ES2304518T3 - Matriz de afinidad polimerica, un metodo de produccion y uso de la misma. - Google Patents
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Abstract
Una matriz de afinidad polimérica para la unión de una o más sustancias en un fluido para eliminar dicha una o varias sustancias del fluido y/o hacer disminuir la cantidad o concentración de la misma en dicho fluido con la intención de evitar, eliminar, o reducir la activación no deseada de los componentes o procesos de dicho fluido, donde dicha matriz comprende a) un soporte sólido b) al menos un espaciador unido al soporte sólido, donde el espaciador se selecciona del grupo que consiste en poli- u oligo-etilenglicoles de fórmula H-(OCH 2CH 2) n-OH, donde n representa 2-250, o poli(alcoholes vinílicos), polivinilaminas, poliolicidoles, polietileniminas, óxidos de polipropileno, o derivados de los mismos, y, acoplado a cada espaciador, c) un ligando que tiene una estructura tridimensional definida que es complementaria por lo que se refiere a carga y/o carácter hidrófobo/hidrófilo a la estructura tridimensional de un motivo de unión de dicha una o varias sustancias, donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en (Ver fórmula) y (Ver fórmula)
Description
Matriz de afinidad polimérica, un método de
producción y uso de la misma.
La presente invención se refiere a una matriz de
afinidad polimérica para su unión a una o más sustancias en un
fluido para eliminar dicha o dichas sustancias del fluido y/o
disminuir la cantidad o concentración de las mismas en dicho fluido
con el propósito de prevenir, eliminar, o reducir la activación no
deseada de componentes o procesos en dicho fluido, a un método para
eliminar dicha o dichas sustancias del fluido y/o disminuir la
cantidad o concentración de las mismas en dicho fluido, a un método
para producir dicha matriz, al uso de dicha matriz y a un kit que
comprende dicha matriz.
El tratamiento extracorpóreo de un fluido, tal
como sangre o cualquier otro fluido corporal requiere poner en
contacto el fluido con material en forma de tubos, conductos,
cuentas o membranas. La introducción de tal material implica el uso
de material extraño y potencialmente bioincompatible (p. ej.,
inmunológicamente activo o procoagulatorio). Este uso de material
foráneo está asociado con la activación del sistema inmunitario del
anfitrión, p. ej. de componentes de la sangre tales como los
linfocitos, las plaquetas o diferentes tipos de cascadas de
proteínas del plasma tales como las proteínas del complemento o la
cascada de la coagulación. Asimismo, La lesión de las células tal
como la lesión mecánica o inducida por estrés p. ej. en los
eritrocitos podría causar una hemólisis y las subsiguientes
complicaciones amenazadoras para la vida del paciente. El
tratamiento de un fluido, tal como la sangre o cualquier fluido
corporal, por lo tanto, requiere el uso de material altamente
biocompatible para evitar la activación no deseada de los
componentes de dicho fluido, p. ej. sangre.
Las endo- y exotoxinas bacterianas promueven una
reacción inmunitaria inflamatoria contundente en un anfitrión
debido a la activación causada por múltiples interacciones entre las
células de la sangre y las proteínas solubles del anfitrión y dicha
endotoxina. Esta respuesta inmunitaria se describe como un rasgo
esencial en los síntomas clínicos del SIRS (síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica), la sepsis o el choque séptico. La
patogénesis es grave y la afección conduce a una lesión tisular,
fallo multiorgánico, y muerte inducida por sepsis. La búsqueda de
nuevos fármacos y métodos terapéuticos para el tratamiento de
pacientes sépticos es importante, puesto que los estudios de las
intervenciones terapéuticas recientes (Dinarello et al. en
European Cytokine Network 1.997; 8:294) muestran un fracaso en la
protección de los pacientes con sepsis grave o choque séptico.
Asimismo, cuando se fabrican sustancias o fluidos terapéuticos, se
debe tener cuidado de que el producto no sea pirogénico, esto es,
que la concentración de endotoxinas esté ausente o por debajo de los
límites aceptados para ejercer sus efectos.
Las endotoxinas o "pirógenos" de las capas
exteriores de la membrana celular de las bacterias Gram negativas,
p. ej. Escherichia coli, Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa o Proteus vulgaris, juegan un
importante papel en la patogénesis de la sepsis, el choque séptico
y el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS). Las
endotoxinas, p. ej. el lipopolisacárido (LPS) de E. coli,
están compuestas por un lípido A y una cadena polisacárida
(Zähringer et al. Adv. Carb. Chem. Biochem., 1.994). La
estructura molecular del LPS se muestra en la Fig. 1. El componente
lipídico A es la parte más activa biológicamente y media el efecto
tóxico de las endotoxinas en las células. El lípido A está muy
conservado en las diferentes cepas de bacterias Gram negativas
mientras la porción polisacárida es mucho más variable.
El lípido A de E. coli consiste en dos
radicales glucosamina, que contienen dos grupos fosfato cargados
negativamente en extremos opuestos de las dos glucosaminas, y seis
restos ácido graso muy hidrófobos de cadena larga que están unidos
a los dos anillos de glucosamina. La cadena polisacárida variable de
la endotoxina también está unida a una de las glucosaminas.
La eliminación de endotoxinas es difícil y a
menudo incluye problemas con la recuperación de o el perjuicio de
las proteínas valiosas, esto es, proteínas que no se pretende
separar, o problemas de biocompatibilidad con la sangre o fluidos
corporales y los medios utilizados para la eliminación de la
endotoxina. Tal problema de biocompatibilidad está causado por una
mera activación de los mecanismos de defensa del anfitrión e implica
la activación celular múltiple y la liberación de proteínas
solubles tales como las citoquinas y las proteínas de la cascada
del complemento. La activación celular y la liberación de proteínas
pueden conducir a una inflamación grave, esto es, una sepsis
sistémica o un choque séptico, con lesión tisular y fallo orgánico
como resultado. La formación de coágulos de sangre causada por la
coagulación es otro problema ocasionado por la bioincompatibilidad.
Por otra parte, el pirógeno no debería ser eliminado
completamente.
Los métodos conocidos para eliminar endotoxinas
incluyen la inactivación por medio del uso de calor, ácido o álcali
(Patentes de los Estados Unidos Núms. 3.644.175, 3.659.027, y
4.070.289). Tales métodos a menudo comprometen la calidad del
producto final, esto es el fluido destoxificado inactivado, puesto
que el fluido y sus proteínas valiosas podrían ser desnaturalizadas
o inactivadas también utilizando este tipo de procesos. Otros
métodos que se emplean incluyen adsorción en carbón, o
descomposición oxidativa utilizando un agente oxidante, p. ej.
permanganato de potasio, peróxido de hidrógeno acuoso, e hipoclorito
sódico.
La eliminación extracorpórea de endotoxinas del
plasma o la sangre completa de pacientes sépticos se estudia como
una estrategia terapéutica potencial en el tratamiento de la sepsis,
el choque séptico y el SIRS. En el plasma humano hay diversas
proteínas de unión que juegan un papel en la mediación y la
inhibición de los efectos de las endotoxinas sobre las células, p.
ej. la proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP), la proteína que
incrementa la permeabilidad bactericida (BPI), sCD14, CAP18, y
lactoferrina. El antibiótico peptídico polimixina B (producido por
Bacillus polymyxa) inhibe la acción de las endotoxinas sobre
las células. El cangrejo de herradura (Limulus polyphemus)
también contiene proteínas de unión a endotoxinas y un producto
lisado celular de esta especie se utiliza para la detección de
endotoxinas (producto lisado de Limulus, LAL, o test de Limulus).
Los motivos de unión de tales proteínas de unión a endotoxinas se
pueden utilizar para el tratamiento extracorpóreo de plasma o
sangre completa de pacientes sépticos.
Una característica común de muchas secuencias de
unión a endotoxinas es la presencia de aminoácidos cargados
positivamente e hidrófobos alternantes en la porción de unión de las
mismas. Se ha demostrado para una proteína de unión a endotoxinas
que tiene su origen en el cangrejo de herradura que la secuencia de
unión a endotoxinas forma una estructura secundaria anfipática
donde los restos cargados positivamente y los restos hidrófobos se
localizan en caras opuestas de una estructura en bucle (Hoess et
al. EMBO J, 1.993). Se ha propuesto un patrón similar para
otros sitios de unión a endotoxinas.
Los polímeros cargados positivamente tales como
la celulosa modificada con polietilenimina (Mizner et al.
Artif. Organs, 1.993; Weber et al. ASAIO J, 1.995; Petsch
et al. J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl., 1.998) o
dietilaminoetilo (DEAE) (Weber et al. A.S.A.I.O. J., 1.995)
tienen una cierta capacidad de adsorción de endotoxinas,
probablemente basada en la interacción de las cargas positivas con
los restos fosfato cargados negativamente del lípido A. Una
desventaja de la polietilenimina es la elevada absorción de heparina
y su interacción bien descrita con las plaquetas que da lugar a
problemas de bioincompatibilidad tales como la coagulación en una
aplicación in o ex vivo.
De un modo similar, los filtros de membrana
cargados positivamente se utilizan para la purificación de fluidos
de infusión. La absorción depende por tanto de las cargas atrayentes
y es menos específica y por lo tanto puede eliminar también
proteínas valiosas deseadas.
Se ha sugerido la arginina inmovilizada sobre
sefarosa para la eliminación de endotoxinas del plasma, la sangre y
las soluciones farmacéuticas (EP 0.949.848 y EP 0.333.474).
En la publicación WO 92/11847 se describe el uso
de un compuesto para la preparación de un medicamento que se va a
utilizar oralmente, intravenosamente, intramuscularmente,
intracutáneamente o intraperitonealmente para el tratamiento de los
efectos inducidos por endotoxinas así como un método para el
tratamiento de los efectos inducidos por endotoxinas. El compuesto
descrito en la publicación WO 92/11847 no está inmovilizado sobre
un soporte sólido.
En la publicación WO 92/04384 A1 se describe el
uso de diferentes espaciadores para proporcionar distancias
definidas entre una fase sólida y un ligando en un método para la
inhibición de los efectos inducidos por endotoxinas.
En la publicación WO 01/23413 se describen
ligandos unidos a un soporte sólido por medio de un espaciador.
Dicho ligando consiste en una mezcla de oligopéptidos lineales o
ramificados y es eficaz para la adsorción de una gran variedad de
endotoxinas.
En Bioorganic & Medicinal Chemistry letters
12 (2.002) 951-954, Soho Kasai et al.,
"Design and Synthesis of
Antiangiogenic/Heparin-Binding Arginine
Dendrimer..." se describen TX-1943 y
TX-1944, que consisten en restos arginina y lisina
unidos a una resina Wang por medio de una glicina.
Asimismo, los polímeros hidrófobos (p. ej.
poliestireno, poliamida, polisulfona, y polietersulfona) pueden
adsorber endotoxinas en soluciones acuosas. Esta propiedad se
utiliza en las membranas de ultrafiltración para la purificación de
agua y fluidos de diálisis/infusión, esto es soluciones con un
contenido de proteínas bajo o nulo (Weber et al., Int. J.
Artific. Org., 1.997). No obstante, la eliminación de endotoxinas de
la sangre o el plasma introduce un problema que compete a las
proteínas circulantes del plasma (LBP, BPI, sCD14) y de los
receptores celulares a una matriz absorbente debido a la absorción
hidrófoba obvia que tiene una baja especificidad.
El uso de polímeros cargados positivamente o
hidrófobos para la eliminación de endotoxinas muestra que la
especificidad de la unión y de ese modo también la selectividad para
la eliminación de las endotoxinas del plasma es baja. En la
práctica se ha planteado el desafío de desarrollar un adsorbente de
endotoxinas eficaz con una elevada especificidad y una elevada
selectividad, combinadas además con una elevada
biocompatibilidad
Se ha sugerido el uso de secuencias peptídicas
de proteínas de unión a endotoxinas para aplicaciones terapéuticas
(Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.639.727 y 5.643.875)
mediante el uso p. ej. de productos proteicos que incrementan la
permeabilidad bactericida (BPI). Una desventaja de los péptidos
inmovilizados es el coste de la síntesis y la necesidad de
inmovilizar los péptidos sin interferir en la estructura de la
unión.
Los ligandos de afinidad tales como la
histamina, la histidina y la polimixina B son eficaces para la
eliminación de endotoxinas aunque su eficacia dependa de otras
proteínas del fluido y disminuya drásticamente en presencia de
proteínas del suero como la seralbúmina u otras proteínas cargadas
negativamente (Anspach y Hilbeck, J. Chromatogr., 1.995, Petsch
et al. J. Chromatogr., 1.997, EP 0.129.786). No obstante, la
Polimixina B es tóxica para el sistema nervioso central y puede
causar lesión en el riñón, que es una desventaja para su aprobación
en el mercado debido al riesgo de escape a la sangre del paciente.
En la Patente de los Estados Unidos 4.771.104 se describe un
material destoxificante de endotoxinas que comprende un portador
fibroso al cual se fija la polimixina B.
