KR101036995B1 - 중합체 친화성 기질과 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유체중의 하나 이상의 물질을 결합하거나 또는 유체로부터 물질(들)을 제거하거나 상기 유체에서 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 유체내에서 성분들의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유체로부터 물질(들)을 제거하거나 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 방법, 상기 기질의 제조 방법, 상기 기질의 용도 및 상기 기질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 중합체 친화성 기질은 결합 단위로서 아르기닌을 함유하는 고형 지지체, 스페이서, 및 리간드를 포함한다.

Description

중합체 친화성 기질과 이의 제조 방법 및 용도{POLYMER AFFINITY MATRIX, A METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF}
본 발명은 유체중의 하나 이상의 물질과 결합하여 유체로부터 물질(들)을 제거하고/하거나 유체에서 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질(polymer affinity matrix), 상기 기질의 제조 방법, 상기 기질의 용도 및 상기 기질을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하거나 유체에서 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질의 제조에 사용하기 위한 중합체 기질의 용도에 관한 것이다.
체외 처리
혈액이나 기타 체액과 같은 유체의 체외 처리에 있어서, 상기 유체는 예를 들어 튜브, 라인, 비드 또는 멤브레인 형태의 물질과 접촉하여야 한다. 이러한 물질을 도입하는데 있어서는 외래 물질의 사용이 수반되고 따라서 생체부적합성(bioincompatible)(예, 면역활성 또는 전응고성(procoagulatory)) 물질의 사용이 수반될 수 있다. 이러한 외래 물질의 사용은 림프구, 혈소판 또는 상이한 유형의 혈장 단백질 케스케이드(예, 보체 또는 응고 케스케이드의 단백질)와 같은 혈액 성분의 숙주 면역계의 활성화와 관련이 있다. 또한, 적혈구 등의 기계적 손상 또는 스트레스-유도된 손상과 같은 세포 손상은 환자에 있어서 용혈에 따른 생명 위협 합병증을 일으킬 수 있다. 따라서, 혈액 또는 어떤 체액과 같은 유체의 처리에는 고도로 생체적합성인 물질을 이용하여 혈액과 같은 체액에 함유된 성분들의 바람직하지 않은 활성화를 회피할 필요가 있다.
세균 독소
세균성 내독소 및 외독소는 숙주중의 혈액 세포 및 가용성 단백질과 내독소 사이의 다중 상호작용에 의한 활성화로 인해 숙주에서 압도적인 염증성 면역 반응을 촉진한다. 이러한 면역 반응은 SIRS(전신성 염증 반응 증후군), 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 임상학적 증상의 필수적인 특징으로 기재된다. 이러한 발병 기전은 중증으로서 그 증상은 조직 손상, 다중 장기 부전, 및 패혈증에 의한 사망을 초래한다. 최근의 치료의 연구(Dinarello 등, European Cytokine Network 1997; 8:294)가 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크로부터 환자를 보호하는데 실패하였음을 보여주고 있기 때문에, 패혈증 환자의 치료를 위한 새로운 치료약 및 방법의 탐색이 중요하게 된다. 또한, 치료 물질 또는 유체를 제조할 때, 생성물이 발열하지 않도록, 즉 내독소 농도가 없거나 또는 그 효과를 나타내는 허용 한계에 못 미치도록 주의가 요구된다.
내독소
대장균(Escherichia coli), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)와 같은 그램 음성 세균의 세포막의 외층으로부터 유래된 내독소 또는 발열인자(pyrogen)는 패혈증, 패혈성 쇼크 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)의 발병기전에 중요한 역할을 한다. 대장균(E.coli) 유래의 당지질(LPS)과 같은 내독소는 지질 A 및 다당 사슬로 이루어진다(Zaehringer 등, Adv. Carb, Chem. Biochem., 1994). LPS의 분자 구조가 도 1에서 도시되어 있다. 지질 A 성분은 생물학적으로 가장 활성이 있는 부분으로서, 세포에 대한 내독소의 독성 작용을 매개한다. 지질 A는 상이한 균주의 그램 음성 세균내에서 고도로 보존되는 반면에 상기 다당 부분은 아주 많이 변화될 수 있다.
대장균(E.coli) 유래의 지질 A는 두 개의 글루코사민 부분들 및 이 부분들에 연결되는 6 개의 장쇄 고소수성 지방산 잔기로 이루어지는데, 상기 글루코사민 부분들은 이들의 대향하는 말단에서 2개의 음으로 하전된 인산기를 함유한다. 또한, 상기 글루코사민들중 하나에는 상기 내독소의 가변성 다당류 사슬이 연결되어 있다.
내독소의 제거
내독소의 제거는 어렵고, 흔히 유용한 단백질(즉, 제거되지 않아야 하는 단백질)의 회수시의 문제, 또는 상기 단백질의 손상의 문제, 또는 혈액이나 채액과의 생체 적합성 문제 및 내독소의 제거에 사용되는 수단과의 생체 적합성 문제를 수반한다. 이러한 생체 적합성 문제는 숙주 방어 기전의 단순한 활성화에 의해 초래되며, 다중 세포 활성화를 수반하고 시토킨과 같은 가용성 단백질 및 보체 캐스케이드(complement cascade)에서 단백질의 방출을 수반한다. 이러한 세포 활성화 및 단백질 방출은 중증 염증, 즉 전신성 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 초래함으로써 조직 손상 및 장기 부전을 초래할 수 있다. 생체부적합성에 따른 또 다른 문제는 혈액 응고이다. 또한, 발열 인자는 완전히 제거될 수 없다.
공지된 내독소 제거 방법으로는 열, 산 또는 알칼리를 이용한 불활성화 방법이 있다(미합중국 특허 제 3,644,175호, 3,659,027호 및 4,070,289호). 이러한 방법들은 흔히 최종 생성물, 즉 불활성화된 탈독성화 유체의 품질을 저하시키는데, 이는 상기 유체 또는 이의 유용 단백질이 이러한 유형의 방법의 사용을 통해 변성 또는 불활성화되기 때문이다. 사용되는 다른 방법으로는 숯에 흡착이나 과망간산칼륨, 과산화수소 수용액 및 차아염소산나트륨 등의 산화제를 이용한 산화성 분해가 있다.
내독소의 제거를 위한 통상적인 수단
패혈증 환자의 혈장이나 전체 혈액으로부터 내독소의 체외 제거는 패혈증, 패혈성 쇼크 및 SIRS의 치료를 위한 가능한 치료법으로 제안되고 있다. 사람의 혈장에는, 세포에 대한 내독소 작용의 매개 및 억제 역할을 하는 몇 개의 결합 단백질, 예를 들어 당지질 결합 단백질(LBP), 살균 투과성 증가 단백질(BPI), sCD14, CAP18 및 락토페린이 있다. 펩타이드 항생제 폴리믹신 B(바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)에 의해 생성됨)는 세포에 대한 내독소의 작용을 억제한다. 또한, 투구게(Limulus polyphemus)는 내독소 결합 단백질을 함유하며 이러한 종으로부터 유래한 세포 라이세이트가 내독소의 검출에 사용된다(투구게 혈구 추출액, LAL, 또는 Limulus test). 이러한 내독소 결합 단백질의 결합 모티프(binding motif)가 패혈증 환자의 혈장 또는 전체 혈액의 체외 처리에 사용될 수 있다.
많은 내독소 결합 서열들의 공통적인 특징은 그 결합 부분에 양으로 하전된 아미노산과 소수성 아미노산들이 번갈아 존재한다는 것이다. 상기 투구게 유래의 하나의 내독소 결합 단백질의 경우, 상기 내독소 결합 서열은 양으로 하전된 잔기와 소수성 잔기가 루우프 구조의 대향하는 면들에 위치하고 있는 양친매성 2차 구조를 형성하는 것으로 확인되어 왔다(Hoess 등, EMBO J, 1993). 다른 내독소 결합 부위의 경우에도 유사한 패턴이 제안되어 왔다.
폴리에틸렌이민(Mizner 등, Artif. Organs, 1993; Weber 등, ASAIO J, 1995; Petsch 등, J Chromatogr. Biomed. Sci. Appl., 1998) 또는 디에틸아마노에틸(DEAE) 개질 셀룰로오스(Weber 등, A.S.A.I.O. J., 1995)와 같은 양전하를 띤 중합체들은 아마도 양전하와 지질 A의 음전하를 띤 인산 잔기와의 상호작용에 근거한 특정의 내독소 흡착 능력을 갖는다. 상기 폴리에틸렌이민의 단점은 헤파린의 흡수율이 높고 혈소판과의 상호 작용에 의하여 생체내 또는 생체외 적용시 응혈과 같은 생체부적합성 문제를 일으킨다는 것이다.
마찬가지로, 양전하를 띤 멤브레인 필터가 주입액의 정제에 사용되고 있다. 따라서, 이러한 흡수는 인력있는 전하를 이용하고 덜 특이적이므로 바람직한 유용 단백질도 제거할 수 있다.
세파로스에 고정된 아르기닌이 혈장, 혈액 및 약학적 용액으로부터 내독소의 제거용으로 제안되어 왔다(EP 0 494 848호 및 EP 0 0333 474호).
WO 92/11847호는 내독소 유도 작용의 치료를 위해 경구, 정맥내, 근육내, 피 부내 또는 복막내 경로로 사용될 약물의 제조를 위한 화합물의 용도 및 내독소-유도 작용의 치료 방법을 기재하고 있다. WO 92/11847호에서 기재된 화합물은 고형 지지체에 고정되지 않는다.
또한, 소수성 중합체(예, 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리설폰 및 폴리에테르설폰)는 수용액 중의 내독소를 흡수할 수 있다. 이러한 특성은 물 및 투석/주입액, 즉 단백질 함량이 낮거나 전혀 없는 용액의 정제를 위한 한외여과막에 이용된다(Weber 등, Int. J. Artfic. Org., 1997). 그러나, 혈액이나 혈장으로부터 내독소의 제거에는 특이성이 낮은 단조로운 소수성 흡수로 인해 흡수제 기질에 대한 세포 수용체(예, CD14) 및 순환 혈장 단백질(예, LBP, BPI, sCD14)과의 경쟁 문제가 발생된다.
내독소의 제거에 양전하를 띤 중합체 또는 소수성 중합체를 사용하는 경우,이러한 중합체는 결합 특이성이 낮고 따라서 혈장중의 내독소의 제거 선택성이 낮다. 실제로 높은 특이성 및 높은 선택성외에도 높은 생체적합성을 갖는 효율적인 내독소 흡수제를 개발하기 위한 시도가 있어왔다.
내독소 결합 단백질 유래의 펩타이드 서열을 살균/투과성 증가(BPI) 단백질 생성물을 이용한 치료에 사용하는 것이 제안되어 왔다(미합중국 특허 제 5,639,727호 및 5,643,875호). 고정된 펩타이드의 단점은 합성 비용이 필요하고 펩타이드를 결합 구조를 방해하지 않고 고정시켜야 한다는 것이다.
히스타민, 히스티딘, 및 폴리믹신 B와 같은 친화성 리간드는 그 효과가 유체중의 다른 단백질에 좌우되고 혈청 알부민 등의 혈청 단백질이나 기타 음전하를 띤 단백질의 존재시에 극적으로 감소하지만 내독소의 제거에 효과적이다(Anspach 및 Hilbeck, J. Chromatogr., 1995, Petsch 등, J. Chromatogr., 1997, EP 0 129 786호). 그러나, 폴리믹신 B는 중추신경계에 독성이 있고, 환자의 혈액내로 누출의 위험성으로 인해 판매 허가를 받는데 있어서 단점이 되는 신장 손상을 유발할 수 있다. 미합중국 특허 제 4,771,104 호는 폴리믹신 B가 고정되는 섬유상 담체를 포함하는 내독소 독성제거 물질을 기재하고 있다.
수불용성 폴리(ε-리신)(PL) 입자를 이용하여 약물 및 유체로부터 내독소, 특히 LPS를 제거하는 것이 문헌[Hirayama 등, Journal of Chromatography B, 271 (1999), 187-195)에 기재되었다.
한계 및 미래의 전망
단백질 유체로부터 효율적으로 내독소를 제거하는 것은 내독소가 제거되어야 하는 바람직한 유용 단백질의 순전하(net charge)에 좌우된다. 내독소와 이의 리간드 사이의 상호작용은 소수성 및 이온성 특성을 갖지만, 이들 각각의 기여 정도는 상기 유체의 이온 강도 및 pH에 좌우된다. 또한, 효율적으로 내독소를 제거하는 것은 높은 관류율 및 내독소를 제거하여 세포 활성화 또는 혈액 응고 등을 방지하기 위한 수단의 생체적합성에 따라 좌우된다.
