CN110546156B - 从生物流体中除去细菌毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从生物流体中除去细菌毒素如脂多糖和脂磷壁酸的方法。在所述方法中，将选自KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA的肽通过其C末端、任选地通过插入的连接体与固体载体共价连接，并用于捕获毒素。本发明还涉及这种衍生化的固体载体，以及涉及包含这种衍生化的固体载体的筒、柱和医疗装置。

Description

从生物流体中除去细菌毒素的方法
本发明涉及从生物流体中除去细菌毒素如脂多糖和脂磷壁酸的方法。在这类方法中，将选自KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA的肽通过其C末端(任选地具有插入的连接体)与固体载体共价连接，并用于捕获毒素。
本发明还涉及这类衍生化的固体载体，以及涉及包含所述衍生化的固体载体的筒、柱和医疗装置。
发明背景
败血症是由人体的免疫和凝血系统引起的临床综合征。败血性休克是危及生命的疾病，其特征是尽管进行了足够的补液，但血压仍然很低，并且器官功能障碍或衰竭。败血症是所有年龄段人群的重要死亡原因(Perner等人，2017)。
在超过二十年的时间里，败血症被定义为会引起发烧(或体温过低)、心动过速、呼吸急促和血液白细胞变化的微生物感染。败血症现在被越来越多地视为对造成器官损伤的微生物入侵的全身性炎症和免疫反应失控。败血性休克的定义为败血症和高乳酸血症和并发的低血压，需要进行血管升压治疗，住院死亡率接近30-50％。
败血症和相关疾病是全世界的主要死亡原因之一，每年1900万例，每天1,400例死亡。仅在像美国这样的发达国家，败血症的发生率估计为1,655,000，导致每年250,000以上的死亡。这已成为美国的主要经济负担，用于医疗保健的总额达167亿美元(Lakshmikanth等人，2016)。
患有败血症的患者通常接受静脉内抗生素、氧气、液体和药物治疗，以刺激心脏并维持可接受的血压水平。在某些情况下，使用透析。
尽管在该领域进行了深入研究，但尚未发现败血症的特定医疗方法。随着败血症的更早期发现以及对最佳医疗实践的更多顺应性，败血症已不再是直接威胁生命的疾病，而更多地是长期的慢性危重疾病，通常与长期炎症、免疫抑制、器官损伤和瘦组织消耗相关。此外，败血症幸存的患者出院后仍有持续的死亡风险，以及长期的认知和功能缺陷。尽早确诊及最佳医疗实践的更好实施已降低了医院内死亡率，但是迄今为止使用免疫调节剂的结果令人失望。同样地，没有任何生物标志物可以明确诊断败血症或预测其临床结局。由于其复杂性，败血症结果的改善可能会持续为缓慢且渐进的(Hotchkiss等人，2016)。
脂多糖(LPS)或内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，是引起败血症的临床综合征的主要细菌产物。LPS与宿主受体Toll样受体4(TLR4)结合会触发炎症反应，其特征是释放大量炎症介质，使宿主能够对入侵的病原体做出反应。当这种产生变得不受控制且过度时，就会导致败血性休克的发生(Ianaro等人，2009)。
脂磷壁酸(LTA)是革兰氏阳性细菌的主要细胞壁成分，还与多种炎症疾病有关，从轻微的皮肤疾病到严重的败血症。已知LTA被Toll样受体2(TLR2)识别，导致天然免疫应答的启动和适应性免疫的进一步发展。但是，过度的免疫反应可能会导致炎症性后遗症，其与严重的疾病(如败血症)有关(Kang等人，2016)。
TORAYMYXIN(Rocco和Klein 2014；Shoji等人，1998)是一种治疗策略，通过将多粘菌素B(PMX)(一种已经用于临床的常规抗菌肽(Roscia等人，2013))固定在血液灌流装置中的聚苯乙烯衍生的纤维上，用以去除循环中的LPS。通过将PMX共价固定在聚苯乙烯衍生的纤维上，从而制成PMX筒，然后可将其用于使用体外回路的外部血液过滤，从而通过将LPS吸附到PMX筒上以去除循环中的LPS。
在另一种策略中，将多粘菌素B(PMX)固定在固相(4B)上，并在清醒大鼠中开发了血浆置换系统，通过PMX-Sepharose柱对内毒素进行特异性的在线血浆吸附(Cohen等人，1987)。
LPS吸附器(Ala-Kokko等人，2011)是一种用于在血液灌流过程中体外清除LPS的医疗装置。该产品的生物技术基于合成的定制肽，该肽选择性结合败血症病人的循环中发现的LPS。
然而，需要替代方法来清除败血症患者血液中的LPS并且可能也去除TLA。
现有技术