La eliminación de endotoxinas, concretamente
LPS, de los fármacos y fluidos mediante el uso de partículas de
poli(\varepsilon-lisina) (PL) insolubles en
agua fue descrita por Hirayama et. al. en Journal of
Chromatography B, 271 (1.999), 187-195.
La eliminación eficaz de endotoxinas de un
fluido con proteínas depende de la carga neta de la proteína valiosa
deseada de la cual se deben eliminar las endotoxinas. La
interacción entre la endotoxina y su ligando es de carácter tanto
hidrófobo como iónico, aunque la contribución de cada uno de ellos
depende de la fuerza iónica y del pH del fluido. La eliminación
eficaz de endotoxinas también depende de una elevada perfusión y
biocompatibilidad de los medios para la eliminación de dicha
endotoxina para evitar p. ej. la activación celular o la coagulación
sanguínea.
Sin embargo, aunque se han desarrollado o
sugerido muchos medios para la eliminación de sustancias tales como
las endotoxinas de los fluidos, p. ej. la sangre, otros fluidos
corporales o fluidos terapéuticos, ninguno de los medios descritos
es altamente biocompatible ni tiene un alto grado de especificidad y
selectividad frente a las sustancias que se van a eliminar p. ej.
endotoxinas, y al mismo tiempo puede ser fácilmente perfundido, p.
ej. por sangre completa o plasma. De este modo es deseable
desarrollar metodologías y medios altamente eficaces,
biocompatibles, y efectivos para la eliminación de sustancias, p.
ej. endotoxinas, de un fluido, y de este modo hacer posible evitar
los problemas asociados con los dispositivos de la técnica anterior.
Con respecto a esto, la presente invención estudia esta necesidad e
interés.
La necesidad de un método novedoso y eficaz y de
medios para disminuir las concentraciones o para eliminar una o más
sustancias de un fluido, p. ej. endotoxinas de la sangre, cualquier
otro fluido o fluido terapéutico con el propósito de evitar,
eliminar o reducir la activación no deseada de los componentes o
procesos en un fluido es evidente a partir de las razones descritas
antes, concretamente en el área biomédica. Semejantes métodos y
medios también serian específicamente valiosos en el tratamiento de
la sepsis, el choque séptico y el SIRS mediante la eliminación
extracorpórea de pirógenos u otras sustancias activadoras del plasma
de los pacientes sépticos.
Adicionalmente, es bien conocida la unión de un
ligando bioespecífico p. ej. un anticuerpo o un péptido a una
matriz o sustrato y la eliminación por medio de estas sustancias
patofisiológicamente críticas del cuerpo o la circulación
sanguínea.
Los materiales conocidos utilizados son p. ej.
Sepharose (Sephadex Pharmacia), resinas de poliacrilato o epoxídicas
en forma de cuentas o partículas.
Las cuentas conocidas están hechas p. ej. de
poli(metacrilato de metilo p. ej. DALI-System
(Fresenius) para la absorción de LDL; Sepharose: p. ej.
Rheosorb-System de Plasmaselect para la adsorción
del fibrinógeno que utiliza un péptido inmovilizado;
Therasorb-Immunoadsorption-System
para eliminar autoanticuerpos utilizando un anticuerpo de oveja
inmovilizado que se une a inmunoglobulinas humanas; columna
Excorim-Protein A (y sistemas similares de otros
fabricantes) que utiliza una proteína bacteriana inmovilizada para
unirse a las inmunoglobulinas.
Las membranas conocidas son por ejemplo
poliamida (MAT/Merck) y otras descritas normalmente como membranas
de afinidad.
Los tejidos conocidos son por ejemplo mallas de
poliestireno/polietileno de Toray con ligando de Polimixina B para
la unión de LPS.
Todos estos sustratos se modifican en el caso en
el que se utilizan ligandos biológicos (tales como péptidos o
anticuerpos) mediante métodos convencionales de la química húmeda,
esto es primero se forma y se aísla el correspondiente ligando
específico (p. ej. mediante síntesis peptídica, mediante métodos
biotecnológicos), después se purifica y luego se inmoviliza en una
matriz sólida.
Normalmente estas matrices no permiten la
síntesis en fase sólida de un ligando (p. ej. un péptido)
directamente sobre la matriz, debido a la incompatibilidad química
frente a los productos químicos (disolventes, ácidos y álcalis
utilizados para escindir los grupos protectores etc.) utilizados en
la síntesis en fase sólida.
Las matrices que son adecuadas para la síntesis
en fase sólida (p. ej. poliestireno) no son adecuadas para fines
terapéuticos debido a la carencia de biocompatibilidad.
Por lo tanto, sería ventajosa una matriz en fase
sólida, que permita la síntesis en fase sólida así como el contacto
con componentes de la sangre (p. ej. plasma o sangre completa), por
las siguientes razones:
(1) Las etapas de desarrollo para encontrar un
ligando adecuado (p. ej. una estructura peptídica optimizada) se
pueden realizar sobre la misma matriz sólida que se puede utilizar
más tarde para la aplicación terapéutica. Esto significa que los
procesos de ensayo biológico necesarios (p. ej. medición de la
afinidad, especificidad y capacidad de unión) se pueden realizar en
condiciones muy similares a las condiciones de la posterior
aplicación terapéutica. Por medio de esto, la información
procedente de los procesos de ensayo biológico es muy fiable y
predictiva para la posterior aplicación terapéutica o clínica. Esto
ahorra tiempo y dinero y disminuye el riesgo de fracaso o efectos
secundarios.
(2) Se puede construir un ligando (péptido)
mediante síntesis en fase sólida de un modo definido exactamente
(con respecto a la secuencia y la geometría). Esto significa que el
enlace (esto es la localización de la conexión covalente) del
ligando (péptido) a la matriz sólida está definido exactamente.
Existen requerimientos en cierto modo
contradictorios para semejante matriz con respecto a la dilatación o
el comportamiento en mojado: para la síntesis en fase sólida
normalmente se utilizan disolventes orgánicos o mezclas de
disolventes no acuosos (polares, tales como dimetilformamida, o
apolares, tales como diclorometano). Por otra parte la aplicación
terapéutica debe tener lugar en un entorno acuoso (p. ej. plasma,
sangre, soluciones terapéuticas etc.). En ambos entornos (es decir
disolventes acuosos y orgánicos) la matriz polimérica debe ser
fácilmente mojable y dilatable:
(1) con el fin de poder eliminar o enjuagar
eficazmente el ligando no unido (exceso) o los componentes básicos
(p. ej. aminoácidos protegidos) o productos químicos (p. ej. agentes
de acoplamiento, tales como carbodiimidas, agentes de
desprotección, tales como ácidos o álcalis orgánicos), y
(2) con el fin de permitir la eliminación de las
respectivas toxinas del entorno acuoso, la matriz también debe ser
mojable y dilatable en este entorno.
Por consiguiente, el problema con las matrices
poliméricas conocidas reside en que se está limitado al tipo de
fluido regenerante que se utiliza con el fin de no hacer eluir el
ligando activo unido como tal sino solamente las sustancias
atrapadas en el material que se van a eliminar del fluido, y que el
ligando se construye como un péptido/molécula definido o un
polipéptido/oligómero polimerizado al azar y después tiene que ser
unido al material de soporte como tal - no se sabe con qué se va a
acabar al final.
Las ventajas del uso de acuerdo con la invención
residen en que se puede construir el ligando directamente sobre el
soporte sólido con el polietilenglicol injertado y se puede utilizar
directamente el soporte sólido con el ligando construido. Esto
proporciona una fiabilidad que no se obtiene con las matrices de la
técnica anterior. Adicionalmente, proporciona ventajas tecnológicas
ya que el ligando biológicamente activo/específico es parte del
dispositivo médico y se acorta el tiempo de progreso (esto podría
permitir o facilitar una clase de tratamiento individuali-
zado).
zado).
Durante el progreso no se sabía ni se esperaba
que el material de acuerdo con la invención funcionara de manera
tan brillante como resultó hacerlo. La desventaja esperada era p.
ej. que la matriz polimérica se dilatara y taponara el flujo a
través del dispositivo. Adicionalmente, se esperaba que la caída de
presión cuando se aplicaba un fluido como la sangre completa fuera
demasiado alta. Finalmente, como resultado de las cuestiones
anteriores, se esperaba que la perfusión del fluido a través del
material de la fase sólida fuera insuficiente.
Se ha demostrado que la matriz polimérica de
acuerdo con una de las realizaciones preferidas es excelente para
la esterilización con vapor de agua y para secarla después. Después
de secar, el resto de aire se elimina fácilmente añadiendo una
solución salina para que la matriz polimérica se dilate de nuevo y
quede lista para su uso. Esto conduce a un tiempo de preparación
corto en clínica, que es importante p. ej. en emergencias y en
momentos de una gran carga de trabajo.
Adicionalmente, el material muestra una
humectación instantánea, que no es el caso de la mayoría de los
soportes sólidos utilizados para diferentes tipos de ligandos. Esta
es una característica muy importante como material de una fase
sólida para ligandos activos. Incluso el material se puede comprimir
y descomprimir adicionalmente en un cierto intervalo, y el material
es biocompatible con respecto a la activación del complemento, la
activación de la fase de contacto, la citotoxicidad y la activación
de los granulocitos.
Por lo tanto, el objeto principal de la presente
invención es eliminar los problemas asociados con la técnica
anterior proporcionando una matriz de afinidad polimérica altamente
biocompatible, específica, selectiva y fácilmente perfundida para
eliminar y/o disminuir las cantidades o concentraciones de las
sustancias no deseadas mencionadas antes, p. ej. endotoxinas, en
fluidos, esto es, una matriz de afinidad polimérica que tiene todas
las ventajas y ninguna de las desventajas de la técnica
anterior.
Este objeto se logra de acuerdo con un primer
aspecto de la presente invención, esto es con una matriz de
afinidad polimérica para su unión a una o más sustancias en un
fluido para eliminar dicha sustancia o sustancias del fluido y/o
disminuir la cantidad o concentración de la misma en dicho fluido,
con el propósito de evitar, eliminar, o reducir la activación no
deseada de los componentes o los procesos de dicho fluido, donde
dicha matriz comprende los componentes a) - c) definidos en la
reivindicación 1.
En una realización preferida la presente
invención hace referencia a una matriz de afinidad polimérica para
la eliminación de endotoxinas para disminuir la activación no
deseada de los componentes o procesos de un fluido, donde la matriz
proporciona un ligando que tiene una estructura tridimensional
complementaria a la estructura tridimensional de un motivo de unión
de dicha endotoxina, permitiendo de ese modo la unión de la
endotoxi-
na.
na.
En la realización preferida para la eliminación
de endotoxinas para disminuir la activación del fluido, cada unidad
de unión de la matriz de afinidad polimérica es arginina. Semejante
matriz de afinidad polimérica genera un corte definido de
aproximadamente 1x10^{2} - 1x10^{6} Daltons y se puede utilizar
para unirse a sustancias hidrófobas y/o hidrófilas.
En otro aspecto la presente invención hace
referencia a un método para eliminar una o más sustancias de un
fluido y/o reducir la cantidad o concentración de la misma en dicho
fluido con el propósito de prevenir, eliminar o reducir la
activación no deseada de los componentes o procesos de dicho fluido,
que comprende poner en contacto el fluido con la matriz de afinidad
polimérica de acuerdo con la invención durante un período de tiempo
suficiente para reducir la cantidad o concentración y/o eliminar
dicha sustancia o sustancias de interés, preferiblemente hasta 24
horas, muy preferiblemente de 1 seg a 2 horas. No obstante, el
período depende de la velocidad de flujo, del tamaño de la columna
y del modo de aplicación, esto es de si el tratamiento se realiza
in vivo, ex vivo o in vitro. Preferiblemente,
la cantidad o concentración de dicha sustancia o sustancias después
de haber sido eliminada o reducida está por debajo de la capacidad
de activar los componentes o procesos de la sangre o evita la
activación de los componentes o procesos de la sangre.
En un aspecto adicional la invención hace
referencia a un método para producir la matriz de afinidad
polimérica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
a 1 a 10 de acuerdo con la presente invención, que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- anclar el espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo y
- b)
- anclar a dicho primer complejo el ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional, o
- c)
- anclar el espaciador al ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional para obtener un segundo complejo, y
- d)
- anclar el soporte sólido a dicho segundo complejo, o
- e)
- anclar el espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo, y
- f)
- síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al soporte sólido, o
- g)
- construir o sintetizar el espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- h)
- anclar a dicho primer complejo el ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional, o
- i)
- construir o sintetizar el espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- k)
- síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al soporte sólido
donde la información acerca de la
estructura tridimensional, la presencia de cargas y las regiones
hidrófobas/hidrófilas del motivo de unión de la sustancia o las
sustancias que se van a unir se recoge de la cristalografía de rayos
X, la secuenciación de proteínas, el modelado de proteínas o los
cálculos del carácter hidrófobo o hidrófilo y la unidad de unión se
hace complementaria en lo que se refiere a la carga y/o el carácter
hidrófilo/hidrófobo al motivo de unión de dicha sustancia o
sustancias.
