KR101965420B1 - 큰개별꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 큰개별꽃 추출물은 함유하여 우수한 항산화 활성, 항염증, 항 알러지 효과를 갖는다.

Description

큰개별꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING ATOPIC DERMATITIS CONTAINING EXTRACT OF PSEUDOSTELLARIA PALIBINIANA OHWI}

본 발명은 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 큰개별꽃 추출물을 함유하는 항산화, 항염증 및 아토피 피부 개선 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염은 음식물이나 외부 물질에 대한 과민반응으로 알레르기성 증상을 수반하는 재발성 만성 피부염이다. 아토피는 알레르기 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염, 음식 알레르기 등의 질환을 수반하며, 이러한 질환은 환자 개개인의 유전적 소인이나 주위환경, 연령 등에 따라 단독으로 또는 동시에 나타날 수 있다.

아토피 피부염은 각질층의 수분 유지 기능이 떨어짐에 따라 피부가 건조해지고, 피부 장벽 기능이 저하됨에 따라 피부 알러지 등이 용이하게 발생하여 소양감이 심하고, 반복적으로 재발되며, 각종 자극에 의해 쉽게 피부염이 유발된다.

많은 경우에 1-2주 간격으로 반복적으로 악화되며 적절한 관리를 하지 않으면 삼출을 동반한 홍반성 발진의 아급성 병변에서 만성 병변으로 진행된다. 아토피 피부의 발생 원인은 크게 두 가지로 구분되는데, 하나는 유전적 원인에 의한 것으로서, 피부 보호막인 세포간 결합물질 감마-리놀레인산(γ-linoleic acid; GLA)이 선천적으로 부족하여 피부 보호막이 약하고 피부 표면의 수분이 쉽게 소실됨으로써 발생하게 된다.

다른 원인은 환경적 원인으로서 건조한 환경, 활성산소, 세균, 바이러스, 곰팡이 등에 의하여 발생한다.

현재까지 알려진 치료 방법으로 스테로이드제, 항히스타민제 그리고 면역반응억제제 등이 사용되고 있다. 이러한 약물치료는 빠른 시간 내에 증상을 완화할 수 있는 강점이 있으나, 장기간 사용 시 면역 억제라는 부작용이 있고 약 복용을 중단하면 재발 우려가 높다. 아토피 피부염 개선을 위한 조성물의 상당수는 일반적으로 피부질환에 효과가 있는 화학 약품을 연고베이스에 첨가하여 사용하였다. 이러한 조성물은 대부분 스테로이드제제나 항생제 등 화학성분을 포함하고 있어, 화학약품에 민감한 피부에 적용하거나 장기간 사용하는 경우, 각질층의 두께가 증가하는 등의 심각한 부작용이 발생할 우려가 있다. 따라서 안전하고 효과적인 대체치료법이 요구된다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부자극 및 염증반응이 유발된다. 이러한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증반응과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 과정 이외에도 피부 손상에 있어서 활성 산소가 관련되어 있음은 수많은 연구에 의해 잘 알려져 있는 사실이다. 또한 아토피피부염에 의해 비만세포는 세포 내 과립에서 히스타민과 같은 알러지 반응 유도 물질이 방출되어 탈과립 상태를 나타내고 알러지성 비염, 천식 등을 동반한다는 점에서 알러지성 질환일 가능성이 높다.

최근에는 다양한 천연물을 이용하여 아토피 치료 및 개선용 화장료 조성물에 대한 연구가 이루어지고 있다. 한국등록특허 제10-1287021호는 블루베리, 블랙베리, 아사이베리, 라즈베리, 빌베리, 크랜베리, 블랙초크베리, 두송열매, 숍베리 및 딸기의 초음파 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 상기 초음파 추출물은 항산화, 항염증 및 아토피 개선 효과를 갖는다. 또한, 한국등록특허 제10-0431076호에는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 일정비율로 혼합함으로써, 항균효과, 보습효과, 항염효과, 자유 라디칼(Free radical) 소거효과 등이 나타나 아토피 피부의 치유 개선 효능을 갖는다고 개시하고 있다.

본 발명은 다양한 천연 식물들에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색하여 우수한 아토피 개선 효과를 보이는 천연물로서 큰개별꽃 추출물을 확인하였고, 이를 이용하여 효과적으로 아토피 피부 개선 효과를 제공할 수 있는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제는 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 큰개별꽃 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 30.0 중량% 함유될 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 큰개별꽃 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출 용매로 추출될 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.