그러나, 혈액이나 기타 체액 또는 치료용 유체등과 같은 유체로부터 내독소와 같은 물질을 제거하기 위한 많은 수단이 개발 또는 제안되어 왔지만, 그 어느 것도 생체적합성이 높지 않을뿐 아니라 내독소와 같은 제거하고자 하는 물질에 대한 특이성 및 선택성이 높지 않은 동시에, 전체 혈액이나 혈장 등이 용이하게 관류할 수 없다. 따라서, 내독소와 같은 물질의 제거에 아주 효과적이고 생체적합성이 있고 효과적인 방법 및 수단을 개발함으로써 종래의 장치와 관련된 문제를 회피할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명은 이러한 필요성 및 중요성을 다룬다.
유체로부터 하나 이상의 물질, 예를 들어 혈액, 임의의 다른 체액 또는 치료 유체로부터 내독소를 제거하거나 그 농도를 감소시켜서 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 효율적인 방법 및 수단의 필요성이 상기의 이유로 인해 특히 생체의학 분야에서 명백하게 된다. 또한, 이러한 방법 및 수단은 패혈증 환자의 혈장으로부터 발열인자나 기타 활성화 물질을 체외 제거함으로써 패혈증, 패혈성 쇼크 및 SIRS를 치료하는데 특히 유용하다.
또한, 기질에 항체나 펩타이드 등의 생체특이성 리간드를 결합시켜 신체나 혈액 순환계로부터 이상생리학적으로 중요한 물질 등을 제거하는 것이 잘 알려져있다.
사용되는 공지 물질의 예로는 비이드나 입자 형태의 세파로스(sephadex, pharmacia), 폴리아크릴레이트 또는 에폭사이드 수지가 있다.
공지의 비이드는 예를들어 하기의 것들로 이루어진다: 폴리메틸메타크릴레이트, 예를 들어 LDL 흡수용 DALI-시스템(Fresenius); 세파로스, 예를 들어 고정된 펩타이드를 이용하는 피브리노겐 흡착용 플라즈마셀렉트(Plasmaselect)에 의한 레오소브-시스템(Rheosorb-System); 사람의 면역 글로불린에 결합하는 고정된 양의 항체를 이용하여 자가항체를 제거하기 위한 테라소브-면역흡착-시스템(Therasorb-Immunoadsorption-System); 고정된 세균 단백질을 이용하여 면역글로불린과 결합하는 엑코림(Excorim)-단백질 A 컬럼(및 기타 제조업자에 의한 유사한 시스템).
공지의 멤브레인의 예로는 폴리아미드(MAT/Merck) 및 기타 친화성 멤브레인으로 일반적으로 알려져 있는 것들이 있다.
공지의 직포(fabrics)의 예로는 LPS 결합용 폴리믹신 B 리간드를 갖는 토레이(Toray) 폴리스티렌/폴리에틸렌 매시(mesh)가 있다.
이러한 기질 모두는 통상적인 습식 화학법에 의해 생물학적 리간드(예를 들어, 펩타이드 또는 항체)를 이용할 경우에 개질된다. 즉, 먼저 상응하는 특이 리간드가 예를 들어 펩타이드 합성 또는 생물공학적 방법에 의해 형성 또는 분리된 다음 정제된 후 고형 기질에 고정된다.
보통 이러한 기질은 고상 합성법에서 사용되는 화학제(보호기의 분열을 위해 사용된 용매, 산 및 염기 등)로 인해 기질상에 리간드(예, 펩타이드)를 직접 고상 합성할 수 없다.
고상 합성에 적당하게 되는 기질(예, 폴리스티렌)은 생체적합성이 부족하기 때문에 치료용으로는 부적합하다.
따라서, 고상 합성이 가능한 외에도 혈액 성분(예, 혈장 또는 전체 혈액)과 접촉이 가능한 고상 기질이 하기의 이유에서 유리하다:
(1) 적당한 리간드(예, 최적 펩타이드 구조)를 찾기 위한 개발 단계가 이후에 치료용으로 사용될 수 있는 동일 고형 기질상에서 수행될 수 있다. 이는 필요한 생물학적 테스트 과정(예, 친화성, 특이성 및 결합 능력의 측정)이 나중의 치료 조건과 매우 유사한 조건하에서 실시될 수 있음을 의미한다. 따라서, 상기 생물학 적 테스트 과정에서 얻어지는 정보가 매우 신뢰할 수 있고 나중의 치료 및 임상학적 용도로 적합하다. 이로써, 시간 및 돈이 절감되고 부전 또는 부작용의 위험이 저하된다.
(2) (펩타이드) 리간드가 서열 및 형태에 있어서 정확히 한정되는 방법으로 고상 합성법에 의해 제작될 수 있다. 이는 고형 기질에 대한 (펩타이드) 리간드의 결합(즉, 공유결합의 위치)이 정확히 한정됨을 의미한다.
이러한 기질은 팽윤 또는 습윤 거동에 있어서 다소 모순되는 요건이 있다. 즉, 고상 합성의 경우 비수성 유기 용매(디메틸포름아미드와 같은 극성 용매, 디클로로메탄과 같은 비극성 용매) 또는 이들의 혼합물이 사용된다. 반면에 치료는 수성 환경(예, 혈장, 혈액, 치료 용액 등)에서 실시되어야 한다. 두 환경(즉, 수성 및 유기 용매)에서, 상기 중합체 기질은 하기의 목적을 위하여 용이하게 습윤 및 팽윤될 수 있어야 한다:
(1) 미결합(과량) 리간드 또는 빌딩 블록(예, 보호된 아미노기) 또는 화학제(예, 카보디이미드와 같은 커플링제, 유기산 또는 염기와 같은 보호기 제거제)를 효과적으로 제거 또는 씻어낼 수 있도록 하기 위하여, 그리고
(2) 개개의 독소가 수성 환경으로부터 제거될 수 있도록 하기 위하여, 상기 기질은 이러한 환경에서 습윤 및 팽윤될 수 있어야 한다.
따라서, 공지의 중합체 기질의 문제점은 결합된 활성 리간드를 그대로 용리시키지 않고 유체로부터 제거하고자 하는 물질을 포착한 물질만을 용리시키기 위하여 유체를 재생하여 이용하는 유형으로 제한되고, 상기 리간드가 규정된 펩타이드/ 분자 또는 랜덤 중합된 폴리펩타이드/올리고머의 형태로 제작되어 지지 물질에 결합되어야 한다는 것이다.
본 발명에 따른 용도의 이점은 그라프트된 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 고형 지지체상에 직접 리간드를 배열할 수 있고, 상기 리간드가 배열된 고형 지지체를 직접 사용할 수 있다는 것이다. 이는 종래의 기질로서는 얻어지지 않는 신뢰성을 제공한다. 또한, 상기 생물학적 활성/특이적 리간드가 의료용 기기의 일부이고 개발 시간이 단축되어 일종의 개별화된 치료를 촉진할 수 있기 때문에 기술적인 이점을 제공한다.
개발 동안에, 본 발명에 따른 물질은 드러날 정도로 탁월하게 작용하는 것으로 알려지거나 또는 예상되지 않았다. 예상된 점은 상기 중합체 기질이 팽윤하여 기구를 통한 흐름을 차단하게 된다는 것이었다. 또한, 전체 혈액과 같은 유체를 적용할 때 압력 강하가 너무 높을 것으로 예상되었다. 끝으로, 그 결과로서, 고상 물질을 통한 유체의 관류가 불충분한 것으로 예상되었다.
그 바람직한 하나의 실시예에 따른 중합체 기질은 우수하게 증기 살균된 다음 건조되는 것으로 확인되었다. 건조후, 공기 잔류물은, 다시 팽윤되도록 중합체 기질에 식염 용액의 첨가에 의하여 쉽게 제거됨으로써 상기 기질은 사용에 적합하게 된다. 이로써, 비상시 및 높은 작업부하시에 중요하게 되는 것으로 임상시에 제조시간이 단축된다.
또한, 상기 물질은 상이한 유형의 리간드마다 고형 지지체가 사용되는 경우와는 다르게 즉각적인 습윤을 나타낸다. 이는 활성 리간드에 대한 고상 물질로서 매우 중요한 특징이다. 또한, 상기 물질은 특정 범위내에서 가압 및 감압될 수 있으며, 보체 활성화, 접촉상 활성화, 세포독성 및 과립구 활성화의 측면에서 생체적합성이 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 주된 목적은 유체에서 전술한 바람직하지 않은 물질, 예를 들어 내독소를 제거하고/하거나 그 양 또는 농도를 감소시키기 위한 것으로 고도로 생체적합성이 있고, 특이성 및 선택성이 있으며 용이하게 관류되는 중합체 친화성 기질, 즉 종래 기술의 모든 장점을 가지면서도 단점이 없는 중합체 친화성 기질(polymer affinity matrix)을 제공함으로써 종래 기술의 문제점을 제거함에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제 1 실시양태는 유체중의 하나 이상의 물질과 결합하여 유체에서 물질(들)을 제거하고/하거나 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질로서, 상기 기질은
a) 고형 지지체(solid support),
b) 고형 지지체에 결합되고, 서로 결합되는 하나 이상의 스페이서(spacer),
c) 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체(binding unit)를 함유하는 리간드를 포함하고, 리간드는 전하 및/또는 소수성/친수성에 대해 상기 물질(들)의 결합 모티프(binding motif)의 삼차원 구조에 상보적인 규정된 삼차원 구조를 가지며, 중합체 친화성 기질은 상기 물질(들)에 선택적으로 결합하는 능력을 가지는 것인 중합체 친화성 기질을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 유체중의 내독소를 제거하여 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질을 제공하는데, 상기 기질은 상기 내독소의 결합 모티프의 삼차원 구조에 상보적인 삼차원 구조를 갖는 리간드를 제공함으로써 상기 내독소의 결합을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질의 바람직한 구체예에서, 고형 지지체는 가교된 폴리스티렌이고, 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜이고, 리간드의 하나 이상의 결합 단위체는 아미노산이고, 각각의 작용기는 아미노기 또는 구아니디노기이다.
내독소를 제거하여 유체의 활성화를 감소시키기 위한 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 친화성 기질중의 각각의 결합 단위체는 혈액의 생리학적 pH 또는 그 근처에서 양전하를 띠는 아미노산, 바람직하게는 아르기닌, 리신, 시스테인, 또는 히스티딘을 포함하거나, 또는 혈액의 생리학적 pH 또는 그 근처에서 양전하를 띠는 하나 이상의 작용기를 갖는 이작용성(difunctional) 또는 삼작용성(trifunctional) 분자를 포함한다. 이러한 중합체 친화성 기질은 약 1 x 102-1 x 106 달톤의 규정된 한계(cut-off)를 가지며 소수성 및/또는 친수성 물질 모두에 결합하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하고/하거나 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시켜서 상기 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 물질(들)의 양 또는 농도를 감소시키고/시키거나 상기 물질을 제거하기에 충분한 시간, 바람직하게는 24 시간 이하, 가장 바람직하게는 1초 내지 2 시간동안 상기 유체를 본 발명의 중합체 친화성 기질과 접촉시키는 것을 포함한다. 그러나, 상기 접촉 시간은 적용 유속, 컬럼 사이즈, 및 적용 방식, 즉, 치료가 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 이루어지는 지에 따라 좌우된다. 바람직하게, 제거 또는 감소된 후 상기 물질(들)의 양 또는 농도는 혈액중의 성분 또는 과정을 활성화하는 능력보다 낮고 혈액에서 성분 또는 과정의 활성화를 방지하는 수준이다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 중합체 친화성 기질을 제조하는 방법으로서,
a) 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계와,
b) 상기 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하는 단계를 포함하거나,
c) 상기 스페이서에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하여 제 2 복합체를 얻는 단계와,
d) 상기 고형 지지체에 상기 제 2 복합체를 부착하는 단계를 포함하거나,
e) 상기 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계와.
f) 상기 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하거나,
g) 상기 고형 지지체상에 단량체를 직접 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계와,
h) 상기 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하는 단계를 포함하거나,
i) 상기 고형 지지체상에 직접 단량체를 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계와,
k) 상기 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하고,
결합시키려는 물질(들)상의 결합 모티프의 삼차원 구조, 전하의 존재, 및 소수성/친수성 영역에 관한 정보가 X-선 결정학, 단백질 서열분석, 단백질 모델링 또는 소수성 및 친수성 계산에 의하여 얻어지고 상기 결합 단위체는 전하 및/또는 친수성/소수성에 대해 상기 물질들의 결합 모티프에 상보적이게 되는 중합체 친화성 기질의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유체, 바람직하게는 체액 또는 치료용 유체, 가장 바람직하게는 혈액으로부터 하나 이상의 물질, 바람직하게는 내독소를 제거하거나 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 상기 중합체 친화성 기질의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하고/하거나 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 상기 유체 중의 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 상기 중합체 친화성 기질, 샘플 튜브, 및 상기 유체, 바람직하게는 혈액이나 혈청의 체외 및/또는 체내 처리용 기구를 포함한다.