En otro aspecto más la presente invención hace
referencia al uso de la matriz de afinidad polimérica para la
eliminación de una o más sustancias, preferiblemente endotoxinas, de
un fluido, o la disminución de la cantidad o concentración de la
misma en dicho fluido, preferiblemente un fluido corporal o un
fluido terapéutico, muy preferiblemente sangre.
En otro aspecto adicional, la invención hace
referencia a un kit para eliminar una o más sustancias de un fluido
y/o disminuir la cantidad o concentración de la misma en dicho
fluido con el propósito de prevenir, eliminar, o reducir la
activación no deseada de los componentes o procesos de dicho fluido,
comprendiendo dicho kit la matriz de afinidad polimérica, tubos de
muestra, y un dispositivo para el tratamiento extra y/o
intracorpóreo de dicho fluido, preferiblemente sangre o suero.
El uso de una matriz de afinidad polimérica de
acuerdo con la presente invención optimizará el tratamiento de
fluidos, tales como sangre, cualquier otro fluido corporal o fluidos
terapéuticos para la eliminación de una o más sustancias, tales
como endotoxinas, y/o la reducción de la cantidad o concentración de
la misma con el propósito de prevenir, eliminar o reducir la
activación no deseada de los componentes o procesos en dicho
fluido.
Específicamente, el uso de un material altamente
biocompatible y perfundible de acuerdo con la invención es
importante para la prevención de la activación en el fluido durante
el uso de la matriz de afinidad polimérica. Esto es de particular
importancia en la eliminación extracorpórea de endotoxinas del
plasma o la sangre de pacientes sépticos y se describe como una
estrategia terapéutica potencial en el tratamiento de la sepsis, el
choque séptico y el SIRS. Como ventaja adicional, el uso de la
matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la presente invención
reducirá el tiempo de tratamiento para el paciente.
Las ventajas y rasgos adicionales de la presente
invención se harán más evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada cuando se tomen junto con los dibujos y las
reivindicaciones adjuntas.
La Fig. 1 es una vista esquemática de un radical
de lípido A de la molécula de LPS con sus elementos
estructurales.
Las Figs. 2A y 2B son vistas esquemáticas de
ejemplos de ligandos pertenecientes a la estructura de tipo árbol
de acuerdo con la presente invención (2A) y la estructura de tipo
peine (2B) de la matriz de afinidad polimérica.
La Fig. 2C muestra ejemplos de matrices de
afinidad poliméricas que tienen una estructura de ligando
cíclico.
Las Figs. 3A-3B muestran cómo se
genera la estructura complementaria de la endotoxina utilizando
requerimientos estructurales y cargas positivas, regiones
hidrófobas y distancias óptimas en el motivo de unión.
La Fig. 4 describe diferentes modos de producir
una matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la presente
invención.
La Fig. 5 muestra los niveles de endotoxina en
plasma humano después de la incubación con cuentas de
PS-PEG para diferentes momentos (1, 10 y 120
minutos).
Las Figs. 6A-6G muestran la
inhibición de la producción inducida por endotoxinas de IL6
intracelular en monocitos después del tratamiento de sangre
mezclada con LPS con cuentas de
PS-PEG-Arg_{8} en comparación con
cuentas sin la matriz, esto es material de referencia
(PS-PEG-material de referencia).
Las Figs. 7A-7D muestran el
perfil de biocompatibilidad de las cuentas de
PS-PEG-Arg_{8} que miden los
números de glóbulos blancos de la sangre (WBC), y glóbulos rojos de
la sangre (RBC), los números de trombocitos (THR) y el hematocrito
(HCT).
La Fig. 8 muestra la carencia de formación de
TCC (complejo del complemento terminal) después del uso de las
cuentas de PS-PEG-Arg_{8} en
sangre completa.
La Fig. 9 muestra la ausencia de liberación de
elastasa después del uso de cuentas de
PS-PEG-Arg_{8} en sangre
completa.
La Fig. 10 muestra la ausencia de formación de
TAT (complejo trombina-antitrombina III) después del
uso de cuentas de PS-PEG-Arg_{8}
en sangre completa.
Las Figs. 11A-11B muestran una
estructura tridimensional del ligando que contiene la unidad de
unión de -Arg_{8} y -Arg_{4} optimizada para la unión de
LPS.
La Fig. 12A muestra el ajuste de la curva de las
isotermas de Langmuir para
PS-PEG-Arg 8 y
PS-PEG-Arg 4 relacionadas con la
masa de cuentas en gramos.
La Fig. 12B muestra el ajuste de la curva de las
isotermas de Langmuir para
PS-PEG-Arg 8 y
PS-PEG-Arg 4 relacionadas con los
moles de arginina.
Como se ha indicado antes, la presente invención
hace referencia a una matriz de afinidad polimérica para la
eliminación de sustancias de un fluido, tal como la sangre,
cualquier otro fluido corporal o fluidos terapéuticos, para
disminuir la activación de los componentes o procesos en el fluido,
teniendo al mismo tiempo especificidad suficiente para evitar la
adsorción de otras sustancias valiosas en el fluido, p, ej.
componentes fisiológicos de la sangre. Dicha matriz proporciona un
ligando que tiene una estructura que es complementaria a la
estructura de un motivo de unión de la sustancia para eliminar o
reducir la cantidad o concentración, p. ej. de una endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente contexto, se pretende que el
término "eliminar... una sustancia" signifique evitar,
reducir, hacer disminuir, neutralizar, inactivar, degradar,
modificar, captar, unir o disimular una sustancia, lo que no
siempre significa una cantidad o concentración cero de la sustancia.
Por otra parte, se pretende que el término "disminuir la cantidad
o concentración de una sustancia" signifique una reducción o
descenso de la cantidad o concentración de una sustancia en un
fluido suficiente para evitar o inhibir la posterior activación de
los componentes en el fluido y/o los mecanismos biológicos celulares
y/o no celulares en el fluido.
Con el término "evitar, eliminar, o reducir la
activación no deseada de los componentes o procesos" el
significado es inactivar, inhibir, disminuir, hacer descender,
reducir, ralentizar o evitar un cierto proceso químico, biológico,
o bioquímico en el fluido p. ej. en sangre o células tisulares, p.
ej. cascadas de proteínas del plasma tales como las rutas de
transducción de señales, procesos del complemento o de la
coagulación y/o la activación de los componentes implicados en
tales procesos, de un modo directo o indirecto. Una eliminación
"directa" de una sustancia influye en el proceso sin ninguna
etapa intermedia, mientras una eliminación "indirecta" implica
la eliminación de una sustancia que es parte de una cadena larga o
una cascada de reacciones, donde la eliminación de una sustancia al
principio evitará, ralentizará o inhibirá un evento de interés aguas
abajo. Esto significa que la eliminación de una sustancia p. ej. de
la sangre puede producir una sangre inactivada o menos activada.
Asimismo, en la presente memoria está implicada la prevención de la
activación del fluido, tal como la sangre.
Se pretende que el término "fluido" incluya
cualquier fluido, tal como cualquier gas o líquido, tal como una
suspensión o una solución, incluyendo soluciones convencionales, p.
ej. soluciones acuosas u orgánicas, o sangre, cualquier fluido
corporal o fluido terapéutico, fluidos para aplicaciones de la
ciencia a la vida, tales como fluidos para aplicaciones biológicas,
diagnósticas o biotecnológicas p. ej. soluciones tampón, fluidos
para infusión, o fluidos para diálisis, fluidos para la nutrición y
fluidos para uso industrial.
Se pretende que el término "fluido
corporal" incluya sangre, plasma, fluido cerebroespinal, ascitis
y fluidos para reinfusión (p. ej. después de una
hemoconcentración), productos de la sangre obtenidos de donantes
sanos, tales como plasma, productos concentrados de plaquetas,
productos concentrados de eritrocitos, que se utilizan para
transfusiones.
Se pretende que el término "fluido
terapéutico" incluya fluidos de diálisis peritoneal, productos
concentrados de hemodiálisis y agua de diálisis, fluidos de
sustitución/fluidos preparados en línea, fluidos para infusión,
fluidos de nutrición parenteral, fluidos de lavado en un entorno
quirúrgico y fluidos para la preparación de componentes de la
sangre, sustitutos de la sangre (p. ej. portadores de oxígeno,
soluciones de hemoglobina modificada, soluciones de hemoglobina
artificial).
Se pretende que el término "fluidos para
aplicaciones científicas vitales" incluya fluidos y/o medios para
el diseño de tejidos mediante cultivo celular, biología molecular
(p. ej. soluciones de proteínas y enzimas utilizadas para técnicas
de PCR), bacteriología, analítica y preparaciones farmacéuticas.
Se pretende que el término "fluidos para
nutrición" incluya agua de bebida, fluidos para situaciones en
exteriores y fluidos para la reconstitución de productos
concentrados o polvos de alimento y de bebida.
Se pretende que el término "soporte sólido"
represente una fase o soporte sólido o una matriz insoluble en la
cual se puede sintetizar o acoplar una molécula, p. ej. un ligando
en forma de polipéptido con o sin un conector o espaciador entre
ellos.
Se pretende que el término "grupo
funcional" represente un átomo específico, o un grupo de átomos,
que produce una molécula, esto es la unidad de unión de la matriz
de acuerdo con la presente invención, p. ej. un aminoácido, un
ácido graso, un carbohidrato, una lectina, y un nucleótido, y
derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos, una
característica o estructura química específica, p. ej. una carga
positiva o negativa, un carácter hidrófobo o carácter hidrófilo,
y/o cualquier otra fuerza físico-química, p. ej.
fuerzas de vand der Waals e interacciones
\pi-\pi o una capacidad para formar enlaces
adicionales, tales como enlaces de hidrógeno o enlaces covalentes.
Los ejemplos de los grupo funcionales de los aminoácidos son -COOH,
-OH, -SH, guanidino, y -NH_{2}, pero también puede ser un grupo
amino sustituido o cualquier grupo cargado positivamente o mezclas
de los mismos.
Se pretende que el término "unidad de
unión" represente la molécula mencionada antes en la definición
del término "grupo funcional", donde dicha molécula es
responsable de la unión a la sustancia o las sustancias que se van
a eliminar y/o reducir, contiene al menos un grupo funcional y está
incluida en el ligando unida a un espaciador de la matriz de
afinidad polimérica según la presente invención.
Cada unidad de unión puede comprender un
aminoácido que está cargado positivamente a pH fisiológico de la
sangre o cerca de él, tal como arginina, lisina, cisteína, o
histidina, u otra molécula bi- o tri-funcional que
tiene al menos un grupo funcional que está cargado positivamente a
pH fisiológico de la sangre o cerca de él.
Se pretende que el término "motivo de
unión" represente una estructura tridimensional y un motivo
químico, individual o repetido, en la sustancia o las sustancias
que se van a eliminar.
El término "ligando" representa la molécula
tridimensional completa unida a la matriz por medio del espaciador,
esto es comprendiendo al menos una unidad de unión con al menos un
grupo funcional. El ligando forma una estructura tridimensional
complementaria con y se une al motivo de unión de la sustancia que
se va a eliminar. Aquí, se pretende que "complementaria"
represente una estructura tridimensional y geométricamente definida
caracterizada por la capacidad para emparejarse precisamente con la
estructura complementaria tridimensional de un motivo de unión de
la sustancia que se va a eliminar.
El término "derivado del mismo" utilizado
en relación con un cierto compuesto representa uno o más compuestos
derivados de tal manera que tienen la misma o esencialmente la misma
función que el propio compuesto.
Adicionalmente, también se pretende que los
isómeros de los compuestos que constituyen el ligando estén
incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que muestren
las mismas o esencialmente las mismas funciones que los propios
compuestos. En las fórmulas de estructura, \alpha y \varepsilon
definen, según la nomenclatura utilizada comúnmente para los
aminoácidos, los grupos amino utilizados para el acoplamiento
covalente de moléculas adicionales.
Se pretende que el término "sustancia o
sustancias" represente al menos un componente o molécula de
interés, soluble o no soluble, que se pretende que esté unido a la
unidad de unión. Los ejemplos de las sustancias son sustancias
tóxicas que pueden activar las células de la sangre tales como las
sustancias derivadas de virus y bacterias, p. ej. una endotoxina,
una población de células de la sangre, tal como linfocitos,
trombocitos, granulocitos, células dendríticas, monocitos, células
endoteliales, células troncales, células tumorales; o un componente
de la sangre o un producto de una actividad metabólica tales como
las moléculas derivadas de glucosa o los productos de la
degradación de la misma, proteínas de la coagulación de la sangre,
proteínas procoagulatorias, proteínas inflamatorias o
proinflamatorias, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas,
quimioquinas, toxinas urémicas, y el factor inhibidor de la
migración de macrófagos. Los ejemplos de los componentes de la
sangre son las sustancias infecciosas que ocasionan p. ej. una
enfermedad contagiosa incluyendo partículas de virus, priones, o
parásitos, hongos, células de la sangre cargadas de patógenos, así
como drogas después de una sobredosis, aditivos alimentarios
patógenos u otros componentes que no se originan en el organismo.