본 발명의 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 우수한 아토피 개선 효과를 가진다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. 용어 약이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, 포함하다 및 포함하는 이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana (Takeda) Ohwi)은 개별꽃속(Pseudostellaria) 석죽과(Caryophyllaceae)에 속하고 이명으로 Pseudostellaria palibiniana (Takeda) Ohwi, Krascheninnikovia raphanorhiza Palib., Krascheninnikovia pabiniana Takeda, Krascheninnikovia palibiniana var. polymera Nakai, Pseudostellaria angustifolia Y.N.Lee가 있으며 땅속에 살찐 계란 모양의 덩이뿌리를 가지고 있는 키 작은 다년초 식물이다. 유사종은 눈개별꽃, 민왜별꽃, 참개별꽃, 개별꽃, 긴개별꽃이 있다.

형태학적 특징으로 잎이 대생하고 줄기 밑부분의 것은 주걱형 또는 도피침형이며 밑부분이 좁아져서 엽병처럼 되고 밑부분에 털이 있다. 줄기 윗부분에 달려 있는 2쌍의 잎은 특별히 크며 마디사이가 짧고 십자형으로 배열되며 넓은 난형이고 둔두 또는 예두이며 밑부분이 급히 좁아져서 엽병처럼 되고 길이 3-4cm, 폭 1.5-2.5cm로서 털이 없다. 줄기의 마디 사이가 짧아서 마치 잎이 윤생한 것처럼 보이기도 한다. 4~6월에 두 종류의 꽃이 피며 원줄기 끝에 1개의 백색 꽃이 위를 향해 달리고 소화경은 길이 15-25mm로서 털이 없다.

특히 꽃이 별모양으로 생겼으며 잎이 다른 개별꽃류에 비해 크기때문에 '큰개별꽃'이라고 한다. 큰개별꽃은 전국 산지에 습기있는 축축한 나무 숲의 하부나 계곡 주변에서 자생하고 전초에 함유된 성분으로는 폴리페놀, 스테로이드, 알칼로이드, 테르페노이드, 플라보노이드 등이 있는 것으로 연구되었지만 정확하게 이소비텍신(isovitexin) 외에 밝혀진 것이 거의 없다. 병리학적 특징으로 낙엽성 관목의 하부에 군식하거나 그늘진 장소에 지피용 소재로 식재하면 좋고 어린순은 나물로 식용할 수 있다. 생약명으로 덩이뿌리를 동삼, 태자삼 이라 하며 약용하고 알려진 효능으로 보폐, 건비, 폐결핵의 해수, 신체쇠약, 비위허약의 식욕부진, 하리, 동계발한, 정신피로 치료, 강장, 소화 불량 등이 있다.

본 발명의 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다.

바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리하거나, 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출, 또는 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 따른 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함한다. 큰개별꽃의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 큰개별꽃의 전초를 100~500 메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모 균주 또는 유산균 등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5 내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량%로 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 아토피 개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 아토피 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화, 항염증, 항알러지 효능이 있는 것을 특징으로 한다.

발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당 업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

제조예 1: 큰개별꽃 ( Pseudostellaria palibiniana Ohwi ) 추출물 제조

음건한 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi)의 전초를 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 24시간씩 3회 침지 추출하고 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다.

실험준비

(1) 세포주와 세포배양

실험예 4 내지 6에 사용된 RBL-2H3 cell(rat basophilic leukemia cell line)은 한국 세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였고, 실험예 3에 사용된 RAW 264.7 cell(murine macrophage cell line) 및 실험예 2에 사용된 HaCaT cell(human adult low calcium high temperature)은 American Type Tissue Collection(ATCC)로부터 구입하여 10% FBS와 1% 페니실리움/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였고, 세포는 100mm cell culture dish에 배양하였으며 배지는 3일마다 교환해 주었다.

(2) 세포독성 측정 및 농도 설정

RBL-2H3 cell, RAW 264.7 cell, HaCaT cell에 대하여 세포독성 확인 및 최적 농도를 결정하기 위해 MTT-based cytotoxicity assay를 시행하였다. 10% FBS와 1% 페니실리움/스트렙토마이신이 함유된 DMEM배지에 24시간 배양한 후 페니실리움/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지로 교체하였고 큰개별꽃 추물물을 DMSO에 녹여 1, 10, 100, 1000ppm 농도로 처리하였다. MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium: 5mg/mL) 용액 1/10을 첨가하여 4시간 방치 후 반응액을 제거하였다. 다음으로 각 웰당 100 μL의 DMSO 용액을 가하여 염색된 세포를 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더로 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 최종농도를 100ppm으로 선정하였다.