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질을 시용하면, 혈액이나 기타 어떠한 체액 또는 치료용 유체와 같은 유체의 처리가 최적화되어 내독소와 같은 하나 이상의 물질이 제거되고/되거나 그 물질이 양 또는 농도가 감소됨으로써 상기 유체내에서 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 활성화가 방지, 제거 또는 감소된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 고도로 생체적합성이 있고 관류가능한 물질을 이용하는 것은 상기 중합체 친화성 기질의 사용 동안 유체에서의 활성화를 방지하는데 중요한 것이다. 이는 패혈증 환자의 혈장이나 혈액으로부터 내독소의 체외 제거시에 특히 중요하며, 패혈증, 패혈성 쇼크 및 SIRS의 치료시 가능한 치료 방법으로서 기재된다. 그 밖의 이점으로서, 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질을 이용하면 환자의 치료 시간이 단축된다.
본 발명의 그 밖의 이점 및 특징들은 도면 및 특허 청구 범위를 참조한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백하게 된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 구조적 성분들을 갖는 LPS 분자의 지질 A 부분의 개략도이다.
도 2A 및 2B는 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질의 나무형 구조(2A) 및 벌집형 구조(2B)에 속하는 리간드의 예들을 도시하는 개략도이다.
도 2C는 고리형 리간드 구조를 갖는 중합체 친화성 기질의 예를 도시한다.
도 3A 및 3B는 결합 모티프에 구조적 요건 및 양전하, 소수성 영역 및 최적 거리를 이용함으로써 내독소의 상보적 구조가 어떻게 발생되는 지를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질을 제조하는 여러가지 방법을 설명한 것이다.
도 5는 PS-PEG-비이드를 여러가지 시간(1, 10 및 120분)동안 배양한 후 사람의 혈장에서 내독소의 수준을 도시한 것이다.
도 6A-6G는 LPS가 스파이크된(spiked) 혈액을 PS-PEG-Arg8 비이드로 처리한 후 단핵세포에서 세포내 IL6의 내독소-유도 생성의 억제를 기질이 없는 비이드, 즉 기준 물질(PS-PEG-기준 물질)과 비교하여 도시한 것이다.
도 7A-7D는 백혈구(WBC) 및 적혈구(RBC) 수, 혈소판(THR)수 및 헤마토크릿(HCT)을 평가하는 PS-PEG-Arg8 비이드의 생체적합성 프로필을 도시한 것이다.
도 8은 전체 혈액에서 PS-PEG-Arg8 비이드를 사용한 후 TCC(말단 보체 복합체)의 형성이 결핍된 것을 도시한 것이다.
도 9는 전체 혈액에서 PS-PEG-Arg8 비이드를 사용한 후 엘라스타제의 방출이 없는 것을 도시한 것이다.
도 10은 전체 혈액에서 PS-PEG-Arg8 비이드를 사용한 후 TAT(트롬빈-안티트롬빈 III 복합체)의 형성이 없는 것을 도시한 것이다.
도 11A-11B는 LPS 결합에 최적인 -Arg8 및 -Arg4의 결합 단위체를 함유하는 리간드의 삼차원 구조를 도시한 것이다.
도 12A는 비이드의 질량(g)에 관한 PS-PEG-Arg 8 및 PS-PEG-Arg 4의 곡선 대입 랭미어 등온선(curve-fitted Langmuir isotherm)을 도시한 것이다.
도 12B는 아르기닌의 몰(g)에 관한 PS-PEG-Arg 8 및 PS-PEG-Arg 4의 곡선 대입 랭미어 등온선을 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명
전술한 바와 같이, 본 발명은 혈액이나 어떠한 기타 체액 또는 치료용 유체와 같은 유체로부터 물질을 제거하여 상기 유체 중의 성분 또는 과정의 활성화를 감소시키는 동시에 혈액의 생리학적 성분과 같은, 유체 중 다른 유용한 물질의 흡착을 회피하는데 충분한 특이성을 갖는 중합체 친화성 기질에 관한 것이다. 이러한 기질은 내독소 등의 양 또는 농도를 제거 또는 감소시키고자 하는 물질의 결합 모티프의 구조에 상보적인 구조를 갖는 리간드를 제공한다.
용어 정의
본 발명에서 사용되는 용어 "물질을 제거하는"은 상기 물질의 양 또는 농도가 제로(zero) 상태인 것을 항상 의미하는 것이 아니라 상기 물질을 방지, 감소, 중화, 불활성화, 분해, 개질, 소거, 결합 또는 은폐시키는 것을 의미한다. 또한, 용어 "물질의 양 또는 농도를 감소시키는"은 유체 중에서 성분의 후속 활성화 및/또는 유체에서 세포 및/또는 비세포 생물 기전을 예방 또는 억제하기에 충분할 정도로, 유체에서 물질의 양 또는 농도를 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "성분 또는 과정을 예방, 제거 또는 감소시키는"은 혈액이나 조직 세포와 같은 유체에서 특정의 화학적, 생물학적 또는 생화학적 과정, 예를 들어 신호 전달 경로, 상보 또는 응고 과정 및/또는 이러한 과정에 관여하는 성분들의 활성화와 같은 혈장 단백질 케스케이드를 직접 또는 간접 방식으로 불활성화, 억제, 저하, 감소, 완화 또는 예방하는 것을 의미한다. 물질의 "직접" 제거는 어떠한 중간 단계없이 과정에 영향을 미치는 반면에, "간접" 제거는 긴사슬의 일부분 또는 반응의 케스케이드가 되는 물질의 제거를 수반하여 후속하는 현상을 조기에 예방, 완화 또는 억제하게 된다. 이는 혈액 등으로부터 물질의 제거가 혈액을 불활성화 또는 덜 활성화시킨다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 따라 혈액과 같은 유체의 활성화가 예방된다는 것을 알 수 있다.
용어 "유체"는 통상적인 용액을 포함한 현탁액이나 용액, 예를 들어 수용액 또는 유기 용액, 혈액, 임의의 체액 또는 치료용 유체, 생물학적, 진단 또는 생물공학적 용도의 유체와 같은 생명과학용 유체, 예를 들어 완충액, 주입액, 또는 투석액, 또는 영양용 유체 및 산업용 유체를 포함한, 임의의 기체 또는 액체와 같은 임의의 유체를 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "체액"은 혈액, 혈장, 뇌척수액, 복수, 재주입액(예, 혈액농축후), 건강한 기증자로부터 얻은 혈액 산물, 예를 들어 수혈에 사용되는 혈장, 혈소판 농축물, 적혈구 농축물을 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "치료용 유체"는 복막 투석액, 혈액투석 농축물, 및 투석수, 대체 유체/온 라인 제조 유체, 주입액, 비경구 영양 유체, 수술용 세척액, 혈액 성분 제조용 유체, 혈액 대체물(예, 산소 담체, 변성 헤모글로빈 용액, 인공 헤모글로빈 용액) 등을 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "생명과학용 유체"는 세포 배양 조직공학 및 분자 생물학용 유체 및/또는 매질(예, PCR 방법에 사용되는 단백질 및 효소 용액)을 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "영양용 유체"는 음료수, 옥외용 유체, 및 식음료 농축물 및 분말용 재구성 유체를 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "고형 지지체"는 폴리펩타이드 형태의 리간드와 같은 분자가 링커 또는 스페이서를 그 사이에 이용하거나 이용하지 않고 합성될 수 있는 고형 지지체 또는 불용성 기질을 의미한다.
용어 "작용기"는 본 발명에 따른 기질에 분자, 즉 결합 단위체, 예를 들어 아미노산, 지방산, 탄수화물, 렉틴, 및 뉴클레오티드, 및 이들의 유도체 또는 조합물, 또는 특정의 화학적 특징 또는 구조, 예를 들어 양전하, 음전하, 소수성 또는 친수성, 및/또는 어떠한 다른 물리화학적 힘, 예를 들어 방향족기 사이의 반데르 발스힘 및 π-π 상호작용, 또는 수소 결합 또는 공유 결합과 같은 그 밖의 결합을 형성하기 위한 능력을 제공하는 특정 원자 또는 원자들의 집단을 의미한다. 아미노산의 작용기의 예로는 -COOH-, -OH, -SH, 구아니디노 및 -NH2외에도, 치환된 아미노기 또는 어떠한 양으로 하전된 기 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
용어 "결합 단위체"는 상기 용어 "작용기"의 정의에서 상기에 언급한 분자를 의미하는 것으로서, 상기 분자는 제거 및/또는 감소시키고자 하는 물질(들)에 대한 결합을 일으키고, 하나 이상의 작용기를 함유하고, 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질에서 스페이서에 결합된 리간드에 포함되는 것이다.
용어 "결합 모티프"는 제거하고자 하는 물질(들)상에 단독으로 또는 반복적으로 존재하는 삼차원 구조의 화학적 모티프를 의미한다.
용어 "리간드"는 스페이서를 통해 기질에 결합되는 전체 삼차원 분자를 의미하는 것으로서, 이는 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 포함한다. 상기 리간드는 제거하고자 하는 물질상의 결합 모티프와 함께 삼차원 상보성 구조를 형성하고 상기 결합 모티프에 결합한다. 여기서, "상보적"은 제거하고자 하는 물질의 결합 모티프의 삼차원 상보성 구조와 정밀하게 대합하는 능력을 특징으로 하는 삼차원적이고 기하학적으로 규정된 구조를 의미한다.
특정의 화합물과 함께 사용되는 용어 "이의 유도체"는 상기 화합물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 기능을 가지도록 유도되는 하나 이상의 화합물을 의미한다.
또한, 상기 리간드를 구성하는 화합물의 이성질체도 상기 화합물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 경우 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다. 하기 화학식에서, α 및 ε은 아미노산에 대하여 공통적으로 사용되는 명명법에 따라, 그 밖의 분자의 공유 결합에 사용되는 아미노기를 정의한다.
용어 "물질(들)"은 가용성이거나 불용성인 하나 이상의 성분 또는 관심있는 분자를 의미하는데, 이는 결합 단위체에 결합되는 것으로 해석된다. 이러한 물질의 예로는 바이러스 및 세균으로부터 유도되는 물질과 같은 혈액 세포를 활성화할 수 있는 독성 물질, 예를 들어 내독소, 혈액 세포 개체군, 예를 들어 림프구, 혈소판, 과립구, 수상세포, 단핵세포, 내피세포, 줄기 세포, 종양 세포; 또는 혈액 성분 또는 대사 활성 생성물, 예를 들어 글루코스 유도 분자 또는 이의 분해 생성물, 혈액 응고 단백질, 전응고 단백질, 염증성 또는 전염증성 단백질, 시토킨, 성장 인자, 호르몬, 케모킨, 요독소, 및 대식세포 이동 억제 인자가 있다. 혈액 성분의 예로는 전염성 질환 등을 일으키는 전염성 물질, 예를 들어 바이러스 입자, 프리온 또는 기생충, 균류, 병원균 적재 혈액 세포외에도, 과투여후의 약물, 병원성 식품 첨가제 또는 인체로부터 유래되지 않는 기타 성분이 있다. 그 밖의 예로는 발열인자, 특히 세균성 발열인자, 세균성 내독소, 그램 양성 세균 유래의 생성물, 예를 들어 리포테이콘산, 당뇨병, 간질환, 요독증 또는 신장 질환 또는 염증에 따른 만성 또는 급성 대사성 장애 생성물, 부착 케스케이드, 예를 들어 가용성 부착 분자가 있다. 제거하고자 하는 물질의 더욱 특별한 예로는 그램 음성 세균 유래의 내독소, 예들들어 LPS, 세균성 DNA 또는 이의 단편 또는 분해 생성물, 및 올리고뉴클레오티드, 헤파린, 인산염, 혈액 세포, 가용성 또는 세포 표면 결합 단백질이 있다.
용어 "스페이서"는 중합체와 같은 사슬로 구성된 분자를 의미하는데, 이는 고형 지지체의 일부가 된다는 점에서 고형 지지체를 변경시키고, 하나 이상의 작용기를 함유하는 하나 이상의 결합 단위체를 갖는 리간드를 고형 지지체와 이격되게 위치시키고, 고형 지지체로부터의 입체 장애에 덜 제한을 받게 하고 내독소, 세포 개체군 또는 혈액 성분 등에 물질(들)이 더욱 용이하게 결합할 수 있도록 하는 것이다. 스페이서 분자는 선형 및/또는 분지형 및/또는 고리형 포맷일 수 있다. 여기서, 상기 스페이서의 길이는 제거하고자 하는 물질(들)의 구조적 요건으로부터 미리 정해진다.
용어 "간격 분자"(distance molecule)는, 필요한 경우 하기 화학식 1 및 2에서 정의된 삼작용성 분지형 분자와 결합 단위체의 사이 및/또는 상기 스페이서와 삼작용성 분지형 분자 사이에 구조적 간격을 만드는 기능을 갖는 리간드내의 이작용성 분자를 의미한다. 상기 간격 분자는 고리의 형태로 존재할 수도 있다.