También se pretende que estén incluidos los pirógenos, concretamente
pirógenos bacterianos, exotoxinas bacterianas, productos de
bacterias Gram positivas, tales como ácido lipoteicónico, los
productos de los trastornos metabólicos, crónicos o agudos, como
resultado p. ej. de diabetes melitus, enfermedad del hígado, uremia
o enfermedades o inflamación del riñón, así como cascadas de
adherencia, p. ej. moléculas de adherencia solubles. Las sustancias
preferidas que se van a eliminar son p. ej. endotoxinas de bacterias
Gram negativas, tales como LPS, así como ADN bacteriano o
fragmentos o productos de degradación del mismo, y oligonucleótidos,
heparina, fosfato, células de la sangre, proteínas solubles o
unidas a la superficie celular.
Se pretende que el término "espaciador"
represente una molécula formada por una cadena, p. ej. un polímero,
que modifica el soporte sólido en el sentido de volverlo una parte
del soporte sólido y sitúa el ligando con la al menos unidad de
unión que contiene al menos un grupo funcional lejos del soporte
sólido y hace que esté menos restringido por el impedimento
estérico del soporte sólido y más asequible a la sustancia o las
sustancias que se van a unir, p. ej. una endotoxina, población
celular o componente de la sangre. La molécula espaciadora puede
tener un formato lineal y/o ramificado y/o cíclico. La longitud del
espaciador está predefinida en la presente memoria a partir de los
requerimientos estructurales de la sustancia o las sustancias que se
van a eliminar.
Se pretende que el término "molécula de
distancia" represente moléculas bifuncionales dentro del ligando
que tienen la función de crear una distancia estructural, si se
desea, entre la unidad de unión y la molécula de ramificación
trifuncional definida en las fórmulas generales I y II de más abajo
y/o entre el espaciador y dicha molécula de ramificación
trifuncional. La molécula de distancia también puede tener un
formato cíclico.
El término "pirógeno" y concretamente
"pirógeno bacteriano" define una sustancia que produce fiebre,
más comúnmente de origen bacteriano, p. ej. una endotoxina.
Aquí, se pretende que el término
"biocompatibilidad" represente la carencia o la ausencia de
capacidad activadora, p. ej. de activación de células, coagulación,
cascadas de complemento o procesos similares, en el sentido de que
el uso de la matriz no conduce a una activación del sistema
inmunitario del paciente, o al menos si se produce semejante
activación, es solamente en un grado menor. Esto significa que el
uso de un compuesto o sustancia biocompatible no conducirá a
ninguna activación no buscada o no deseada de los componentes o
procesos p. ej. en la sangre u otros fluidos corporales así como a
la muerte celular o a la lisis celular mecánica o inducida por
estrés.
Para crear una diversidad en la matriz de
afinidad polimérica suficiente para unirse y adsorber una gran
variedad de sustancias, el ligando puede comprender
1-100 grupos funcionales, preferiblemente
1-32 grupos funcionales, pero el ligando de la
matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la presente invención
tiene la estructura definida en la reivindicación 1.
La matriz de afinidad polimérica de acuerdo con
la presente invención puede tener forma de cuenta, estructura de
tipo gel, membrana o parte de una membrana, película, o red, o una
combinación de las mismas.
Específicamente, cuando la matriz se compone de
acuerdo con la presente invención, genera un corte definido de
aproximadamente 1x10^{2} a 1x10^{6} Daltons y se puede unir
tanto a sustancias hidrófobas como hidrófilas sin ninguna
restricción.
En una realización preferida, la matriz de
afinidad polimérica tiene la forma de una cuenta de
PS-PEG (p. ej. TentaGel®, obtenible de Rapp
Polymere Tübingen), utilizando el PEG como espaciador. El PEG
utilizado como espaciador tiene la ventaja de una buena dilatación
de las cuentas en disolventes tanto orgánicos como acuosos y
permite, debido a sus propiedades casi-fluidas,
procesos de difusión similares a los de un fluido, preferiblemente
un coeficiente de difusión próximo al del agua, esto es 40%.
De acuerdo con la invención, la matriz de
afinidad polimérica debe mostrar en una forma preferida una elevada
biocompatibilidad cuando se utiliza en una aplicación específica,
tal como el tratamiento extracorpóreo de sangre completa. Una
elevada biocompatibilidad implica que se pretende que ciertas
características sean más importantes que otras. Por ejemplo, es
importante la no activación del complemento, medida mediante la
formación temprana del complejo y la cuantificación del complejo
del complemento terminal (proteína TCC) según Deppisch et
al. (Kidney Int. 37:696-706). Asimismo, es
deseable para el paciente una baja trombogenicidad. El grado de
trombogenicidad se mide mediante la cuantificación de complejo
trombina-antitrombina III (TAT) según Deppisch
(Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23, 1.994) y
no debe aumentar durante el tratamiento de la sangre o el plasma.
Sin embargo, está incluido un número constante de células de la
sangre de glóbulos blancos y de glóbulos rojos de la sangre así
como una ausencia de activación celular debida a la activación de la
fase de contacto. Se pretende que un recuento de células de la
sangre constante represente un grado bajo de lesión o virtualmente
ninguna lesión en las células de la sangre debido al mero estrés,
activación o lesión mecánica.
Las proteasas, tales como la elastasa producida
p. ej. por los granulocitos o los neutrófilos tras la activación,
están en aumento en los pacientes con sepsis bacteriana y choque
séptico (Heiden et al. Sem. Thromb. Hemost. 1.996). También
se ha sugerido la elastasa neutrofílica como un marcador temprano y
eficaz de la infección (Jensen et al., Scand. J Clin. Lab.
Invest. 1.996; Groenenveld et al. Cytokine, 1.995). Las
medidas de la elastasa pueden proporcionar información adicional
acerca de la biocompatibilidad, y por consiguiente los niveles no
deben cambiar durante el tratamiento de la sangre.
Para poder crear un ligando complementario al
motivo de unión de la sustancia que se va a eliminar, tal como una
endotoxina, se tiene que formar una estructura tridimensional. Esto
se puede lograr mediante el uso p. ej. de una estructura
polipeptídica flexible o rígida que sea fácil de sintetizar de una
manera óptima para la estructura tridimensional requerida.
Semejante polímero puede ser lineal o ramificado, p. ej. en una
estructura de tipo árbol o peine, o cíclica. Resulta beneficioso
para la formación de tales estructuras tridimensionales el uso de
aminoácidos puesto que proporciona flexibilidad por naturaleza. La
química para el acoplamiento de semejante polímero, p. ej. un
polipéptido, es bien conocida en la técnica. Semejante polímero hace
referencia a un polímero que contiene más de un aminoácido,
generalmente hasta aproximadamente cien, esto es un oligómero,
conectados por enlaces peptídicos. Los ejemplos de los polímeros
lineales son los poli- u oligo-péptidos formados
por enlaces amida entre los grupos alfa-carboxilo y
alfa-amino de restos adyacentes, y los ejemplos de
los polímeros ramificados son los poli- u
oligo-péptidos formados por enlaces amida que
implican uno o más grupos amino no alfa.
Como se ha establecido antes, la molécula de
ligando puede estar en formato cíclico. La estructura cíclica puede
estar formada por un acoplamiento covalente entre dos grupos
funcionales apropiados dentro de la estructura del ligando, p. ej.
un enlace disulfuro (-S-S-) entre dos grupos SH de
cisteína mediante oxidación (una reacción de ciclación común que
también se produce en las estructuras de las proteínas
naturales).
Las Figs. 2A y 2B muestran ejemplos de
diferentes estructuras ramificadas de tipo árbol y de tipo peine,
respectivamente, del ligando acoplado a un espaciador unido a un
soporte sólido, pero la presente invención solamente hace
referencia a las estructuras de tipo árbol de la Fig. 2A. En estas
estructuras, los ligandos están construidos básicamente con restos
lisina, y las unidades de unión de cada ligando son restos arginina.
El ligando incluido en la matriz de afinidad polimérica puede estar
representado por las dos fórmulas siguientes:
\newpage
Fórmula General I:
En la Fórmula general I, que representa una
estructura de tipo árbol, los diferentes símbolos tienen el
siguiente significado:
n = 0 o 1;
m = 2^{k} - 1;
k = 0 a 10, donde si k = 0, X_{2} = X_{3} y
Z_{1} = Z_{2};
i = 0 o 1; y
j = 0 o 1,
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula General II:
En la fórmula general II, que representa una
estructura de tipo peine, los diferentes símbolos tienen el
siguiente significado:
n = 0 o 1;
m = 2^{k} - 1;
k = 0 - 10, donde si k = 0, X_{3} = X_{3} y
Z_{1} = Z_{2};
r = 1 - 100;
i = 0 o 1;
j = 0 o 1; y
p = 0 o 1.
Z^{1}, Z^{2} y Z^{3} representan cada uno
la unidad de unión y son cada uno una molécula orgánica seleccionada
del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un ácido
graso, un carbohidrato, una lectina, y un nucleótido y derivados de
los mismos, o combinaciones de los mismos, donde Y, Y^{1} e
Y^{2} son cada uno una molécula de ramificación trifuncional que
contiene grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en
amino, hidroxi, aldehído, isocianato, isotiocianato, tiol,
maleimido, epoxi, y derivados de los mismos, o combinaciones de los
mismos, y donde
X^{1}, X^{2}, y X^{3} son cada uno una
molécula de distancia bifuncional opcional que contiene dos grupos
funcionales seleccionados del grupo que consiste en amino, carboxi,
hidroxi, aldehído, isocianato, isotiocianato, tiol, maleimido,
epoxi, y derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos.
En la Fig. 2C se muestran ejemplos de matrices
de afinidad poliméricas que tienen una estructura del ligando
cíclica. En las fórmulas de estructura R representa
-Lys_{m}[Arg]_{(m+1)}, donde m = 2^{k} -1, y se
muestran ejemplos en los que k = 0, 1 o 2.
De este modo, la al menos una unidad de unión
del ligando de la matriz de afinidad polimérica contiene al menos
un grupo funcional, preferiblemente un grupo amino o un grupo
guanidino o un grupo amino sustituido o al menos uno de dichos
grupos funcionales,
Preferiblemente, se seleccionan los aminoácidos
por su característica de estar cargados positivamente a pH
fisiológico o cerca de él, específicamente de la sangre \geq 7,2,
esto es, a un pK de aproximadamente \geq 6,0. Los ejemplos de
tales aminoácidos preferidos son arginina (Arg), lisina (Lys), e
histidina (His). También se pueden utilizar mezclas de dichos
aminoácidos en el ligando de la matriz, para crear sin embargo una
variabilidad adicional.
Muy preferiblemente, el ligando comprende
arginina como unidad o unidades de unión y constituye \leq 3
mmoles/g de matriz. En general, la cantidad de aminoácidos puede
ser de al menos aproximadamente 0,01-5 mmoles/g de
matriz.
En la realización cuando la unidad de unión de
un ligando ramificado comprende el aminoácido arginina, el número
de moléculas de arginina por ligando es de 2-100
moléculas de arginina, y preferiblemente 4-8
moléculas, conocido como Arg_{4-8}. Sin embargo,
utilizando un aminoácido trifuncional, esto es que contiene tres
grupos funcionales, aquí dos grupos amino y un grupo carboxi, tal
como lisina, se puede crear una estructura ramificada. Este enfoque
de utilización de los denominados péptidos antigénicos múltiples,
MAP, ha sido introducido por Tam et al., y se describe en la
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.229.490. Mediante la variación
del número de ramas, se pueden variar la agrupación y las
distancias de los grupos terminales, p. ej. arginina cargada
positivamente que comprende grupos funcionales positivos terminales,
como se ha comentado antes con relación a la Fig. 2.
En una realización específica de la invención,
en la que las endotoxinas son las sustancias que se van a eliminar
por medio de la matriz de afinidad polimérica, las cargas positivas
de los grupos funcionales de los aminoácidos se mantienen a una
distancia definida por la distancia entre los grupos fosfato
cargados negativamente individuales de la endotoxina como se
muestra en la Fig. 3.
Como se ha comentado antes, la cantidad y las
configuraciones de los aminoácidos crean la variabilidad del
ligando complementario en la matriz de afinidad polimérica, y por lo
tanto se pueden variar para crear una variabilidad suficiente para
absorber una gran variedad de sustancias. En otra realización de la
invención la cantidad de aminoácido es de al menos aproximadamente
0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4, o 5 mmoles/g de matriz.