실험예 1: DPPH 라디칼 소거능 측정

상기의 제조예 1에 대하여 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 L-아스코르브산(Ascorbic acid)을 비교샘플로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 프리라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 프리라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.2mM 용액을 메탄올에 용해하여 100mL로 하였다. 측정방법으로서, 96-웰 플레이트에 0.2mM DPPH 용액과 DMSO에 녹여 제조한 큰개별꽃 추출물의 비를 1:1로 하여 최종 농도가 1, 10, 100, 1000 ppm 되도록 처리하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다. 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.2 mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	SC50(ppm)
L-ascorbic acid	5.21 ± 1.14
제조예 1	42.61 ± 7.87

상기 표 1의 DPPH 자유라디칼을 50% 소거하는데 필요한 시료의 농도인 SC₅₀에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 큰개별꽃 추출물(제조예 1)은 우수한 항산화 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

실험예 2: 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS ) 소거능 분석

큰개별꽃 추출물의 항산화능을 분석하기 위하여, 큰개별꽃 추출물이 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)로 유도한 ROS 생성에 미치는 영향을 확인하였다. HaCaT 세포에 H₂O₂를 100 μM의 농도로 2시간 동안 전처리한 후 DMSO에 녹여 제조한 큰개별꽃 추출물(제조예 1)을 최종농도가 1, 10, 100ppm 되도록 처리하였다. 다음으로 배지를 모두 제거하고 PBS 세척 후 세포 투과성 형광 염료(cell permeable fluorescent dye)인 20 μM의 농도가 되도록 DCFH-DA를 30분 동안 반응한 후 ROS 생성 억제능을 멀티플레이트 리더(multiplate reader)를 이용하여 분석하였다.

시료명	농도	상대 형광율 (%)
H2O2	100uM	148.15 ± 10.17
제조예 1	1 ppm	130.24 ± 9.88
	10 ppm	115.65 ± 8.67
	100 ppm	98.11 ± 7.26

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, H₂O₂에 의해 약 148% 정도 유도된 ROS가 큰개별꽃 추출물을 처리한 경우에 농도 의존적으로 ROS 생성이 억제됨으로써, 본 발명에 따른 큰개별꽃 추출물이 강한 항산화능을 나타내는 것을 알 수 있다.

실험예 3: NO 생성 억제 효과

염증성 사이토카인(cytokines)에 의하여 면역계에서 생성될 수 있는 물질 중 하나인 산화질소(Nitric Oxide; NO)는 포유세포에서 정상적으로 분비되는 물질로서 숙주 방어기작에 중요한 역할을 하지만, 유도성 나이트릭 옥사이드 신타아제(inducible nitric oxide synthase; iNOS)에 의한 산화질소의 과다형성은 염증성 질환의 원인으로 작용한다. NO 생성량은 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 세포 배양액 내의 아질산염(nitrite) 농도를 측정하여 확인하였다. 실험에 사용된 RAW 264.7 세포를 48-웰 플레이트에 배양하였다. 그 후 DMSO에 녹인 제조예 1의 추출물을 최종농도가 1, 10, 100ppm이 되도록 처리하고, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 NO 생성을 유도한 뒤 배양 상등액과 그리스 시약을 1:1로 혼합하여 ELISA 리더를 사용하여 540 nm에서 NO 생성량을 측정하였다. 아질산나트륨(NaNO₂)을 사용하여 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM 농도로 표준 곡선을 작성한 후 NO 측정에 사용하였다.