용어 "발열인자" 및 특히 "세균성 발열인자"는 일반적으로 세균 기원의 발열 물질, 예를 들어 내독소를 정의한다.
용어 "생체적합성"은 상기 기질을 사용하면 환자의 면역계의 활성화가 일어나지 않거나 또는 이러한 활성화가 일어나는 경우에도 작은 정도로만 일어난다는 점에서, 세포 활성화, 응고, 보체 케스케이드 또는 유사한 과정 등의 활성화 능력이 부족하거나 없는 것을 의미한다. 이는 생체적합성 화합물이나 물질을 사용하면, 혈액이나 기타 체액 등에서 성분 또는 과정의 원치않거나 바람직하지 않은 활성화가 일어나지 않는 외에도, 기계적인 손상 또는 스트레스-유도된 세포 사멸 또는 세포 용해가 일어나지 않는다는 것을 의미한다.
중합체 친화성 기질
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질을 다량의 물질을 충분히 결합 및 흡착하도록 다양하게 하기 위하여, 상기 리간드는 1-100 개의 작용기, 바람직하게는 1-32 개의 작용기를 포함하게 된다.
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질은 비이드, 겔형 구조, 멤브레인 또는 멤브레인의 일부분, 필름, 또는 그물, 또는 이들의 조합의 형태로 존재할 수 있다.
구체적으로, 상기 기질이 본 발명에 따라 제작되는 경우, 약 1x102 내지 1x106 달톤의 규정된 한계를 가질 수 있고 어떠한 제한이 없이 소수성 및 친수성 물질 모두에 결합할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 중합체 친화성 기질은 스페이서로서 PEG를 이용하는 PS-PEG 비이드(예, Rapp Polymers Tubingen으로부터 입수가능한 TentaGel®)의 형태로 존재한다. 스페이서로서 사용되는 PEG는 유기 및 수성 용매 모두에서 비이드의 팽윤이 양호하다는 장점이 있고, 준유체 특성으로 인해 유체와 유사한 확산 과정, 바람직하게는 물에 근접한 확산 계수(즉 40%)가 가능하다.
생체적합성
본 발명에 따라, 바람직한 형태로 존재하는 중합체 친화성 기질은 전체 혈액의 체외 처리와 같은 특별한 용도로 사용되는 때 높은 생체적합성을 나타낸다. 높은 생체적합성은 특정의 특징이 무엇보다도 중요하다는 것을 나타낸다. 예를 들어, Deppisch 등(Kidney Int. 37:696-706)에 따라 말단 보체 복합체(TCC 단백질)의 조기 착물 형성 및 정량분석에 의해 측정하였을 때 보체 활성화가 없는 것이 중요하다. 또한, 낮은 혈전형성 정도가 환자에게 바람직하다. 혈전형성의 정도는 Deppisch 등 (Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23, 1994)에 따라 트롬빈-안티트롬빈 III 복합체(TAT)의 정량분석에 의하여 측정되며, 혈액 또는 혈장 처리 동안 증가되어서는 안 된다. 또한, 처리 전후에 백혈구 및 적혈구의 혈구수가 일정하고 접촉상 활성화로 인한 세포 활성화가 없어야 한다. 일정한 혈구수는 단순한 스트레스, 활성화 또는 기계적 손상으로 인한 혈구 손상이 낮거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다.
예를 들어 활성화시에 과립구 또는 호중구에 의해 생성되는 엘라스타제와 같은 프로테아제는 세균성 패혈증 및 패혈성 쇼크 환자의 경우에는 증가한다(Heiden 등, Sem, Thromb. Hemost. 1996). 또한, 호중구 엘라스타제는 감염을 조기에 판단하기 위한 효과적인 마커로서 제안되고 있다(Jensen 등, Scand. J Clin. Lab. Invest, 1996; Groenenveld 등, Cytokine, 1995). 엘라스타제를 측정하면, 생체적합성에 관한 추가의 정보를 얻을 수 있고, 따라서 그 수준은 혈액 처리 동안에 변화해서는 안 된다.
리간드
내독소와 같은 제거하고자 하는 물질의 결합 모티프에 상보적인 리간드를 만들 수 있도록 하기 위하여는 삼차원 구조체를 형성하여야 한다. 이것은 필요한 삼차원 구조에 최적인 방법으로 용이하게 합성되는 유연하거나 단단한 폴리펩타이드 구조체를 이용하여 달성할 수 있다. 이러한 중합체는 나무형 또는 벌집형 구조의 선형 또는 분지형이거나 또는 고리형일 수 있다. 이러한 삼차원 구조를 형성하는데 이로운 것은 아미노산을 이용하는 것인데, 이는 상기 아미노산이 유연성을 제공하기 때문이다. 이러한 중합체, 예를 들어 폴리펩타이드를 커플링하기 위한 화학적 방법이 이 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이러한 중합체는 하나 이상의 아미노산, 일반적으로는 펩타이드 결합을 통해 일제히 결합된 약 100 개 이하의 아미노산, 즉 올리고머를 나타낸다. 선형 중합체의 예로는 이웃한 잔기들의 알파-카르복시기와 알파-아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 형성된 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드가 있다. 분지형 중합체의 예로는 하나 이상의 비-알파-아미노기를 포함하는 아미드 결합에 의해 형성된 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드가 있다.
전술한 바와 같이, 상기 리간드 분자는 고리 형태로 존재할 수 있다. 이러한 고리형 구조는 리간드 구조내의 두 개의 적절한 작용기들 사이의 공유 결합을 통해 형성될 수 있다. 예를 들어, 산화에 의한 시스테인의 두 SH 기들 사이의 디설파이드 결합(-S-S-)을 통해 형성될 수 있다(천연 단백질 구조에 존재하는 일반적인 고리화 반응).
도 2A 및 2B는 고형 지지체에 결합된 스페이서에 결합된 리간드의 나무형 및 벌집형 분지형 구조의 예를 도시한다. 이러한 구조에서, 상기 리간드는 근본적으로 리신 잔기로 구성되고, 각 리간드내의 결합 단위체는 아르기닌 잔기이다. 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질에 포함되는 리간드는 하기의 화학식들로 표시될 수 있다:
-X1 n-Ym[X2 i-Z1; X3 j-Z2]1/2(m+1)
나무형 구조를 나타내는 화학식 1에서, 상이한 부호들은 하기의 의미를 갖는다:
n= 0 또는 1;
m= 2k-1;
k= 0 내지 10(여기서, k=0 인 경우, X2=X3 및 Z1=Z2);
i= 0 또는 1, 및
j= 0 또는 1.
-(X1 n-Y1[Y2 m[X2 i-Z1 ; X3 j-Z2]1/2(m+1))r-X4 p -Z3
벌집형 구조를 나타내는 화학식 2에서, 상이한 부호들은 하기의 의미를 갖는다:
n= 0 또는 1;
m= 2k-1;
k= 0 내지 10(여기서, k=0 인 경우, X2=X3 및 Z1=Z2);
r= 1-100
i= 0 또는 1,
j= 0 또는 1, 및
p= 0 또는 1.
Z1, Z2 및 Z3는 각각 결합 단위체를 나타내는 것으로서, 각각 아미노산, 펩타이드, 지방산, 탄수화물, 렉틴, 뉴클레오티드, 이들의 유도체 및 조합으로 구성되는 군에서 선택된 유기 분자이고, Y, Y1 및 Y2는 각각 아미노, 히드록시, 알데히드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 티올, 말레이미도, 에폭시, 이들의 유도체 및 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 작용기를 함유하는 삼작용성 분지형 분자이고, X1, X2 및 X3는 각각 아미노, 카르복시, 히드록시, 알데히드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 티올, 말레이미도, 에폭시, 이들의 유도체 및 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 두 개의 작용기를 함유하는 임의적인 이작용성 간격 분자이다.
도 2C에는 고리형 리간드 구조를 갖는 중합체 친화성 기질들의 예가 도시되어 있다. 상기 구조식들에서, R은 -Lysm[Arg](m+1) (여기서, m=2k-1)를 의미하고, k=0, 1 및 2인 예들이 도시되어 있다.
따라서, 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질에서 리간드의 하나 이상의 결합 단위체는 하나 이상의 작용기, 바람직하게는 아미노기 또는 구아니딘기 또는 치환된 아미노기 또는 상기 작용기들중 하나 이상의 작용기를 함유한다.
바람직하게, 상기 아미노산은 생리학적 pH 또는 그 근처에서 양전하를 띠는 특성, 구체적으로는 7.2 이상의 혈액 pH에서 양전하를 띠는 특성, 즉 약 6.0 이상의 pK를 갖는 특성을 고려하여 선택된다. 이러한 바람직한 아미노산의 예로는 아르기닌(Arg), 리신(Lys) 및 히스티딘(His)이 있다. 또한, 상기 아미노산들의 혼합물도 상기 기질의 리간드에 사용될 수 있어서, 추가의 가변성을 제공한다.
더욱 바람직하게, 상기 리간드는 결합 단위체(들)로서 아르기닌을 포함하고, 기질 1 g당 3 mmol 이하의 양으로 사용된다. 일반적으로, 상기 아미노산의 양은 기질 1 g당 약 0.01-5 mmol 이상일 수 있다.
분지형 리간드의 결합 단위체가 아미노산 아르기닌을 포함하는 구체예에서, 리간드당 아르기닌 분자의 수는 2-100 개, 바람직하게는 4-8 개(Arg4-8로 표시함)이다. 또한, 삼작용성, 여기서는 리신과 같은 두 개의 아미노기 및 하나의 카르복시기를 함유하는 삼작용성 아미노산을 이용하여, 분지형 구조를 형성할 수 있다. 이른바 다중 항원 펩타이드(MAP)를 이용하는 이러한 방법은 Tam 등에 의해 소개되었고, 미합중국 특허 제 5,229,490호에서 기재되어 있다. 분지의 수를 변화시킴으로써, 말단기, 예를 들어 말단 양성 작용기를 포함하는 양으로 하전된 아르기닌의 밀집 및 거리를 도 2에 대하여 위에서 설명한 바와 같이 변화시킬 수 있다.
상기 중합체 친화성 기질을 이용하여 제거하고자 하는 물질이 내독소인 본 발명의 특별한 구체예에서, 상기 아미노산의 작용기의 양전하들은 도 3에서 도시한 바와 같이 내독소내의 개개의 음으로 하전된 인산기들 사이의 간격만큼 이격된 간격으로 유지된다.
전술한 바와 같이, 상기 아미노산의 양 및 형태에 따라 상기 중합체 친화성 기질내의 상보적 리간드가 다양하게 변화될 수 있고, 따라서 다량의 물질을 흡착하기에 충분한 다양성이 얻어질 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 아미노산의 양은 기질 1g 당 약 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4, 또는 5 mmol 이상이다.
결합 단위체(들)을 함유하는 리간드의 설계
물질에 상보적인 구조를 얻기 위하여, 실시예 1에서 설명되고 도 3 및 11에서 도시한 바와 같이, 구조, 특정의 간격으로 유지되는 양전하들의 존재, 하전된 기들에 근접한 위치에서 소수성 영역의 존재 사이의 상관관계를 연구하는 분야에서 알려져 있는 과정, 예를 들어 X-선 결정학, 단백질 서열 분석, 단백질 모델링 또는 소수성 또는 친수성 계산 과정으로부터 정보가 수집된다.
바람직한 구체예에서, 제거하고자 하는 물질은 지질 A를 함유하는 LPS와 같은 내독소이고, 구조 및 분자내의 하전된 인산기들 사이의 거리 등에 관하여 당업자에게 알려져 있는 정보를 이용하여 중합체 친화성 기질내에서 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드가 형성된다. 이 구체예에서 상기 리간드를 형성하는 중합체는 아미노산, 예를 들어 아르기닌 및/또는 리신을 이용하여 합성된다. 그러나, 히스티딘 또는 시스테인과 같은 다른 아미노산도 사용될 수 있다.
제거하고자 하는 물질, 예를 들어 내독소의 결합 모티프에 상보적인 부분으로서 본 발명의 Arg4-8 구체예에서, 결합 단위체인 상기 아르기닌은 도 3에서 도시한 바와 같이 내독소의 제거를 위하여 하기의 특성을 갖는다:
a) 지질 A에서 음으로 하전된 인산기의 간격과 최적으로 일치하는 간격으로 유지되는 양전하가 존재하고,
b) 지질 A의 지방산 부분과의 소수성 상호작용이 가능하도록 하전된 기에 인접하여 소수성 영역이 존재하고,
c) 상기 a) 및 b)의 특성들이 조합되어 최적의 결합이 가능한 지질 A에 상보적인 구조가 얻어진다.