Para obtener una estructura complementaria a una
sustancia, se recoge información de los procedimientos conocidos en
la técnica para estudiar las relaciones referentes a la estructura,
la presencia de cargas positivas que se mantienen a una cierta
distancia así como la presencia de una región hidrófoba en la
proximidad de los grupos cargados, p. ej. cristalografía de rayos
X, secuenciación de proteínas, modelado de proteínas o cálculos del
carácter hidrófobo e hidrófilo como se describe en el Ejemplo 1 y se
muestra en las Figs. 3 y 11.
En la realización preferida, la sustancia que se
va a eliminar es una endotoxina, tal como LPS que contiene lípido
A, y se utiliza la información conocida por el experto en la técnica
acerca de la molécula referente p. ej. a la estructura y las
distancias entre los grupos fosfato cargados positivamente de la
molécula, para formar un ligando con al menos una unidad de unión
en la matriz de afinidad polimérica. El polímero que forma el
ligando está sintetizado en esta realización por aminoácidos, p. ej.
arginina y/o lisina.
En la realización Arg_{4-8} de
la invención como parte complementaria al motivo de unión de la
sustancia que se va a eliminar, p. ej. una endotoxina, dicha
arginina como unidad de unión posee las siguientes propiedades para
la eliminación de las endotoxinas como se muestra en la Fig. 3:
- a)
- presencia de cargas positivas que se mantienen a una distancia que se ajusta óptimamente a la distancia del grupo fosfato cargado negativamente en el lípido A,
- b)
- presencia de una región hidrófoba en la proximidad de los grupos cargados que permite interacciones hidrófobas con los radicales ácido graso del lípido A, y
- c)
- una combinación de dichas propiedades de a) y b) para dar una estructura complementaria al lípido A que permita una unión óptima.
La matriz de afinidad polimérica de acuerdo con
la invención comprende un espaciador que es sustancialmente
hidrófobo o hidrófilo, que modifica el soporte sólido en el sentido
de convertirse en una parte del soporte sólido, y tiene la función
de una porción de anclaje para el ligando que comprende la al menos
unidad unión con al menos un grupo funcional.
Preferiblemente, se utiliza polietilenglicol
(PEG) como molécula espaciadora, en una configuración lineal o
ramificada a un peso molecular medio preferido de
400-10.000 Daltons y está representada por la
fórmula H-(OCH_{2}
CH_{2})_{n}-OH, donde n es de aproximadamente 2-250. La flexibilidad de las cadenas de PEG permite un buen acceso de las moléculas de toxina dentro de la estructura tridimensional del polímero ligando.
CH_{2})_{n}-OH, donde n es de aproximadamente 2-250. La flexibilidad de las cadenas de PEG permite un buen acceso de las moléculas de toxina dentro de la estructura tridimensional del polímero ligando.
Por otra parte, en otra realización de la
presente invención el soporte sólido puede ser proporcionado con
dos o más espaciadores de la misma o diferente clase, p. ej.
polietilenglicoles, óxidos de polipropileno, poli(alcoholes
vinílicos), polivinilaminas, poliglicidoles, o polietileniminas, y
derivados de los mismos.
El soporte sólido debe proporcionar variabilidad
en las características de porosidad y exclusión por tamaños.
Asimismo, se debe proporcionar un soporte para la síntesis en fase
sólida para la síntesis de polipéptidos en la realización
preferida. Los diferentes soportes sólidos, esto es polímeros, que
se pueden utilizar en la presente invención se describen en EP
0.187.391, la publicación WO 99/17120, y la Patente de los Estados
Unidos Núm. 4.908.405. Aquí, el soporte sólido es un copolímero de
injerto biocompatible lineal y/o ramificado que tiene un grado de
entrecruzamiento de 0,05-10% y se selecciona del
grupo que consiste en poli(alcoholes vinílicos),
polihidroxiestirenos, polímeros producidos a partir de poliestirenos
clorometilados y etilenglicoles; poli- u
oligo-etilenglicoles de fórmula H-(OCH_{2}
CH_{2})_{n}-OH, donde n representa de 2 a 250, poliacrilatos o polimetacrilatos funcionalizados con grupos hidroxi; y derivados de los mismos. En la presente invención el grado de entrecuzamiento mencionado antes puede ser de hasta 50%.
CH_{2})_{n}-OH, donde n representa de 2 a 250, poliacrilatos o polimetacrilatos funcionalizados con grupos hidroxi; y derivados de los mismos. En la presente invención el grado de entrecuzamiento mencionado antes puede ser de hasta 50%.
El material soporte sólido se selecciona, además
de los mencionados antes, del grupo que consiste en poliestireno,
hidroxilaquilpoliestirenos, hidroxiarilpoliestirenos,
hidroxialquilarilpoliestirenos, poliestrirenos
polihidroxialquilados, poliestirenos polihidroxiarilados,
isocianatoalquil-poliestirenos,
isocianatoaril-poliestirenos,
carboxialquil-poliestirenos,
carboxiaril-poliestirenos,
aminoalquil-poliestirenos,
aminoaril-poliestirenos, polietilenglicoles
entrecruzados, poliacrilatos, polimetacrilatos, celulosa, sílice,
carbohidratos, látex, copolímeros de cicloolefina, vidrio, otros
polímeros adecuados o combinaciones de los mismos. La forma del
soporte sólido puede ser una cuenta, membrana, partícula, p, ej.
nanopartícula, red, género tejido y no tejido, fieltro de fibra,
tubo, película, lámina o combinación de los mismos, o redes
interpenetrantes entrecruzadas. En una realización preferida, la
matriz de afinidad descrita antes consiste en poliestireno
entrecruzado sobre el cual se injerta PEG como espaciador.
Un material de soporte sólido preferido en la
presente invención es una cuenta, que tiene un tamaño suficiente
para proporcionar un soporte altamente perfundible y biocompatible,
p. ej. poliestireno, preferiblemente combinado con PEG como
espaciador al cual se ha anclado lisina y/o arginina, que no debe
tener restricciones para las sustancias hidrofílicas o
hidrofóbicas. En la Tabla 1 se muestra una lista de cuentas
disponibles en el mercado adecuadas.
Se forma una estructura de tipo hidrogel cuando
la matriz de afinidad polimérica es hidratada y, debido a la
hidratación, se dilata. La capacidad de dilatación se define como la
dilatación debida a la hidratación del polímero a partir de un
estado seco para formar la matriz hidratada y de tipo gel. Semejante
dilatación se puede definir como un incremento en el peso por
unidad de volumen cuando se hidrata y de acuerdo con la presente
invención puede ser un factor de aproximadamente 1,5 - 10 veces,
preferiblemente 3 - 5 veces, cuando se comparan las formas seca e
hidratada de la matriz de afinidad polimérica. Esta capacidad de
dilatación permite que toda la sangre perfunda completamente a
través de la matriz, manteniendo sin embargo las células de la
sangre y los números intactos.
Como se ha afirmado antes, en la realización
preferida, la matriz de afinidad polimérica como tal genera una
matriz con un corte definido de aproximadamente 1 x 10^{2} - 1 x
10^{6} Daltons permitiendo que las células de la sangre perfundan
y casi sin restricción de difusión para las sustancias hidrofílicas
y/o hidrofóbicas.
La presente invención también hace referencia a
un método para eliminar una o más sustancias de un fluido y/o
reducir la cantidad o concentración de la misma en dicho fluido con
la intención de evitar, eliminar o reducir la activación no deseada
de los componentes o procesos de dicho fluido, que comprende poner
en contacto el fluido con la matriz de afinidad polimérica de
acuerdo con la presente invención durante un período de tiempo
suficiente para reducir la cantidad o concentración y/o eliminar
dicha o dichas sustancias. En una realización preferida en la que
se utiliza este método, la eliminación de una sustancia, p. ej. una
endotoxina de la sangre o de cualquier otro fluido corporal,
evitará directa o indirectamente de ese modo la activación p. ej.
de células de la sangre uniéndose a las sustancias no deseadas
enumeradas en la definición de "sustancias" anterior.
Preferiblemente esto se puede lograr poniendo en contacto el fluido
con la matriz de afinidad polimérica definida antes durante un
período de hasta 24 horas, muy preferiblemente de 1 seg. a 2 horas,
proporcionando una menor activación o evitando la activación de la
sangre y sus componentes.
En una realización preferida, la sustancia que
se va a eliminar de acuerdo con el método descrito en la presente
invención es una endotoxina. La presente invención también hace
referencia a la eliminación de un tipo de célula de la sangre o una
población definida seleccionada entre leucocitos, p. ej. células T y
B, monocitos, trombocitos, granulocitos y/o neutrófilos. Asimismo
se pretende eliminar de la matriz polimérica descrita antes los
componentes de una ruta de transducción de la señal extra- o
intra-celular seleccionada del grupo que consiste
en glucosa y sus productos de degradación, compuestos carbonilados,
proteínas inflamatorias y proinflamatorias y/o proteínas implicadas
en la trombogénesis o en la cascada del complemento, constituyentes
derivados de bacterias, endotoxinas, células de la sangre, bacterias
y virus, o células de la sangre cargadas de patógenos, o al menos
parte de los productos de degradación de los mismos, ADN o
fragmentos del mismo, o fosfato, proporcionando un ligando que
comprende al menos una unidad de unión y que tiene una estructura
que es complementaria a la estructura del motivo de unión de la
sustancia.
En esta realización preferida, se elimina una
endotoxina, p. ej. LPS hasta <50% a lo largo de 2 horas durante
p. ej. una incubación estática o durante una perfusión de una
columna en fase sólida.
En esta realización preferida, la endotoxina es
eliminada durante un período de tiempo definido de aproximadamente
1 segundo a aproximadamente 2 horas inclusive a una cantidad o
concentración que inactive la sangre o prevenga la activación de la
sangre medida de acuerdo con un análisis LAL, que se describe más
abajo. Utilizando el análisis LAL conocido en la técnica se
proporcionará información acerca de los niveles de endotoxina. El
método de acuerdo con la invención, que es rápido y eficaz,
producirá niveles de endotoxina según el análisis LAL, en el
período de tiempo mencionado antes de 1 seg. - 2 h, por debajo de la
capacidad de activación de la sangre, o activando solamente las
células y los componentes de la sangre en un menor grado.
El método para producir una matriz de afinidad
polimérica de acuerdo con la presente invención comprende las
siguientes etapas:
- a)
- anclaje del espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo, y
- b)
- anclaje a dicho primer complejo del ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional; o
- c)
- anclaje de un espaciador al ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional para obtener un segundo complejo, y
- d)
- anclaje del soporte sólido a dicho segundo complejo; o
- e)
- anclaje del espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo, y
- f)
- síntesis en fase sólida del ligando del espaciador unido al soporte sólido, o
- g)
- construcción o síntesis del espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- h)
- anclaje a dicho primer complejo del ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional, o
- i)
- construcción o síntesis del espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- k)
- síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al soporte sólido,
donde la información acerca de la
estructura tridimensional, la presencia de cargas y las regiones
hidrófobas/hidrófilas del motivo de unión de la sustancia o las
sustancias que se van a unir se recogen de la cristalografía de
rayos X, el modelado de proteínas o los cálculos del carácter
hidrófobo e hidrófilo y el ligando que contiene la unidad de unión
se vuelve complementario en lo que se refiere a la carga y al
carácter hidrófilo/ hidrófobo al motivo de unión de dicha sustancia
o
sustancias.
El método descrito antes también incluye en una
realización la producción de una matriz con una molécula espaciadora
que comprende un ligando inmovilizado sobre un soporte sólido según
cualquiera de los siguientes modos como se muestra con detalle en
la Fig. 4;
para los apartados a) y b) anteriores:
activación del soporte sólido, acoplamiento de la molécula
espaciadora al soporte sólido, síntesis del ligando que contiene la
unidad de unión, y acoplamiento específico del sitio del ligando a
la molécula espaciadora, o
para los apartados c) y d) anteriores: síntesis
del ligando que contiene la unidad de unión, acoplamiento de la
molécula espaciadora al ligando, activación del soporte sólido, y
acoplamiento específico del sitio del complejo
espaciador-ligando al soporte sólido activado,
o,
para los apartados e) y f) anteriores:
activación del soporte sólido, acoplamiento de la molécula
espaciadora al soporte sólido activado, y síntesis en fase sólida
del ligando que contiene la unidad de unión sobre este soporte.
El método que contiene los apartados a) - f)
descritos antes también incluye en una segunda realización las
etapas específicas de, para los apartados a) y b), activación del
espaciador, acoplamiento del espaciador activado al soporte sólido,
y acoplamiento del ligando a dicho espaciador activado, o,
para los apartados c) y d), síntesis del
ligando, activación del espaciador, acoplamiento específico del
sitio del ligando a la molécula espaciadora activada y acoplamiento
del complejo espaciador-ligando al soporte sólido,
o,
para los apartados e) y f), activación del
espaciador, acoplamiento del espaciador activado al soporte sólido
y síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al
soporte sólido.