WO2010038220公开了以单体、树突状结构和多抗原肽(MAP)形式提供的抗菌肽序列KKIRVRLSA(M33)及其功能类似物RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA，特别是以下文化合物A的形式，并公开了M33中和LPS的能力。在上文列出的WO2010038220的4个抗菌肽序列中，所有氨基酸均为L-构型。
WO2012010266公开了当M33的L-氨基酸及其功能类似物被其相对的D-氨基酸对应部分替代时，所得肽仍具有抗菌活性。
从Falciani等人(2012)已知M33-衍生的四支链的肽(其中M33为全-L或全D-构型)在试验中结合LTA和LPS，从而将它们的生物素化衍生物固定在抗生蛋白链菌素包被的单元上(即，非共价结合到固体载体上)。
EP1789436公开了具有与本发明的M33肽和M33功能类似物相似、但不相同的序列的MPA肽，它们通过固相合成法合成(其中当肽与固相载体结合时，是完全侧链保护的)，并公开了其在biacore试验中针对LPS的活性(其中与固相载体结合的部分是LPS，而不是所述抗菌肽)。
Gustafsson等人(2010)公开了多种抗菌肽及其固定在固体载体上时的LPS结合活性。同样，Costa等人(2011)公开了如何将抗菌肽共价连接于固体载体上。
附图简述
图1描述了交联的羟乙基聚苯乙烯和聚乙二醇的复合树脂。
图2描述了在SulfolinkTM树脂和游离硫醇之间如何形成共价键。
图3描述了在与SulfolinkTM树脂偶联之前(A)和之后(B)，含有化合物B的溶液的HPLC谱图。
图4描述了在暴露于用化合物B衍生化的树脂(A)和相同的未衍生化的树脂(B)之前和之后，生物流体中的LPS含量。
图5描述了在暴露于用化合物B衍生化的树脂(A)和相同的未衍生化的树脂(B)之前和之后，生物流体中的LPS含量。
图6描述了血清样品(A)、与用化合物B衍生化的树脂接触后的血清样品(B)、与用化合物A衍生化的树脂接触后的血清样品(C)的蛋白电泳图谱，以及此类蛋白质的参考值(D)
图7描述了在暴露于用化合物B衍生化的树脂(A)和相同的未衍生化的树脂(B)之前和之后，生物流体的LTA含量。
发明详述
我们已经惊讶地确定，当M33通过其C末端共价结合到固体载体上时，特别是当通过与化合物A或下面的化合物B形成共价键而结合到该结构上时，其允许选择性地将LPS从生物流体中去除，但不会改变流体中的蛋白质含量。
所述衍生化的固体载体也可用于从生物流体中去除LTA。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种从生物流体中去除选自LPS和LTA的细菌毒素的方法，该方法包括使生物流体与选自KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA的肽接触，所述肽通过其C末端(任选地具有插入的连接体)共价连接至固相载体，且其中所述肽的所有氨基酸均为L-构型或D-构型。
在一个实施方案中，选自KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA的肽的所有氨基酸均为L-构型。
在另一实施方案中，选自KKIRVRLSA、RRIRVRLSA、KRIRVRLSA和RKIRVRLSA的肽的所有氨基酸均为D-构型。
在一个实施方案中，所述肽-连接体部分是下式的基团
其中
R1—、R2—、R3—、R4—、R5—、R6—、R7—和R8—可以相同或不同，且选自KKIRVRLSA—、RRIRVRLSA—、KRIRVRLSA—和RKIRVRLSA—；
X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7相同或不同，且是至少双官能残基；
n、m、p、q、t、v和w可以相同或不同，且可以是0或1，且m、n、p和q中至少一个是1，条件是如果t是0，那么n和m是0，且p和q中至少一个是1，如果v是0，那么p和q是0，且m和n中至少一个是1，且如果w是0，那么v是0，且m和n中至少一个是1；
Y是键或间隔基。
在一个实施方案中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7相同或不同，且各自包含至少两个官能氨基基团。
在另一个实施方案中，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7相同或不同，且选自赖氨酸残基、鸟氨酸残基、正赖氨酸(norlysine)残基、氨基丙氨酸残基和二氨基丙酸残基。
在一个实施方案中，R1—、R2—、R3—、R4—、R5—、R6—、R7—和R8—中至少一个是KKIRVRLSA—。