스페이서
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질은 고형 지지체의 일부가 된다는 점에서 고형 지지체를 개질시키는, 실질적으로 소수성이거나 또는 친수성인 스페이서를 포함한다. 상기 스페이서는 하나 이상으 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 포함하는 리간드의 앵커링 부분으로서 작용한다.
바람직하게는, 400-10000 달톤의 바람직한 분자량을 갖는 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 스페이서 분자로 이용되고, 화학식 H-(OCH2CH2)n-OH (식중, n은 약 2-250을 나타냄)으로 표시된다. PEG 사슬의 유연성으로 인하여 리간드 중합체의 삼차원 구조내로 독소 분자의 양호한 접근이 가능하게 된다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 고형 지지체는 동일 또는 상이한 종류, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 아민, 폴리글리시돌, 폴리에틸렌이민 또는 이들의 유도체의 둘 이상의 스페이서를 구비할 수 있다.
대안적으로, 예를 들어 결합시키려는 물질(들)의 상보적인 결합 모티프의 삼차원 구조가 결합용 스페이서가 없어도 가능한 경우에는 중합체 친화성 기질에서 스페이서의 존재가 불필요하다. 따라서, 본 발명의 이러한 구체예에 따라 결합 단위체는 상기 고형 지지체에 직접 결합된다.
고형 지지체
고형 지지체는 다공성 및 크기 배제 특성에 있어서 다양성을 제공하여야 한다. 또한, 상기 고형 지지체는 바람직한 구체예에서 폴리펩타이드의 고상 합성을 위한 지지체로서 이용된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 여러가지 고형 지지체, 즉 중합체가 EP 0 187 391호, WO 99/17120호, 및 미합중국 특허 4,908,405호에 기재되어 있다. 여기서, 상기 고형 지지체는 0.05-10%의 가교도를 갖는 선형 및/또는 분지형의 생체적합성 그라프트 공중합체이며, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시스티렌, 클로로메틸화된 폴리스티렌 및 에틸렌 글리콜로부터 생성된 중합체, 화학식 H-(OCH2CH2)n-OH(식중, n은 2 내지 250을 나타냄)의 폴리- 또는 올리고에틸렌 글리콜, 히드록시 작용기를 갖는 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트, 및 이들의 유도체로 구성되는 군에서 선택된다. 본 발명에 있어서, 상기 가교도는 50% 이하일 수 있다.
고형 지지체 재료는 상기 언급한 것들 외에도, 폴리스티렌, 히드록시알킬-폴리스티렌, 히드록시아릴-폴리스티렌, 히드록시알킬-아릴-폴리스티렌, 폴리히드록시알킬화된 폴리스티렌, 폴리히드록시아릴화된 폴리스티렌, 이소시아네이토알킬-폴리스티렌, 이소시아네이토아릴-폴리스티렌, 카르복시알킬-폴리스티렌, 카르복시아릴-폴리스티렌, 아미노알킬-폴리스티렌, 아미노아릴-폴리스티렌, 가교된 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스, 실리카, 탄수화물, 라텍스, 시클로-올레핀 공중합체, 글래스, 기타 적당한 중합체 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된다. 상기 고형 지지체는 비이드, 멤브레인, 입자, 예를 들어 나노입자, 그물, 직포 및 부직포, 섬유 매트, 튜브, 필름, 호일, 또는 이들의 조합, 또는 가교된 상호침투형 망상구조의 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 전술한 친화성 기질은 PEG가 스페이서로서 그라프트되는 가교된 폴리스티렌으로 구성된다.
본 발명의 바람직한 고형 지지체는 리신 및/또는 아르기닌이 부착되는 스페이서인 PEG와의 조합으로 아주 관류가능하고 생체적합성인 지지체, 예를 들어 폴리스티렌을 제공하기에 충분한 크기를 갖는 비이드이다. 상업적으로 이용가능한 적당한 비이드의 목록이 하기 표 1에서 보여진다.
상업적으로 이용가능한 활성화된 비이드a
Toyo Pearl HW70EC® (TosoHass)
Toyo Pearl HW65EC® (TosoHass)
Toyo Pearl AF650M® (TosoHass)
TentaGel® (Rapp Polymer)
Eupergit C250L® (Rohm)
Eupergit 250® (Rohm)
Fractogel EMD Epoxy® (M) (Merck)
Fractogel EMD Azlactone® (S) (Merck)
Poros EP® (Perlin Elmer-Biosystems)
a: 상기의 상업적으로 입수가능한 활성화된 비이드는 리간드의 고정을 위해 조절될 수 있다.
중합체 친화성 기질의 관류성
중합체 친화성 기질이 수화되는 경우 히드로겔형 구조가 형성되어 수화로 인해 팽윤한다. 상기 팽윤성은 중합체의 수화로 인해 건조 상태로부터 팽윤하여 수화된 겔형 지질을 형성하는 능력으로 정의된다, 이러한 팽윤은 수화시의 단위 체적당 중량의 증가로 정의되고 본 발명에 따른 팽윤은 중합체 친화성 기질의 건조한 형태 및 수화 형태를 비교해 보면, 약 1.5-10 배, 바람직하게는 3-5 배일 수 있다. 이러한 팽윤성으로 인해 전체 혈액이 기질을 통해 완전히 관류되면서도 혈액 세포 및 세포수가 그대로 유지된다.
전술한 바와 같이, 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 친화성 기질은 그 자체가 약 1x102-1x106 달톤의 규정된 한계를 갖는 기질을 생성함으로써 친수성 및/또는 소수성 물질의 확산에 거의 제한이 없이 혈액 세포가 관류될 수 있다.
물질을 제거하기 위한 방법
또한 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하고 및/또는 상기 유체에서 그 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 상기 유체 중의 성분 또는 과정의 바람직하지 않은 불활성화를 예방, 제거 또는 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 물질(들)의 양 또는 농도를 감소시키고 및/또는 그 물질을 제거하기에 충분한 시간 동안 상기 유체를 본 발명의 중합체 친화성 기질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법을 이용하는 바람직한 구체예에서, 혈액이나 어떠한 다른 체액으로부터 내독소와 같은 물질을 제거하면 전술한 "물질(들)"의 정의에서 언급한 바람직하지 않은 물질들의 활성화가 직접 또는 간접적으로 방지된다. 바람직하게 이것은 상기 유체를 전술한 중합체 친화성 기질과 24 시간 이하, 가장 바람직하게는 1 초 내지 2 시간동안 접촉시켜서 혈액이나 이의 성분들을 덜 불활성화하거나 또는 활성화를 방지함으로써 달성된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 제거하고자 하는 물질은 내독소이다. 또한, 본 발명은 백혈구, 예를 들어 T 및 B 세포, 단핵세포, 혈소판, 과립구, 및/또는 호중구로부터 선택된 규정된 혈액 세포 유형 또는 개체군의 제거에 관한 것이다. 또한 전술한 중합체 친화성 기질을 이용하여 제거하고자 하는 물질로는 세포외 또는 세포내 신호 전달 경로의 성분으로서 글루코스 및 이의 분해 생성물, 카르보닐 화합물, 염증성 및 전염증성 단백질 및/또는 혈전형성 또는 보체 캐스케이드에 관여하는 단백질, 세균 유래의 성분, 내독소, 세포, 혈액 세포, 세균 및 바이러스, 또는 병원균 적재 혈액 세포, 또는 이들의 최소한 일부분 또는 분해 생성물, DNA 또는 이의 단편, 또는 인산염으로 구성되는 군에서 선택되는 성분이 있는데, 이러한 제거는 하나 이상의 결합 단위체를 포함하고 상기 물질의 결합 모티프의 구조에 상보적인 구조를 갖는 리간드를 제공함으로써 달성된다.
이러한 바람직한 구체예에서, 내독소(예, LPS)는 예를 들어 정치 배양 또는 고체상 컬럼의 관류 동안에 두 시간에 걸쳐서 50% 미만이 제거된다.
이러한 바람직한 구체예에서, 상기 내독소는 후술하는 LAL 분석에 따라 측정하였을 때 혈액을 불활성화하거나 혈액의 활성화를 방지하는 양 또는 농도까지 1 초 내지 2 시간 동안에 제거된다. LAL 분석을 이용하는 것은 당업계에서 알려져 있으며 내독소 수준에 관한 정보를 제공한다. 신속하고 효율적인 본 발명에 따른 방법은 LAL 분석에 따라 측정하였을 때, 1초 내지 2 시간 동안에 내독소의 수준을 혈액을 활성화하는 능력 아래로 감소시키거나 또는 혈액 새포 및 성분들을 단지 작은 정도로만 활성화한다.
중합체 친화성 기질의 제조 방법
본 발명에 따른 중합체 친화성 기질을 제조하는 방법은
a) 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계와,
b) 상기 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체 를 함유하는 리간드를 부착하는 단계를 포함하거나,
c) 상기 스페이서에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하여 제 2 복합체를 얻는 단계와,
d) 상기 고형 지지체에 상기 제 2 복합체를 부착하는 단계를 포함하거나,
e) 상기 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계와.
f) 상기 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하거나,
g) 상기 고형 지지체상에 단량체를 직접 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계와,
h) 상기 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하는 단계를 포함하거나,
i) 상기 고형 지지체상에 직접 단량체를 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계와,
k) 상기 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하고,
결합시키려는 물질(들)상의 결합 모티프의 삼차원 구조, 전하의 존재, 및 소수성/친수성 영역에 관한 정보가 X-선 결정학, 단백질 서열분석, 단백질 모델링 또는 소수성 및 친수성 계산에 의하여 수집되고 상기 결합 단위체를 함유하는 리간드는 전하 및/또는 친수성/소수성에 대해 상기 물질들의 결합 모티프에 상보적이게 되는 중합체 친화성 기질의 제조 방법에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 전술한 방법은 도 4에서 더욱 상세하게 도시한 바와 같이 하기의 방법들중 어느 한 방법에 따라 고형 지지체상에 고정된 리간드를 포함하는 스페이서 분자를 갖는 기질을 제조하는 것을 포함한다:
상기 단계 a) 및 b)의 경우, 상기 고형 지지체를 활성화하고, 상기 고형 지지체상에 스페이서 분자를 커플링하고, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 합성하고, 상기 스페이서에 상기 리간드를 부위 특이적으로 커플링하거나, 또는
상기 단계 c) 및 d)의 경우, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 합성하고, 상기 리간드에 스페이서 분자를 커플링하고, 상기 고형 지지체를 활성화하고, 상기 활성화된 고형 지지체에 상기 스페이서-리간드 복합체를 부위 특이적으로 커플링하거나,
상기 단계 e) 및 f)의 경우, 고형 지지체를 활성화하고, 상기 활성화된 고형 지지체에 스페이서 분자를 커플링하고, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 상기 지지체상에 고상 합성한다.
또한, 제 2 구체예에서, 전술한 단계 a)-f)를 포함하는 방법은 하기의 구체적인 단계들을 포함한다:
단계 a) 및 b)의 경우, 스페이서를 활성화하고, 상기 활성화된 스페이서를 고형 지지체에 커플링하고, 상기 활성화된 스페이서에 리간드를 결합하거나,
단계 c) 및 d)의 경우, 리간드를 합성하고, 스페이서를 활성화하고, 상기 활성화된 스페이서 분자에 상기 리간드를 부위 특이적으로 커플링하고, 상기 스페이서-리간드 복합체를 고형 지지체에 커플링하거나,
단계 e) 및 f)의 경우, 스페이서를 활성화하고, 상기 활성화된 스페이서를 고형 지지체에 커플링하고, 상기 고형 지지체에 결합된 스페이서상에 리간드를 고상 합성한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 방법에 있어서, 상기 고형 지지체, 스페이서 및 리간드는 고형 지지체를 활성화하고, 스페이서 분자를 커플링하고, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 고형 지지체상에 직접 고상 합성함으로써 고정된다.
중합체 친화성 기질의 용도
또한, 본 발명은 유체, 바람직하게는 체액이나 치료용 유체, 가장 바람직하게는 혈액으로부터 하나 이상의 물질, 바람직하게는 내독소를 제거하거나 또는 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시켜서 특히 덜 활성화된 혈액을 생성하거나 혈액에서 성분이나 과정의 바람직하지 않은 활성화를 방지하는데 사용하기 위한 본 발명의 중합체 친화성 기질의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 중합체 친화성 기질은 체외 혈액 정제 과정의 일부로서 사용되거나 또는 혈액이나 혈류와 접촉 상태로 사용되는데, 예를들어 혈액이나 어떠한 다른 체액과 접촉하도록 체내, 예를 들어 맥관계(vascular system), 혈관 또는 복강내에서 임플란트로서 사용된다.
중합체 친화성 기질을 포함하는 키트
하나의 구체예에서, 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하고 및/또는 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시킴으로써 상기 유체 중에서 성분들의 바람직하지 않은 활성화를 방지, 제거 또는 감소시키기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질과, 샘플 튜브와, 상기 유체, 바람직하게는 혈액이나 혈청의 체외 또는 체내 처리를 위한 기구를 포함한다.