시료명	농도(ppm)	NO 생성 (μM)
LPS (-)	1	9.87 ± 3.22
LPS (+)	1	72.12 ± 10.25
제조예 1	1	44.28 ± 8.36
	10	24.12 ± 5.88
	100	10.14 ± 4.02

표 3에 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 큰개별꽃 추출물(제조예 1)이 LPS에 의한 NO 생성을 농도 의존적으로 억제시키는 것을 통하여, 본 발명에 따른 큰개별꽃 추출물이 강한 항염효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

실험예 4: 세포 배양액 내의 사이토카인 측정

RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 24-웰 플레이트에 배양하였다. 그 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하고 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배지교환 후 큰개별꽃 추출물(제조예 1)을 DMSO에 녹여 1, 10, 100 ppm농도가 되도록 처리하여 1시간 동안 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 DNP-HSA(10 μg/mL)를 처리하여 4시간 동안 자극시키고 얼음조(ice bath)에서 10분 동안 방치하였다. 다음으로 상층액을 분리하여 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였고 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 IL-4와 TNF-α ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 끝으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4와 TNF-α의 양을 계산하였다.

시료명	농도(ppm)	TNF-a(%)	IL-4(%)
DNP-igE(-)	0.03	100	100
DNP-igE(+)	0.03	186.12 ± 11.81	167.81 ± 10.88
제조예 1	1	165.64 ± 8.23	148.42 ± 8.16
	10	142.55 ± 8.51	126.18 ± 6.46
	100	113.17 ± 5.12	104.56 ± 7.67

표 4의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 큰개별꽃 추출물이 사이토카인 TNF-a, IL-4의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 통하여, 본 발명에 따른 큰개별꽃 추출물이 강한 항염효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

실험예 5: 항원-항체 반응에 의한 β- 헥소사미니다아제 ( hexosaminidase ) 방출량 측정

알러지 즉시반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 β-헥소사미니다아제의 분비를 측정하였다. RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 환경으로 48-웰 플레이트에 배양하였다. 그 후 anti-DNP IgE (30 ng/mL)로 감작하고 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 각 웰의 세포들을 Siraganian buffer(119 mM NaCl, 5mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, pH 7.2)로 2 번 세척한 다음 각 웰당 5.6 mM 글루코오스, 1 mM CaCl₂와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하고 제조예 1의 큰개별꽃 추출물을 DMSO에 녹여 최종농도가 1, 10, 100 ppm이 되도록 1 시간 동안 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 DNP-HSA(10 μg/mL)로 처리하여 1 시간 동안 반응시키고 얼음조에서 10 분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다. 상층액 20 μL를 96-웰 플레이트에 옮기고 substrate buffer(4-p-Nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide 1 mM, 구연산 나트륨 0.05 M, pH 4.5) 80 μL를 넣고 37℃에서 30분 배양시킨 다음 각 웰당 저장 용액(stop solution) 200 μL를 첨가하여 반응을 하였다. 다음으로 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 큰개별꽃 처리군과 대조군의 흡광도 값으로 수학식 2에 의해 β-헥소사미니다아제 분비 억제율(%)로 계산하였다.

C: Cell (+), DNP-HSA (+), 큰개별꽃 (-)

T: Cell (+), DNP-HSA (+), 큰개별꽃 (+)

시료명	농도(ppm)	β-헥소사미니다아제 분비 억제율(%)
DNP-igE(+)	0.03	178.97 ± 10.91
제조예 1	1	166.94 ± 9.55
	10	131.51 ± 9.12
	100	109.17 ± 7.89

큰개별꽃 추출물이 농도 의존적으로 β-헥소사미니다아제 분비를 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명에 따른 추출물이 탈과립 억제 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 6: 항원-항체 반응에 의한 히스타민 방출량 측정

알레르기 즉시반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 위하여 히스타민의 분비를 측정하였다. RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 분주하였다. 그 후 anti-DNP IgE(30 ng/ml)로 감작하고 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 각 well의 세포들을 Siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, pH 7.2)로 2번 세척한 다음 각 웰당 5.6 mM 글루코오스, 1 mM CaCl₂와 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer를 첨가하고 DMSO에 녹여 제조한 큰개별꽃 추출물을(최종농도 1, 10, 100 ppm) 1시간 동안 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 DNP-HSA(10 μg/ml)로 처리하여 1시간 동안 반응시키고 얼음조에서 10분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다. 배양된 RBL-2H3 세포를 4℃에서 5분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리하여 그 상층액을 시료로 사용하였다. e-tube에 시료 25 μL를 넣고 0.1N HCl 22.5 μL, 60% HClO₄ 2.5 μL를 넣고 혼합 후 원심분리 하여 그 상층액 40 μL를 5N NaOH 용액 25 μL, n-부탄올 500 μL 및 NaCl 0.06 g을 혼합한 튜브에 넣고 진탕 후 원심분리(2000 rpm, 10 min)하였다. 부탄올 층 400 μL를 새 e-튜브에 넣고 0.1N HCl 용액 150 μL, n-헵탄 0.5 ml를 가하여 진탕 후 원심분리(2,000 rpm, 10 min)하였다. 여기에서 얻어진 수층 100 μL에 1N NaOH 용액 200 μL와 OPT(o-phthaldialdehyde) 용액 5 μL를 넣고 혼합 후 37℃에서 3분 동안 반응시킨 후 3N HCl 용액 10 μL를 넣고 혼합하여 2분 동안 방치한 후 360 nm(excitation)와 450 nm(emission)에서 형광계(SPECTRAMAX M2, Molecular Devices Co.Ltd. USA)로 형광도를 측정하였다. 다음 수학식 3에 의해 히스타민 분비 억제율(%)을 계산하였다.