在另一个实施方案中，R1—、R2—、R3—、R4—、R5—、R6—、R7—和R8—中每一个都是KKIRVRLSA—。
在一个实施方案中，Y是选自氨基酸残基和肽。
在一个具体的实施方案中，Y选自氨基酸残基、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、八肽、九肽和十肽。
在一个更具体的实施方案中，Y选自β-丙氨酸残基、其中1≤y≤11的N-(PEG)y-CH2-CH2-C(O)残基、半胱氨酸残基和包含此类残基的肽。
在一个甚至更具体的实施方案中，上述实施方案的肽选自二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、八肽、九肽、十肽。
在一个实施方案中，y选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。
在一个实施方案中，w是0，v是0，t是1，m是1且n是1。
在一个具体的实施方案中，w是0，v是0，t是1，m是1，n是1且X1、X2和X5各自是赖氨酸残基。
在一个具体的实施方案中，w是0，v是0，t是1，m是1且n是1，且R1—、R2—、R3—和R4—中至少一个是KKIRVRLSA—。
在一个具体的实施方案中，w是0，v是0，t是1，m是1且n是1，且R1—、R2—、R3—和R4—各自是KKIRVRLSA—。
在某些实施方案中，所述固体载体是多孔的。
在一个实施方案中，所述固体载体是交联的琼脂糖树脂。
在另一个实施方案中，所述固体载体是交联的羟乙基聚苯乙烯和聚乙二醇的复合树脂。
在一些实施方案中，所述生物流体选自血清、血浆和血液。
本发明的第一方面的所有实施方案可以组合。
在本发明的第二方面，提供了带有如上在本发明的第一方面的实施方案中所述的基团的固体载体。
在本发明的第三方面，提供了一种选自柱和筒的物品，其各自包括本发明第二方面的固体载体。
在本发明的第四方面，提供了一种医疗装置，其包括本发明第二方面的固体载体或本发明第三方面的物品。
在一个具体的实施方案中，该医疗装置是用于从生物流体中去除选自LPS和LTA的细菌毒素的医疗装置。
在本发明的第五方面，提供了本发明的第四方面所述的医疗装置用于从生物流体中去除选自LPS和LTA的细菌毒素的用途。
实施例
现在通过非限制性实施例描述本发明。
实施例1：与树脂结合的化合物A的合成
化合物A是在100mg NovaSyn TG树脂(0.24mmol/g)(Novabiochem)上合成。
该树脂a是低交联的羟乙基聚苯乙烯和3000-4000MW聚乙二醇的复合物，其已用氨基末端官能化。(图1)
使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学和O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)/1,3-异丙基乙基胺(DIPEA)活化，在自动合成仪Syro(MultiSynTech,Witten,德国)上进行肽合成。侧链保护基团对于Lys是叔丁氧基羰基，对于Arg是2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，对于Ser是叔丁基醚。第一个氨基酸是Fmoc-βAla-OH。使用两个与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的连续的偶联步骤来构建赖氨酸核心，然后顺序添加Fmoc氨基酸以完成肽KKIRVRLSA。最后，通过用含水和三异丙基硅烷的三氟乙酸(95:2.5:2.5)处理，使树脂上的化合物A侧链脱保护。然后将肽基树脂用DCM洗涤四次，用MeOH洗涤四次，用1M乙酸洗涤三次，用H2O洗涤四次，并用MeOH洗涤四次。
实施例2:化合物B的合成
化合物B是通过标准Fmoc化学方法用Syro多肽合成仪(MultiSynTech,Witten,德国)通过固相合成制备。该肽是在TentaGel S RAM树脂上合成，其中Fmoc-NH-Cys(Trt)-COOH为C-末端的第一个氨基酸，在第二个偶联步骤中添加Fmoc-NH-PEG(4)-CH2-CH2-COOH，然后添加两次Fmoc-Lys(Fmoc)-OH以构建四聚核心。随后依次添加9个Fmoc氨基酸以完成肽KKIRVRLSA。侧链保护基团是，R用2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，K用叔丁氧基羰基且S用叔丁基。将终产物从固体载体上解离下来，并通过用含有三异丙基硅烷、水的TFA(95/2.5/2.5)处理进行脱保护，并用乙醚沉淀。粗制肽通过反相色谱在制备柱上(XBridge肽BEH C18 Waters)纯化，线性梯度为从75％到65％A，40分钟，其中A为0.1％TFA/水，且B为乙腈(rt＝22min)。通过用上述相同的梯度在Phenomenex Jupiter C18分析柱(300A°,5μm,250x 4.6mm)上进行反相色谱法并通过质谱MALDI TOF/TOF(Ultraflex III BrukerDaltonics)确定最终肽的纯度和同一性(M+:实测值7723,5；计算值7724,1)。