Como se ha afirmado antes, en la presente
invención se prefiere el método anterior, donde el soporte sólido,
el espaciador y el ligando son inmovilizados mediante activación de
un soporte sólido, acoplamiento de la molécula espaciadora, y
síntesis en fase sólida del ligando que contiene la unidad de unión
directamente sobre el soporte sólido.
La presente invención también hace referencia al
uso de una matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la presente
invención, preferiblemente el uso para la eliminación de una o más
sustancias, preferiblemente endotoxinas, de un fluido, o la
disminución de la cantidad o concentración de las mismas en dicho
fluido, preferiblemente un fluido corporal o un fluido terapéutico,
muy preferiblemente sangre, en particular para la producción de
sangre menos activada o para evitar la activación no deseada de los
componentes o procesos de la sangre. La matriz de afinidad
polimérica se utiliza preferiblemente como parte del procedimiento
extracorpóreo de purificación de la sangre o en contacto con sangre
o una corriente de sangre, p. ej. como un implante en el organismo
para que contacte con la sangre o cualquier fluido corporal, p. ej.
el sistema vascular, los vasos sanguíneos o la cavidad
peritoneal.
En una realización la presente invención hace
referencia a un kit para eliminar una o más sustancias de un fluido
y/o disminuir la cantidad o concentración de la misma en dicho
fluido con la intención de evitar, eliminar, o reducir la
activación no deseada de los componentes de dicho fluido,
comprendiendo dicho kit una matriz de afinidad polimérica según la
presente invención, tubos para muestras, y un dispositivo para el
tratamiento extra- y/o intra-corpóreo de dicho
fluido, preferiblemente sangre o suero.
La presente invención proporciona los medios
para la eliminación de sustancias de un fluido de un modo altamente
eficaz y con ahorro de tiempo. Esto se logra mediante el uso de una
matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la invención que es
altamente biocompatible y permite que la sangre completa fluya a
través debido a una buena capacidad de dilatación. Los medios
eficaces también se deben a la generación de un ligando que
comprende una unidad de unión complementaria al motivo de unión de
la sustancia que se va a eliminar. Por lo tanto, la presente
invención se puede aplicar, p. ej. en el tratamiento extracorpóreo
de la sangre tal como la diálisis y la medicina de la transfusión
para aplicaciones terapéuticas, la terapia de las células troncales
y/o la terapia de las células terapéuticas, las aplicaciones de
diagnóstico y también en biotecnología, bioingeniería, tecnología
génica, química de los alimentos y preparación y/o purificación de
agua.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención también tiene que ver con
el uso de una matriz polimérica para la producción de una matriz de
afinidad polimérica para la eliminación de una o más sustancias de
un fluido o la disminución de la cantidad o concentración de las
mismas en dicho fluido, donde la afinidad específica depende de
cualquier ligando aplicado a la matriz polimérica, donde la matriz
polimérica incluye un soporte sólido y un espaciador, donde el
soporte sólido está fabricado de un material seleccionado del grupo
formado por poliestireno, poli(alcoholes vinílicos),
polihidroxiestirenos, polímeros producidos a partir de poliestirenos
clorometilados o poliacrilatos, polimetacrilatos funcionalizados
con grupos hidroxi, hidroxilaquilpoliestirenos,
hidroxiarilpoliestirenos, hidroxialquilarilpoliestirenos,
poliestrirenos polihidroxialquilados, poliestirenos
polihidroxiarilados, isocianatoalquil-poliestirenos,
isocianatoaril-poliestirenos,
carboxialquil-poliestirenos,
carboxiaril-poliestirenos,
aminoalquil-poliestirenos,
aminoaril-poliestirenos, polimetacrilatos,
polietilenglicoles entrecruzados, celulosa, sílice, carbohidratos,
látex, copolímeros de cicloolefina, vidrio o combinaciones de los
mismos, preferiblemente un poliestireno entrecruzado, y donde el
espaciador se selecciona del grupo que consiste en poli- u
oligo-etilenglicoles de fórmula
H-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-OH, donde n
representa 2-250.
En una realización preferida de la invención el
soporte sólido tiene la forma de una cuenta, gel, membrana,
partícula, red, género tejido o no tejido, fieltro de fibra, tubo,
película, lámina o combinaciones de los mismos, o redes
interpenetrantes entrecruzadas.
En otra realización preferida de la invención el
espaciador es un polietilenglicol (PEG) en una configuración lineal
y/o ramificada y tiene un peso molecular medio de
400-10.000 Daltons, o derivados del mismo.
En otra realización preferida de la invención la
matriz polimérica tiene una capacidad de dilatación suficiente para
permitir la perfusión del plasma o la sangre completa.
En otra realización preferida de la invención la
capacidad de dilatación de la matriz polimérica es de
aproximadamente 1,5-20 veces, preferiblemente de
2-6 veces, desde un estado seco a la forma
hidratada.
En otra realización preferida de la invención la
matriz polimérica tiene la forma de cuentas de tipo gel.
En otra realización preferida de la invención,
dicho fluido es una solución acuosa u orgánica, un fluido corporal,
preferiblemente sangre, fluidos terapéuticos, fluidos para
aplicaciones de la ciencia a la vida, preferiblemente soluciones
tampón, fluidos de infusión o fluidos de diálisis en aplicación
biológica, de diagnóstico o biotecnológica, productos de la sangre
obtenidos de donantes sanos, tales como plasma, productos
concentrados de plaquetas, productos concentrados de eritrocitos,
preferiblemente portadores de oxígeno, soluciones de hemoglobina
modificada, y soluciones de hemoglobulina artificial, fluidos para
nutrición y fluidos para uso industrial.
En otra realización preferida de la invención la
matriz polimérica tiene un valor de corte de aproximadamente 1 x
10^{2} a 1 x 10^{6} Daltons y se une a sustancias hidrófobas y/o
hidrófilas.
En otra realización preferida de la invención el
soporte sólido es un poliestireno entrecruzado, el espaciador es un
polietilenglicol.
El desarrollo racional de la estructura de unión
específica aplicable en el tratamiento extracorpóreo de la sangre
requiere: (i) una tecnología flexible para construir ligandos y (ii)
requerimientos básicos de biocompatibilidad, toxicología y
manejabilidad. Se aplica la síntesis de péptidos en fase sólida para
obtener estructuras de ligandos bien definidas ensambladas sobre
sustancias poliméricas biocompatibles, que, de acuerdo con una de
las realizaciones preferidas, son copolímeros injertados con
poliestireno-polietilenglicol específicos para las
sustancias biológicas.
Mediante la variación sistemática de la
estructura geométrica de los motivos ligando los autores de la
presente invención podrían demostrar un incremento en la afinidad
del ligando en un factor de 10 a 100 con respecto a la
concentración molar de los componentes básicos. Estas
investigaciones se llevaron a cabo en suero humano, esto es, en
presencia de proteínas competitivas.
La evaluación de la compatibilidad con la sangre
se realizó mediante análisis in vitro en plasma humano y/o
sangre completa. El material con una base de PS-PEG
con o sin ligando es biocompatible con respecto a la activación del
complemento, la activación de la fase de contacto, la citotoxicidad
y la activación de los granulocitos.
La estructura polimérica base muestra un perfil
de biocompatiblidad ventajoso especialmente para la aplicación
extracorpórea. La tecnología aplicada para la síntesis de ligandos
permite el tratamiento de materiales poliméricos específicos sin la
generación de residuos tóxicos.
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Ejemplo
1
Este ejemplo describe, sin limitar la invención,
el diseño de un ligando que contiene una unidad de unión para la
eliminación de LPS.
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La eliminación eficaz de las toxinas, p. ej.
LPS, requiere un ligando con una unidad de unión que es
complementaria al motivo de unión de la sustancia que se va a
eliminar. Esto incluye un aspecto tridimensional de la sustancia
que se va a eliminar y una disposición precisa de las moléculas para
optimizar un reconocimiento bioespecífico con características como
las cargas complementarias, el carácter hidrófobo e hidrófilo. Esto,
junto con unas distancias apropiadas de las características
mencionadas anteriormente, completará el ligando con su unidad de
unión. Asimismo, la presentación tridimensional total de semejante
ligando en una matriz polimérica debe tener un espacio óptimo para
una elevada perfusión, presentación del ligando y flexibilidad del
ligando. Sin embargo, una elevada biocompatibilidad es un requisito
previo para la purificación de la sangre in o ex vivo
en pacientes. En la matriz descrita, la accesibilidad es comparable
o incluso idéntica a la de una solución acuosa en fase no sólida.
La estructura de LPS se muestra en la Fig. 1. La unión
complementaria sugerida a LPS se muestra en las Figs.
3A-D, donde se toman en consideración los grupos
fosfato y la cola hidrófoba de LPS para la formación de un motivo
de unión complementario. La estructura sugerida se muestra para
Arg_{4} y Arg_{8} en la Fig. 2 así como en un formato
tridimensional en la Fig. 11. La Arg_{8} muestra la mitad de
posiciones arginina en la Figura a mano izquierda y la mitad de
posiciones arginina en la Fig. 11B a mano derecha. Asimismo, se
muestra la conexión al espaciador, aquí a PEG.
Adicionalmente se aplicaron simulaciones
moleculares para identificar y verificar la estructura geométrica
tridimensional y química del sitio de unión descrito. Las
simulaciones se realizaron sobre Silicon Graphics Octane2
Workstation, utilizando Insight II-Package
(Molecular Simulations Inc. (MSI), San Diego, CA) y los algoritmos
de optimización incluidos en él, p. ej. campos de fuerza AMBER. Los
resultados de las disposiciones tridimensionales para Arg_{4} y
Arg_{8} se muestran en las Figs. 11A y B, respectivamente. Aquí,
la ilustración muestra el principio de la parte terminal
tridimensional de la matriz, sin el espaciador PEG o el soporte
sólido.
El ligando con su unidad de unión se sintetiza
según la Fig. 4, donde se ilustran tres modos diferentes. El método
preferido de los tres es la síntesis en fase sólida directamente
sobre el espaciador de PEG anclado al soporte sólido. La unidad de
unión se utiliza en la presente memoria en ejemplos adicionales.
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Ejemplo
2
Este ejemplo describe la adsorción de la
endotoxina LPS del plasma humano. El ejemplo también muestra la
comparación entre los ligandos lineales y ramificados en cuanto a
su adsorción de la endotoxina.
Se incuban cuentas con plasma humano
heparinizado durante un período de tiempo de dos horas. Los niveles
de endotoxinas se determinan después de dos horas de incubación
utilizando un análisis LAL.
Se utilizan las siguientes cuentas:
Se lleva a cabo la incubación de la cuentas en
plasma heparinizado a 37ºC. Las muestras se agitan lentamente y las
cuentas se separan mediante centrifugación después de un período de
incubación de dos horas.
Se realiza un análisis LAL para cuantificar los
niveles de endotoxinas después de la incubación con las cuentas. El
análisis se realiza mediante una reacción de la sustancia
cromogénica inducida por LAL (Chromogenics, Mölndal, Suecia). Los
niveles se calculan de acuerdo con una curva patrón obtenida con
concentraciones definidas de endotoxina en el plasma humano
heparinizado.
Utilizando el análisis LAL se encontraron las
siguientes concentraciones de endotoxina después de un período de
incubación de dos horas.
Este experimento muestra que los niveles de
endotoxina podrían disminuir 5 veces utilizando la matriz
tridimensional, ramificada sobre las cuentas
PS-PEG. Las cuentas con un ligando lineal no eran
tan eficaces y los niveles de endotoxina en aquellas muestras
estaban todavía en los niveles de partida de endotoxina, o cerca de
ellos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo muestra la cinética de la unión a
la endotoxina cuando se incuban las cuentas con una matriz
tridimensional, optimizada para la unión a LPS, con plasma y se
analizan en diferentes momentos.
La cinética de la absorción depende de la
estructura y del grado de entrecruzamiento de la matriz polimérica.
Las cuentas se incuban con plasma humano heparinizado. Después, se
retiran muestras a los 1, 10, y 120 minutos. Los niveles de
endotoxinas se determinan utilizando un análisis LAL.
Se utilizan las siguientes cuentas:
Se lleva a cabo la incubación de la cuentas en
plasma heparinizado a 37ºC. Las muestras se agitan lentamente y las
muestras de ensayo se separan después de un período de incubación de
1, 10, 120 minutos. Las cuentas se separan mediante
centrifugación.
Se realiza un análisis LAL para la
cuantificación de los niveles de endotoxina como en el Ejemplo
2.
