大規模に行った。要約すると、プレインキュベーション混合物は、100mMのTris-HCl緩衝液(pH8.0)又はビヒクル緩衝液、陽性対照又は様々な濃度の試験サンプルと共に4.942mUのエラスターゼ酵素を含有していた。試薬を混合し、混合物を37℃で15分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、基質(N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド)を添加して0.338mMの最終濃度とし、溶液を混合し、37℃で30分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー(Versamax、Molecular devices、USA)において、405nmで吸光度を測定した。試験サンプルなしで対照の反応を行った。
変異原性
グルコース溶液の調製(40%)
1Lのフラスコ中で、1Lの蒸留水を400gのデキストロースに添加した。溶液を透明になるまでマグネチックスターラー上に置いた。次いで、フラスコを121℃で20分間オートクレーブ処理した。次いで、溶液を4℃で保存(冷蔵)した。
温蒸留水(650mL)を、マグネチックスターラー上の2Lフラスコ中の硫酸マグネシウム(MgSO4.H2O)10g、クエン酸一水和物100g、無水(第二)リン酸カリウム(K2HPO4)500g及びリン酸アンモニウムナトリウム(Na2NH2PO4.4H2O)175g(各々の新しい塩の添加前に完全に前のものが溶解していることを確認した)に加えた。次に蒸留水を最終的に容量1Lになるまで添加した。次いで、溶液を121℃で30分間オートクレーブ処理し、その後放冷し、室温で暗所に保存した。
寒天(Difco agar)(15g)を900mLの蒸留水に添加した。その後、該溶液を121℃で30分間オートクレーブし、約65℃に冷却した。その後、滅菌したXVB塩溶液20mLをフラスコに加え、確実に混合した。最後に、50mLの40%グルコース溶液を同じフラスコに加え、確実に混合した。次いで、混合物を100×15mmペトリ皿に分注した(各プレート中に±25~30mLの寒天)。プレートを密封したプラスチックバッグに入れる前に固化し、4℃で一晩保存した。翌日、プレートを室温に戻した後、試験に使用した。
蒸留水(1L)を沸騰させ、D-ビオチン124mgとL-ヒスチジン96mgを水に溶解した。
寒天6gと6gのNaClを900mLの蒸留水に加えた。混合物をオートクレーブ中で10分間加熱して寒天を融解した。これに続き、予め調製したヒスチジン/ビオチン溶液100mLを瓶に加えた。上層寒天を標識し、さらに30分間オートクレーブ処理し、暗所で室温で保存した。
oxoid nutrient broth number 2(25g)を1Lの蒸留水に加え、ブロスが溶解するまで攪拌した。50mLのブロスをエルレンマイヤーフラスコに分注し、20分間オートクレーブ処理した。溶液を冷却し、室温で暗所に保存した。
NaH2PO4.H2O(13.8g)を1Lの水に加えた(ナトリウム一塩基酸、0.1M)。その後、14.2gのNa2HPO4.H2Oを1Lの水に加えた(ナトリウム二塩基酸、0.1M)。次に、ナトリウム二塩基酸溶液120mLを880mLの一塩基酸溶液に添加し、混合した。0.1Mのナトリウム二塩基酸溶液を添加してpHを7.4に調整した。緩衝液を121℃で30分間オートクレーブ処理した。ボトルを冷却し、その後、室温で暗所に保存した。
サンプルを培養し、3つの異なる濃度で試験した、各試験は三連で行った。細菌ストック100μLを20mLのoxoid nutrient broth中で、37℃で16時間、回転式シェーカーでインキュベートした。該一晩培養物0.1mLを、0.1mLの試験溶液(試験サンプル、溶媒対照又は陽性対照)と0.5mLのリン酸緩衝液と共に、2.0mLの上層寒天(ビオチンとヒスチジンを僅かに含む)に添加した。上層寒天混合物を最小寒天プレートの表面上に注ぎ、37℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、復帰突然変異体コロニー(突然変異体)の個数を計数した。全ての培養は三連で行った(レプリカを5回行った溶媒対照を除く)。毒性は、細菌のバックグラウンド層(background layer)を調べることで確認できる。毒性がないことは、通常は存在するはずのバックグラウンド細菌の増殖を観察することで試験した。当該研究で用いた陽性対照は、2μg/mLの濃度の4-ニトロキノリン-1-酸化物(4-NQO)であった。
微生物数、金属分析及び刺激試験(パッチ試験)
微生物計数、金属分析及び刺激試験を行うためのM.africanaエタノール抽出物は、前述のように調製した。
防腐剤負荷試験
防腐剤負荷試験において、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、大腸菌(Escherichia coli)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)及びクロコウジカビ(Aspergillus niger)を用いて、USP 31法(USPC 2008)に従ってサンプルを試験した。防腐剤Euxyl PE 9010を陽性対照として使用した。
生理化学的分析
抽出物の臭気及び色の測定
M.africana抽出物の臭気及び色(外観)を視覚的に記録した。
pHメーターを用いてM.africana抽出物のpHを測定した。pHメーターは、pH4及びpH7標準溶液を用いて較正した。次に、電極を抽出物に浸し、記録した。
比重計を用いて抽出物の比重を測定した。比重計を空にして秤量した。その後、蒸留水で満たし、再度秤量した。満たす前の重量を満たした後の重量から減算し、比重計の容量(mL)で割って比重をg/mLで得た。
M.africanaの粘度の測定は、粘度計(Brookfield)を用いて行った。5rpmのスピードで、サイズ5のスピンドルを用いて粘度計の表示数値を得た。粘度計の表示数値に係数を積算し、ゲルクリームの粘度をcPs(センチポアズ)で記録した。
屈折率は、屈折計を用いて測定した。ガラス製のパスツールピペットを用いて、植物抽出物2~3mLを吸い上げた。植物抽出物を屈折計のレンズ上に置き、屈折率を25℃で測定した。
安定性試験
M.africanaのエタノール粗抽出物