C: Cell (+), DNP-HSA (+), 큰개별꽃 (-)

T: Cell (+), DNP-HSA (+), 큰개별꽃 (+)

시료명	농도(ppm)	히스타민 분비 억제율(%)
DNP-igE(+)	0.03	152.11 ± 6.88
제조예 1	1	145.62 ± 6.27
	10	128.74 ± 5.96
	100	115.01± 6.02

큰개별꽃 추출물이 농도 의존적으로 히스타민의 분비를 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명에 따른 추출물이 탈과립 억제 효과가 있음을 알 수 있다.

처방예 1 - 화장수

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 함유한 화장료 중 화장수의 처방예는 다음 표 7과 같다.

성분	함량(단위:중량%)
제조예 1 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 피이지1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.2 미량 잔량
합계	100

처방예 2 - 크림

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 처방예는 다음 표 8과 같다.

성분	함량 (단위:중량%)
제조예 1 친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알콜 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐히아루로네이트 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100

처방예 3 - 에센스

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음 표 9와 같다.

성분	함량 (단위:중량%)
제조예 1 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100

비교처방예 1 - 크림

큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 함유하지 않은 것을 제외하고는 표 8의 처방과 동일하게 제조하였다.

실험예 7: 아토피 치유 개선효과(상태 개선 효과)

상기 처방예 2와 비교처방예 1의 영양크림에 대한 아토피 치유 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다. 10 내지 30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피 피부염을 앓고 있는 환자 중 20(n)명에 대하여 아토피 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 처방예 2의 영양크림을, 오른쪽 손에는 비교처방예 1의 영양크림을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포한 후 아토피 상태 개선을 확인하기 위하여 아토피 상태 개선 정도를 측정하였다.

구분		아토피 상태 개선
		(n)	(%)
처방예 2	매우 좋다	11	55
	좋다	7	35
	보통이다	2	10
	그저 그렇다	-	-
비교 처방예 1	매우 좋다	-	-
	좋다	4	20
	보통이다	7	35
	그저 그렇다	9	45

상기 표 10에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 큰개별꽃 추출물을 포함하는 처방예 2의 화장료가 비교처방예 1보다 아토피 피부의 상태 개선 효과가 우수하다.

실험예 8: 아토피 치유 개선효과(효능 평가)

상기 처방예 2에 의해 제조된 아토피 피부염 개선 크림의 효능을 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다. 10 내지 30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피 피부염을 앓고 있는 환자 중 20명에 대하여 아토피 임상 효능평가를 조사하였다. 평가는 4주간에 걸쳐 진행되었으며, 상기 크림을 1일 3회 환부에 부드럽게 펴 발라 주었다.

피부증상정도	A			B
	부종	홍반	찰상	소양감	수면장애
전	2.8	1.8	1.4	8.0	4.0
후	1.3	1.3	2.6	5.0	3.0

사용 후 피부의 증상은 "A : 0=없음, 1=경도, 2=중등도, 3=중도, B : 0=없음 ~ 10=매우 심함"와 같이 점수로 평가하였으며, 그 결과는 상기 표 11과 같이 제조된 아토피 피부염 개선 크림은 아토피 피부염의 대표적 증상인 부기, 염증, 상처, 가려움 및 이들 증상으로 인한 수면장애에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

1. 큰개별꽃(Pseudostellaria palibiniana Ohwi) 추출물을 유효성분으로 포함하며, 상기 큰개별꽃 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 큰개별꽃 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 30.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피 피부 개선용 화장료 조성물.
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