La Fig. 5 muestra los resultados de los niveles
de endotoxina medidos en diferentes momentos. La Figura demuestra
que se necesita un período de tiempo de dos horas para una
separación eficaz, esto es, dejando 20-30% de
endotoxina de los niveles de partida en las muestras. El ligando
lineal que contiene arginina
(PS-PEG-Arg) solamente está
eliminando la mitad de la cantidad de endotoxinas, esto es dejando
un nivel de 60% después de 120 minutos. De un modo similar, cuando
se añadían las cuentas de referencia
(PS-PEG-NH-Ac), la
cantidad de endotoxina después de la incubación con las cuentas
todavía no había cambiado, esto es, estaba en los niveles de
partida, después de 120 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este experimento muestra la influencia del
aminoácido terminal y (arginina de acuerdo con la presente invención
frente a lisina) y la influencia de la ramificación del ligando, no
ramificado, frente a ramificado 4 veces frente a ramificado 8
veces.
Las cuentas se incuban con plasma humano
heparinizado con o sin endotoxina. Los niveles de endotoxina se
determinan utilizando un análisis LAL después de dos horas.
Se utilizan las siguientes cuentas:
Se realiza un análisis LAL como en el Ejemplo
2.
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Los resultados muestran que un ligando
ramificado es más eficaz que las formas lineales, y que la arginina
es varias veces (4 veces y 200 veces para Arg_{8} y Arg_{4},
respectivamente) más eficaz que la lisina en la eliminación de las
endotoxinas. Asimismo,
PS-PEG-Arg_{4} es el más eficaz en
la eliminación de endotoxinas después de dos horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este ejemplo describe la reducción de la
inducción de IL6 dependiente de endotoxina en monocitos humanos
mediante el uso de
PS-PEG-Arg_{8}.
En respuesta a LPS, los monocitos comienzan a
transcribir y expresar IL6. Los niveles de IL6 regulada al alza se
pueden medir fácilmente después de 4 horas mediante análisis de
citometría de flujo intracelular (FACS).
Se utilizan células mononucleares humanas de
sangre completa. Se utiliza
PS-PEG-Arg_{8} para la eliminación
de endotoxinas y
PS-PEG-NH-Ac está
incluido como control. Se utiliza lipopolisacárido (E. coli
cepa 055:B5 de Biowittaker Co.) para la estimulación del los MNC
in vitro. El análisis FACS se realiza utilizando FACSCAN
Calibur (Beckton Dickinson®).
Se incuba sangre completa a 37ºC (5% CO_{2})
durante 30 minutos con 10 o 30 UI/ml de LPS. Las muestras se
incuban en paralelo con y sin cuentas de
PS-PEG-Arg_{8}, así como cuentas
de control
PS-PEG-NH-Ac. Las
células se fijan en PermFix (Beckton Dickinson®) y se realiza una
doble tinción con anti-CD14-FITC y
anti-IL6-PE. Se cuentan 20.000
células por muestra de células para el análisis FACS. Los monocitos
definidos como células CD14^{+} constituyen normalmente
aproximadamente un 5% de la población de células totales.
Los monocitos se definen como células CD14^{+}
en la suspensión celular. La IL6 intracelular (IL6ic) se calibra en
cuanto a un patrón interno y se cuantifica en la población de
células CD14^{+} utilizando el análisis FACS después de la
incubación con 10 o 30 UI/ml de LPS durante 30 minutos. Los cálculos
se realizan utilizando CellQuest Software Package (Beckton
Dickinson®).
Utilizando los datos de FACS y los cálculos
realizados a partir de ellos, el análisis por un experto en la
técnica de la población de monocitos CD14^{+} genera los
siguientes datos presentados en la Fig. 6. En el gráfico se muestra
una reducción de 70% de los niveles de endotoxinas cuando se
utilizan cuentas de PS-PEG-Arg_{8}
en comparación con las cuentas de control
(PS-PEG-NH-Ac) y las
muestras sin cuentas incluidas. Los niveles intracelulares de IL6
se muestran en los histogramas. Al lado derecho, se puede observar
un descenso en los niveles de IL6 después de la incubación con
cuentas de PS-PEG-Arg_{8}. La fila
inferior izquierda muestra la ausencia de IL6 intracelular en las
células de nueva aportación.
Este experimento muestra una inhibición rápida y
completa de la estimulación de LPS en la población de monocitos
CD14^{+} humanos medida mediante la inhibición de la regulación al
alza de IL6 en monocitos dependiente de LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ejemplo describe, sin limitar la invención,
la permeabilización de las células de la sangre después de la
perfusión a través de la matriz de afinidad polimérica sobre
cuentas.
La purificación de la sangre requiere la
ausencia de lesión o activación de las células. La lesión mecánica,
especialmente de los eritrocitos, podría conducir a la hemólisis y
posteriores complicaciones que ponen en peligro la vida. Una matriz
polimérica de tipo hidrogel de acuerdo con la invención puede ser
perfundida sorprendentemente por las células de la sangre
completa.
Se utilizan una matriz polimérica altamente
dilatable, cuentas de
PS-PEG-Arg_{8}. Las columnas, DI
200 mm, se llenan con 1 g de la matriz, absorbiendo
4-5 ml de agua y posteriormente se
pre-enjuagan con solución salina fisiológica antes
de su uso. Después se utilizan las columnas para la perfusión de la
sangre completa.
La sangre completa de nueva aportación con
citrato y LPS (30 UI/ml) es perfundida a través de las columnas
utilizando un equipo estéril en un flujo laminar. La sangre completa
mezclada con LPS es perfundida a un flujo de 5 ml/min a 37ºC. Las
muestras de sangre se retiran antes de la perfusión y se analizan.
Las células analizadas son los glóbulos rojos (RBC), el hematocrito
(HTC) y la hemoglobina libre, los glóbulos blancos (WBC), las
plaquetas, y los números de trombocitos (TRC).
El número de células se cuenta antes y después
de la perfusión en la columna por medio de un Coulter Counter®
(Beckton Dickinson).
La hemoglobina libre se mide como el total del
nivel de hemoglobina después de una lisis completa de los
eritrocitos seguido de una cuantificación fotométrica a 405 nm. La
integridad de los eritrocitos después de la perfusión de la sangre
completa se muestra por medio de las mediciones de la hemoglobina
libre en plasma mediante una cuantificación fotométrica a 405
nm.
Se miden los números de células y el HCT y los
resultados se muestran en las Figs. 7A (trombocitos), 7B (HCT), 7C
(RBC), y 7D (WBC). Además, no se encuentra un incremento en la
hemoglobina libre, esto es no se induce hemólisis (datos no
mostrados). Los datos de este experimento muestran que, después del
tiempo de retención transitorio inicial debido a un efecto de
dilución inicial, el número de células se estabiliza para los
valores de la pre-columna. Los datos muestran una
permeabilización del material de la matriz de aproximadamente el
100%, puesto que el recuento celular en la
pre-columna es el mismo que el recuento celular en
la post-columna. Asimismo, las células permanecen
intactas, como se mide mediante un recuento de células viables y
lisis de los glóbulos rojos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Este ejemplo describe partes del perfil de
biocompatibilidad de la matriz de
PS-PEG-Arg_{8}.
La biocompatibilidad o la no compatibilidad se
miden en la presente memoria como la activación del complemento, la
liberación de elastasa y la trombogenicidad mediante la formación
del complejo trombina-antitrombina III.
Como en el Ejemplo 6, se utiliza material
celulósico como referencia.
Se mide la elastasa en plasma a partir de la
perfusión de sangre completa utilizando un análisis inmunoabsorbente
con enzima específica (ELISA; Diagnostic Product Co.).
Se mide la activación del complemento mediante
cuantificación del complejo terminal del complemento (proteína TCC)
según Deppisch et al. (Kidney Int.
37:696-706).
El grado de trombogenicidad, TAT, se mide de
acuerdo con Deppisch et al. (Neuphrol. Dial. Transplant
Suppl. 3:17-23, 1.994).
En la Fig. 8, se muestra la formación de TCC con
el tiempo. Las cuentas de referencia,
PS-PEG-NH-Ac (base
TG o material ref) muestra un incremento de 4-5
veces en la formación de TCC. Después de un enjuagado inicial a lo
largo de 10-15 minutos para
PS-PEG-Arg_{8} la formación de TCC
se estabiliza a los niveles de pre-perfusión.
En la Fig. 9, se mide el nivel de elastasa con
el tiempo. Los niveles no están cambiando en comparación con los
valores de la pre-columna. Se muestran las
mediciones a lo largo de 35 minutos. Para el material de referencia
los niveles de elastasa están creciendo 8-9 veces a
lo largo de 35 minutos.
En la Fig. 10, se muestra la formación de TAT.
No se detecta un incremento de la formación de TAT.
Las características de biocompatibilidad son
importantes en el tratamiento de la sangre ex vivo e in
vivo, p. ej. diálisis. La matriz descrita no muestra activación
del sistema del complemento, ni activación del sistema de
coagulación y no hay liberación de elastasa en comparación con el
material de referencia incluido, esto es una elevada
biocompatibilidad. Esto, junto con la elevada capacidad de perfusión
de la sangre completa como se muestra en el Ejemplo 6, demuestra
que la matriz de afinidad polimérica de acuerdo con la invención es
muy adecuada para el tratamiento extracorpóreo de la sangre,
incluida la sangre completa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se han realizado experimentos de adsorción de
endotoxina adicionales con el fin de mostrar la importancia de
encontrar una disposición geométricamente definida de los grupos
funcionales (esto es restos arginina) que constituyen un ligando
para la unión a la endotoxina. Se demuestra que la unión a la
endotoxina no depende sólo de la cantidad de arginina (esto es, las
cargas positivas) sino que la disposición geométrica definida es
más importante.
Se mezcló suero humano (representativo de los
fluidos corporales humanos tales como la sangre, el plasma etc.)
con cantidades bien definidas de endotoxina (esto es 3 UI/ml y 10
UE/ml) y se incubaron con 40 mg de cuentas de
PS-PEG que contenían la disposición Arg_{8} o la
disposición Arg_{4} como ligando. Las dos clases de disposiciones
de cuentas/ligando contienen diferentes cantidades de arginina: Arg4
contiene 0,72 mmoles/g y Arg8 contiene 1,89 mmoles/g. El mayor
contenido de arginina de las cuentas de Arg8 es una consecuencia de
la ramificación adicional causada por las bifurcaciones de lisina.
Después de 30 minutos de incubación se midió la concentración libre
(esto es no unida a la superficie de la matriz) de endotoxina (por
medio de un ensayo LAL) en el suero sobrenadante.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos se analizaron utilizando el enfoque
de Langmuir que describe las interacciones
ligando-receptor y los equilibrios en las
superficies sólidas (p. ej. adsorción de proteína) (Ref: JD Andrade:
Principles of protein adsorption. en: JD Andrade (Ed.) Surface
and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers. Volumen 2,
Protein Adsorption, Plenum Press New York 1.985, págs.
1-80). Este análisis se realiza trazando la cantidad
de toxina (esto es endotoxina) unida al
ligando-matriz (calculada a partir de la diferencia
entre la cantidad añadida y la cantidad que queda en el
sobrenadante después de la incubación) dividida por el número total
de ligandos presentes en la matriz frente a la concentración de
equilibrio de la toxina (esto es la concentración de endotoxina
después de la incubación) en el sobrenadante. Los gráficos se
ajustan después a la expresión matemática de la isoterma de
Langmuir, lo que proporciona las constantes de afinidad o asociación
para los diferentes ligandos unidos a la matriz hacia la toxina. En
las Figs. 12A y 12B se muestran ejemplos del enfoque de
Langmuir.
Se realizaron dos clases de gráficos de
Langmuir, que diferían a propósito del número total definido de
ligandos presentes en la matriz:
(1) omitiendo el diferente contenido de arginina
de las cuentas, esto es tomando solamente la masa de las cuentas en
gramos como una medida del número total de ligandos (Fig. 12A); este
enfoque se justifica puesto que en la aplicación práctica del
ligando-matriz polimérica, p. ej. en un dispositivo
adsorbente que se va a perfundir con un fluido corporal humano tal
como sangre o plasma en un circuito extracorpóreo, está hasta
cierto punto limitada por la masa total o el volumen de cuentas que
tiene que ser rellenado en el dispositivo con el fin obtener una
reducción terapéuticamente eficaz de la concentración de una toxina
en el paciente. La limitación p. ej. está relacionada con la caída
de presión a través del dispositivo, los efectos no específicos
sobre los componentes de la sangre (proteínas y células) o incluso
el espacio de almacenamiento para el dispositivo.
(2) teniendo en cuenta los diferentes contenidos
de arginina de las cuentas, esto es tomando la masa de las cuentas
en gramos dividida por la carga de arginina en mmoles/gramo como una
medida del número total de ligandos (Fig. 12B); este enfoque se
justifica por el hecho de que el contenido de arginina es un factor
de coste principal en la fabricación del
ligando-matriz polimérica; el resultado describe la
eficacia de los ligandos desde un punto de vista económico.
Los parámetros de equilibrio para los diferentes
gráficos de Langmuir se muestran en la Tabla 3.
La constante de afinidad describe y caracteriza
cuán fuerte se puede unir un cierto ligando a una toxina,
independientemente de la cantidad de ligando presente.