결론
본 발명은 아주 효율적이고 시간 절약적인 방법으로 유체로부터 물질을 제거하기 위한 수단을 제공한다. 이것은 아주 생체적합성이 있고 우수한 팽윤성으로 인해 전체 혈액을 유동시키는 것이 가능한 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질의 사용을 통해서 달성된다. 또한, 이러한 효율적인 수단은 제거하고자 하는 물질의 결합 모티프에 상보적인 결합 단위체를 포함하는 리간드의 형성에 의하여 달성된다. 따라서, 본 발명은 치료용 약물, 줄기 세포 요법 및/또는 치료 세포 요법 및 진단용 약물의 투석 및 주입과 같은 체외 혈액 처리, 생물 공학, 생명 공학, 유전자 공학, 식품 화학 및 수제조 및/또는 수정제 등에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하거나 상기 유체에서 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질용 중합체 기질의 용도에 관한 것으로, 상기 특이적 친화성은 고형 지지체 및 스페이서를 포함하는 중합체 기질상에 적용되는 리간드의 종류에 따라 좌우되고, 상기 고형 지지체는 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시스티렌, 클로로메틸화된 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트로부터 생성된 중합체, 히드록시 작용기를 갖는 폴리메타크릴레이트, 히드록시알킬-폴리스티렌, 히드록시아릴-폴리스티렌, 히드록시알킬-아릴-폴리스티렌, 폴리히드록시알킬화된 폴리스티렌, 폴리히드록시아릴화된 폴리스티렌, 이소시아네이토알킬-폴리스티렌, 이소시아네이토아릴-폴리스티렌, 카르복시알킬-폴리스티렌, 카르복시아릴-폴리스티렌, 아미노알킬-폴리스티렌, 아미노아릴-폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 가교된 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 실리카, 탄수화물, 라텍스, 시클로-올레핀 공중합체, 글래스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 재료로 이루어지고, 바람직하게는 가교된 폴리스티렌으로 이루어지고, 상기 스페이서는 화학식 H-(OCH2CH2)n-OH(식중, n은 2-250을 나타냄)의 폴리- 또는 올리고에틸렌 글리콜로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 고형 지지체는 비이드, 겔, 멤브레인, 입자, 그물, 직포 또는 부직포, 섬유 매트, 튜브, 필름, 호일 또는 이들의 조합 또는 가교된 상호침투형 망상구조의 형태를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현에에서, 상기 스페이서는 선형 및/또는 분지형의 400-10000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 중합체 기질은 혈장 또는 전체 혈액을 관류시키기에 충분한 팽윤량(swelling capacity)을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 기질의 팽윤량은 수화된 형태가 건조 상태의 약 1.5-20 배, 바람직하게는 2-6 배이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 기질은 겔형 비이드의 형태를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 유체는 수용액 또는 유기 용 액, 체액, 바람직하게는 혈액, 치료용 유체, 생명과학용 유체, 바람직하게는 생물학용, 진단용 또는 생물공학용 완충액, 주입액 또는 투석액, 건강한 기증자로부터 얻은 혈액 산물, 예를 들어 혈장, 혈소판 농축물, 적혈구 농축물, 바람직하게는 산소 담체, 개질 헤모글로빈 용액 및 인공 헤모글로빈 용액, 영양용 유체 및 공업용 유체이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 중합체 기질은 약 1x102 내지 1x106 달톤의 한계값을 가지며 소수성 및/또는 친수성 물질에 결합한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 고형 지지체는 가교된 폴리스티렌이고, 상기 스페이서는 폴리에틸렌 글리콜이다.
체외 혈액 처리에 적용할 수 있는 특별한 결합 구조의 적합한 개발을 위하여는 하기의 것들이 필요하다: (i) 리간드를 결합하기 위한 유연한 기술, 및 (ii) 생체적합성, 독물학 및 가공성에 관한 기본적 요건. 고상 펩타이드 합성을 적용하면, 생체적합성 중합체 물질에 조립된 잘 규정된 리간드 구조가 얻어지는데, 상기 중합체 물질은 본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따라, 생물학적 물질에 특이적인 폴리스티렌-폴리에틸렌 글리콜 그라프트 공중합체이다.
리간드 모티프의 기하학적 구조를 변화시킴으로써 본 발명자들은 리간드 친화성이 상기 빌딩 블록의 몰농도에 대하여 10 내지 100 배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 검사는 사람의 혈청중에서, 즉 경쟁 단백질의 존재하에서 수행되었다.
혈액 적합성의 평가를 사람의 혈장 및/또는 전체 혈액에서 시험관내 분석을 통해 수행하였다. 리간드가 있거나 없는 PS-PEG계 물질은 보체 활성화, 접촉상 활성화, 세포독성 및 과립구 활성화에 대해서 생체적합성이 있다.
상기 기저 중합체 구조는 체외용으로 특히 유리한 생체적합성 프로필을 나타낸다. 리간드의 합성에 적용되는 적용되는 기술은 독성 잔기를 발생하지 않고 특정의 중합체 물질의 처리를 가능하게 한다.
실시예 1
LPS에 대한 결합 단위체를 함유하는 리간드의 설계
실시예는 본 발명을 제한하지 않고, LPS의 제거를 위한 결합 단위체를 함유하는 리간드의 설계를 설명한다.
원리
LPS와 같은 독소의 효과적인 제거를 위하여는, 제거하고자 하는 물질의 결합 모티프에 상보적인 결합 단위체를 갖는 리간드가 필요하다. 여기에는 제거하고자 하는 물질의 삼차원 구조 및 분자들의 정밀한 배열이 포함됨으로써 상보적인 전하, 소수성 및 친수성 등의 특성에 관한 생물특이적 인식이 최적화된다. 이로써 전술한 특성들을 고려하면서 결합 단위체를 갖는 리간드가 얻어진다. 또한, 중합체 기질내에서 이러한 리간드의 전체 삼차원 구조는 높은 관류율, 리간드 제공 및 리간드의 유연성을 고려하여 최적화되어야 한다. 또한, 높은 생체적합성이 환자의 생체내 또는 생체외 혈액 정제를 위한 전제가 된다. 전술한 기질에 있어서, 그 접근성은 고상이 아닌 수용액에 필적하거나 또는 아주 동일하다. LPS의 구조가 도 1에서 도시되어 있다. LPS에 상보적인 결합이 도 3A 내지 3D에서 도시되어 있는데, LPS의 인산기 및 소수성 테일이 상보적인 결합 모티프를 형성하는 것으로 간주된다. 제안된 구조는 도 2에서는 Arg4 및 Arg8로서 도시되고 도 11에서는 삼차원 구조로서 도시되어 있다. Arg8은 도 11B의 좌측의 아르기닌 위치의 절반 및 우측의 아르기닌 위치의 절반을 나타낸다. 또한, 스페이서(PEG)에 대한 결합이 도시되어 있다.
분자 시뮬레이션
분자 시뮬레이션을 이용하여, 전술한 결합 부위의 3차원적 형태 및 화학적 구조를 확인하였다. 이러한 시뮬레이션을 Insight II-Package (Molecular Simulations Inc. (MSI), San Diego (CA)) 및 여기에 포함된 최적화 알고리즘, 예를 들어 AMBER-forcefields를 이용하여 Silicon Graphics Octane2 Workstation 상에서 실시하였다. Arg4 및 Arg8에 대한 삼차원 배열의 결과를 도 11A 및 도 11B에서 각각 도시하였다. 여기서는 PEG 스페이서 및 고형 지지체가 없는 기질의 삼차원 말단 부분의 원리가 도시되어 있다.
리간드의 합성
세 가지의 상이한 방법을 예시하는 도 4의 방법에 따라 결합 단위체를 갖는 리간드를 합성하였다. 상기 세가지 방법들중 바람직한 방법은 고형 지지체에 부착된 PEG 스페이서 상에 직접 고상 합성하는 것이다. 상기 결합 단위체는 하기의 실시예들에서 사용된다.
실시예 2
분지형 및 선형 리간드의 비교
이 실시예는 사람의 혈장으로부터 내독소 LPS의 흡착을 설명한다. 또한, 이 실시예는 상기 내독소의 흡착을 위한 선형 리간드와 분지형 리간드 사이의 비교를 보여준다.
비이드를 헤파리처리된 사람 혈청과 함께 2 시간 동안 배양하였다. 2 시간 배양후 LAL 분석을 이용하여 내독소 수준을 측정하였다.
물질
하기의 비이드를 이용하였다:
PS-PEG-LBP 94-108 LBP로부터의 내독소 결합 서열(선형)
PS-PEG-BPI 85-99 BPI로부터의 내독소 결합 서열(선형)
PS-PEG-Arg8 아르기닌을함유하는 8배 분지형
PS-PEG-NH-Ac 대조군으로서 아세틸화 베이스 물질
비이드 없음 대조군
절차
헤파린처리된 혈장에서 비이드의 배양을 37 ℃로 실시하였다. 샘플을 서서히 교반하고 2 시간 배양후 비이드를 원심분리로 제거하였다.
분석
LAL 분석을 실시하여 비이드와 함께 배양후의 내독소의 수준을 정량분석하였다. 상기 분석을 LAL 유도 색원 물질 반응(Cheomogenics, Molndal, Sweden)을 이용하여 실시하였다. 헤파린처리된 사람 혈장에서 내독소의 농도에 따라 얻은 기준 곡선에 따라 내독소 수준을 계산하였다.
결과
2 시간 배양후 LAL 분석을 이용하여 하기의 내독소 농도룰 확인하였다.
내독소 (IU)/ml
PS-PEG-LBP 94-108 10
PS-PEG-BPI 85-99 9
PS-PEG-Arg8 2
PS-PEG-NH-Ac 10
비이드 없음 8
출발값 10
검토
이 실험은 PS-PEG-비이드에 분지형 삼차원 기질을 이용함으로써 내독소 수준이 5배 감소될 수 있었음을 나타낸다. 선형 리간드를 갖는 비이드는 효율적이지 않았고 상기 샘플내의 내독소 수준은 출발 수준과 동일하거나 유사하였다.
실시예 3
내독소 결합의 동적 특성
이 실시예에서는, LPS 결합을 위하여 최적화되는 삼차원 기질을 갖는 비이드가 혈장과 함께 배양되고 여러가지 시점에서 분석되는 때 얻어지는 내독소 특성의 동적 특성을 나타낸다.
원리
흡수의 동적 특성은 중합체 기질의 구조 및 가교도에 좌우된다. 비이드를 헤파리처리된 인간 혈청과 함께 배양하였다. 1, 10 및 120분 후, 샘플을 회수하였다. LAL 분석을 이용하여 내독소 수준을 측정하였다.
재료
하기의 비이드를 이용하였다:
PS-PEG-Arg8 아르기닌을 함유하는 8배 분지형
PS-PEG-Arg4 아르기닌을 함유하는 4배 분지형
PS-PEG-Arg 아르기닌을 함유하는 선형
PS-PEG-NH-Ac 아세틸화된 베이스 물질(기준)
절차
헤파리처리된 혈장에서 비이드의 배양을 37 ℃에서 실시하였다. 샘플을 서서히 교반하고 1, 10 및 120분 배양후 샘플을 회수하였다. 비이드를 원심분리로 제거하였다.
분석
LAL 분석을 실시하여 실시예 2에서와 같이 내독소 수준을 정량하였다.
결과
도 5는 여러가지 시점에서 측정한 내독소 수준의 결과를 도시한 것이다. 이 도면에서는 효율적인 제거, 즉 샘플중의 출발 내독소 수준의 20-30% 수준에 달하는 잔류를 위하여는 2 시간이 필요하다는 것을 나타내었다. 아르기닌을 함유하는 선형 리간드(PS-PEG-Arg)는 내독소량의 절반, 즉 120분후 60%의 수준이 잔류하였다. 유사하게, 기준 비이드(PEG-NH-Ac)가 첨가되는 경우, 배양후 내독소의 양은 120분후 변화되지 않았다. 즉, 여전히 출발 수준이었다.
실시예 4
중합체의 말단 아미노산 및 분지의 영향
이 실시예는 말단 아미노산의 영향 (아르기닌 대 리신) 및 리간드의 분지, 비분지, 4배 분지 및 8배 분지의 영향을 나타낸다.
원리
비이드를 내독소가 있거나 없는 헤파린처리된 인간 혈청과 함께 배양하였다. 두 시간후 LAL 분석을 이용하여 내독소 수준을 측정하였다.