200mLの抽出物を含む4個の250mLガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。防腐剤Euxyl PE 9010を各々の瓶に1%加えた。安定性試験は、5℃、25℃、40℃及び50℃で行った。1,2,4,8及び12週間後に、各温度で保存した抽出物の様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的に記録した外観及び臭気が含まれた。pHはpHメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、最初と最後(12週間の間隔)のみで測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
200mLのクリームゲルを含む4個の250mLガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。安定性試験は、5℃、25℃、40℃及び50℃で行った。1,2,4,8及び12週間後に、各温度で保存したクリームゲルの様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的方法で記録した外観及び臭気が含まれた。pHはpHメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、粘度は粘度計を用いて測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
M.Africanaの葉のエタノール抽出物の被験者へのin vivo有効性試験
乾燥した葉のエタノール抽出物(300mg)を70%エタノール(40mL)に溶解し、その後、5%希釈し、製品の濃度とした。
基準時(すなわち試験製品適用前)の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで2つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から14日目(D14-BL)の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで統計的有意差はなかった。基準時から28日目(D28-BL)の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品FCAH106/4325の値は、FCAH106/AqCの値よりも有意に低かった(表9)。
基準時(すなわち試験製品適用前)の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで2つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から14日目(D14-BL)の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品FCAH106/4325の値は、FCAH106/AqCの値よりも有意に低かった。基準時から28日目(D28-BL)の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにt検定を実施した。5%の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品FCAH106/4325の値はFCAH106/AqCの値よりも有意に低かった(表9)。
上記の実施例は、Myrsine africanaの葉のエタノール抽出物が有望なエラスターゼ阻害活性を示すことを明らかにする。単離した化合物MA-NR-01(ミルシノシド B)は、125μg/mLの濃度で13.00±1.04%の阻害率を有することが判明した。
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Claims (7)
- 皮膚のエラスターゼ活性を阻害して皺の出現を低減する美容方法における、Myrsine africanaのエタノール葉抽出物と皮膚科学的に許容されるビヒクルを含む局所スキンケア組成物の使用であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドBを含む、使用(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 皮膚科学的に許容されるビヒクルが、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、美容液、スプレー、日焼け止め、懸濁液及び化粧水からなる群から選択される、請求項1に記載の使用。
- 被験体の皺の予防又は処置の美容方法における、Myrsine africanaのエタノール葉抽出物の使用であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドBを含む、使用(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 皺の予防又は処置が、前記ミルシノシドBによるエラスターゼ活性の阻害の結果である、請求項3に記載の使用。
- Myrsine africanaのエタノール葉抽出物を含む局所スキンケア組成物であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドBを含む局所スキンケア組成物を、それを必要とする被験体の皮膚に局所適用することを含む、皮膚のエラスターゼ活性を阻害して皺の出現を低減する美容方法(ヒトに対する医療行為を除く)。
- 前記局所スキンケア組成物が皮膚科学的に許容されるビヒクルを含む、請求項5に記載の美容方法。
- 皮膚科学的に許容されるビヒクルが、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、美容液、スプレー、日焼け止め、懸濁液及び化粧水からなる群から選択される、請求項6に記載の美容方法。
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2018
- 2018-06-14 ZA ZA2018/03987A patent/ZA201803987B/en unknown
Patent Citations (3)
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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South African Journal of Botany,2008年,Vol.74,pp.577-582 |
Also Published As
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