实施例3：与树脂结合的化合物B的合成
化合物B通过其巯基连接到作为交联琼脂糖树脂的SulfolinkTM树脂上，如图2所示。
将稀释为4ml的化合物B(1mg/ml)重新悬浮，并在室温下在偶联缓冲液(50mMTris,5mM EDTA-Na；pH 8.5)中孵育30分钟。
通过混合将SulfoLinkTM树脂(肽固定试剂盒，PierceBiotechnology,Rockford,Illinois,美国)在其筒/柱(5ml柱，直径1cm，树脂体积2ml)重新悬浮，并经1,000x g离心1分钟除去存储缓冲液，将该柱置于15ml收集管中。将2ml偶联缓冲液(如上所述)加在树脂上，然后将该混合物离心，并重复此步骤一次。加入2ml化合物B溶液，并在室温下摇动或上下颠倒混合15分钟。然后，将该柱直立放置并在室温下孵育30分钟而不混合。将该步骤重复两次。
将该柱放入新的15ml收集管中，并离心以收集未结合的肽。保存流穿液以通过HPLC测定偶联效率，如图3所示，当化合物B在22.27分钟洗脱，偶联效率最佳。
将柱洗涤并离心3次。然后，用2ml偶联缓冲液洗涤柱子并离心。然后将在偶联缓冲液中的50mM半胱氨酸加到色谱柱上，并在室温下混合45分钟，以封闭未反应的结合位点。进一步离心后，将柱排干。
实施例4:树脂结合的化合物B从生物流体中去除LPS，并且不会显著改变血清的蛋 白含量
使用在其5ml柱(5ml柱，直径1cm，树脂体积2ml)中的2ml实施例3的加载有化合物B的树脂。将2ml含有来自大肠杆菌(E.coli)O111:B4的LPS(Sigma,St.Louis,MO)(5ng/ml)的人血清在持续振摇下于室温下与筒中的树脂一起孵育2小时。然后按照材料和方法中的描述，收集样品并通过鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验来检测LPS的量。
作为阴性对照，将相同量的未加载化合物B的树脂与相同量的血清一起孵育，并如上所述检测其LPS含量。
作为另一个对照，还检测了未处理的血清等分试样的LPS含量。
如图4所示，加载的树脂能够去除血清中85％的大肠杆菌(E.coli)LPS，而未加载的树脂完全不能去除LPS。
如图6A和6B所示，其分别描述了在血清通过加载有化合物B的树脂之前和之后的毛细管电泳图，这种通过不会显著改变血清的蛋白含量。
实施例5:与树脂结合的化合物A从生物流体中去除LPS，且不会显著改变血清的蛋 白含量
将1ml实施例1的加载有化合物A的树脂装入5ml柱中(5ml柱，直径为1cm)。使用实施例4中描述的相同方法，如图5所示，已经确定加载化合物A的树脂能够从大肠杆菌(E.coli)中去除超过74％的LPS，而未加载的树脂则能够去除43％的LPS。
如图6A和6C所示，其分别描绘了在血清通过加载有化合物A的树脂之前和之后的毛细管电泳图，这种通过不会显著改变血清的蛋白含量。
实施例6：与树脂结合的化合物B从含有LTA的磷酸盐缓冲盐溶液中去除LTA
使用在其5ml柱(5ml柱，直径1cm，树脂体积2ml)中的2ml实施例3的加载有化合物B的树脂。将含有来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的LTA(MyBiosource,San Diego,CA,US)(500pg/ml)的1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液在持续振摇下于室温与筒中的树脂一起孵育2小时。然后按照材料和方法中的描述，收集样品并通过人LTA(脂磷壁酸)ELISA试剂盒来检测LTA的量。
作为阴性对照，将相同量的未加载化合物B的树脂与相同量的PBS一起孵育，并如上所述检测其LTA含量。如图7所示，加载的树脂能够去除97％的来自金黄色葡萄球菌的LTA，而未加载的树脂仅能去除14％。
材料与方法
通过LAL试验检测LPS
使用LAL生色内毒素定量试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,US)进行LPS去除分析，其是游离LPS存在的指示剂。
使用在无内毒素的水中的来自大肠杆菌(Escherichia coli)(O111:B4)的对照标准内毒素并连续稀释来制备标准曲线(0.1-1EU/ml)。将血清样品在无内毒素的水中稀释50倍和100倍。每个样品一式两份进行处理。