재료
하기의 비이드를 사용하였다:
PS-PEG-Arg8 아르기닌을 함유하는 8배 분지형
PS-PEG-Lys8 리신을 함유하는 8배 분지형
PS-PEG-Arg4 아르기닌을 함유하는 4배 분지형
PS-PEG-Lys4 리신을 함유하는 4배 분지형
PS-PEG-NH-Ac 아세틸화 베이스 물질
PS-PEG-Arg 아르기닌을 함유하는 선형
비이드없음 대조군
분석
LAL 분석을 실시예 2에서와 같이 실시하였다.
결과
내독소 (IU/ml)
PS-PEG-Arg8 0.4
PS-PEG-Lys8 1.8
PS-PEG-Arg4 0.01
PS-PEG-Lys4 2.7
PS-PEG-NH-Ac 7.8
PS-PEG-Arg 3.5
비이드없음 11
배양전, 즉 출발값 13
검토
상기의 결과는 분지형 리간드가 선형 형태보다 더욱 효과적이고, 아르기닌이 내독소의 제거에 있어서 리신보다 몇 배(Arg8 및 Arg4의 경우 각각 4배 및 200 배)더 효과적이라는 것을 나타내었다. 또한, PS-PEG-Arg4는 2 시간후 내독소 제거 효과가 가장 효과적이었다.
실시예 5
CD14 + 단핵세포에서 내독소 의존성 IL6 유발의 감소
이 실시예는 PS-PEG-Arg8을 이용하여 사람의 단핵세포에서 내독소 의존성 IL6 유발을 감소시키는 것을 설명한다.
원리
LPS에 반응하여, 단핵세포는 IL6를 전사 및 발현하기 시작하였다. 4 시간후 세포내 유세포 분석법(FACS)을 이용하여 상향조절 IL6의 수준을 측정할 수 있었다.
물질
전체 혈액 유래의 인간 단핵세포를 이용하였다. PS-PEG-Arg8을 내독소의 제거에 이용하고 PEG-NH-Ac를 대조군으로 사용하였다. 당지질(Biowittaker Co로부터 입수한 대장균 균주 055:B5)를 MNC의 시험관내 자극에 사용하였다. FACSCAN Calibur(Beckton Dickinson®)을 이용하여 FACS 분석을 실시하였다.
절차
전체 혈액을 10 또는 30 IU/ml LPS와 함께 37 ℃(5% CO2)로 30 분간 배양하였다. 샘플들을 PS-PEG-Arg8 비이드의 존재 및 부재하에서 그리고 대조군 비이드 PS-PEG-NH-Ac와 함께 배양하였다. 상기 세포를 PermFix(Beckton Dicknson®)에 고정하고 이중 염색을 항-CD14-FITC 및 항-IL6-PE를 이용하여 실시하였다. 세포 샘플당 20000개 세포를 FACS 분석을 위하여 계수하였다. CD14+ 세포로서 정의되는 단핵세포는 일반적으로 전체 세포 개체군의 약 5%를 구성한다.
분석
단핵 세포를 세포 현탁액에서 CD14+ 세포로 정의하였다. 세포내 IL6(icIL16)을 내부 기준에 대하여 검정하고 10 또는 30 IU/ml LPS와 함께 30분간 배양한 후 FACS 분석을 이용하여 CD14+ 세포 개체군에서 정량하였다. CellQuest Software Package (Beckton Dickinson®)을 이용하여 계산을 실시하였다.
결과
FACS 데이터 및 이로부터 실시한 계산을 이용하여, CD14+ 단핵 세포 개체군의 분석을 실시하여, 도 6에서 도시한 데이터를 얻었다. 도 6에서 도시한 바와 같이, PS-PEG-Arg8 비이드를 이용할때 내독소 수준이 대조군 비이드(PS-PEG-NH-Ac)를 이용한 샘플 및 비이드가 없는 샘플과 비교하여 70% 감소하였다. IL6의 세포내 수준이 히스토그램으로 도시되었다. 우측에서는 PS-PEG-Arg8 비이드와 함께 배양후 IL6 수준이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 좌측 아래에서는 새로운 세포에서 세포내 IL6가 없다는 것을 볼 수 있었다.
검토
이 실험에서는, 단핵세포에서 LPS 의존성 IL6 상향조절의 억제에 의하여 인간 CD14+ 단핵세포 개체군에서 LPS 자극이 신속하고 완전히 억제되는 것을 보여준다.
실시예 6
전체 혈액 관류후 세포수
이 실시예는 본 발명을 제한하지 않고, 비이드상의 중합체 친화성 기질을 통한 관류후 혈액 세포의 침투를 보여준다.
원리
혈액 정제에는 세포 손상 또는 세포의 활성화가 초래되지 않는다. 특히 적혈구의 기계적인 손상은 용혈후 생명을 위협하는 합병증을 초래한다. 놀랍게도 본 발명에 따른 히드로겔형 중합체 기질을 통해서 전체 혈액 세포가 관류될 수 있다.
재료
고도로 팽윤성이 있는 중합체 기질인 PS-PEG-Arg8 비이드를 사용하였다. ID가 20 mm인 컬럼에 1 g의 기질을 채우면서 4-5 ml의 물을 흡수시킨 후 사용에 앞서 생리적 식염수로 미리 세정하였다. 이후 컬럼을 전체 혈액의 관류에 이용한다.
절차
구연산염 및 LPS(30 IU/ml)를 함유하는 새로운 전체 혈액을 살균 장치를 이용하여 층류로 컬럼을 통해 관류시켰다. LPS- 스파이크 전체 혈액을 37 ℃로 5 ml/min의 속도로 관류하였다. 관류 전후에 혈액 샘플을 채취한 다음 분석하였다. 분석된 세포는 적혈구(RBC), 헤마토크릿(HTC) 및 유리 헤모글로빈, 백혈구(WBC), 혈소판 및 혈소판수(TRC) 이다.
컬럼 관류 전후에 Coulter Counter® (Beckton Dickinson)을 이용하여 세포 수를 계수하였다.
적혈구의 완전한 용해후 전체 헤모글로빈 수준으로서 유리 헤모글로빈을 측정한 다음 405 nm에서 광도계로 정량하였다. 405 nm에서 광도계 정량에 의해 혈장중 유리 헤모글로빈을 측정하여 전체 혈액 관류후 적혈구의 보존을 확인하였다.
결과 및 검토
세포수 및 HCT를 측정하여 그 결과를 도 7A(혈소판), 도 7B(HCT), 도 7C(RBC), 및 도 7D(WBC)에 도시하였다. 또한, 유리 헤모글로빈의 증가가 확인되지 않았다. 즉, 용혈이 발생되지 않았다(결과 미도시). 이 실험의 데이터는 초기 희석 효과에 따른 초기의 일시적인 체류 시간후, 세포수가 전-컬럼 값으로 안정하다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 전컬럼 세포수와 후컬럼 세포수가 동일하므로 약 100%의 기질의 투과를 나타낸다. 또한, 생존 세포수 및 적혈구 용해에 의해 측정한 것으로 세포수는 그대로 유지된다.
실시예 7
생체적합성
이 실시예는 PS-PEG-Arg8 기질의 생체적합성 프로필을 설명한다.
원리
생체적합성 또는 비적합성은 보체 활성화, 엘라스타제 방출, 및 트롬빈-안티트롬빈 III 복합체 형성에 따른 혈전형성으로서 측정된다.
물질
실시예 6에서와 같이, 셀룰로오스 물질을 기준 물질로 이용하였다.
방법
특이적 효소결합 면역측정법(ELISA; Diagnostic Product Co.)을 이용하여 전체 혈액 관류시의 혈장중의 엘라스타제를 측정하였다.
Deppisch 등(Kidney Int. 37:696-706)의 방법에 따라 말단 보체 복합체(TCC 단백질)을 정량하여 보체 활성화를 측정하였다.
혈전형성 정도인 TAT를 Deppisch 등(Neuphrol. Dial. Transplant Supl. 3:17-23, 1994)의 방법에 따라 측정하였다.
도 8은 시간에 따른 TCC의 형성을 도시한 것이다. 기준 비이드인 PS-PEG-NH-Ac (TG 베이스 또는 기준 물질)은 TCC 형성의 4-5 배 증가를 나타낸다. PS-PEG-Arg8의 경우 10-15분간 초기 세정후 TCC 수준은 관류전 수준으로 안정하다.
도 9는 시간에 따라 측정한 엘라스타제의 수준을 도시한 것이다. 상기 수준은 전-컬럼의 값과 비교하여 변화되지 않는다. 35 분에 걸친 측정치가 도시된다. 기준 물질의 경우 엘라스타제 수준은 35 분에 걸쳐서 8-9배 증가한다.
도 10에서는 TAT의 형성이 도시되어 있다. TAT 형성의 증가가 관찰되지 않는다.
검토
생체적합성은 생체내 및 생체외 혈액 처리, 예를 들어 투석시에 중요한 것이다. 상기의 기질은 기준 물질과 비교하여 보체계의 활성화, 응고계의 활성화 및 엘리스타제 방출을 나타내지 않는다. 즉, 높은 생체적합성을 나타낸다. 이는 실시예 6에서 나타낸 전체 혈액의 높은 관류율과 함께, 본 발명에 따른 중합체 친화성 기질이 전체 혈액을 포함하는 혈액의 체외 처리에 아주 적당하다는 것을 나타낸다.
실시예 8
내독소 흡착 실험
내독소 결합용 리간드를 구성하는 작용기(즉, 아르기닌 잔기)의 기하학적으로 규정된 특정 배열을 확인하는 것이 중요하다는 것을 나타내기 위하여 내독소 흡착 실험을 실시하였다. 내독소 결합은 아르기닌(즉, 양전하)의 양에 직접적으로 의존하지 않지만 규정된 기하학적 배열이 더욱 중요한 것으로 확인된다.
절차
혈액이나 혈장 등과 같은 대표적인 인간 체액인 인간 혈청에 규정된 양의 내독소(즉, 3 IU/ml 및 10 EU/ml)를 스파이킹하고 리간드로서 Arg8 또는 Arg4 배열을 함유하는 40 mg의 PS-PEG-비이드와 함께 배양하였다. 상기 두 종류의 비이드/리간드 배열은 상이한 양의 아르기닌을 함유하였다: 즉, Arg4는 0.72 mmol/g을 함유하고 Arg8은 1.89 mmol/g을 함유하였다. 상기 Arg8 비이드의 아르기닌 함량이 더욱 높은 것은 리신 분기에 의한 추가의 분지화 때문이다. 30분 배양후, 내독소의 유리(즉, 표면이나 기질에 결합되지 않은) 농도를 상층 혈청에서 LAL 테스트에 의해 측정하였다.
분석
인간 혈청을 이용한 배양 실험의 결과
배양전의 스파이킹 혈청 0 3 10 EU/ml
30분 배양후의 혈청 비이드없음 0 3 9.1 EU/ml
PS-PEG-Arg4 0 1.5 5.5 EU/ml
PS-PEG-Arg8 0 0.2 1.6 EU/ml
상기 데이터는 리간드-수용체 상호작용 및 고체 표면에서의 평형(예, 단백질 흡착)을 설명하는 랭미어 방법(Langmuir approach)을 이용하여 분석하였다. 참조문헌(JD Andrade: Principles of protein adsorption. in: JD Andrade (Ed) Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers. Volume 2, Protein Adsorption, Plenum Press New York 1985, pp 1-80). 이러한 분석은 상층액중의 독소의 평형 농도(즉, 배양후 내독소 농도)에 대하여, 기질에 존재하는 리간드의 총수로 나눈 리간드-기질에 결합된 독소(내독소)의 양(배양후 상층액에 첨가된 양과 남아있는 양 사이의 차이로부터 계산됨)을 플로트함으로써 수행된다. 다음에, 상기 플로트(plot)를 독소에 대한 여러가지 기질-결합 리간드의 친화성 및 연합 상수를 제공하는 랭미어 등온선의 수학식에 대입하였다. 도 12A 및 12B는 랭미어 방법의 예들을 도시한 것이다.
기질에 존재하는 리간드의 총수를 변화시키면서 두 종류의 랭미어 플로트를 실시하였다.
(1) 상기 비이드의 여러가지 아르기닌 함량을 무시하면서, 즉 비이드의 질량(g)을 리간드의 총수의 기준으로 취함으로써(도 12A), 이 방법은 정당화되는데, 이는 리간드-중합체-기질의 실제 적용시에, 예를 들어 체외에서 혈액이나 혈장과 같은 인간 체액이 관류되는 흡착 장치에서, 환자에서 독소 농도의 치료에 효과적인 감소를 달성하기 위하여 상기 장치내로 채워져야 하는 비이드의 전체 질량 또는 체적에 어느 정도 제한을 받기 때문이다. 이러한 제한은 예를 들어 상기 장치를 가로지르는 압력 강하, 혈액 성분(단백질 및 세포)에 대한 비특이적 효과, 또는 상기 장치에 대한 저장 공간과 관련이 있다.