Sorprendentemente, la constante de afinidad del ligando Arg8 era
más de 10 veces mayor (esto es en un factor de 12,3) que la
constante de afinidad del ligando Arg4.
La concentración de saturación describe la
cantidad máxima de toxina que se puede unir al respectivo
ligando-matriz, suponiendo que se encuentran
disponibles cantidades ilimitadas de toxina. Sorprendentemente la
concentración de saturación del ligando Arg8-matriz
era más de 2 veces mayor (esto es en un factor de 2,8) que la
concentración de saturación del ligando
Arg4-matriz. Puesto que de acuerdo con el modelo de
adsorción de Langmuir la concentración de saturación es
completamente independiente de la constante de afinidad, esto se
puede interpretar de manera que la disposición geométrica
específica del ligando Arg 8 influye en la accesibilidad del
ligando-matriz para las toxinas, p. ej. influyendo
en la morfología (p. ej. de tipo cristal frente a fluido) de la
porción de PEG del ligando-matriz.
El siguiente ejemplo demuestra la importancia y
la relevancia de una afinidad mejorada de la endotoxina por el
ligando Arg8-matriz con respecto a la cantidad de
matriz que es necesaria para obtener una reducción terapéuticamente
relevante de la concentración de toxina:
En los pacientes sépticos se encuentran
concentraciones de endotoxina en el intervalo de 0,1 a 1 UE/ml (p.
ej. Nakamura et al. Renal Failure 2.000;
22:225-234). Suponiendo una concentración en plasma
de 0,3 UE/ml al principio del tratamiento y una concentración en
plasma de 0,03 UE/ml después del tratamiento y un volumen de plasma
de 4.000 ml, esto significa que se han tenido que unir al
ligando-matriz 1.080 UE de endotoxina durante el
tratamiento. La cantidad de matriz necesaria para unirse a esta
cantidad de endotoxina se puede calcular a partir de la expresión
de Langmuir utilizando las constantes de afinidad y las
concentraciones de saturación para los respectivos ligandos. La
concentración al final del tratamiento es la concentración de
equilibrio. Utilizando los datos del equilibrio de la Tabla 3 este
cálculo demuestra que para el ligando Arg8 -matriz solamente son
necesarios 83 g, mientras que para el ligando
Arg4-matriz son necesarios 1.201 g para obtener el
objetivo terapéutico. Puestos que ambos
ligandos-matrices tienen una densidad similar (masa
por volumen) esto significa que el volumen y el tamaño del
dispositivo adsorbente será mucho más pequeño para el ligando Arg8,
lo que facilita la perfusión por el plasma o la sangre.
Claims (22)
1. Una matriz de afinidad polimérica para la
unión de una o más sustancias en un fluido para eliminar dicha una
o varias sustancias del fluido y/o hacer disminuir la cantidad o
concentración de la misma en dicho fluido con la intención de
evitar, eliminar, o reducir la activación no deseada de los
componentes o procesos de dicho fluido, donde dicha matriz
comprende
a) un soporte sólido
b) al menos un espaciador unido al soporte
sólido, donde el espaciador se selecciona del grupo que consiste en
poli- u oligo-etilenglicoles de fórmula
H-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-OH, donde n
representa 2-250, o poli(alcoholes
vinílicos), polivinilaminas, poliolicidoles, polietileniminas,
óxidos de polipropileno, o derivados de los mismos, y, acoplado a
cada espaciador,
c) un ligando que tiene una estructura
tridimensional definida que es complementaria por lo que se refiere
a carga y/o carácter hidrófobo/hidrófilo a la estructura
tridimensional de un motivo de unión de dicha una o varias
sustancias, donde el ligando se selecciona del grupo que consiste
en
y
2. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con la reivindicación 1, donde el espaciador es un polietilenglicol
(PEG) en una configuración lineal y/o ramificada y tiene un peso
molecular medio de 400-10.000 Daltons, o derivados
del mismo.
3. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con la reivindicación 1 o 2, donde el soporte sólido está hecho de
un material seleccionado del grupo que consiste en poliestireno,
poli(alcoholes vinílicos), polihidroxiestirenos, polímeros
producidos a partir de poliestirenos clorometilados o poliacrilatos,
polimetacrilatos funcionalizados con grupos hidroxi,
hidroxilaquilpoliestirenos, hidroxiarilpoliestirenos,
hidroxialquilarilpoliestirenos, poliestirenos
polihidroxialquilados, poliestirenos polihidroxiarilados,
isocianatoalquil-poliestirenos,
isocianatoaril-poliestirenos,
carboxialquil-poliestirenos,
carboxiaril-poliestirenos,
aminoalquil-poliestirenos,
aminoaril-poliestirenos, polimetacrilatos,
polietilenglicoles entrecruzados, celulosa, sílice, carbohidratos,
látex, copolímeros de cicloolefina, vidrio o combinaciones de los
mismos, preferiblemente un poliestireno entrecruzado.
4. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con la reivindicación 3, donde el soporte sólido tiene la forma de
una cuenta, gel, membrana, partícula, red, género tejido o no
tejido, fieltro de fibra, tubo, película, lámina o combinaciones de
los mismos, o redes interpenetrantes entrecruzadas, preferiblemente
una cuenta de poliestireno-PEG.
5. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha
matriz es biocompatible y tiene una capacidad de dilatación
suficiente para permitir la perfusión de sangre completa.
6. La matriz polimérica de acuerdo con la
reivindicación 5, donde la capacidad de dilatación es de
aproximadamente 1,5-20 veces, preferiblemente
2-6 veces, desde el estado seco a la forma
hidratada.
7. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha
matriz de afinidad proporciona una estructura complementaria
tridimensional para la unión a al menos una sustancia seleccionada
del grupo que consiste en constituyentes derivados de bacterias o
virus, endotoxinas, exotoxinas, ADN bacteriano o fragmentos del
mismo, oligonucleótidos; células, en particular células
endoteliales, células troncales, y células tumorales; células de la
sangre, en particular linfocitos, trombocitos, granulocitos,
células dendríticas, y monocitos, priones, parásitos, hongos, drogas
después de una sobredosis, aditivos alimentarios patógenos,
productos de trastornos metabólicos agudos o crónicos resultantes de
diabetes melitus, enfermedad del hígado, uremia, enfermedades o
inflamación del riñón, heparina, bacterias y virus, células de la
sangre cargadas de patógenos, o al menos partes o productos de
degradación de las mismas, ADN, fosfato, citoquinas, factores de
crecimiento, hormonas, quimioquinas, toxinas urémicas, proteínas de
coagulación de la sangre, proteínas procoagulatorias, proteínas
inflamatorias o proinflamatorias, factor inhibidor de la migración
de macrófagos, proteínas solubles o unidas a la superficie celular,
moléculas de adherencia solubles, y glucosa o productos de
degradación de la misma, pirógenos, exotoxinas bacterianas,
productos de bacterias Gram positivas, preferiblemente ácido
lipoteicónico, en particular pirógenos bacterianos, preferiblemente
endotoxinas, en particular el componente lípido A de los
lipopolisacáridos (LPS).
8. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha
matriz tiene un valor de corte de aproximadamente 1 x 10^{2} a
aproximadamente 1 x 10^{6} Daltons y se une a sustancias
hidrófobas y/o hidrófilas.
9. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el
fluido del cual se van a eliminar o se van a reducir una o varias
sustancias es una solución acuosa u orgánica, un fluido corporal,
preferiblemente sangre, fluidos terapéuticos, fluidos para
aplicaciones de la ciencia a la vida, preferiblemente soluciones
tampón, fluidos de infusión o fluidos de diálisis en aplicaciones
biológicas, de diagnóstico o biotecnológicas, productos de la
sangre obtenidos de donantes sanos, tales como plasma, productos
concentrados de plaquetas, productos concentrados de eritrocitos que
se utilizan para transfusiones, sustitutos de la sangre,
preferiblemente portadores de oxígeno, soluciones de hemoglobina
modificada, y soluciones de hemoglobina artificial; fluidos para
nutrición y fluidos para uso industrial.
10. La matriz de afinidad polimérica de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el
soporte sólido es un poliestireno entrecruzado, y el espaciador es
un polietilenglicol.
11. Un método para eliminar una o más sustancias
de un fluido y/o reducir la cantidad o concentración de las mismas
con la intención de prevenir, eliminar o reducir la activación no
deseada de los componentes o procesos de dicho fluido, que
comprende poner en contacto el fluido con la matriz de afinidad
polimérica definida en una cualquiera de las reivindicaciones
1-10 durante un período de tiempo suficiente para
reducir la cantidad o concentración y/o eliminar dicha sustancia o
sustancias, preferiblemente hasta 24 horas.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, donde el período de tiempo es de 1 segundo a 2 horas.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 y 12, donde la sustancia es una endotoxina
y el fluido es sangre, donde la cantidad o concentración de
endotoxina después de haber sido separada o reducida está por
debajo de la capacidad de activar los componentes de la sangre o
evita la activación de los componentes o procesos de la sangre.
14. El uso de la matriz de afinidad polimérica
definida en una cualquiera de las reivindicaciones
1-10 para la eliminación de una o más sustancias,
preferiblemente endotoxinas, de un fluido, o la disminución de la
cantidad o concentración de las mismas en dicho fluido,
preferiblemente un fluido corporal o un fluido terapéutico, muy
preferiblemente sangre o suero.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14
para la producción de sangre menos activa o la prevención de la
activación no deseada de los componentes o procesos de la
sangre.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14
como parte de un procedimiento de purificación de la sangre
extracorpóreo o como un implante en el organismo para que contacte
con la sangre o cualquier fluido corporal, preferiblemente en el
sistema vascular, los vasos sanguíneos o la cavidad peritoneal.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16
para la producción de sangre menos activada o la prevención de la
activación de los componentes o procesos de la sangre.
18. Un kit para eliminar una o más sustancias de
un fluido y/o disminuir la cantidad o concentración de las mismas
en dicho fluido con la intención de prevenir, eliminar, o reducir la
activación no deseada de los componentes o los procesos de dicho
fluido, comprendiendo dicho kit una matriz de afinidad polimérica
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
1-10.
19. El kit de acuerdo con la reivindicación 18,
donde éste comprende adicionalmente tubos para muestras, y un
dispositivo para el tratamiento extra- y/o
intra-corpóreo de dicho fluido, preferiblemente
sangre o suero.
20. Un método para producir una matriz de
afinidad polimérica como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, que comprende
- a)
- anclar el espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo y
- b)
- anclar a dicho primer complejo el ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional, o
- c)
- anclar el espaciador al ligando que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional para obtener un segundo complejo, y
- d)
- anclar el soporte sólido a dicho segundo complejo, o
- e)
- anclar el espaciador al soporte sólido para obtener un primer complejo, y
- f)
- síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al soporte sólido, o
- g)
- construir o sintetizar el espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- h)
- anclar a dicho primer complejo el líquido que contiene dicha al menos una unidad de unión con al menos un grupo funcional, o
- i)
- construir o sintetizar el espaciador a partir de monómeros directamente sobre el soporte sólido mediante injerto, y
- k)
- síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al soporte sólido,
donde la información acerca de la
estructura tridimensional, la presencia de cargas y las regiones
hidrófobas/hidrófilas del motivo de unión de la sustancia o las
sustancias que se van a unir se recoge de la cristalografía de rayos
X, la secuenciación de proteínas, el modelado de proteínas o los
cálculos del carácter hidrófobo o hidrófilo y el ligando que
contiene la unidad de unión se hace complementario en lo que se
refiere a la carga y/o el carácter hidrófilo/hidrófobo al motivo de
unión de dicha sustancia o
sustancias.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
20 que comprende las etapas de,
para los apartados a) y b): activación del
soporte sólido, acoplamiento de la molécula espaciadora al soporte
sólido, síntesis del ligando que contiene la unidad de unión, y
acoplamiento específico del sitio del ligando a la molécula
espaciadora, o
para los apartados c) y d): síntesis del ligando
que contiene la unidad de unión, acoplamiento de la molécula
espaciadora al ligando, activación del soporte sólido, y
acoplamiento específico del sitio del complejo
espaciador-ligando al soporte sólido, o,
para los apartados e) y f): activación del
soporte sólido, acoplamiento de la molécula espaciadora al soporte
sólido activado, y síntesis en fase sólida del ligando sobre el
espaciador unido al soporte.
22. El método de acuerdo con la reivindicación
21 que comprende las etapas de,
\newpage
para los apartados a) y b), activación del
espaciador, acoplamiento del espaciador activado al soporte sólido,
y acoplamiento del ligando a dicho espaciador activado, o,
para los apartados c) y d), síntesis del
ligando, activación del espaciador, acoplamiento específico del
sitio del ligando a la molécula espaciadora activada y acoplamiento
del complejo espaciador-ligando al soporte sólido,
o,
para los apartados e) y f), activación del
espaciador, acoplamiento del espaciador activado al soporte sólido
y síntesis en fase sólida del ligando sobre el espaciador unido al
soporte sólido.
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