将微孔板在37℃的加热块中平衡10分钟。然后，将50μL的每种标准品和样品分配到微孔板上，并在37℃下孵育5分钟。
向每个孔中加入50μL鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)，并将该板在37℃下孵育10分钟。恰好10分钟后，将100μL显色底物溶液添加到每个孔中。将该板在37℃孵育6分钟。最后，加入50μL终止剂(25％乙酸)。在读板器(Ascent Software)上检测405-410nm处的吸光度。根据上文所述获得的标准曲线来计算EU。
通过ELISA法测定LTA
可以通过使用市售的试剂盒来容易地测定样品中LTA的含量。这种试剂盒的一个实例是Antibody Research Corporation(St.Charles,Missouri)LTA ELISA试剂盒。将样品加至预先涂布有脂磷壁酸抗体的微孔板孔中。孵育并洗涤后，加入用生物素标记的脂磷壁酸检测抗体。适当孵育后，加入抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物，然后孵育并洗涤以除去未复合的酶。加入生色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液后，将样品孵育5分钟。通过加入硫酸溶液来停止HRP酶反应。显色的强度与样品中存在的脂磷壁酸浓度成正比，并使用读板器在450nM下读数。通过在标准曲线中内推吸光度值来确定样品中脂磷壁酸的浓度。
使用人LTA(脂磷壁酸)ELISA试剂盒(MyBiosource,San Diego,CA,US)进行LTA去除分析。
使用在样品/标准品稀释缓冲液中的来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的对照标准脂磷壁酸并连续稀释来制备标准曲线(7.8-500pg/ml)。
在样品/标准品稀释缓冲液中将样品稀释2和10倍。每个样品一式两份进行处理。
在加入标准品、样品和对照(零)孔之前，将微孔板洗涤两次。然后将100μL的每种标准品和样品分配到微孔板上，并在37℃下孵育90分钟。
将100μL生物素-检测抗体工作溶液添加到上述孔中，并在37℃下孵育60分钟。
用洗涤缓冲液将板洗涤3次。
向每个孔中加入100μL HRP-抗生蛋白链菌素缀合物(SABC)工作溶液，并将板在37℃下孵育30分钟。恰好30分钟后，将板用洗涤缓冲液洗涤5次。
向每个孔中加入90μL TMB底物溶液。将该板在黑暗中于37℃孵育15-30分钟。最后，加入50μL终止溶液。在读板器(Ascent Software)上检测450nm处的吸光度。根据如上所述获得的标准曲线计算LTA浓度。
毛细管电泳
按照生产商的说明，通过临床装置Capillarys(4.51软件；Sebia)，利用毛细管电泳，在通过加载有化合物A或B的树脂之前和之后分析人血清。该仪器以克/升的形式提供了样品中存在的蛋白质含量，还显示了电泳曲线谱，相对含量以百分比表示，含量基于曲线外面积计算。
参考文献
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Claims (4)

1.KKIRVRLSA肽在制备用于从生物流体中去除选自LPS和LTA的细菌毒素的产品中的用途，其中所述肽通过其C末端与插入的连接体共价连接至固相载体，从而形成连接体-肽部分，其中：
(i)所述肽的所有氨基酸均为L-构型或D-构型；
(ii)所述肽-连接体部分是下式的基团：
其中
R1—、R2—、R3—、R4—、R5—、R6—、R7—和R8—为KKIRVRLSA—；
X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7为赖氨酸残基；
w是0，v是0，q是0，p是0，t是1，m和n是0或1，条件是m和n中至少一个是1；
Y选自β-丙氨酸残基、其中1≤y≤11的N-(PEG)y-CH2-CH2-C(O)-残基和半胱氨酸残基。
2.如权利要求1中所述的用途，其中所述固体载体选自交联的琼脂糖树脂和交联的羟乙基聚苯乙烯和聚乙二醇的复合树脂。
3.固体载体，其与KKIRVRLSA肽的C-末端通过插入的连接体共价连接，由此形成肽-连接体部分，其中所述肽-连接体部分如权利要求1中所定义。
4.一种用于从生物流体中去除选自LPS和LTA的细菌毒素的医疗装置，所述医疗装置包含如权利要求3中所述的固体载体。
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