(2) 상기 비이드의 아르기닌 함량을 고려하면서, 즉 아르기닌 적재량(mmol/g)으로 나눈 비이드의 질량(g)을 리간드의 총수의 기준으로 취함으로써(도 12B), 이 방법은 아르기닌 함량이 리간드-중합체-기질의 제조시의 주된 비용 인자라는 사실때문에 정당화되며, 그 결과는 경제적인 관점에서 리간드의 효율을 설명한다.
여러가지 랭미어 플로트들의 평형 파라미터들이 하기 표 3에서 보여진다.
대입한 곡선으로부터 얻은 평형 파라미터
PS-PEG-Arg8 PS-PEG-Arg4 단위
분석 1 친화 상수 1.81 0.15 ml/EU
포화 농도 253.9 200.7 EU/g
분석 2 친화 상수 1.81 0.15 ml/EU
포화 농도 479.9 168.6 EU/mmol
결과 및 검토
친화 상수는 특정의 리간드가 존재하는 리간드의 양과 무관하게 얼마나 강하게 독소에 결합할 수 있는 지를 설명 및 특성화한다. 놀랍게도, Arg8 리간드의 친화 상수는 Arg4 리간드의 친화 상수보다 10 배 넘게 (즉, 12.3 배) 더 높았다.
포화 농도는 비제한적인 양의 독소가 이용될 수 있다는 가정하에서 개개의 리간드-기질에 결합될 수 있는 독소의 최대량을 설명한다. 놀랍게도, Arg8 리간드-기질의 포화 농도는 Arg4 리간드-기질의 포화 농도보다 2 배 넘게(즉, 2.8 배) 더 높았다. 랭미어 흡착 모델에 따라 포화 농도는 친화 상수와 완전히 무관하므로, Arg8 리간드의 특정의 기하학적 배열이 리간드-기질의 PEG-부분의 형태(예, 유체 상태에 대한 결정 상태)에 영향을 미침으로써 독소에 대한 리간드-기질의 접근성에 영향을 미치는 것으로 해석될 수 있다.
하기의 실시예는 독소 농도의 치료에 적절한 감소를 달성하는데 필요한 기질의 양에 대한 Arg8 리간드-기질 내독소의 개선된 친화성의 중요성 및 타당성을 증명한다:
0.1-1 EU/ml 범위의 내독소 농도가 패혈증 환자에게서 확인된다(예, Nakamura 등, Renal Failure 2000; 22: 225-234). 이것은, 처리의 출발시에 0.3 EU/ml의 혈장 농도, 처리후 0.03 EU/ml의 혈장 농도 및 4000 ml의 혈장 체적을 가정할 때, 1080 EU의 내독소가 처리동안 상기 리간드-기질에 결합되어야 한다는 것을 의미한다. 이러한 양의 내독소에 결합하는데 필요한 기질의 양은 각각의 리간드에 대한 친화 상수 및 포화 농도를 이용하는 랭미어 식에 따라 계산할 수 있다. 처리의 종료후의 농도는 평형 농도가 된다. 표 3의 평형 데이터를 이용한 이러한 계산 결과는 Arg8 리간드-기질의 경우에는 치료 목적을 달성하는데 83g만이 필요한 반면에, Arg4 리간드-기질의 경우에는 1201g이 필요하다는 것을 나타낸다. 상기 리간드-기질 모두는 유사한 밀도(체적당 질량)를 갖기 때문에, 상기 결과는 Arg8의 경우에는 흡착 장치의 체적 및 크기가 아주 작아져서 혈장이나 혈액에 의한 관류가 촉진된다는 것을 의미한다.

Claims (46)

  1. 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하거나 유체 중의 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 중합체 친화성 기질로서, 상기 기질이
    a) 고형 지지체,
    b) 고형 지지체에 결합된 하나 이상의 스페이서로, 상기 스페이서가 화학식 H-(OCH2CH2)n-OH(여기서, n은 2-250을 나타냄)의 폴리- 또는 올리고에틸렌 글리콜, 또는 폴리비닐알코올, 폴리비닐아민, 폴리올리시돌, 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌옥사이드, 또는 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고, 서로 커플링된, 스페이서,
    c) 전하 또는 소수성 또는 친수성에 대해 상기 물질의 결합 모티프의 삼차원 구조에 상보적인 규정된 삼차원 구조를 갖는 리간드로서, 상기 리간드가
    Figure 112010066701678-pct00028
    ,
    Figure 112010066701678-pct00029
    및
    Figure 112010066701678-pct00030
    로 이루어진 군에서 선택된 리간드
    를 포함하는, 중합체 친화성 기질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 스페이서가 평균 분자량이 400-10000 달톤인 선형 또는 분지형의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체인 중합체 친화성 기질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 고형 지지체가 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시스티렌, 클로로메틸화된 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트로부터 생성된 중합체, 히드록시 작용기를 갖는 폴리메타크릴레이트, 히드록시알킬-폴리스티렌, 히드록시아릴-폴리스티렌, 히드록시알킬-아릴-폴리스티렌, 폴리히드록시알킬화된 폴리스티렌, 폴리히드록시아릴화된 폴리스티렌, 이소시아네이토알킬-폴리스티렌, 이소시아네이토아릴-폴리스티렌, 카르복시알킬-폴리스티렌, 카르복시아릴-폴리스티렌, 아미노알킬-폴리스티렌, 아미노아릴-폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 가교된 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 실리카, 탄수화물, 라텍스, 시클로-올레핀 공중합체, 글래스(glass), 또는 이들의 조합으로부터 구성되는 군에서 선택된 재료로 제조되는, 중합체 친화성 기질.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 고형 지지체가 비이드, 젤, 멤브레인, 입자, 그물, 직포 또는 부직포, 섬유 매트, 튜브, 필름, 호일, 또는 이들의 조합 또는 가교된 상호침투형 망상구조의 형태를 갖는, 중합체 친화성 기질.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 기질이 생체적합성이 있고, 전체 혈액을 관류시키기에 충분한 팽윤량을 갖는, 중합체 친화성 기질.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 팽윤량이 수화된 형태가 건조 상태의 1.5-20 배인, 중합체 친화성 기질.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 기질이 세균 또는 바이러스 유래 성분, 내독소, 외독소, 세균성 DNA 또는 이의 단편, 올리고뉴클레오티드; 내피세포, 줄기 세포 및 종양 세포로 구성되는 군에서 선택되는 세포; 림프구, 혈소판, 과립구, 수상 세포, 및 단핵 세포로 구성되는 군에서 선택되는 혈액 세포; 프리온, 기생충, 균류, 과잉 투여후 약물, 병원성 식품 첨가제, 당뇨병, 간질환, 요독증, 신장 질환 또는 염증에 따른 만성 또는 급성 대사성 장애 생성물, 헤파린, 세균 및 바이러스, 병원균 적재 혈액 세포, 또는 이의 일부 또는 전체 또는 이의 분해 생성물, DNA, 인산염, 시토킨, 성장 인자, 호르몬, 케모카인, 요독소, 혈액 응고 단백질, 전응고 단백질, 염증 또는 전염증 단백질, 대식세포 이동 억제 인자, 가용성 또는 세포 표면 결합 단백질, 가용성 부착 분자, 및 글루코스 또는 이의 분해 생성물, 발열인자, 세균성 외독소, 세균성 내독소로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질에 결합하기 위한 삼차원의 상보적 구조를 제공하는, 중합체 친화성 기질.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 기질이 1x102 내지 1x106 달톤의 한계값을 갖고 소수성 또는 친수성 물질에 결합하는, 중합체 친화성 기질.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 물질을 제거 또는 감소시키고자 하는 상기 유체가 수용액 또는 유기 용액; 체액; 치료용 유체; 건강한 기증자로부터 얻은 혈액 산물; 혈액 대체물; 영양용 유체 및 공업용 유체인, 중합체 친화성 기질.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 고형 지지체가 가교된 폴리스티렌이고, 상기 스페이서가 폴리에틸렌 글리콜인 중합체 친화성 기질.
  11. 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하거나 유체 중의 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 방법으로서,
    상기 물질의 양 또는 농도를 감소시키거나 상기 물질을 제거하기에 충분한 시간 동안, 상기 유체를 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 중합체 친화성 기질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 접촉 시간이 1 초 내지 2 시간인 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 물질이 내독소이고, 상기 유체가 혈액이고, 제거 또는 감소된 후의 내독소의 양 또는 농도가 혈액 중에서 성분을 활성화시키는 수준(capacity)보다 낮거나 혈액 중에서 성분 또는 과정의 비정상적인 활성화를 방지하는 수준인 방법.
  14. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 중합체 친화성 기질을 이용하여, 혈액이나 혈청으로부터 내독소를 제거하거나 내독소의 양 또는 농도를 감소시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 중합체 친화성 기질이 덜 활성화된 혈액을 생성시키거나 혈액 내에서 성분 또는 과정의 비정상적인 활성화를 방지함을 특징으로 하는, 방법.
  16. 체외 혈액 정제 과정의 일부로서 또는 혈액이나 체액과 접촉시키기 위한, 제 1항 내지 제 10항에서 정의된 중합체 친화성 기질을 포함하는 임플란트.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 임플란트가 덜 활성화된 혈액을 생성시키거나 혈액내에서 성분 또는 과정의 비정상적인 활성화를 방지함을 특징으로 하는, 임플란트.
  18. 유체로부터 하나 이상의 물질을 제거하거나 유체에서 물질의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 키트로서, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 중합체 친화성 기질을 포함하는 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 샘플 튜브, 및 유체의 체외 또는 체내 처리를 위한 기구를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 중합체 친화성 기질을 제조하기 위한 방법으로서,
    a) 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계 및
    b) 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하는 단계; 또는
    c) 스페이서를 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드에 부착하여 제 2 복합체를 얻는 단계 및
    d) 고형 지지체를 제 2 복합체에 부착하는 단계; 또는
    e) 고형 지지체에 스페이서를 부착하여 제 1 복합체를 얻는 단계, 및
    f) 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계; 또는
    g) 고형 지지체상에 단량체를 직접 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계 및,
    h) 제 1 복합체에 하나 이상의 작용기를 갖는 하나 이상의 결합 단위체를 함유하는 리간드를 부착하는 단계; 또는
    i) 고형 지지체상에 직접 단량체를 그라프트하여 스페이서를 증대 또는 합성하는 단계 및,
    k) 고형 지지체에 결합된 스페이서 상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하고,
    결합시키려는 물질 상의 결합 모티프의 삼차원 구조, 전하의 존재, 및 소수성 또는 친수성 영역에 관한 정보가 X-선 결정학, 단백질 서열분석, 단백질 모델링 또는 소수성 및 친수성 계산에 의하여 얻어지고 결합 단위체를 함유하는 리간드는 전하 또는 친수성 또는 소수성에 대해 상기 물질의 결합 모티프에 상보적이게 되는 중합체 친화성 기질을 제조하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 단계 a) 및 b)의 경우, 고형 지지체를 활성화하고, 고형 지지체상에 스페이서 분자를 커플링하고, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 합성하고, 스페이서 분자에 리간드를 부위 특이적으로 커플링하는 단계, 또는
    단계 c) 및 d)의 경우, 결합 단위체를 함유하는 리간드를 합성하고, 리간드에 스페이서 분자를 커플링하고, 고형 지지체를 활성화하고, 활성화된 고형 지지체에 스페이서-리간드 복합체를 부위 특이적으로 커플링하는 단계, 또는
    단계 e) 및 f)의 경우, 고형 지지체를 활성화하고, 활성화된 고형 지지체에 스페이서 분자를 커플링하고, 지지체에 결합된 스페이서상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 단계 a) 및 b)의 경우, 스페이서를 활성화하고, 활성화된 스페이서를 고형 지지체에 커플링하고, 활성화된 스페이서에 리간드를 커플링하는 단계, 또는
    단계 c) 및 d)의 경우, 리간드를 합성하고, 스페이서를 활성화하고, 활성화된 스페이서 분자에 리간드를 부위 특이적으로 커플링하고, 스페이서-리간드 복합체를 고형 지지체에 커플링하는 단계, 또는
    단계 e) 및 f)의 경우, 스페이서를 활성화하고, 활성화된 스페이서를 고형 지지체에 커플링하고, 고형 지지체에 결합된 스페이서상에 리간드를 고상 합성하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제 4항에 있어서, 상기 고형 지지체가 폴리스티렌-PEG 비이드의 형태를 갖는, 중합체 친화성 기질.
  24. 제 6항에 있어서, 상기 팽윤량이 수화된 형태가 건조 상태의 2-6배인, 중합체 친화성 기질.
  25. 제 11항에 있어서, 상기 물질의 양 또는 농도를 감소시키거나 물질을 제거하기에 충분한 시간이 24 시간 이하인, 방법.
  26. 제 16항에 있어서, 상기 임플란트가 체내의 맥관계(vascular system), 혈관 또는 복강 내에서 사용되는 임플란트인, 임플란트.
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